CN109320597A - 狐亚科激活素a蛋白及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种狐亚科激活素A蛋白及其制备与应用。所述的激活素A蛋白由两个狐亚科激活素βA亚基组成，从狐亚科动物中分离得到其基因序列后利用分子生物学及细胞生物学的方法纯化出具有生物活性的蛋白。激活素A蛋白在狐亚科动物中的研究还比较少，本发明分离得到了其基因序列，并提高了其高纯度蛋白的表达方法，可为相关研究提供研究基础和新的思路，大大增加了激活素A蛋白的研究与应用前景。

Description

狐亚科激活素A蛋白及其制备与应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种狐亚科激活素A蛋白及其制备与应用。

背景技术

激活素(Actvin,ACT)，又名活化素，是Vale等和Ling等首先从猪卵泡液中分离纯化出来的一种糖蛋白激素，因能与抑制素(Inhibin,INH)分别特异性促进和抑制垂体细胞分泌卵泡刺激素(Follicle StimulatingHormone，FSH)而得名，属于转化生长因子β超家族成员。激活素主要是由卵巢颗粒细胞和胎盘合成分泌，由于其具有特异性地促进垂体细胞分泌及合成卵泡刺激素的生物学活性，因而被命名为激活素。

ACT同INH均为两个亚基构成的二聚体。ACT由β亚单位构成，包括同源二聚体ACTA(βA-βA)和ACTB(βB-βB)或异源二聚体ACTAB(βA-βB)。其中βA亚基含量最多。三种分子结构的激活素具有类似的生物学活性，其作用的特异性与其受体后信号传导的组织差异有关。因ACTA的生理作用更为广泛，对机体整个生命过程均有重要的作用，成为近年来备受关注的新型细胞因子，故目前对ACTA的研究较多。

狐狸(Vulpes vulpes)属于中型的杂食性哺乳动物，属于犬科。它作为重要的毛皮动物被大量饲养。目前国内外关于狐狸卵母细胞的体外成熟的研究并不顺利，主要原因是狐狸卵母细胞成熟过程中调节因子的种类及机制知之甚少。众所周知ACTA在哺乳动物卵母细胞成熟过程中发挥了重要作用。但ACTA是否有助于狐狸卵母细胞的体外成熟的研究一直没有被进行，主要是因为目前国内对狐亚科ACTA的研究还较少，尚无狐亚科ACTA蛋白质与cDNA序列的报道，这为进一步探讨研究狐亚科ACTA的功能、其表达的时空特异性、相关信号通路及对狐亚科繁殖力等的研究都将造成了障碍。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新颖的激活素A蛋白，并对其制备方法与功能进行了研究。

所述的激活素A蛋白由两个狐亚科激活素βA亚基(氨基酸序列如SEQID NO:1所示)组成，从狐亚科动物中分离得到。

激活素A蛋白在狐亚科动物中的研究还比较少，本发明分离得到了其基因序列，并提高了其高纯度蛋白的表达方法，可为相关研究提供研究基础和新的思路，大大增加了激活素A蛋白的研究与应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中北极狐INHBA基因扩增结果；M.DNA相对分子质量标准(DL2000)；1.INHBA基因扩增产物；2.阴性对照；

图2为本发明一个实施例中pcDNA4/INHBA-Fox质粒的酶切鉴定结果；M1.DNA相对分子质量标准(DL10000)；1.INHBA基因扩增产物；2.BamHI单酶切pcDNA4/myc-His空质粒；3.BamHI单酶切pcDNA4/INHBA-Fox重组质粒；4.BamHI和EcoRI双酶切pcDNA4/INHBA-Fox重组质粒；M2.DNA相对分子质量标准(DL2000)；

图3为本发明一个实施例中INHBA基因在CHO细胞中瞬时表达的免疫荧光图；A1,A2,A3为CHO细胞转染pcDNA4/INHBA-Fox后荧光显微镜照片(A1：DAPI染核，A2：INHBA-His融合蛋白，A3：重叠后照片)；B1,B2,B3为CHO细胞转染pcDNA4/myc-His后荧光显微镜照片(B1：DAPI染核，B2：阴性对照，B3：重叠后照片)；

图4为本发明一个实施例中INHBA基因在CHO细胞中瞬时表达的Western Blot鉴定结果；1转染重组质粒pcDNA4/INHBA-Fox的CHO细胞破碎产物；2转染空载体pcDNA4/myc-His的CHO细胞破碎产物；M蛋白maker；

图5为本发明一个实施例中SDS-PAGE检测激活素A的表达；1转染空载体pcDNA4/myc-His的CHO细胞培养液上清；2转染重组质粒pcDNA4/INHBA-Fox的CHO细胞培养液上清(非还原性SDS-PAGE上样缓存液变性)；

图6为本发明一个实施例中Western blot检测激活素A的表达；A转染重组质粒pcDNA4/INHBA-Fox的CHO细胞培养液上清(非还原性SDS-PAGE上样缓存液变性)；B转染重组质粒pcDNA4/INHBA-Fox的CHO细胞培养液上清(还原性SDS-PAGE上样缓存液变性)；

图7为本发明一个实施例中前体和成熟形式的激活素的示意图；

图8为本发明一个实施例中检测激活素A对SMAD2/3磷酸化的影响；

图9为本发明一个实施例中激活素A对小鼠颗粒细胞细胞Aromatase和StAR表达量的影响；A实时荧光定量PCR检测P450aromatase和StARmRNA表达量水平；B Western Blot检测P450aromatase和StAR蛋白表达量水平。

具体实施方式

除非另有限定，本发明使用的所有技术和科学术语具有与所公开的实施方案所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本发明所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本实施方式的实践或测试中，但下文仍然描述了合适的方法和材料。本发明提及的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献通过引用全部内容结合于本文中。在冲突的情况下，本说明书(包括定义)将起支配作用。此外，材料、方法以及实施例仅仅是说明性的，而不旨在限制。实施方式的其他特征和优点将从以下详细的说明书和权利要求中变得明显。

为了促进理解本文描述的实施方式这一目的，将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述这些实施方式。本文所使用的术语仅用于描述具体实施方式目的，而不旨在限制本公开的范围。

本发明涉及一种狐亚科激活素βA亚基，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种狐亚科激活素A蛋白，其由两个如上所述的狐亚科激活素βA亚基组成。

根据本发明的一方面，本发明还涉及分离的核酸，其编码权利如上所述激活素βA亚基；

在本文中，核酸包含其保守置换的变体(例如简并密码子的置换)和互补序列。术语“核酸”和“多核苷酸”是同义的，包含基因、cDNA分子、mRNA分子以及它们的片段例如寡核苷酸。

在一些实施方式中，所述核酸为DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2或3所示。

本发明所述核酸还包括与本发明所提供序列高度同源的功能等价体序列。

所述高度同源的功能等价体序列包括在严格条件下能够与具有SEQ ID NO：2或3所示的序列的DNA杂交的DNA序列。本发明中使用的“严格条件”是公知的，包括诸如在含400mM NaCl、40mM PIPES(pH6.4)和1mM EDTA的杂交液中于60℃杂交12～16小时，然后在65℃下用含0.1％SDS、和0.1％SSC的洗涤液洗涤15～60分钟。

功能等价体序列还包括与SEQ ID NO：2或3所示序列有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，且能够表达具有激活素活性蛋白的基因序列，可以从任何生物体中分离获得。其中，序列同一性的百分比可以通过公知的生物信息学算法来获得，包括Myers和Miller算法(Bioinformatics，4(1)：11-17，1988)、Needleman-Wunsch全局比对法(J.Mol.Biol.，48(3)：443-53，1970)、Smith-Waterman局部比对法(J.Mol.Biol.，147：195-197，1981)、Pearson和Lipman相似性搜索法(PNAS，85(8)：2444-2448，1988)、Karlin和Altschul的算法(Altschul等，J.Mol.Biol.，215(3)：403-410，1990；PNAS，90：5873-5877，1993)。这对于本领域技术人员来说是熟悉的。

根据本发明的一方面，本发明还涉及载体，其包含如上所述的核酸；

所述载体可以包含选择标记(例如便于富集的标签，例如his tag；或便于被检测的标签，例如GFP)，以及与所述克隆载体所指定的细胞类型相匹配的复制起点，而表达载体则包含对于影响指定靶细胞中的表达必要的调节元件。所述载体可以是克隆载体与表达载体，包括质粒载体、噬菌体载体、病毒载体等，在表达或是制备抗体或片段时，常涉及原核表达载体和真核表达载体，原核表达载体常用PET系列、pGEX系列，真核表达载体常用pcDNA3.1、pcDNA3.4、pcDNA4、pEGFP-N1、pEGFP-N1、pSV2等，所述病毒载体可是慢病毒、逆转录病毒、腺病毒或腺相关病毒。

在一些具体的实施方式中，所述载体选自pEASY-Blunt Simple CloningVector和/或pcDNA4/myc-His。

根据本发明的一方面，本发明还涉及宿主细胞，其被如上所述的核酸或如上所述的载体所转化；

所述宿主细胞主要涉及真核细胞，真核细胞包括哺乳动物细胞、酵母、昆虫细胞。尤其是哺乳动物细胞，常用到的细胞可以是CHO、293、NSO细胞。

在一些实施方式中，所述转化入所述宿主细胞的方法，包括脂质体转染方法和电穿孔方法，如Lipofectamine^TM、RNAiMAX、HiPerFect、DharmaFECT、X-tremeGENEsiLentFect^TM、TransIntroTM EL Transfection Reagent等。病毒载体通过其自然感染方式导入哺乳细胞，如逆转录病毒或慢病毒通过制备完整病毒颗粒直接加入培养细胞感染哺乳细胞。

在一些具体的实施方式中，所述宿主细胞选自CHO细胞系。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种制备狐亚科激活素βA亚基或狐亚科激活素A蛋白的方法，包括：

在培养基中培养如上所述的宿主细胞，从所培养的宿主细胞中回收如此产生的蛋白。

在一些实施方式中，从所培养的宿主细胞中回收的蛋白带有his tag，所述方法还包括将所述蛋白经亲和层析柱处理；

在一些实施方式中，所述亲和层析柱的填充物为Ni-Agarose Resin填料。

在一些实施方式中，在用所述亲和层析柱对所得蛋白进行处理时：

Binding Buffer用量为8～12倍柱体积，含有8～12mM咪唑，pH＝7.7～8.1；

Soluble Binding Buffe用量为13～17倍柱体积，含有18～22mM咪唑，pH＝7.7～8.1；

Soluble Elution Buffer含有480～520mM咪唑，pH＝7.7～8.1。

在一些实施方式中，在用所述亲和层析柱对所得蛋白进行处理时：

Binding Buffer用量为10倍柱体积，含有10mM咪唑，pH＝7.9；

Soluble Binding Buffe用量为15倍柱体积，含有20mM咪唑，pH＝7.9；

Soluble Elution Buffer含有500mM咪唑，pH＝7.9。

在一些实施方式中，在用所述亲和层析柱对所得蛋白进行处理时：

Binding Buffer用量为10倍柱体积，配方为：Tris-HCl(pH7.9)20mM；咪唑10mM；NaCl 0.5M；

Soluble Binding Buffe用量为15倍柱体积，配方为：Tris-HCl(pH7.9)20mM；咪唑20mM；NaCl 0.5M；

Soluble Elution Buffer配方为：Tris-HCl(pH7.9)20mM；咪唑500mM；NaCl 0.5M。

根据本发明的一方面，本发明还涉及如上所述的狐亚科激活素βA亚基，或如上所述的狐亚科激活素A蛋白在制备调节犬科动物生理功能的药物中的应用；

所述生理功能包括：组织细胞生长调节，免疫调节，调节神经细胞分化，调节成骨细胞功能，调节红细胞生产，提高FSH受体的表达，降低LH诱导雄激素的生产，增强垂体分泌FSH的能力，促进卵泡发育和成熟，延缓卵泡闭锁和黄体化，促进超数排卵，控制同期发情中的一种或多种；

在一些实施方式中，免疫调节具体为参与组织损伤和炎症修复。

在一些实施方式中，所述犬科Caninae动物为狐亚科Vulpini动物。

在一些实施方式中，所述犬科Caninae动物为狐属Vulpes动物。

在一些实施方式中，所述犬科Caninae动物为北极狐Vulpes lagopus。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例

1材料与方法

试验于2017年6月至2018年4月在中国农业科学院特产研究所国家重点实验室完成。

1.1试验动物与样品的采集

试验动物北极狐来源于中国农业科学院特产研究所毛皮兽实验基地。在2016年10月通过手术法活体摘除北极狐卵巢组织放入液氮中运送至实验室，放置于超低温冰箱内保存。

1.2主要试剂

DMEM-F12培养基、胰蛋白酶、青霉素、链霉素从HyClone公司购买；胎牛血清从Gibco公司购买；PrimeSTAR HS高保真DNA聚合酶、反转录试剂盒(PrimeScript One ScriptRT-PCR Kit Ver.2)从大连宝生物工程有限公司购买；RNA提取试剂盒从天根生化科技(北京)有限责任公司购买；凝胶回收、质粒小提试剂盒、去内毒素质粒大提试剂盒从康为世纪有限责任公司购买；pEASY-Blunt Simple Cloning Vector平端克隆载体、大肠杆菌DH5α感受态细胞从北京全式金生物技术有限公司购买；T4 DNA连接酶从Promega公司购买；核酸染料(Super GelRed Nucleic Acid Gel Stain,10,000×in DMSO)从苏州宇恒生物科技有限公司购买；限制性内切酶购、3000、pcDNA 4/myc-His真核表达载体从Thermo Scientific公司购买；组蛋白(histone，His)镍纯化试剂盒从康为世纪公司购买。

1.3引物设计

根据犬INHBA的mRNA预测序列(XM_540364.4)，利用Primer Primer5.0软件，在INHBA基因CDS区域设计1对可以扩增北极狐的INHBA基因完整开放阅读框的引物(预期扩增产物大小1275bp)。引物为:上游引物(INHBA-F)：5’-TTGCTGCCAGGATGCCCTTGCT-3’(SEQ IDNO:4)，下游引物(INHBA-R)：5’-GGGTGCTCTATGAGCACCCGCA-3’(SEQ ID NO:5)。同时利用Primer Primer5.0软件设计1对用于构建真核表达质粒的引物。引物为:上游引物(P4-INHBA-F)：5’-CGGGATCCCGATAATGGCCTTGCTCTGGC-3’(SEQ ID NO:6)，下游引物(P4-INHBA-R)：5’-CGGAATTCTGAGCACCCGCACTCC-3’(SEQ ID NO:7)。引物在上海生工生物公司合成。

1.4总RNA的提取

利用RNA提取试剂盒提取北极狐卵巢组织总RNA，利用分光光度计和1.0％变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的纯度及完整性。利用PrimeScript One Script RT-PCR Kit Ver.2反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，-20℃保存备用。

1.5北极狐INHBA基因的扩增

以上述cDNA为模板，使用引物INHBA-F、INHBA-R和PrimeSTAR HS高保真DNA聚合酶，按常规方法进行PCR扩增。反应体系50μL：5×PrimeSTAR Buffer 10μL；dNTP Mixture(2.5mmol/L each)4μL；上游引物INHBA-F 1μL；下游引物INHBA-R 1μL；北极狐卵巢组织cDNA 2μL；PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL；ddH₂O 31μL。反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸2min，反应35个循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.6北极狐INHBA基因优化及合成

经PCR扩增的北极狐INHBA基因在上海生工生物公司测序，序列为SEQ ID NO:2所示。由于每个氨基酸对应2-3个密码子，而这些密码子在不同生物中使用的频率并不相同，所以我们将北极狐INHBA氨基酸的密码子替换掉，替换为啮齿类动物喜欢的密码子，但并不改变氨基酸序列，这样可以促使北极狐激活素A分泌量增加。密码子优化后的基因序列如SEQ ID NO:3所示，在苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.7北极狐INHBA基因克隆载体的构建

基因合成产物经变性和退火后和pEASY-Blunt Simple Cloning Vector平端克隆载体进行连接。反应体系为：pEASY-Blunt Simple Cloning Vector平端克隆载体1μL、基因合成产物3μL、ddH2O 1μL，25℃连接15min。将连接产物加入50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，立即移入冰中静置5min，之后加入500μL 37℃预温的无抗性的LB培养基，37℃摇床培养1h，最后将菌液均匀涂布含有Kanamycin的LB固体培养基上，放入37℃生化培养箱内过夜培养，筛选阳性菌落。随机挑取10株单克隆菌落。按照质粒小提试剂盒说明书提取重组质粒pEASY-INHBA-Fox。用PCR法鉴定出连接成功的阳性克隆后，送到上海生工生物公司测序。

1.8pcDNA4/INHBA-Fox真核表达质粒的构建

以上述质粒pEASY-INHBA-Fox为模板，使用引物P4-INHBA-F、P4-INHBA-R和PrimeSTAR HS高保真DNA聚合酶，按常规方法进行PCR扩增。PCR产物经1.0％的琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收。将纯化后的P4-INHBA-Fox基因与真核表达载体pcDNA4/myc-His同时利用限制性内切酶BamH I和EcoRI进行双酶切，经1.0％的琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收。回收后的P4-INHBA-Fox基因片段和经同样双酶切的真核表达载体pcDNA4/myc-His进行连接。将连接产物加入100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行转化。随机挑取15株单克隆菌落，用PCR法鉴定阳性克隆菌落。提取阳性克隆菌的重组质粒。用PCR法、单双酶切鉴定连接正确后将菌液送到上海生工生物公司测序。测序鉴定插入方向及读码框完全正确后用去内毒素质粒提取试剂盒提取质粒。用微量紫外分光光度计测定其浓度及纯度，-20℃贮存备用。所得到的重组真核表达质粒命名为pcDNA4/INHBA-Fox。

1.9pcDNA4/INHBA-Fox在CHO细胞中瞬时表达并鉴定

CHO细胞系在含10％FBS的DMEM-F12培养基中，于37℃、5％的CO₂孵箱中培养。在转染的前一天将5×10⁶个细胞接种到直径为60mm的一次性培养皿内。待CHO细胞汇合度为70％～80％时(大约24h后)，按照3000试剂盒说明书操作，将重组表达质粒pcDNA4/INHBA-Fox转染细胞。同时设转染pcDNA 4/myc-His空质粒的细胞为阴性对照。转染48h后，使用兔抗His标签单克隆抗体对转染重组表达质粒pcDNA4/INHBA-Fox、pcDNA 4/myc-His的CHO细胞进行免疫荧光及Western Blot鉴定。

1.10北极狐激活素A的表达及纯化

在转染的前一天将3×10⁷个细胞接种到直径为100mm的一次性培养皿内。待CHO细胞汇合度为70％～80％时(大约24h后)，按照3000试剂盒说明书操作，将重组表达质粒pcDNA4/INHBA-Fox转染细胞。pcDNA4/INHBA-Fox质粒转染CHO细胞12h后，用ExpiCHO^TM Expression Medium继续培养48h后，收集细胞培养液，4℃、10000g离心10min，收集并保存上清液。根据6×His-Tagged Protein Purification Kit说明书操作，首先将Ni-Agarose Resin填料混匀后加入层析柱，室温静置10分钟，待凝胶与溶液分层后，把底部的出液口打开，让乙醇通过重力作用缓慢流出。向装填好的柱中加入5倍柱体积的去离子水将乙醇冲洗干净后，再用10倍柱体积的Binding Buffer(Tris-HCl(pH7.9)20mM；咪唑10mM；NaCl 0.5M)平衡柱子，平衡结束后即可上样。用Binding Buffer将细胞培养液上清等倍稀释后负载上柱，流速为10倍柱体积/小时，收集流穿液。使用15倍柱体积的Soluble BindingBuffer(Tris-HCl(pH7.9)20mM；咪唑20mM；NaCl 0.5M)冲洗柱子，洗去杂蛋白。使用适量Soluble Elution Buffer(Tris-HCl(pH7.9)20mM；咪唑500mM；NaCl 0.5M)洗脱。用Westernblot法鉴定纯化后的蛋白。

1.11北极狐激活素A生物活性的测定

1.11.1小鼠卵丘颗粒细胞的培养

将小鼠断颈处死，迅速取出双侧卵巢置于预温过的含有双抗的灭菌生理盐水液滴中。将采集到的小鼠卵巢，用含有双抗的灭菌生理盐水清洗5次后带入无菌室。用1mL注射器的针头刺破小鼠卵巢表面的卵泡壁。然后在光镜下使用拉制好的玻璃吸管捡出卵丘-卵母细胞复合体。将捡出来的卵丘-卵母细胞复合体放入1.5mL离心管内，通过反复吹打脱落颗粒细胞，置于离心管内以2000r/min离心5min。用含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL硫酸链霉素和1×GlutaMAX的DMEM-F12细胞培养液将颗粒细胞吹打混匀后，接种到60mm培养皿内，同时利用玻璃吸管捡出所有卵母细胞并弃掉。最后置于37℃、5％的CO₂培养箱中培养。

在小鼠卵丘颗粒细胞生长密度达到80％左右时，将培养基更换为低血清培养基(含有0.5％胎牛血清)，继续培养细胞24h。然后在低血清培养基中加入外源性重组的北极狐激活素A(25ng/mL)处理细胞24h。然后用RT-qPCR和Western blot检测芳香化酶、StAR和P450等类固醇激素激素合成关键基因的mRNA和蛋白水平。

1.11.2荧光定量PCR

将外源性重组的北极狐激活素A(25ng/mL)处理的小鼠卵丘颗粒细胞以及对照组的小鼠卵丘颗粒细胞用冷的PBS清洗后，按照RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA。然后利用PrimeScript One Script RT-PCR Kit Ver.2反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，-20℃保存备用。

以正常小鼠卵丘颗粒细胞cDNA为模板，使用表1中的引物和PrimeSTAR HS高保真DNA聚合酶，按常规方法进行PCR扩增。反应体系为25μL：5×PrimeSTAR Buffer 5μL；dNTPMixture(2.5mmol/L each)2μL；上游引物1μL；下游引物1μL；3月份水貂睾丸cDNA 1μL；PrimeSTARHS DNA Polymerase(2.5U/μL)0.5μL；ddH₂O 14.5μL。反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，反应35个循环；最后72℃延伸5min。PCR扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳鉴定。PCR产物经2.0％的琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收。回收后的目的基因片段和pMD19-T克隆载体进行连接。用PCR法鉴定出连接成功的阳性克隆后，送到上海生工生物公司测序。

表1引物序列与real-time PCR反应参数

荧光定量PCR反应体系：12.5μL FS Universal SYBR Green Master(ROX)、0.5μL上游引物(10μmol/L)、0.5μL下游引物(10μmol/L)、2μL cDNA(1ng/μL)样品和9.5μLNuclease-Free H₂O。荧光定量PCR反应程序：95.0℃预变性10.0min；95.0℃变性30.0s、60.0℃退火及延伸30.0s，40个循环。每个循环的退火及延伸阶段采集荧光信号数据。扩增结束后立即进行熔解曲线分析，根据熔解曲线判断反应的特异性，根据每个样品的Ct值，用2^－△△Ct法计算目的基因的相对表达量，每个试验样品设置3次重复，同是有3个生物学重复。

1.11.3Western Blot检测Smad信号通路

在小鼠卵丘颗粒细胞生长密度达到80％左右时，将培养基更换为低血清培养基(含有0.5％胎牛血清)，继续培养细胞24h。然后在低血清培养基中加入外源性重组的北极狐激活素A(25ng/mL)处理细胞2h。将处理后的小鼠卵丘颗粒细胞以及对照组的小鼠卵丘颗粒细胞用冷的PBS清洗后，按照Mammalian试剂盒说明书提取细胞总蛋白。蛋白上样量为30μg，浓缩胶中电压为90V，时间30min，分离胶的电压为120V，时间为75min。电泳凝胶电转移NC膜，转膜电压为90V，时间为80min。用TBST稀释的5％BSA室温振荡封闭1h。本研究中使用的一抗信息见表2。最佳稀释比例的一抗在4℃冰箱孵育过夜，TBST洗涤3次，每次10min，再加入用5％BSA稀释的HRP标记的二抗(见表2)，37℃孵育1h，TBST洗涤3次，每次10min，最后用ECL发光液显影。

表2抗体信息表

1.12实验数据处理

试验数据用SPSS 16.0统计分析软件One-way ANOVA进行方差分析和显著性检验，结果用平均值和标准方差(SEM)表示，P<0.05时判为差异显著，P>0.05时判为差异不显著。

2结果

2.1北极狐INHBA基因的扩增

RT-PCR扩增的产物分别经1％琼脂糖凝胶电泳显示，在约1275bp处有一明显扩增条带,与预期的目的基因INHBA大小一致(见图1)。

2.2真核表达质粒pcDNA4/INHBA-Fox的构建与鉴定

为了使目的基因在CHO细胞中具有高的表达效率，我们使用OPTIMWIZ密码子优化工具，对北极狐INHBA基因的编码区序列进行了密码子偏好性、GC含量等关键参数进行优化。在不改变氨基酸序列的基础上我们将176个核苷酸突变，将密码子优化为啮齿类动物常用密码子，同时将GC含量降到55.3％。

2.3真核表达质粒pcDNA4/INHBA-Fox的构建与鉴定

构建好的重组质粒pcDNA4/INHBA-Fox，经PCR、BamH I单酶切、BamH I和EcoRI双酶切鉴定结果(见图2)显示pcDNA4/INHBA-Fox质粒构建初步成功，然后进一步进行核苷酸序列测定，结果显示插入pcDNA4/myc-His的INHBA基因的读码框架和插入方向均正确。

2.4INHBA基因在CHO细胞中瞬时表达

将重组质粒pcDNA4/INHBA-Fox和对照空载体pcDNA4/myc-His转染CHO细胞48h后，用4％的多聚甲醛固定细胞，然后使用兔抗His标签单克隆抗体进行免疫荧光染色，细胞核用DAPI染色。荧光显微镜下发现而转染pcDNA4/myc-His空质粒的细胞在细胞质和细胞核内没有红色荧光(图3，B3)；转染pcDNA4/INHBA-Fox质粒的细胞质内有弥散的红色荧光，在细胞质内有大量的红色荧光显现，细胞核内没有红色荧光分布(图3，A3)。表明INHBA在CHO细胞中表达后，主要分布于细胞质内。将转染重组质粒pcDNA4/INHBA-Fox和对照空载体pcDNA4/myc-His 48h后的CHO细胞总蛋白进行Western Blot鉴定，结果(图4)发现转染重组质粒pcDNA4/INHBA-Fox的CHO细胞在45KD处有一条特异的条带，这与北极狐激活素A的bateA亚基大小一致。然而转染空载体pcDNA4/myc-His的CHO细胞没有条带。

2.5北极狐激活素A蛋白纯化及鉴定

利用无血清CHO表达方法，表达了北极狐激活素A。将含有北极狐激活素A的细胞培养液上清利用非还原SDS上样缓存液进行了SDS-PAGE分离，然后后利用考马斯亮蓝显色，结果显示北极狐激活素A条带明显，大小一致(图5)。同时利用His标签蛋白纯化试剂盒纯化北极狐激活素A，然后利用BCA试剂盒测定蛋白浓度，结果发现体外表达北极狐激活素A的蛋白含量为15ng/μL。利用His标签抗体对纯化后的北极狐激活素A进行Western blot检测，结果发现利用非还原性SDS-PAGE上样缓存液变性的北极狐激活素A所得目的条带有两条，大小约为58KD和26KD这与预期北极狐激活素A的大小一致(图6A)。使用还原性SDS-PAGE上样缓存液变性的北极狐激活素A所得目的条带有两条，大小约为45KD和13KD这与预期北极狐激活素A的大小一致(图6B)。体外表达的北极狐激活素A有两条目的条带主要是因为，它包含了前体蛋白和成熟蛋白两种形式，前体蛋白主要由一分子全长INHBA亚单位(约45KD)和一分子切割后的成熟的INHBA亚单位(约13KD)组成。然而成熟的北极狐激活素A是由2分子成熟的INHBA亚单位(约13KD)组成(图7)。

2.6北极狐激活素A可以激活SMAD信号通路

为了证实体外表达的北极狐激活素A是否具有生物学活性，我们利用猪颗粒细胞测试了体外表达的北极狐激活素A能否激活经典的SMAD信号通路。利用25ng/mL纯化的北极狐激活素A处理60min可以诱导SMAD2或SMAD3磷酸化(图8)。

2.7北极狐激活素A对颗粒细胞类固醇生成的影响

为了进一步研究，北极狐激活素A在类固醇激素生成过程中的生物学作用，我们利用纯化的北极狐激活素A处理小鼠原代颗粒细胞24小时后，检测芳香化酶(CytochromeP450aromatase)以及StAR(Steroidogenic acute regulatory protein)的mRNA和蛋白质水平的变化。结果发现(图9)北极狐激活素A处理后的小鼠原代颗粒细胞芳香化酶的mRNA和蛋白质水平均上调，然而StAR的mRNA和蛋白质水平均下调。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院特产研究所

<120> 狐亚科激活素A蛋白及其制备与应用

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 424

<212> PRT

<213> Vulpes lagopus

<400> 1

Met Pro Leu Leu Trp Leu Arg Gly Phe Leu Val Ala Asn Cys Trp Ile

1 5 10 15

Ile Val Arg Ser Ser Pro Thr Pro Gly Pro Glu Gly Pro Gly Ala Ala

20 25 30

Pro Ala Cys Pro Ala Cys Ala Leu Thr Ala Leu Pro Arg Asp Ala Pro

35 40 45

Asn Ser Gln Pro Glu Met Val Glu Ala Val Lys Lys His Ile Leu Asn

50 55 60

Met Leu His Leu Lys Lys Arg Pro Glu Val Thr Gln Pro Val Pro Lys

65 70 75 80

Ala Ala Leu Leu Asn Ala Ile Arg Lys Leu His Val Gly Lys Val Gly

85 90 95

Glu Asn Gly Phe Val Glu Ile Glu Asp Asp Ile Gly Arg Arg Ala Glu

100 105 110

Met Asn Glu Leu Met Glu Gln Thr Ser Glu Ile Ile Thr Phe Ala Glu

115 120 125

Ser Gly Thr Ala Arg Lys Thr Leu His Phe Glu Ile Ser Lys Glu Gly

130 135 140

Ser Asp Leu Ser Val Val Glu Arg Ala Glu Val Trp Leu Phe Leu Lys

145 150 155 160

Val Pro Lys Ala Asn Arg Thr Arg Thr Lys Val Thr Ile Arg Leu Leu

165 170 175

Gln Lys His Pro Gln Gly Ser Leu Asp Ala Gly Glu Glu Ala Glu Asp

180 185 190

Met Gly Phe Pro Glu Glu Arg Asn Glu Val Leu Ile Ser Glu Lys Val

195 200 205

Val Asp Ala Arg Lys Ser Thr Trp His Ile Phe Pro Val Ser Ser Ser

210 215 220

Ile Gln Arg Leu Leu Asp Gln Gly Arg Ser Ser Leu Asp Val Arg Ile

225 230 235 240

Ala Cys Glu Gln Cys His Glu Thr Gly Ala Ser Leu Val Leu Leu Gly

245 250 255

Lys Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Gly Glu Gly Lys Lys Lys Asp Gly

260 265 270

Gly Asp Ala Gly Ala Gly Gly Asp Glu Asp Lys Glu Gln Ser His Arg

275 280 285

Pro Phe Leu Met Leu Gln Ala Arg Gln Ser Glu Asp His Pro His Arg

290 295 300

Arg Arg Arg Arg Gly Leu Glu Cys Asp Gly Lys Val Asn Ile Cys Cys

305 310 315 320

Lys Lys Gln Phe Phe Val Ser Phe Lys Asp Ile Gly Trp Asn Asp Trp

325 330 335

Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Gly Cys

340 345 350

Pro Ser His Ile Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Phe His Ser

355 360 365

Thr Val Ile Asn His Tyr Arg Leu Arg Gly His Ser Pro Phe Thr Asn

370 375 380

Leu Lys Ser Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu

385 390 395 400

Tyr Tyr Asp Asp Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met

405 410 415

Ile Val Glu Glu Cys Gly Cys Ser

420

<210> 2

<211> 1275

<212> DNA

<213> Vulpes lagopus

<400> 2

atgcccttgc tctggctgag aggattcttg gtggcgaatt gctggattat agtgcggagc 60

tccccgaccc cggggcccga ggggcccggc gcggcccccg cctgcccggc ctgcgcgctc 120

accgccctgc ccagggatgc ccccaactcc cagcccgaga tggtggaggc cgtcaagaag 180

cacatcctca acatgctgca cttgaagaag agacccgaag tcacccagcc ggtgcccaag 240

gcggcgcttc tgaacgcgat ccgcaagctg cacgtaggca aagtcgggga gaacgggttc 300

gtggagatcg aggatgacat cggcaggagg gcagaaatga atgaactcat ggagcagacc 360

tcggagatca tcacgttcgc ggaatcaggc acagccagga aaacgctgca ctttgagatt 420

tccaaagaag gcagtgacct gtcggtggtg gagcgtgcag aggtctggct cttcctcaaa 480

gtccccaagg ccaacaggac caggaccaaa gtcaccatcc ggctcttgca gaagcacccc 540

cagggcagct tggatgcggg ggaggaggcc gaggacatgg gcttcccgga ggagaggaac 600

gaggtgttga tttctgaaaa ggtggtggac gcccggaaga gcacctggca catcttccct 660

gtctccagca gcatccagcg cttgctggac cagggcagga gctccctgga cgttcggatt 720

gcctgcgagc agtgccacga gacgggcgcc agcctggtgc tcctgggcaa gaagaagaag 780

aaggaggagg agggggaagg gaagaagaag gacggaggag acgcaggggc cgggggggac 840

gaggacaagg agcagtccca cagacctttc ctcatgctgc aggcccgcca gtctgaagac 900

caccctcacc ggcggcggcg gcggggcctg gagtgtgacg gcaaggtcaa catctgctgt 960

aagaaacagt tctttgtgag cttcaaggac attggctgga acgactggat catcgccccc 1020

tccggctatc acgccaacta ctgcgagggt gggtgcccga gccacatagc aggcacgtcg 1080

gggtcctcgc tctcctttca ctcgaccgtc atcaaccact accgcctgcg gggtcacagc 1140

cccttcacca acctcaagtc gtgctgtgtg cccaccaagc tgagaccaat gtccatgctg 1200

tactacgatg atgggcaaaa catcatcaaa aaggacattc agaacatgat cgtggaggag 1260

tgcgggtgct catag 1275

<210> 3

<211> 1302

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggttttac tgtggctgag aggcttcctc gtcgccaact gctggatcat tgtgaggtcc 60

tcccctaccc ccggtcccga aggacccggt gctgctcccg cttgtcccgc ttgtgctctg 120

accgccctcc ctcgtgacgc tcctaacagc cagcccgaaa tggtggaggc tgtgaagaag 180

cacatcctca acatgctgca cctcaaaaag aggcccgagg tgacacagcc cgttcccaag 240

gctgctttat taaacgccat tcgtaagctg cacgtgggca aggtcggcga gaacggcttc 300

gtggagatcg aggacgatat cggcagaagg gccgagatga atgagctgat ggagcagaca 360

agcgagatca tcaccttcgc cgagagcggc acagccagaa agacactgca cttcgagatc 420

agcaaggaag gctccgattt atccgtggtg gaaagagccg aggtgtggct gtttttaaaa 480

gtgcctaagg ccaatcgtac tcgtacaaaa gtgaccattc gtctgctgca gaagcacccc 540

caaggttctt tagatgccgg agaggaagcc gaggacatgg gattccccga ggaaagaaac 600

gaggtgctga tctccgagaa ggtggtcgac gccagaaaga gcacttggca catcttcccc 660

gtttccagca gcatccagag gctgctggac caaggtagat cctctttaga cgtgagaatc 720

gcttgtgagc agtgccacga aaccggcgct agcctcgtgc tgttaggcaa aaagaagaaa 780

aaggaggagg aaggcgaggg caagaagaaa gacggaggcg atgctggagc cggaggagac 840

gaggacaagg aacagtccca tcgtcctttt ctgatgctgc aagctcgtca gagcgaggac 900

catcctcatc gtaggaggag aaggggcctc gagtgtgacg gcaaggtgaa catttgctgt 960

aaaaagcagt tcttcgtgag cttcaaggac atcggctgga acgactggat cattgccccc 1020

agcggctacc atgccaacta ctgcgagggc ggatgcccca gccacattgc tggcaccagc 1080

ggctcctctt tatccttcca ctccaccgtg atcaaccatt atcgtctgag aggccacagc 1140

cccttcacca atttaaaaag ctgttgtgtg cccacaaagc tgaggcccat gagcatgctc 1200

tactacgacg acggacaaaa tattatcaag aaagatatcc agaacatgat tgtcgaggaa 1260

tgcggctgta gcggcggagg aggcagcggc ggcggcggtt ct 1302

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttgctgccag gatgcccttg ct 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gggtgctcta tgagcacccg ca 22

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgggatcccg ataatggcct tgctctggc 29

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cggaattctg agcacccgca ctcc 24

Claims (10)

1.狐亚科激活素βA亚基，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.狐亚科激活素A蛋白，其由两个权利要求1所述的狐亚科激活素βA亚基组成。

3.分离的核酸，其编码权利要求1所述激活素βA亚基。

4.根据权利要求3所述的核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2或3所示。

5.载体，其包含权利要求3或4所述的核酸；

优选的，所述载体选自pEASY-Blunt Simple Cloning Vector和/或pcDNA4/myc-His。

6.宿主细胞，其被权利要求3或4所述的核酸或权利要求5所述的载体所转化；

优选的，所述宿主细胞选自CHO细胞系。

7.一种制备狐亚科激活素βA亚基或狐亚科激活素A蛋白的方法，其特征在于，包括：

在培养基中培养权利要求6所述的宿主细胞，从所培养的宿主细胞中回收如此产生的蛋白。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，从所培养的宿主细胞中回收的蛋白带有his tag，所述方法还包括将所述蛋白经亲和层析柱处理；

优选的，所述亲和层析柱的填充物为Ni-Agarose Resin填料。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在用所述亲和层析柱对所得蛋白进行处理时：

Binding Buffer用量为8～12倍柱体积，含有8～12mM咪唑，pH＝7.7～8.1；

Soluble Binding Buffe用量为13～17倍柱体积，含有18～22mM咪唑，pH＝7.7～8.1；

Soluble Elution Buffer含有480～520mM咪唑，pH＝7.7～8.1。

10.权利要求1所述的狐亚科激活素βA亚基，或权利要求2所述的狐亚科激活素A蛋白在制备调节犬科动物生理功能的药物中的应用；

所述生理功能包括：组织细胞生长调节，免疫调节，调节神经细胞分化，调节成骨细胞功能，调节红细胞生产，提高FSH受体的表达，降低LH诱导雄激素的生产，增强垂体分泌FSH的能力，促进卵泡发育和成熟，延缓卵泡闭锁和黄体化，促进超数排卵，控制同期发情中的一种或多种；

优选的，所述犬科动物为狐亚科动物。