CN109311990A - 使用CD32B x CD79B结合分子治疗炎症性疾病和病症的方法 - Google Patents

使用CD32B x CD79B结合分子治疗炎症性疾病和病症的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及使用双特异性结合分子的方法，所述双特异性结合分子具有对于CD32B的表位特异性的结合位点和对于CD79B的表位特异性的结合位点，从而能够同时结合至CD32B和CD79B。本发明尤其涉及这样的分子，所述分子是双特异性抗体或双特异性双抗体(尤其是另外包含Fc结构域的这类双抗体)。本发明涉及这类分子的用途以及涉及包含这类分子的药物组合物在治疗炎症性疾病或病况中的用途。

Description

使用CD32B x CD79B结合分子治疗炎症性疾病和病症的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求美国专利申请系列第62/346,717号(2016年6月7日提交；待决)和第62/432,328号(2016年12月9日提交；待决)的优先权，上述申请中的每一个通过引用以其整体并入本文。
序列表的参考
根据37C.F.R.1.821以及下面的条款，本申请包括一个或多个序列表，其以计算机-可读介质(文件名：1301_0145PCT_ST25.txt，2017年5月19日创建，并且大小为59,748字节)公开，该文件通过引用以其整体并入本文。
发明背景
技术领域
本发明涉及使用双特异性结合分子的方法，所述双特异性结合分子具有对于CD32B的表位特异性的结合位点和对于CD79B的表位特异性的结合位点，从而能够同时结合至CD32B和CD79B。本发明尤其涉及这类分子，所述分子是双特异性抗体或双特异性双抗体(尤其是另外包含Fc结构域的这类双抗体)。本发明涉及这类分子的用途，并且涉及含有这类分子的药物组合物在治疗炎症性疾病或病况中的用途。
现有技术描述
I.Fcγ受体和CD32B
抗体-抗原复合物与免疫系统细胞的相互作用产生各种各样的应答，应答的范围从效应功能诸如抗体依赖性细胞毒性、肥大细胞脱粒和噬菌到诸如调节淋巴细胞增殖和抗体分泌的免疫调节信号。所有这些相互作用通过抗体或免疫复合物的Fc结构域与造血细胞上特化的细胞表面受体的结合而引发。经抗体和免疫复合物触发的细胞应答的多样性由Fc受体的结构异质性造成。Fc受体共享据推测介导细胞内信号传导的结构上相关的配体结合结构域。
Fc受体是蛋白质的免疫球蛋白基因超家族的成员。它们是能够结合免疫球蛋白分子的Fc部分的表面糖蛋白。每一个家族成员均通过Fc受体α链上的识别结构域而识别具有一种或多种同种型的免疫球蛋白。
Fc受体通过其对免疫球蛋白亚型的特异性来定义(见，Ravetch J.V.等(1991)“FcReceptors,”Annu.Rev.Immunol.9:457-92；Gerber J.S.等(2001)“Stimulatory AndInhibitory Signals Originating From The Macrophage FcγReceptors,”Microbesand Infection,3:131-139；Billadeau D.D.等(2002)“ITAMs Versus ITIMs:Striking ABalance During Cell Regulation,”J.Clin.Invest.2(109):161-168l；Ravetch J.V.等(2000)“Immune Inhibitory Receptors,”Science 290:84-89；Ravetch J.V.等(2001)“IgG Fc Receptors,”Annu.Rev.Immunol.19:275-90；Ravetch J.V.(1994)“FcReceptors:Rubor Redux,”Cell,78(4):553-60)。
能够结合至IgG抗体的Fc受体称为“FcγR”。该家族的每一个成员均是膜内在糖蛋白，具有与免疫球蛋白相关结构域的C2-组有关的细胞外结构域、一个跨膜结构域和具有可变长度的细胞质内结构域。存在三种已知FcγR，命名为FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。这三种受体由不同的基因编码；然而，这三个家族成员之间广泛的同源性提示，它们可能由于基因复制而源于共同的祖先。
FcγRII(CD32)蛋白质是40KDa膜内在糖蛋白，由于对单体Ig低的亲和力(106M-1)，其仅结合复合的IgG。该受体是所有造血细胞，包括单核细胞、巨噬细胞、B细胞、NK细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞和血小板上存在的最广泛表达的FcγR。FcγRII在其免疫球蛋白结合链中仅具有两个免疫球蛋白样区域，因此相比FcγRI对IgG的亲和力低很多。存在三种人类FcγRII基因(FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIC(CD32C))，其均结合聚集体或免疫复合物中的IgG。
FcγRIIA和FcγRIIB细胞质结构域中的明显差异产生了对受体连接的两种功能上异质的应答。根本的差异是，在结合至IgG Fc区域之后，FcγRIIA同等型引发细胞内信号传导，导致免疫系统激活(例如，吞噬、呼吸爆发等)，然而，在结合至IgG Fc区域之后，FcγRIIB同等型引发信号，该信号导致免疫系统的阻抑或抑制(例如，抑制B细胞激活等)。
这类激活信号和抑制信号在连接至IgG Fc区域之后经FcγR转导。这些完全相反的功能由不同受体同等型之间的结构差异造成。受体的细胞质信号传导结构域中的两个不同结构域称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)或基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，其是造成不同应答的原因。将不同细胞质酶招募至这些结构决定了FcγR-介导的细胞应答的结果。含有ITAM的FcγR复合物包括FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA，而含有ITIM的复合物仅包括FcγRIIB。
人类嗜中性粒细胞表达FcγRIIA基因。经免疫复合物或特定抗体交联而成簇的FcγRIIA用于聚集ITAM以及促进ITAM磷酸化的受体相关的激酶。ITAM磷酸化用作Syk激酶的泊靠位点，所述Syk激酶的激活导致下游底物(例如，PI3K)的激活。细胞激活导致促炎介质的释放。
FcγRIIB基因在B淋巴细胞上表达；它的细胞外结构域与FcγRIIA具有96％同一性，并且以不能区分的方式结合IgG复合物。ITIM在FcγRIIB细胞质结构域中的存在定义了该FcγR抑制亚类。已经确定了该抑制的分子基础。当FcγRIIB经由免疫复合物的IgG免疫球蛋白的Fc区域共连接至激活受体时，FcγRIIB ITIM成为磷酸化的，并且吸引肌醇聚磷酸盐5’-磷酸酶(SHIP)的SH2结构域，肌醇聚磷酸盐5’-磷酸酶(SHIP)水解由于含ITAM的FcγR介导的酪氨酸激酶激活而释放的磷酸肌醇信使，从而防止细胞内Ca++的流入。因此，FcγRIIB与激活受体的这类交联阻抑激活受体的活性，从而抑制细胞应答。因此，在B细胞上，B细胞激活、B细胞增殖和抗体分泌受到阻抑或被中止。因此，在开始进行抗原检测时，发生单体IgG-抗原键合，并且，结合的抗体的Fc区域结合至激活FcγR的ITAM，从而介导免疫系统的激活。随着宿主的应答发展，形成了多聚体IgG-抗原免疫复合物，其能够结合至FcγRIIB(从而共连接此类复合物与激活受体)，导致免疫应答的阻抑和最后中断(见，例如，美国专利号：8,445,645；8,217,147；8,216,579；8,216,574；8,193,318；,192,737；8,187,593；8,133,982；8,044,180；8,003,774；7,960,512；7,786,270；7,632,497；7,521,542；7,425,619；7,355,008和美国专利申请号：2012/0276094；2012/0269811；2012/0263711；2012/0219551；2012/0213781；2012/0141476；2011/0305714；2011/0243941；2010/0322924；2010/0254985；2010/0196362；2010/0174053；2009/0202537；2009/0191195；2009/0092610；2009/0076251；2009/0074771；2009/0060910；2009/0053218；2009/0017027；2009/0017026；2009/0017023；2008/0138349；2008/0138344；2008/0131435；2008/0112961；2008/0044429；2008/0044417；2007/0077246；2007/0036799；2007/0014795；2007/0004909；2005/0260213；2005/0215767；2005/0064514；2005/0037000；2004/0185045)。
II.B细胞受体和CD79B
B细胞是负责产生抗体的免疫系统细胞。另外，B细胞呈递抗原并分泌细胞因子。B细胞对抗原的应答是正常免疫系统的必要组分。B细胞具有特化的细胞表面受体(B细胞受体；“BCR”)。如果B细胞遇到能够结合至该细胞的BCR的抗原，则B细胞会被刺激以增殖和产生对结合的抗原特异性的抗体。为了产生针对抗原有效的应答，还需要BCR相关蛋白质和T细胞协助。抗原/BCR复合物被内化，并且抗原经蛋白水解被加工。一小部分抗原保持与B细胞表面上的主要组织相容性复合物-II(“MHC-II”)类分子复合，其中复合物可由T细胞识别。经由此类抗原呈递激活的T细胞分泌CD40L和诱发B细胞成熟的多种淋巴因子。
通过BCR的信号传导在抗体产生、在自身免疫性和在建立免疫学耐受性方面发挥重要的作用(Gauld,S.B.等(2002)“B Cell Antigen Receptor Signaling:Roles In CellDevelopment And Disease,”Science296(5573):1641-1642)。结合自身抗原并仍然在骨髓中的非成熟B细胞通过细胞凋亡被消除。相比之下，成熟B细胞上结合的抗原导致激活、增殖、无反应性和细胞凋亡。观察到的具体功能应答取决于B细胞是否通过被激活的其它表面受体和特定信号转导通路来接收共刺激信号。
BCR由膜免疫球蛋白构成，其与CD79的非共价结合的α和β亚基(分别为“CD79a”和“CD79B”)一起形成BCR复合物。CD79a和CD79B为信号转导亚基，其包含信号转导所需的保守的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(“ITAM”)(Dylke,J.等(2007)“Role of theextracellular and transmembrane domain of Ig-alpha/beta in assembly of the Bcell antigen receptor(BCR),”Immunol.Lett.112(1):47-57；Cambier,J.C.(1995)“NewNomenclature For The Reth Motif(or ARH1/TAM/ARAM/YXXL),”Immunol.Today 16:110)。由多价抗原导致的BCR复合物的聚集引发CD79a和CD79B ITAM的转磷酸化和受体相关的激酶的激活(DeFranco,A.L.(1997)“The Complexity Of Signaling PathwaysActivated By The BCR,”Curr.Opin.Immunol.9:296-308；Kurosaki,T.(1997)“MolecularMechanisms In B-Cell Antigen Receptor Signaling,”Curr.Opin.Immunol.9:309-318；Kim,K.M.等(1993)“Signalling Function Of The B-Cell Antigen Receptors,”Immun.Rev.132:125-146)。磷酸化的ITAM招募额外的效应子，如PI3K、PLC-γ和Ras/MAPK通路的成员。这些信号传导事件是造成B细胞增殖和激活标志物(诸如MHC-II和CD86)的表达增加的原因，所述激活标志物是使B细胞致敏以便它们随后与T-辅助细胞(“Th”)相互作用所需要的。
III.炎症性疾病或病况
炎症是身体的白血细胞和化学物质保护我们的身体免受外来物质诸如细菌和病毒的感染的过程。炎症的特征通常是受影响区域的疼痛、肿胀、发热和发红。已知作为细胞因子和前列腺素的化学物质控制该过程，并且以有序和自限制的级联方式释放到血液或受影响的组织中。这种化学物质的释放增加了血液向损伤区域或感染区域的流量，并且可导致发红和发热。一些化学物质致使流体渗漏到组织中，导致肿胀。这种保护性过程可以刺激神经和引起疼痛。当在相关区域中发生有限的时间时，这些变化为身体的益处发挥作用。
炎症性疾病或病况反映了免疫系统对身体自身细胞和组织的攻击(即“自身免疫”应答)。存在以不同方式影响身体的许多不同自身免疫性病症。例如，在患有多发性硬化症的个体中大脑受到影响，在患有克罗恩病的个体中肠受到影响，并且在患有类风湿性关节炎的个体中各种关节的滑膜、骨骼和软骨受到影响。随着自身免疫性病症发展，可导致一种或多种类型的身体组织的破坏、器官的异常生长或器官功能的变化。自身免疫性病症可只影响一个器官或一种组织类型，或可影响多个器官和多种组织。通常受到自身免疫性病症影响的器官和组织包括红细胞、血管、结缔组织、内分泌腺(例如甲状腺或胰腺)、肌肉、关节和皮肤。自身免疫性病症的实例包括但不限于阿狄森氏病、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病、重症肌无力、克罗恩病、皮肌炎、家族性腺瘤性息肉病、移植物抗宿主病(GvHD)、格雷夫斯病、桥本氏甲状腺炎、红斑狼疮、多发性硬化症(MS)；恶性贫血、赖特氏综合征、类风湿性关节炎(RA)、斯耶格伦氏综合佂、系统性红斑狼疮(SLE)、1型糖尿病、原发性血管炎(例如，风湿性多肌痛、巨细胞动脉炎、白塞病天疱疮、视神经脊髓炎、抗NMDA受体脑炎、格-巴二氏综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、格雷夫斯眼病、IgG4相关疾病、原发性血小板减少性紫癜(ITP)和溃疡性结肠炎。
当身体的正常保护性免疫系统通过攻击外来细胞或组织(其存在有益于身体)(例如，排斥移植物(宿主抗宿主疾病))而引起损害时也产生炎症性疾病或病况，或者由于引入的移植移植物的免疫活性细胞对免疫抑制宿主的细胞的排斥(移植物抗宿主病)也产生炎症性疾病或病况(DePaoli,A.M.等(1992)“Graft-Versus-Host Disease And LiverTransplantation,”Ann.Intern.Med.117:170-171；Sudhindran,S.等(2003)“TreatmentOf Graft-Versus-Host Disease After Liver Transplantation With BasiliximabFollowed By Bowel Resection,”Am J Transplant.3:1024-1029；Pollack,M.S.等(2005)“Severe,Late-Onset Graft-Versus-Host Disease In A Liver Transplant RecipientDocumented By Chimerism Analysis,”Hum.Immunol.66:28-31；Perri,R.等(2007)“GraftVs.Host Disease After Liver Transplantation:A New Approach Is Needed,”LiverTranspl.13:1092-1099；Mawad,R.等(2009)“Graft-Versus-Host Disease PresentingWith Pancytopenia After En Bloc Multiorgan Transplantation:Case Report AndLiterature Review,”Transplant Proc.41:4431-4433；Akbulut,S.等(2012)“Graft-Versus-Host Disease After Liver Transplantation:A Comprehensive LiteratureReview,”World J.Gastroenterol.18(37):5240-5248。
尽管最近在治疗这类疾病或病况方面的进步，但对于能够治疗或预防炎症性疾病或病况的组合物仍存在需要。
IV.双特异性结合分子
A.双特异性抗体
未修饰的天然抗体(例如，IgG)结合抗原的表位的能力取决于免疫球蛋白轻链和重链上可变结构域(即，其轻链可变结构域(VL结构域)和其重链可变结构域(VH结构域))的存在和形成抗体的表位结合位点的相互作用。由于仅存在单一种类的轻链和单一种类的重链，因此天然抗体能够仅仅结合一个表位种类(即，它们是单特异性的)，但是它们可结合该种类的多个拷贝(即，展示双价或多价)。
然而，本领域已经例如通过如下手段成功地产生了双特异性抗体：共表达具有不同表位特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对，接下来利用亲和色谱法纯化期望的分子，如Milstein等(1983)“Hybrid Hybridomas And Their Use In Immunohistochemistry,”Nature 305:537-39、WO 93/08829描述的。在不同方法中，已经将具有期望的结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变结构域融合至免疫球蛋白恒定结构域序列，例如融合至重链恒定结构域(包含至少一部分铰链区、CH2区和CH3区)。可将编码这些融合物的核酸插入到相同表达载体或不同表达载体中，并在合适的宿主有机体中表达。双特异性抗体由例如以下文献综述：Traunecker等(1991)“Bispecific Single Chain Molecules(Janusins)Target Cytotoxic Lymphocytes On HIV Infected Cells,”EMBO J.10:3655-3659；Zhukovsky,E.A.等(2016)“Bispecific Antibodies And Cars:GeneralizedImmunotherapeutics Harnessing T Cell Re方向,”Curr.Opin.Immunol.40:24-35；Kiefer,J.D.等(2016)“Immunocytokines And Bispecific Antibodies:TwoComplementary Strategies For The Selective Activation Of Immune Cells At TheTumor Site,”Immunol.Rev.270(1):178-192；Solimando,A.G.等(2016)“Targeting B-Cell Non Hodgkin Lymphoma:New And Old Tricks,”Leuk.Res.42:93-104；Fan,G.等(2015)“Bispecific Antibodies And Their Applications,”J.Hematol.Oncol.8:130；Grandjenette,C.等(2015)“Bispecific Antibodies:An Innovative Arsenal To Hunt,Grab And Destroy Cancer Cells,”Curr.Pharm.Biotechnol.16(8):670-683；-Prado,N.等(2015)“The Coming Of Age Of Engineered Multivalent Antibodies,”DrugDiscov.Today 20(5):588-594；and Kontermann,R.E.等(2015)“BispecificAntibodies,”Drug.Discov.Today 20(7):838-847。
除了完整的双特异性抗体以外，本领域还开发了双特异性单链抗体衍生物(例如，双特异性T细胞衔接体(Engager)(BiTE))，其由具有针对第一结合分子的VL和VH结构域和针对第二结合分子的VL和VH结构域的单多肽链构成(例如，美国专利号7,112,324、7,235,641、7,575,923、7,919,089；Wu,J.等(2015)“Blinatumomab:A Bispecific T CellEngager(BiTe)Antibody Against CD19/CD3For Refractory Acute LymphoidLeukemia,”J.Hematol.Oncol.8:104；Lutterbuese,R.等(2008)“Conversion OfCetuximab,Panitumumab,Trastuzumab And Omalizumab Into T-Cell-Engaging BiteAntibodies Creates Novel Drug Candidates Of High Potency,”Proc.Am.Assoc.Cancer Res 99:Abs 2402；Baeuerle,P.A.等(2009)“Bispecific T-CellEngaging Antibodies For Cancer Therapy,”Cancer Res.69(12):4941-4944。
B.双特异性双抗体
本领域已经指出产生在能够结合两种或多种不同表位种类(即除了二价或多价外还展示双特异性或多特异性)方面不同于天然抗体的双抗体的能力。双抗体的设计基于单链Fv构建体(scFv)，其具有由间插连接体分隔的VL结构域和相应的VH结构域，这允许这类结构域彼此相互作用。在由于使用了长度不足(小于约12个氨基酸残基)的连接体而使VL和VH结构域的相互作用变得不可能的情况下，两个这类scFv构建体可彼此相互作用形成双价双抗体分子，在所述双价双抗体分子中，一条链的VL结构域与另一条链的VH结构域缔合(在以下文献中综述：Marvin等(2005)“Recombinant Approaches To IgG-Like BispecificAntibodies,”Acta Pharmacol.Sin.26:649-658；Holliger等(1993)“’Diabodies’:SmallBivalent And Bispecific Antibody Fragments,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)90:6444-6448；US 2004/0058400(Holliger等)；US 2004/0220388(Mertens等)；Mertens,N.等,“New Recombinant Bi-and Trispecific Antibody Derivatives,”在NovelFrontiers In The Production Of Compounds For Biomedical Use中,A.VanBroekhoven等(编辑),Kluwer Academic Publishers,Dordrecht,The Netherlands(2001),第195-208页；Alt等(1999)FEBS Lett.454(1-2):90-94；Lu,D.等(2005)“A Fully HumanRecombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth FactorReceptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced AntitumorActivity,”J.Biol.Chem.280(20):19665-19672；WO 02/02781(Mertens等)；Olafsen,T.等(2004)“Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-SpecificConjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,”ProteinEng.Des.Sel.17(1):21-27；Wu,A.等(2001)“Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20Single Chain Fv-Fc Fusion Protein Is Mediated Through Variable DomainExchange,”Protein Engineering14(2):1025-1033；Asano等(2004)“A Diabody ForCancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human FcRegion,”Abstract 3P-683,J.Biochem.76(8):992；Takemura,S.等(2000)“ConstructionOf A Diabody(Small Recombinant Bispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588；Baeuerle,P.A.等(2009)“Bispecific T-Cell EngagingAntibodies For Cancer Therapy,”Cancer Res.69(12):4941-4944)。
非单特异性双抗体的供给带来了明显优势：共连接和共定位表达不同表位的细胞的能力。二价双抗体因此具有广泛的应用，包括治疗和免疫诊断。二价使得在各种应用中设计和工程化改造双抗体时具有很大的灵活性，提供了对多聚抗原增强的亲合力、不同抗原的交联、以及依赖于两个靶抗原的存在而对特定细胞类型的定向靶向。由于它们提高的价、低解离速率以及从循环中快速清除(对于小尺寸的双抗体，为约50kDa或低于约50kDa)，本领域已知的双抗体分子还在肿瘤造影领域显示出特定用途(Fitzgerald等(1997)“Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed InPichia pastoris,”Protein Eng.10:1221)。特别重要的是不同细胞的共连接，例如细胞毒性T细胞与肿瘤细胞的交联(Staerz等(1985)“Hybrid Antibodies Can Target Sites ForAttack By T Cells,”Nature 314:628-631；和Holliger等(1996)“Specific Killing OfLymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,”ProteinEng.9:299-305)。
双抗体表位结合结构域也可以被引导至在T淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞或其它单核细胞上表达的任何免疫效应细胞的表面决定簇，诸如CD3、CD16、CD32或CD64。在许多研究中，还发现与效应细胞决定簇例如Fcγ受体(FcγR)结合的双抗体激活效应细胞(Holliger等(1996)“Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-CellsMediated By A Bispecific Diabody,”Protein Eng.9:299-305；Holliger等(1999)“Carcinoembryonic Antigen(CEA)-Specific T-cell Activation In Colon CarcinomaInduced By Anti-CD3x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7x Anti-CEABispecific Fusion Proteins,”Cancer Res.59:2909-2916；WO 2006/113665；WO 2008/157379；WO 2010/080538；WO 2012/018687；WO 2012/162068)。通常，效应细胞激活通过抗原结合抗体与效应细胞经Fc-FcγR相互作用的结合而触发；因此，就这一点而言，本发明的双抗体分子可不依赖它们是否包含Fc结构域而展示Ig样功能(例如如在本领域已知的任何效应功能测定中测定的或本文示例的(例如ADCC测定))。通过交联肿瘤细胞和效应细胞，双抗体不仅使效应细胞临近肿瘤细胞，而且还导致有效的肿瘤杀伤(见例如，Cao等(2003)“Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics,”Adv.Drug.Deliv.Rev.55:171-197)。
然而，实现上述优势需要很高的成本。这类非单特异性双抗体的形成需要成功组装两条或更多条独特而不同的多肽(即这样的形成要求双抗体通过不同多肽链种类的异源二聚化而形成)。这一事实与单特异性双抗体相反，其通过相同多肽链的同源二聚化而形成。因为为了形成非单特异性双抗体，必须提供至少两条不同的多肽(即两条多肽种类)，且因为这类多肽的同源二聚化导致无活性分子(Takemura,S.等(2000)“Construction Of ADiabody(Small Recombinant Bispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588)，因此这类多肽的产生必须以防止相同种类多肽之间的共价结合的方式实现(Takemura,S.等(2000)“Construction Of A Diabody(SmallRecombinant Bispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588)。因此，现有技术教导了这类多肽的非共价缔合(见例如，Olafsen等(2004)“Covalent Dissulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific ConjugationAnd Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,”Prot.Engr.Des.Sel.17:21-27；Asano等(2004)“A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its FunctionalEnhancement By Fusion Of Human Fc Region,”Abstract 3P-683,J.Biochem.76(8):992；Takemura,S.等(2000)“Construction Of A Diabody(Small RecombinantBispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588；Lu,D.等(2005)“A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both TheEpidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor ReceptorFor Enhanced Antitumor Activity,”J.Biol.Chem.280(20):19665-19672)。
然而，本领域已经认识到，由非共价缔合的多肽构成的双特异性双抗体不稳定，且易于解离成非功能性单体(见例如，Lu,D.等(2005)“A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And TheInsulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,”J.Biol.Chem.280(20):19665-19672)。
在面对这种挑战时，本领域已经成功地开发了稳定的、共价结合的异源二聚非单特异性双抗体(见例如，WO 2006/113665；WO 2008/157379；WO 2010/080538；WO 2012/018687；WO 2012/162068；Johnson,S.等(2010)“Effector Cell Recruitment With NovelFv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor CytolysisAnd In Vivo B-Cell Depletion,”J.Molec.Biol.399(3):436-449；Veri,M.C.等(2010)“Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma ReceptorIIb(CD32B)Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold,”Arthritis Rheum.62(7):1933-1943；Moore,P.A.等(2011)“Application Of DualAffinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell KillingOf B-Cell Lymphoma,”Blood 117(17):4542-4551；Chen,X.等(2016)“MechanisticProjection Of First In Human Dose For Bispecific Immuno-Modulatory P-CadherinLP-DART-An Integrated PK/PD Modeling Approach,”Clin.Pharmacol.Ther.doi:10.1002/cpt.393；Tsai,P.等(2016)“CD19xCD3DART Protein Mediates Human B-CellDepletion In Vivo In Humanized BLT Mice,”Mol.Ther.Oncolytics.3:15024；Root等(2016)“Development of PF-06671008,a Highly Potent Anti-P-cadherin/Anti-CD3Bispecific DART Molecule with Extended Half-Life for the Treatment ofCancer,”Antibodies 5:6；Sloan,D.D.等(2015)“Targeting HIV Reservoir in InfectedCD4T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules(DARTs)that Bind HIVEnvelope and Recruit Cytotoxic T Cells,”PLoS Pathog.11(11):e1005233；Al-Hussaini,M.等(2016)“Targeting CD123In Acute Myeloid Leukemia Using A T-Cell-Directed Dual-Affinity Retargeting Platform,”Blood127(1):122-131)；Chichili,G.R.等(2015)“A CD3xCD123Bispecific DART For Redirecting Host T Cells ToMyelogenous Leukemia:Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates,”Sci.Transl.Med.7(289):289ra82；Zanin,M.等(2015)“An Anti-H5N1Influenza VirusFcDART Antibody Is A Highly Efficacious Therapeutic Agent And ProphylacticAgainst H5N1Influenza Virus Infection,”J.Virol.89(8):4549-4561)。这类方法涉及将一个或多个半胱氨酸残基工程化到每一种应用的多肽种类中。例如，已经证明向这类构建体的C末端添加半胱氨酸残基允许多肽链之间的二硫键合，从而稳定了所得的异源二聚体而不干扰二价分子的结合特性。
基于这些成就，本领域已经产生了一种双特异性二价双抗体MGD010，其共连接抑制性Fcγ受体IIb(CD32B)和B细胞上的B细胞受体(BCR)组分CD79B，以便能够同时结合CD32B和CD79B(Chen,W.(2014)“Development Of Human B-Lymphocyte Targeted Bi-SpecificMolecules For The Treatment Of Autoimmune Disorders,”J.Immunol.192(1Supp.):200.9)(图1A)。本发明涉及用于使用和施用MGD010和其它CD32Bx CD79B双特异性分子，尤其是包含Fc结构域的这类双特异性分子的改进的方法。
发明内容
本发明涉及使用双特异性结合分子的方法，所述双特异性结合分子具有对于CD32B的表位特异性的结合位点和对于CD79B的表位特异性的结合位点，并因此能够同时结合至CD32B和CD79B。本发明尤其涉及这类分子，所述分子是双特异性抗体(即，“CD32B xCD79B抗体”)或双特异性双抗体(即，“CD32B x CD79B双抗体”，尤其是另外包含Fc结构域的这类双抗体(即，“CD32B x CD79B Fc双抗体”)。本发明涉及这类分子的用途，并涉及包含这类分子的药物组合物在治疗炎症性疾病或病况中的用途。
详细地，本发明提供了一种治疗炎症性疾病或病况的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用治疗有效量的CD32B x CD79B结合分子，其中所述CD32B x CD79B结合分子能够免疫特异性结合CD32B的表位和CD79B的表位，并且其中所述CD32B x CD79B结合分子以大约3mg/kg和大约30mg/kg之间的剂量以及以每周一个剂量和每8周一个剂量之间的剂量方案被施用。
本发明还涉及一种降低或抑制免疫应答的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用治疗有效量的CD32B x CD79B结合分子，其中所述CD32B x CD79B结合分子能够免疫特异性结合CD32B的表位和CD79B的表位，并且其中所述CD32B x CD79B结合分子以大约3mg/kg和大约30mg/kg之间的剂量以及以每周一个剂量和每8周一个剂量之间的剂量方案被施用。
本发明还涉及这类方法的实施方案，其中所述CD32B x CD79B结合分子以大约3mg/kg的剂量被施用，其中所述CD32B x CD79B结合分子以大约10mg/kg的剂量被施用，或其中所述CD32B x CD79B结合分子以大约30mg/kg的剂量被施用。
本发明还涉及这类方法的实施方案，其中所述剂量方案是每2周一个剂量(Q2W)，其中所述剂量方案是每3周一个剂量(Q3W)，或其中所述剂量方案是每4周一个剂量(Q4W)。
本发明还涉及这类方法的实施方案，其中所述CD32B x CD79B结合分子是结合CD32B的表位和CD79B的表位的双特异性抗体，或包含该双特异性抗体的CD32B-和CD79B-结合结构域的分子。
本发明还涉及这类方法的实施方案，其中所述CD32B x CD79B结合分子是结合CD32B的表位和CD79B的表位的CD32B x CD79B双特异性双抗体，尤其地，其中所述CD32B xCD79B双特异性双抗体是CD32B x CD79B双特异性Fc双抗体。
本发明还涉及这类方法的实施方案，其中所述炎症性疾病或病况是自身免疫性疾病，尤其地，其中所述自身免疫性疾病选自：阿狄森氏病、自身免疫性肝炎、自身免疫内耳疾病、重症肌无力、克罗恩病、皮肌炎、家族性腺瘤性息肉病、移植物抗宿主病(GvHD)、格雷夫斯病、桥本氏甲状腺炎、红斑狼疮、多发性硬化症(MS)；恶性贫血、赖特氏综合征、类风湿性关节炎(RA)、斯耶格伦氏综合佂、系统性红斑狼疮(SLE)、1型糖尿病、原发性血管炎(例如，风湿性多肌痛、巨细胞动脉炎、白塞病)、天疱疮、视神经脊髓炎、抗NMDA受体脑炎、格-巴二氏综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、格雷夫斯眼病、IgG4相关疾病、原发性血小板减少性紫癜(ITP)和溃疡性结肠炎。本发明尤其涉及这类方法的实施方案，其中所述炎症性疾病或病况是GvHD、MS、RA或SLE。
本发明还涉及这类方法的实施方案，其中所述免疫球蛋白的血清水平在施用第一剂量的CD32B x CD79B结合分子之后第36天降低。本发明尤其涉及这类方法的实施方案，其中免疫球蛋白是IgM、IgA或IgG。
本发明还涉及这类方法的实施方案，其中BCR介导的外周B细胞激活在施用单剂量的CD32B x CD79B结合分子之后第24小时受到抑制，其中所述B细胞激活通过离体钙动员测定而确定。本发明尤其涉及这类方法的实施方案，其中BCR介导的B细胞激活受到至少50％的抑制，并且其中所述抑制维持至少6天。
本发明还涉及这类方法的实施方案，其中在施用第一剂量的所述CD32B x CD79B结合分子之后6小时，外周B细胞上至少20％的CD32B x CD79B结合位点被占据。
本发明还涉及这类方法的实施方案，其中受试者是人类。
本发明尤其涉及所有这类方法的实施方案，其中所述CD32B x CD79B结合分子包含：
(A)VLCD32B结构域，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；
(B)VHCD32B结构域，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；
(C)VLCD79B结构域，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
(D)VHCD79B结构域，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
本发明还涉及这类方法的实施方案，其中所述CD32B x CD79B Fc双抗体包含：
(A)第一多肽链，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
(B)第二多肽链，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；
(C)第三多肽链，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。
附图说明
图1提供由两条多肽链构成的、共价结合的代表性双抗体的示意图，所述双抗体具有两个表位结合结构域，每条多肽链具有E-螺旋或K-螺旋异源二聚体促进结构域(可选的异源二聚体促进结构域在下面提供)。半胱氨酸残基可存在于连接体中和/或存在于异源二聚体促进结构域中，如图3A/3B所示。识别相同表位的VL和VH结构域使用相同阴影或填充式样显示。
图2提供由两条多肽链构成的、共价结合的代表性双抗体分子的示意图，所述双抗体分子具有两个表位结合结构域，每条多肽链具有CH2和CH3结构域，以便缔合的链形成全部的Fc区域或形成一部分Fc区域。识别相同表位的VL和VH结构域使用相同阴影或填充式样显示。
图3A-3E提供由三条多肽链构成的、共价结合的代表性双抗体分子的示意图，所述双抗体分子具有两个表位结合结构域。显示了CH2-CH3结构域的两个取向(图3A/3B对比图3C/3D)。多肽链中的两条具有CH2和CH3结构域，以便缔合的链形成全部的F区域或形成一部分Fc区域。包含VL和VH结构域的多肽链各自进一步包含异源二聚体促进结构域，并且经存在于连接体中的半胱氨酸残基(图3A和3C)或存在于异源二聚体促进结构域中的半胱氨酸残基(图3D和3B)之间形成的二硫键彼此共价结合。图3E图解具有图3A所示结构域取向的示例性CD32B x CD79B Fc双抗体的结构和功能。图3E所示双抗体是共价结合的复合物，其包含图3A的双抗体的三条多肽链，但不没有任选存在的异源二聚体促进结构域。复合物包括包含CH2和CH3IgG重链结构域的Fc结构域和对于CD32B和对于CD79B特异性的结合结构域。识别相同表位的VL和VH结构域使用相同阴影或填充式样显示。
图4图解了一种示例性机制，通过该机制，本发明的双抗体可介导它们对免疫系统的抑制。如图所示，本发明的双抗体能够同时结合至BCR的CD79B分子和结合至B细胞的CD32B分子，从而彼此共连接这类分子。这类共连接用于允许CD32B分子的ITIM成为磷酸化的，并且吸引肌醇聚磷酸盐5’-磷酸酶(SHIP)的SH2结构域，肌醇聚磷酸盐5’-磷酸酶(SHIP)水解由于ITAM-介导的酪氨酸激酶激活而释放的磷酸肌醇信使。这类水解抑制ITAM激活信号，从而用于减弱B细胞激活。
图5显示优选的CD32B x CD79B Fc双抗体在鼠科模型中降低体内异源GvHD的能力。
图6显示示例性CD32B x CD79B结合分子在施用至人类受试者之后的体内药代动力学。
图7概括了示例性CD32B x CD79B结合分子在施用至人类受试者之后在研究过程中与外周B细胞的体内结合的离体流式细胞术分析。
图8A-8D显示在施用示例性CD32B x CD79B结合分子至人类受试者之后在研究过程中的外周B细胞和T细胞群体，如通过离体流式细胞术分析测定的。
图9A-9D显示B细胞功能研究的方法和结果。图9A-9B图解离体钙动员测定的离体实验程序和数据分析方法，所述离体钙动员测定用于评估示例性CD32B x CD79B结合分子的接受者的B细胞功能。图9C-9D显示在施用示例性CD32B x CD79B结合分子至人类受试者之后在研究过程中峰值响应的降低(图9C)和整体响应的持续降低，如通过曲线下面积所测量的(AUC；图9D)。
图10A-10C显示在研究过程中施用CD32B x CD79B结合分子下调人类受试者CD27+记忆B细胞上的BCR表达。图10A：膜结合的IgG(mIgG)；图10B：膜结合的IgM；图10C：膜结合的IgD(mIgD)。数据以平均值±SEM呈现。
图11A-11C显示在研究过程中施用CD32B x CD79B结合分子下调人类受试者CD27-初始B细胞上的BCR表达。图11A：膜结合的IgD(mIgD)；图11B：膜结合的IgM；图11C：膜结合的IgM(mIgM)的百分比变化。膜结合的免疫球蛋白水平经流式细胞术测定。数据以平均值±SEM呈现。
图12A-12C显示在研究过程中施用CD32B x CD79B结合分子调节人类受试者的血清Ig水平。图12A：血清IgM；图12B：血清IgA；图12C：血清IgG。血清免疫球蛋白IgA、IgG和IgM水平经ELISA测定。数据以平均值±SEM呈现。
图13显示施用CD32B x CD79B结合分子降低共刺激分子CD40的水平，如通过外周B细胞的表面共刺激分子的离体流式细胞术分析测定的。数据以平均值±SEM呈现。
图14A-14B显示实施例1的示例性CD32B x CD79B Fc双抗体的离体饱和Emax PK/PDB细胞结合研究的数据(以两个不同浓度范围)。在线性-线性和对数-线性尺度上对数据进行图解评估。
图15A-15F通过人类中叠加的CD32B x CD79B结合分子药代动力学曲线描绘了临床前靶浓度，以确定可实现靶浓度的剂量。在图15A-15F中，y-轴是CD32B x CD79B结合分子浓度[ng/mL]和x-轴是以小时计的时间，上水平线、中水平线和下水平线分别是体外B细胞结合/抑制研究的结合分子浓度值、当前研究中EC50B细胞结合的结合分子浓度值、和体内抑制人源化小鼠模型中的IgG和IgM的结合分子浓度值。
图16A-16D显示剂量为0.3mg/kg(图16A)、1mg/kg(图16B)、3mg/kg(图16C)和10mg/kg(图16D)受试者体重，给药方案为每两周一次(Q2W)、每三周一次(Q3W)和每四周一次(Q4W)的CD32B x CD79B结合分子的平均浓度的模拟。使用了实际的时间和浓度以及名义剂量。对于图16A-16D，y-轴是CD32B x CD79B结合分子浓度[ng/mL]和x-轴是以小时计的时间。
图17A-17D显示图16A-16D的建模曲线中预期的变化性(具有SD)。
图18显示在接种HAV后第57天在健康的人类受试者的血清中存在的HAV特异性IgG的浓度。这些数据显示施用CD32B x CD79B结合分子降低在HAV接种的人类受试者中的HAV特异性IgG的水平。
图19显示CD32B x CD79B结合分子阻断CD40依赖性B细胞应答，如通过CD40依赖性B细胞IgG分泌的体外检测所测定的。在存在或不存示例性CD32B x CD79B结合分子(20μg/mL)的情况下，在未稀释的或连续3倍稀释(1、1/3、1/9和1/27)的刺激物(CD40-配体(500ng/mL)、IL-4(100ng/mL)和IL-21(20ng/mL))存在或不存在的情况下，培养人类B细胞达5天，并且经ELISA测定测定分泌的IgG。
具体实施方式
本发明涉及使用双特异性结合分子的方法，所述双特异性结合分子具有对于CD32B的表位特异性的结合位点和对于CD79B的表位特异性的结合位点，因而能够同时结合至CD32B和CD79B。本发明尤其涉及这类分子，其是双特异性抗体(即，“CD32B x CD79B抗体”)或双特异性双抗体(即，“CD32B x CD79B双抗体”，尤其是另外包含Fc结构域的这类双抗体(即，“CD32B x CD79B Fc双抗体”)。本发明涉及这类分子的用途以及涉及含有这类分子的药物组合物的用途。
如上所述，CD79B和CD32B(FcγRIIB)均由响应抗原识别而增殖的B细胞表达。本发明的双特异性结合分子能够免疫特异性结合至两种分子，因而能够共连接所述分子。这类共连接(见例如，图4)允许CD32B分子的ITIM成为磷酸化的，并且吸引肌醇聚磷酸盐5’-磷酸酶(SHIP)的SH2结构域，肌醇聚磷酸盐5’-磷酸酶(SHIP)水解由于酪氨酸激酶-介导的CD79BITAM的激活而释放的磷酸肌醇信使。这类水解抑制CD79B的ITAM激活信号，从而用于减弱B细胞激活。因此，本发明的双特异性结合分子具有响应不需要的B细胞激活、B细胞增殖和抗体分泌而抑制或阻抑宿主的免疫系统的能力，并且可用于治疗炎症性疾病和病症，尤其是系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化症(MS)和移植物抗宿主病(GVHD)。
I.抗体特征和结构
如本文使用的，术语“抗体”是指由于在多肽或蛋白质或非蛋白质分子上存在特定结构域或部分或构象(“表位”)而能够免疫特异性结合至这类分子的免疫球蛋白分子。含有表位的分子可具有免疫原性活性，以便其在动物中引起抗体产生应；这类分子称为“抗原”)。含有表位的分子不一定是免疫原性的。
天然抗体(诸如IgG抗体)由与两条重链与两条轻链复合而构成。天然抗体(诸如IgG抗体)的每条轻链含有可变结构域(VL结构域)和恒定结构域(CL结构域)。天然抗体的每条重链含有重链可变结构域(VH结构域)、三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3结构域)、和位于CH1和CH2结构域之间的“铰链”结构域(“H”)。天然产生的免疫球蛋白(例如，IgG)的基本结构单元因此是具有两条轻链和两条重链的四聚体，通常以大约150,000Da的糖蛋白表达。每条链的氨基末端(“N-末端”)部分包含主要负责抗原识别的大约100至110或更多个氨基酸的可变结构域。每条链的羧基末端(“C-末端”)部分限定恒定区域，其中轻链具有单一恒定结构域而重链通常具有三个恒定结构域和铰链结构域。因此，IgG分子的轻链结构是n-VL-CL-c和IgG重链结构是n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c(其中n和c分别代表多肽的N-末端和C-末端)。抗体结合抗原表位的能力取决于抗体VL和VH结构域的存在和氨基酸序列。抗体轻链和抗体重链的相互作用，尤其是其VL和VH结构域的相互作用形成天然抗体的两个表位结合位点之一。天然抗体能够仅结合一个表位种类(即，它们是单特异性的)，但是它们可结合该种类的多个拷贝(即，展示二价或多价)。IgG分子的可变结构域由互补决定区(CDR)和称为框架区段(FR)的非CDR区段组成，所述互补决定区(CDR)包含与表位接触的残基，所述框架区段一般维持结构和决定CDR环的定位，以便允许这类接触(尽管某些框架残基也可接触抗原)。因此，VL和VH结构域具有结构n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c。作为(或可用作)抗体轻链的第一、第二和第三CDR的多肽在本文分别命名为CDRL1结构域、CDRL2结构域和CDRL3结构域。类似地，作为(或可用作)抗体重链的第一、第二和第三CDR的多肽在本文分别命名为CDRH1结构域、CDRH2结构域和CDRH3结构域。因此，术语CDRL1结构域、CDRL2结构域、CDRL3结构域、CDRH1结构域、CDRH2结构域和CDRH3结构域涉及的是当并入到蛋白质中时使得该蛋白质能够结合至特异性表位的多肽，无论这类蛋白质是否是具有轻链和重链的抗体或双抗体或单链结合分子(例如，scFv、BiTe等)或是另一类型的蛋白质。因此，如本文所使用，术语“表位结合结构域”指负责这类分子免疫特异性结合表位的能力的表位结合分子的部分。表位结合片段可包含这类抗体的1、2、3、4、5或所有6个CDR结构域，并且尽管能够免疫特异性结合至这类表位，但可展示对与这类抗体的表位不同的这类表位的免疫特异性、亲和力或选择性。然而，优选地，表位结合片段将包含这类抗体的所有6个CDR结构域。抗体的表位结合片段可以是单多肽链(例如，scFv)，或可包含两条或更多条多肽链，每条多肽链均具有氨基末端和羧基末端(例如，双抗体、Fab片段、F(ab')2片段等)。
如本文使用的，术语“抗体”包括单克隆抗体、多特异性抗体、人类抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、多克隆抗体、骆驼源化(camelized)抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、免疫学活性抗体片段(例如，能够结合至表位的抗体片段，例如Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、含有VL和/或VH结构域的片段、或含有特异性结合抗原等的这类VL结构域的1、2或3个互补决定区(CDR)(即，CDRL1、CDRL2和/或CDRL3)或VH结构域的1、2或3个互补决定区(CDR)(即，CDRH1、CDRH2和/或CDRH3))的片段、双功能或多功能抗体、二硫化物连接的双特异性Fv(sdFv)、胞内抗体和双抗体、和任意上述各项的表位结合片段。尤其地，术语“抗体”意图包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性片段，即含有表位结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以属于任意类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类(见，例如，美国专利公布号：20040185045；20050037000；20050064514；20050215767；20070004909；20070036799；20070077246；和20070244303)。最近数十年已经看到对抗体的治疗潜能的兴趣的复兴，并且抗体已经成为一种主要类型的生物技术衍生的药物(Chan,C.E.等(2009)“The Use Of Antibodies InThe Treatment Of Infectious Diseases,”Singapore Med.J.50(7):663-666)。超过200种基于抗体的药物已经被批准使用或正在开发。
术语“嵌合抗体”指这样的抗体，在所述抗体中，重链和/或轻链的一部分与来自一个物种(例如，小鼠)的抗体或抗体类别或亚类相同或同源，而剩余部分与来自另一物种(例如，人类)的抗体或抗体类别或亚类相同或同源，只要它们展示期望的生物学活性。本文感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类动物源化(primatized)”抗体，其包含源自非人类灵长类动物(例如，旧大陆猴、猿等)的可变结构域抗原结合序列和人类恒定区域序列。
本文使用的术语“单克隆抗体”指基本上同质的(homogeneous)抗体群体中的抗体，即构成群体的单个抗体是相同的，除了可少量存在具有天然产生的突变的可能抗体，并且，本文使用的术语“多克隆抗体”指获自异质抗体群体的抗体。术语“单克隆”指示抗体的特征为基本上同质的一群抗体，而不应被理解为要求抗体以任何具体方法(例如，通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物等)产生。该术语包括完整的免疫球蛋白以及上面根据“抗体”的定义描述的片段等。制备单克隆抗体的方法是本领域已知的。可采用的一种方法是Kohler,G.等(1975)“Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting AntibodyOf Predefined Specificity,”Nature 256:495-497的方法或其改良。典型地，单克隆抗体在小鼠、大鼠或兔子中开发。通过用免疫原性量的细胞、细胞提取物或包含期望表位的蛋白质制品免疫动物而产生抗体。免疫原可以是但不限于原代细胞、培养细胞系、癌细胞、蛋白质、肽、核酸或组织。用于免疫的细胞可被培养一段时间(例如，至少24小时)，然后将它们用作免疫原。细胞本身或联合非变性佐剂，比如Ribi，可用作免疫原(见例如，Jennings,V.M.(1995)“Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production,”ILAR J.37(3):119-125)。一般而言，在用作免疫原时，细胞应保持完整并且优选是存活的。相比于破裂的细胞，完整的细胞可允许抗原被经免疫的动物更好地检测。变性或烈性佐剂，例如弗氏佐剂的使用可使细胞破裂，因此，其应用受阻。免疫原可以以周期性间隔被多次施用，诸如两周一次或一周一次，或者可以以维持动物中(例如，组织重组体中)的生存力这样的方式被施用。可选地，对于期望的致病表位是免疫特异性的现有单克隆抗体和任意其它等价抗体可被测序，并通过本领域中已知的任意手段重组产生。在一个实施方案中，对这样的抗体测序，然后将多核苷酸序列克隆至载体用于表达或增殖。编码感兴趣的抗体的序列可在宿主细胞中保持在载体中，并且，可然后扩增和冷冻宿主细胞，用于将来的使用。这类抗体的多核苷酸序列可用于基因操作，以产生本发明的单特异性或多特异性(例如，双特异性、三特异性和四特异性)分子以及亲和力优化的嵌合抗体、人源化抗体和/或犬源化(caninized)抗体，以改善抗体的亲和力或其它特征。
术语“scFv”指单链可变结构域片段。通过使用短连接肽连接轻链和/或重链可变结构域而制备scFv分子。Bird等(1988)(“Single-Chain Antigen-Binding Proteins,”Science 242:423-426)描述了连接肽的例子，其在一个可变结构域的羧基末端和另一可变结构域的氨基末端之间桥接约3.5nm。已经设计和使用了其它序列的连接体(Bird等(1988)“Single-Chain Antigen-Binding Proteins,”Science 242:423-426)。为了另外的功能，比如药物的附着或附着至固体载体，连接体进而可被修饰。可经重组或合成产生单链变体。为了合成产生scFv，可使用自动合成仪。为了重组产生scFv，可将包含编码scFv的多核苷酸的合适质粒引入到适当的宿主细胞中，所述宿主细胞可以是真核细胞，比如酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞，或原核细胞，比如大肠杆菌。可通过常规操作比如多核苷酸的连接制备编码感兴趣的scFv的多核苷酸。可使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离所得scFv。
术语“人源化抗体”指通常使用重组技术制备的嵌合分子，其具有来自非人类物种的免疫球蛋白的表位结合位点和基于人类免疫球蛋白结构和/或序列的分子的剩余免疫球蛋白结构。表位结合位点可包含融合到恒定结构域上的完整可变结构域或仅仅包含移植至可变结构域中的适当框架区上的CDR。表位结合位点可以是野生型或通过一个或多个氨基酸取代被修饰。这消除了人个体中作为免疫原的恒定区，但是仍保留对外源可变区域的免疫应答的可能性(LoBuglio,A.F.等(1989)“Mouse/Human Chimeric Monoclonal AntibodyIn Man:Kinetics And Immune Response,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)86:4220-4224)。另一种方法不仅仅关注提供源自人类的恒定区域，而且也修饰可变区域，以便重塑它们使其尽可能地与人类形式接近。已知重链和轻链的可变区域都包含三个CDR，侧翼是四个框架区域(FR)，所述CDR对所讨论的抗原的应答不同并且决定结合能力，所述框架区域(FR)在给定物种中相对保守并且推定其为CDR提供支架。当针对特定抗原制备非人抗体时，通过将源自非人抗体的CDR移植在待修饰的人抗体中存在的FR上，可“重塑”或“人源化”可变区域。下面已经报道了该方法在各种抗体中的应用：Sato,K.等(1993)“Reshaping AHuman Antibody To Inhibit The Interleukin 6-Dependent Tumor Cell Growth,”Cancer Res53:851-856；Riechmann,L.等(1988)“Reshaping Human Antibodies forTherapy,”Nature 332:323-327；Verhoeyen,M.等(1988)“Reshaping Human Antibodies:Grafting An Antilysozyme Activity,”Science239:1534-1536；Kettleborough,C.A.等(1991)“Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting:TheImportance Of Framework Residues On Loop Conformation,”Protein Engineering 4:773-3783；Maeda,H.等(1991)“Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity,”Human Antibodies Hybridoma 2:124-134；Gorman,S.D.等(1991)“Reshaping A Therapeutic CD4Antibody,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88:4181-4185；Tempest,P.R.等(1991)“Reshaping A Human Monoclonal Antibody ToInhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo,”Bio/Technology9:266-271；Co,M.S.等(1991)“Humanized Antibodies For Antiviral Therapy,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88:2869-2873；Carter,P.等(1992)“Humanization Of AnAnti-p185her2Antibody For Human Cancer Therapy,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)89:4285-4289；和Co,M.S.等(1992)“Chimeric And Humanized Antibodies WithSpecificity For The CD33Antigen,”J.Immunol.148:1149-1154。在一些实施方案中，人源化抗体保留所有的CDR序列(例如，人源化小鼠抗体，其包含来自小鼠抗体的所有六个CDR)。在其它实施方案中，人源化抗体具有一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个或六个)，其氨基酸序列相对于初始抗体不同，也称为“源自”初始抗体的一个或多个CDR(即，源自这类CDR、源自这类CDR的氨基酸序列的知识等)的一个或多个CDR。编码抗体可变结构域的多核苷酸序列可用于产生这类衍生物和改善这类抗体的亲和力或其它特征。人源化抗体的一般原则涉及保留抗体的表位结合部分的基本序列，同时用人抗体序列交换抗体的非人剩余部分。人源化单克隆抗体有四个基本步骤。这些步骤是：(1)确定起始抗体轻链和重链可变结构域的核苷酸和预测的氨基酸序列；(2)设计人源化抗体或犬源化抗体，即，决定在人源化或犬源化过程中使用哪种抗体框架区域；(3)实际人源化或犬源化方法/技术；和(4)转染和表达人源化抗体。见例如，美国专利号4,816,567；5,807,715；5,866,692；和6,331,415。
如上所述，本发明的双特异性结合分子具有至少两个表位结合结构域。这类表位结合结构域中的每一个均能够以“免疫特异性”方式结合至表位。如本文使用的，如果本发明的抗体、双抗体或其它双特异性结合分子，相对于可选的表位，与另一分子的区域(即，表位)更经常、更快速、以更长的持久性和/或以更大的亲和力反应或缔合，则认为抗体、双抗体或其它双特异性结合分子“免疫特异性”结合该表位(或展示对该表位的“特异性”结合)。例如，特异性结合至CD32B的表位(或CD79B的表位)的抗体是，相比其结合至CD32B的其它表位(或结合至CD79B的其它表位)或结合至不是CD32B(或CD79B)的分子的表位，以更大的亲和力、亲合力、更容易和/或以更大的持久性结合这类表位的抗体。通过阅读该定义，应理解，例如，免疫特异性结合至第一靶的抗体(或部分或表位)可特异性或优先或非特异性或非优先结合至第二靶。因此，“免疫特异性结合”不必要求(尽管其可包括)排他性结合。一般而言(但不是必要的)，提及结合意思是“特异性”结合。抗体免疫特异性结合至表位的能力可经例如免疫测定来测定。
本发明的人源化分子的表位结合结构域可包含融合至恒定结构域的完整可变结构域或仅包含移植至合适的框架区域的这类可变结构域的互补决定区(CDR)。表位结合结构域可以是野生型或可以经一种或多种氨基酸取代而被修饰，例如以减小分子的任意恒定结构域用作人类个体中的免疫原的能力。尽管这可消除人类个体中作为免疫原的恒定区域，但是仍保留了对外源可变结构域的免疫应答的可能性(LoBuglio,A.F.等(1989)“Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man:Kinetics And ImmuneResponse,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)86:4220-4224)。另一种方法不仅仅关注提供源自人类的恒定区域，而且也修饰可变区域，以便重塑它们使其尽可能地与人类形式接近。已知重链和轻链二者的可变结构域都包含三个互补决定区(CDR)，侧翼是四个框架区域(FR)，所述互补决定区(CDR)对所讨论的抗原的应答不同并且决定结合能力，所述框架区域(FR)在给定物种中相对保守并且推定其为CDR提供支架。当针对特定抗原制备非人抗体时，通过将源自非人抗体的CDR移植在待修饰的人抗体中存在的FR上，可“重塑”或“人源化”可变结构域。下面已经报道了该方法在各种抗体中的应用：Sato,K.等(1993)Cancer Res 53:851-856.Riechmann,L.等(1988)“Reshaping Human Antibodies for Therapy,”Nature 332:323-327；Verhoeyen,M.等(1988)“Reshaping Human Antibodies:Grafting AnAntilysozyme Activity,”Science 239:1534-1536；Kettleborough,C.A.等(1991)“Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting:The ImportanceOf Framework Residues On Loop Conformation,”Protein Engineering 4:773-3783；Maeda,H.等(1991)“Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity,”Human Antibodies Hybridoma 2:124-134；Gorman,S.D.等(1991)“Reshaping A Therapeutic CD4Antibody,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88:4181-4185；Tempest,P.R.等(1991)“Reshaping A Human Monoclonal Antibody ToInhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo,”Bio/Technology9:266-271；Co,M.S.等(1991)“Humanized Antibodies For Antiviral Therapy,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88:2869-2873；Carter,P.等(1992)“Humanization Of AnAnti-p185her2Antibody For Human Cancer Therapy,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)89:4285-4289；和Co,M.S.等(1992)“Chimeric And Humanized Antibodies WithSpecificity For The CD33Antigen,”J.Immunol.148:1149-1154。在一些实施方案中，人源化抗体保留所有CDR序列(例如，人源化小鼠抗体，其含有来自小鼠抗体的所有六个CDR)。在其它实施方案中，人源化抗体具有一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个或六个)，其序列相对于初始抗体不同。
已经描述了包含源自非人免疫球蛋白的表位结合位点的一些“人源化”抗体分子，包括具有啮齿动物或修饰的啮齿动物可变结构域、和融合至人类恒定结构域的它们的缔合的互补决定区(CDR)的嵌合抗体(见例如，Winter等(1991)“Man-made Antibodies,”Nature349:293-299；Lobuglio等(1989)“Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man:Kinetics And Immune Response,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)86:4220-4224(1989)；Shaw等(1987)“Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody(17-1A)To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen,”J.Immunol.138:4534-4538；和Brown等(1987)“Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human ChimericMonoclonal Antibody,”Cancer Res.47:3577-3583)。其他参考文献描述了移植至人支撑框架区域(FR)的啮齿动物CDR，其然后与适当的人抗体恒定结构域融合(见，例如，Riechmann,L.等(1988)“Reshaping Human Antibodies for Therapy,”Nature 332:323-327；Verhoeyen,M.等(1988)“Reshaping Human Antibodies:Grafting An AntilysozymeActivity,”Science 239:1534-1536；和Jones等(1986)“Replacing TheComplementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From AMouse,”Nature 321:522-525)。另外的参考文献描述了由重组修饰的啮齿动物框架区域支撑的啮齿动物CDR。见例如，欧洲专利公开号519,596。这些“人源化的”分子被设计，以使对啮齿动物抗人抗体分子的不利免疫应答最小化，所述不利免疫应答限制了这些部分在人类接受者中治疗应用的持续时间和效力。也可使用的人源化抗体的其他方法公开在以下文献中：Daugherty等(1991)“Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning,CDR-Grafting,And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody DirectedAgainst The CD18Component Of Leukocyte Integrins,”Nucl.Acids Res.19:2471-2476；和美国专利号6,180,377；6,054,297；5,997,867；和5,866,692。
II.抗体恒定区域
优选的CL结构域是人类IgG CLК结构域。示例性人类CLК结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:1)：
可选地，示例性CL结构域是人类IgG CLλ结构域。示例性人类CLλ结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:2)：
示例性CH1结构域是人类IgG1 CH1结构域。示例性人类IgG1 CH1结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:3)：
示例性CH1结构域是人类IgG2CH1结构域。示例性人类IgG2 CH1结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:4)：
示例性CH1结构域是人类IgG4CH1结构域。示例性人类IgG4CH1结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:5)：
一个示例性铰链区是人类IgG1铰链区。示例性人类IgG1铰链区的氨基酸序列是(SEQ ID NO:6)：EPKSCDKTHTCPPCP。
另一示例性铰链区是人类IgG2铰链区。示例性人类IgG2铰链区的氨基酸序列是(SEQ ID NO:7)：ERKCCVECPPCP。
另一示例性铰链区是人类IgG4铰链区。示例性人类IgG4铰链区的氨基酸序列是(SEQ ID NO:8)：ESKYGPPCPSCP。如本文所述的，IgG4铰链区可包含稳定化突变诸如S228P取代。示例性稳定化的IgG4铰链区的氨基酸序列是(SEQ ID NO:9)：ESKYGPPCPPCP。
抗体重链的CH2和CH3结构域相互作用形成Fc区域，其含有由细胞Fc受体识别的Fc结构域，所述细胞Fc受体包括但不限于Fcγ受体(FcγR)诸如CD32B。示例性人类IgG1的CH2-CH3结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:10)：
通过Kabat阐释的EU索引编号，其中X是赖氨酸(K)或不存在。
示例性人类IgG2的CH2-CH3结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:11)：
通过Kabat阐释的EU索引编号，其中X是赖氨酸(K)或不存在。
示例性人类IgG3的CH2-CH3结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:12)：
通过Kabat阐释的EU索引编号，其中X是赖氨酸(K)或不存在。
示例性人类IgG4的CH2-CH3结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:13)：
通过Kabat阐释的EU索引编号，其中X是赖氨酸(K)或不存在。
在整个本说明书中，IgG重链的恒定区域中残基的编号是如在Kabat等(Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版.Public Health Service,NH1,MD(1991)(“Kabat”))中的EU索引的编号，其通过参考明确并入本文。术语“在Kabat中的EU索引”指人类IgG1EU抗体的编号。通过链中氨基酸的位置来命名免疫球蛋白的成熟重链和轻链的可变结构域中的氨基酸。Kabat描述了抗体的许多氨基酸序列，鉴定了每个亚组的氨基酸共有序列，并且为每个氨基酸指定残基编号，并且，如Kabat定义的来鉴定CDR(应当理解，如Chothia,C.&Lesk,A.M.((1987)“Canonical Structures For The HypervariableRegions Of Immunoglobulins,”J.Mol.Biol.196:901-917)限定的CDRH1提前五个残基开始)。通过参考保守的氨基酸来比对所讨论的抗体与Kabat中的共有序列中的一条，Kabat的编号方案可扩展至未包括在其纲要中的抗体。这种用于指定残基编号的方法已经成为本领域的标准并且容易鉴定在不同抗体(包括嵌合变体或人源化的变体)中等同位置处的氨基酸。例如，在人抗体轻链50位的氨基酸占据与在小鼠抗体轻链的50位氨基酸等同的位置。
已经在抗体恒定区域中的许多不同位置(例如，Fc位置，包括但不限于270、272、312、315、356和358位，通过Kabat阐释的EU索引编号)处观察到了多态性，因此示出的序列和现有技术的序列之间可能存在轻微的差别。已经充分表征了人免疫球蛋白的多态性形式。目前，已知18个Gm同种异型(allotype)：G1m(1、2、3、17)或G1m(a、x、f、z)、G2m(23)或G2m(n)、G3m(5、6、10、11、13、14、15、16、21、24、26、27、28)或G3m(b1、c3、b3、b0、b3、b4、s、t、g1、c5、u、v、g5)(Lefranc,等,“The Human IgG Subclasses:Molecular Analysis OfStructure,Function And Regulation.”Pergamon,Oxford,pp.43-78(1990)；Lefranc,G.等1979,Hum.Genet.:50,199-211)。具体考虑本发明的抗体可并入任何免疫球蛋白基因的任何同种异型、异同种异型(isoallotype)或单倍型(haplotype)，并且不限于本文提供的序列的同种异型、异同种异型或单倍型。此外，在一些表达体系中，CH3结构域的C-末端氨基酸残基(上面粗体显示的)可在翻译后去除。因此，CH3结构域的C-末端残基是本发明的包含Fc结构域的结合分子中任选的氨基酸残基。本发明尤其包括缺乏CH3结构域的C-末端残基的本发明的结合分子。本发明还尤其包括的是包含CH3结构域的C-末端赖氨酸残基的这类构建体。
III.本发明优选的CD32B x CD79B结合分子
本发明涉及双特异性结合分子，其能够结合至CD32B的表位和Cd79B的表位，以便能够同时结合至在B细胞表面上自然排列的(即，不存在重组诱发的超表达)这类分子。这类特异性结合分子可由单条多肽链构成(例如，BiTe)，或可由一起(优选通过CD32B x CD79B结合分子的单条多肽链之间多个二硫键的存在)形成共价结合的复合物的两条、三条、四条、五条或更多条多肽链构成。优选地，这类分子能够免疫特异性结合至CD32B而基本上不干扰或妨碍CD32B分子结合至抗体的Fc结构域或结合至含Fc结构域的双抗体的Fc结构域的能力。
A.双特异性ScFv和抗体
在第一优选的实施方案中，本发明的CD32B x CD79B结合分子是单链分子诸如BiTe，其具有VLCD32B结构域、VLCD79B结构域、VHCD32B结构域和VLCD79B结构域，并且其中这类结构域由肽连接体分子分隔开，所述肽连接体分子允许VLCD32B结构域与VHCD32B结构域相互作用形成CD32B表位结合结构域，并允许VLCD79B结构域与VHCD79B结构域相互作用形成CD79B表位结合结构域。
在第二优选的实施方案中，本发明的CD32B x CD79B结合分子是双特异性抗体或其表位结合片段，其具有VLCD32B结构域、VLCD79B结构域、VHCD32B结构域和VLCD79B结构域，从而形成CD32B表位结合结构域和CD79B表位结合结构域。这类抗体可包含Fc结构域。
B.双特异性双抗体
1.不含Fc-结构域的双特异性双抗体
在进一步优选的实施方案中，本发明的CD32B x CD79B结合分子是双特异性单价双抗体，其由两条、三条、四条、五条或更多条多肽链构成。
例如，图1显示由经二硫键彼此共价结合的两条多肽链构成的CD32B x CD79B双特异性单价双抗体。第一多肽链的VL结构域与第二多肽链的VH结构域相互作用，从而形成对第一抗原(即，CD32B或CD79B)特异性的第一功能性抗原结合位点。类似地，第二多肽链的VL结构域与第一多肽链的VH结构域相互作用，从而形成对第二抗原(即，CD79B或CD32B，取决于第一抗原的身份)特异性的第二功能性抗原结合位点。因此，协同第一和第二多肽链的VL和VH结构域的选择，以便两条多肽链总共包含能够结合至CD32B和CD79B的VL和VH结构域(即，它们包含VLCD32B/VHCD32B和VLCD79B/VHCD79B)(图1)。共同地，每一种这样的VL和VH结构域和分隔开它们的间插连接体统称为该分子的抗原结合结构域。
优选的CD32B x CD79B双特异性单价双抗体的第一多肽链包含(在N-末端至C-末端方向)：氨基末端、能够结合至CD32B或CD79B的单克隆抗体的VL结构域(即，VLCD32B或VLCD79B)、间插间隔体肽(连接体1)、能够结合至CD79B(如果这样的第一多肽链含有VLCD32B)或CD32B(如果这样的第一多肽链含有VLCD79B)的单克隆抗体的VH结构域、间插间隔体肽(连接体2)、异源二聚体促进结构域、为异源二聚体促进结构域提供改善的稳定性的任选的另外的结构域和C-末端(图1)。
这类优选的CD32B x CD79B双特异性单价Fc双抗体的第二多肽链包含(在N-末端至C-末端方向)：氨基末端、能够结合至CD79B或CD32B的单克隆抗体的VL结构域(即，VLCD79B或VLCD32B，取决于为双抗体的第一多肽链选择的VL结构域)、间插连接体肽(连接体1)、能够结合至CD32B(如果这样的第二多肽链含有VLCD79B)或CD32B(如果这样的第二多肽链含有VLCD32B)的单克隆抗体的VH结构域、间插间隔体肽(连接体2)、异源二聚体促进结构域和C-末端(图1)。
最优选地，选择分隔开这类VL和VH结构域的连接体1的长度，以基本上或完全防止这类VL和VH结构域彼此结合(例如由1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸残基组成)。因此，第一多肽链的VL和VH结构域基本上或完全不能彼此结合。类似地，第二多肽链的VL和VH结构域基本上或完全不能彼此结合。优选的间插间隔体肽(连接体1)具有序列(SEQ ID NO:14)：GGGSGGGG。
连接体2的目的是分隔开多肽链的VH结构域与该多肽链的任选存在的异源二聚体促进结构域。多种连接体中的任意一种均可用于连接体2的目的。这类连接体2的优选的序列具有氨基酸序列：ASTKG(SEQ ID NO:15)，其源自IgG CH1结构域；或GGCGGG(SEQ ID NO:16)，其具有可用于经二硫键彼此共价结合第一和第二多肽链的半胱氨酸残基。由于连接体2——ASTKG(SEQ ID NO:15)不具有这样的半胱氨酸，因此，这类连接体2的使用优选与含有半胱氨酸的异源二聚体促进结构域，诸如SEQ ID NO:23的E-螺旋或SEQ ID NO:24的K-螺旋(见下面)的使用结合。因此，在一个实施方案中，多肽链的连接体2含有半胱氨酸残基(以便彼此共价连接第一和第二多肽链)。在另一实施方案中，多肽链的连接体2不具有半胱氨酸，并且这类多肽链的异源二聚体促进结构域含有这样的半胱氨酸残基，从而彼此共价连接第一和第二多肽链。
第一和第二多肽链的异源二聚体的形成可通过包含异源二聚体促进结构域而驱动。这类结构域包括一条多肽链上的GVEPKSC(SEQ ID NO:17)或VEPKSC(SEQ ID NO:18)和另一条多肽链上的GFNRGEC(SEQ ID NO:19)或FNRGEC(SEQ ID NO:20)(US2007/0004909)。
然而，更优选地，本发明的异源二聚体促进结构域由具有相反电荷的一个、两个、三个或四个串联重复的螺旋结构域形成，所述螺旋结构域包含具有至少六个、至少七个或至少八个带电荷的氨基酸残基的序列(Apostolovic,B.等(2008)“pH-Sensitivity of theE3/K3Heterodimeric Coiled Coil,”Biomacromolecules 9:3173–3180；Arndt,K.M.等(2001)“Helix-stabilized Fv(hsFv)Antibody Fragments:Substituting the ConstantDomains of a Fab Fragment for a Heterodimeric Coiled-coil Domain,”J.Molec.Biol.312:221-228；Arndt,K.M.等(2002)“Comparison of In Vivo Selectionand Rational Design of Heterodimeric Coiled Coils,”Structure 10:1235-1248；Boucher,C.等(2010)“Protein Detection By Western Blot Via Coiled–CoilInteractions,”Analytical Biochemistry 399:138-140；Cachia,P.J.等(2004)“Synthetic Peptide Vaccine Development:Measurement Of Polyclonal AntibodyAffinity And Cross-Reactivity Using A New Peptide Capture And Release SystemFor Surface Plasmon Resonance Spectroscopy,”J.Mol.Recognit.17:540-557；DeCrescenzo,G.D.等(2003)“Real-Time Monitoring of the Interactions of Two-Stranded de novo Designed Coiled-Coils:Effect of Chain Length on the Kineticand Thermodynamic Constants of Binding,”Biochemistry42:1754-1763；Fernandez-Rodriquez,J.等(2012)“Induced Heterodimerization And Purification Of TwoTarget Proteins By A Synthetic Coiled-Coil Tag,”Protein Science 21:511-519；Ghosh,T.S.等(2009)“End-To-End And End-To-Middle Interhelical Interactions:NewClasses Of Interacting Helix Pairs In Protein Structures,”ActaCrystallographica D65:1032-1041；Grigoryan,G.等(2008)“Structural SpecificityIn Coiled-Coil Interactions,”Curr.Opin.Struc.Biol.18:477-483；Litowski,J.R.等(2002)“Designing Heterodimeric Two-Strandedα-Helical Coiled-Coils:The EffectsOf Hydrophobicity Andα-Helical Propensity On Protein Folding,Stability,AndSpecificity,”J.Biol.Chem.277:37272-37279；Steinkruger,J.D.等(2012)“The d′--d--d′Vertical Triad is Less Discriminating Than the a′--a--a′Vertical Triad inthe Antiparallel Coiled-coil Dimer Motif,”J.Amer.Chem.Soc.134(5):2626–2633；Straussman,R.等(2007)“Kinking the Coiled Coil–带负电荷的Residues at theCoiled-coil Interface,”J.Molec.Biol.366:1232-1242；Tripet,B.等(2002)“KineticAnalysis of the Interactions between Troponin C and the C-terminal Troponin IRegulatory Region and Validation of a New Peptide Delivery/Capture Systemused for Surface Plasmon Resonance,”J.Molec.Biol.323:345–362；Woolfson,D.N.(2005)“The Design Of Coiled-Coil Structures And Assemblies,”Adv.Prot.Chem.70:79-112；Zeng,Y.等(2008)“A Ligand-Pseudoreceptor System Based On de novoDesigned Peptides For The Generation Of Adenoviral Vectors With AlteredTropism,”J.Gene Med.10:355-367)。
这类重复的螺旋结构域可以是精确的重复或可具有取代。例如，第一多肽链的异源二聚体促进结构域可包含具有八个带负电荷的氨基酸残基的序列和第二多肽链的异源二聚体促进结构域可包含具有八个带负电荷的氨基酸残基的序列。哪个螺旋被提供至第一或第二多肽链不重要，条件是具有相反电荷的螺旋被用于另一多肽链。然而，本发明的优选的CD32B x CD79B双特异性单价双抗体的第一多肽链具有带负电荷的螺旋。带正电荷的氨基酸可以是赖氨酸、精氨酸、组氨酸等和/或带负电荷的氨基酸可以是谷氨酸、天冬氨酸等。带正电荷的氨基酸优选地是赖氨酸和/或带负电荷的氨基酸优选地是谷氨酸。仅仅采用一个异源二聚体促进结构域是可能的(因为这类结构域抑制同源二聚化，从而促进异源二聚化)，然而，优选本发明双抗体的第一多肽链和第二多肽链都含有异源二聚体促进结构域。
在优选的实施方案中，异源二聚体促进结构域之一包含四个串联的“E-螺旋”螺旋结构域(SEQ ID NO:21：EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK)，其谷氨酸残基在pH 7形成负电荷，而另一个异源二聚体促进结构域包含四个串联的“K-螺旋”结构域(SEQ ID NO:22:KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE)，其赖氨酸残在pH 7形成正电荷。这类带电荷结构域的存在促进第一多肽和第二多肽之间的缔合，从而促进异源二聚化。尤其优选的是这样的异源二聚体促进结构域，其中SEQ ID NO:21的四个串联的“E-螺旋”螺旋结构域之一已经被修饰成含有半胱氨酸残基：EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK(SEQ ID NO:23)。类似地，尤其优选的是这样的异源二聚体促进结构域，其中SEQ ID NO:22的四个串联的“K-螺旋”螺旋结构域之一已经被修饰成含有半胱氨酸残基：KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE(SEQID NO:24)。
2.含有Fc结构域的双特异性双抗体
在进一步优选的实施方案中，本发明的CD32B x CD79B双抗体另外包含Fc结构域。本发明的这类含有Fc结构域的双抗体的Fc结构域可以是完整的Fc区域(例如，完整的IgGFc区域)或仅仅是完整的Fc区域的片段。尽管本发明的双特异性单价Fc双抗体的Fc结构域可具有结合至一种或多种Fc受体(例如，FcγR(一种或多种))的能力，但更优选这类Fc结构域具有对FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB(CD16b)基本上降低的结合能力或没有结合能力(相对于野生型Fc区域展示的结合)。本发明的双特异性单价Fc双抗体的Fc结构域可包括完整的Fc区域的一些或所有CH2结构域和/或一些或所有CH3结构域，或可包含变异的CH2和/或变异的CH3序列(相对于完整的Fc区域的CH2或CH3结构域，其可包括，例如一个或多个插入和/或一个或多个缺失)。本发明的双特异性单价Fc双抗体的Fc结构域可包含非Fc多肽部分，或可包含非天然的完整Fc区域的一部分，或可包含非天然产生的取向的CH2和/或CH3结构域(诸如例如，两个CH2结构域或两个CH3结构域或在N-末端至C-末端方向，与CH2结构域连接的CH3结构域等)。
本发明的这类含有Fc结构域的双抗体可包含两条多肽链(例如，图2)或可包含三条多肽链(例如，图3A-3E)或更多条多肽链。图2显示的双抗体具有类似于上述结构的结构，除了各个异源二聚体促进结构域被CH2-CH3结构域取代。优选地，由这类多肽链形成的Fc结构域具有对于激活的FcγR，诸如FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB(CD16b)基本上降低的结合能力或没有结合能力(相对于野生型Fc区域展示的结合)。
图3A-3E显示由三条多肽链构成的、可选的CD32B x CD79B Fc双抗体，其中第一和第二多肽链彼此共价结合和第一和第三多肽链彼此共价结合。如在上述双抗体中，第一多肽链的VL结构域与第二多肽链的VH结构域相互作用，从而形成对第一抗原(即，CD32B或CD79B)特异性的第一功能性抗原结合位点。类似地，第二多肽链的VL结构域与第一多肽链的VH结构域相互作用，从而形成对第二抗原(即，CD79B或CD32B，取决于第一抗原的身份)特异性的第二功能性抗原结合位点。因此，协同第一和第二多肽链的VL和VH结构域的选择，以便两条多肽链总共包含能够结合至CD32B和CD79B的VL和VH结构域(即，它们包含VLCD32B/VHCD32B和VLCD79B/VHCD79B)。每一个这样的VL和VH结构域和分隔开它们的间插连接体统称为该分子的抗原结合结构域。
在图3A和图3B所示的CD32B x CD79B双特异性Fc双抗体实施方案中，第一多肽链包含(在N-末端至C-末端方向)：氨基末端、包含半胱氨酸的肽(肽1)、由抗体Fc区域的CH2和CH3结构域的全部或一部分构成的IgG Fc结构域、间插连接体肽(连接体3)、能够结合至CD32B或CD79B的单克隆抗体的VL结构域(即，VLCD32B或VLCD79B)、间插肽(连接体1)、能够结合至CD79B(如果这样的第一多肽链含有VLCD32B)或CD32B(如果这样的第一多肽链含有VLCD79B)单克隆抗体的VH结构域、间插间隔体肽(连接体2)、异源二聚体促进结构域、为异源二聚体促进结构域提供改善的稳定性的任选的第四间隔体肽(连接体4)和C-末端。
这类CD32B x CD79B双特异性Fc双抗体实施方案的第二多肽链包含(在N-末端至C-末端方向)：氨基末端、能够结合至CD79B或CD32B的单克隆抗体的VL结构域(即，VLCD79B或VLCD32B，取决于为双抗体的第一多肽链选择的VL结构域)、间插连接体肽(连接体1)、能够结合至CD32B(如果这样的第二多肽链含有VLCD79B)或CD32B(如果这样的第二多肽链含有VLCD32B)的单克隆抗体的VH结构域、间插间隔体肽(连接体2)、异源二聚体促进结构域和C-末端。
这类优选的CD32B x CD79B双特异性Fc双抗体的第三多肽链包含(在N-末端至C-末端方向)：氨基末端、包含半胱氨酸的肽(肽1)、与第一多肽链的Fc结构域具有相同同种型的IgG Fc结构域(优选地，抗体Fc区域的CH2和CH3结构域)和C-末端。
图3A所示的CD32B x CD79B双特异性Fc双抗体的实施方案与图3B所示实施方案的不同之处在于第一和第二多肽链的间插间隔体肽(连接体2)不含有半胱氨酸残基，这类半胱氨酸残基现在是这些多肽链的异源二聚体促进结构域的一部分。
在图3C所示CD32B x CD79B双特异性Fc双抗体实施方案中，第一多肽链包含(在N-末端至C-末端方向)：氨基末端、能够结合至CD32B或CD79B的单克隆抗体的VL结构域(即，VLCD32B或VLCD79B)、间插肽(连接体1)、能够结合至CD79B(如果这样的第一多肽链含有VLCD32B)或CD32B(如果这样的第一多肽链含有VLCD79B)的单克隆抗体的VH结构域、含有半胱氨酸的间插间隔体肽(连接体2)、异源二聚体促进结构域、包含半胱氨酸的肽(肽1)、由抗体Fc区域的CH2和CH3结构域的全部或一部分构成的IgG Fc结构域和C-末端。
这类CD32B x CD79B双特异性Fc双抗体实施方案的第二多肽链包含(在N-末端至C-末端方向)：氨基末端、能够结合至CD79B或CD32B的单克隆抗体的VL结构域(即，VLCD79B或VLCD32B，取决于为双抗体的第一多肽链选择的VL结构域)、间插连接体肽(连接体1)、能够结合至CD32B(如果这样的第二多肽链含有VLCD79B)或CD32B(如果这样的第二多肽链含有VLCD32B)的单克隆抗体的VH结构域、含有半胱氨酸的间插间隔体肽(连接体2)、异源二聚体促进结构域和C-末端。
图3C和图3D的CD32B x CD79B双特异性Fc双抗体的第三多肽链包含(在N-末端至C-末端方向)：氨基末端、包含半胱氨酸的肽(肽1)、具有与第一多肽链的Fc结构域相同同种型的IgG Fc结构域(优选地，抗体Fc区域的CH2和CH3结构域)和C-末端。
图3D所示CD32B x CD79B双特异性Fc双抗体的实施方案中与图3C所示实施方案的不同之处在于第一和第二多肽链的间插间隔体肽(连接体2)不含有半胱氨酸残基，这类半胱氨酸残基现在是这些多肽链的异源二聚体促进结构域的一部分。
第一和第三多肽链的包含半胱氨酸的肽(肽1)可包含相同的氨基酸序列或包含不同的氨基酸序列，并且含有1、2、3或更多个半胱氨酸残基。尤其优选的肽1具有氨基酸序列(SEQ ID NO:25)：DKTHTCPPCP或(SEQ ID NO:26)GGGDKTHTCPPCP。优选的间插连接体肽(连接体3)包含氨基酸序列(SEQ ID NO:27)：APSSS，更优选具有氨基酸序列(SEQ ID NO:28)：APSSSPME。优选的第四间隔体肽(连接体4)具有序列GGG或是SEQ ID NO:29：GGGNS。
优选地，由本发明的含有Fc的双抗体的第一和第三多肽链形成的Fc结构域具有对于激活的FcγR，诸如FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB(CD16b)基本上降低的结合能力或没有结合能力(相对于野生型Fc区域展示的结合)。具有降低或消除与这类受体的结合的突变的Fc结构域是本领域中已知的，所示突变包括234和235位的氨基酸取代、265位的取代或297位的取代(见，例如，美国专利号5,624,821，通过引用并入本文)。在优选的实施方案中，CH2和CH3结构域包括在234位用丙氨酸进行的取代和在235位用丙氨酸进行的取代。
本发明的含有Fc的双抗体的第一和第三多肽链的CH2和/或CH3结构域不需要相同，并且有利地被修饰以促进两条多肽链之间的复合。例如，氨基酸取代(优选以包含形成“杵(knob)”的大侧基的氨基酸例如色氨酸进行取代)可被引入CH2或CH3结构域中，以便空间干扰防止与类似的突变结构域的相互作用并迫使突变结构域与其中互补或适应性突变已经被工程化的结构域——即“臼(hole)”(例如，用甘氨酸进行的取代)——配对。这样的突变组可被工程化到构成Fc双抗体分子的任意多肽对中，并且，进一步地被工程化到所述多肽链对的任何部分中。蛋白质工程化以相对于同源二聚化利于异源二聚化的方法在本领域中是悉知的，尤其就工程化免疫球蛋白样分子而言，这些都包括在本文中(见例如，Ridgway等(1996)“‘Knobs-Into-Holes’Engineering Of Antibody CH3Domains ForHeavy Chain Heterodimerization,”Protein Engr.9:617-621；Atwell等(1997)“StableHeterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using APhage Display Library,”J.Mol.Biol.270:26-35；和Xie等(2005)“A New Format OfBispecific Antibody:Highly Efficient Heterodimerization,Expression And TumorCell Lysis,”J.Immunol.Methods 296:95-101；其每一篇通过引用以其整体并入本文)。优选地，‘杵’被工程化到第一多肽链的CH2-CH3结构域中和‘臼’被工程化到第三多肽链的CH2-CH3结构域中。因此，‘杵’将有助于防止第一多肽链经其CH2和/或CH3结构域而同源二聚化。由于第三多肽链优选地含有‘臼’取代，其会与第一多肽链异源二聚化以及同其自身同源二聚化。通过修饰天然的IgG Fc区域以含有修饰T366W而产生优选的杵。通过修饰天然的IgG Fc区域以含有修饰T366S、L368A和Y407V而产生优选的臼。为了有助于从包含第一、第二和第三多肽链的、最终的双特异性单价Fc双抗体纯化第三多肽链同源二聚体，优选地通过在435位的氨基酸取代(H435R)来突变第三多肽链的CH2和CH3结构域的蛋白质A结合位点。为了有助于从包含第一、第二和第三多肽链的、最终的双特异性单价Fc双抗体纯化第三多肽链同源二聚体，优选地通过氨基酸取代来突变第三多肽链的CH2和CH3结构域的蛋白质A结合位点。因此，第三多肽链同源二聚体不结合蛋白质A，而双特异性单价Fc双抗体保持其经在第一多肽链上的蛋白质A结合位点而结合蛋白质A的能力。
3.示例性CD32B x CD79B双特异性双抗体
本发明的示例性CD32B x CD79B双特异性双抗体包含两条或更多条多肽链，其包含：
(1)结合CD32B的抗体的VL结构域(VLCD32B)，这类VLCD32B结构域具有序列(SEQ IDNO:30)：
(2)结合CD32B的抗体的VH结构域(VHCD32B)，这类VHCD32B结构域具有序列(SEQ IDNO:31)：
(3)结合CD79B的抗体的VL结构域(VLCD79B)，这类VLCD79B结构域具有序列(SEQ IDNO:32)：
(4)结合CD79B的抗体的VH结构域(VHCD79B)，这类VHCD79B结构域具有序列(SEQ IDNO:33)：
本发明的第一示例性CD32B x CD79B双特异性双抗体具有两条多肽链。这类示例性双抗体的第一多肽链在N-末端至C-末端方向具有结构：N-末端、上述VLCD32B结构域、连接体1、上述VHCD79B结构域、含有半胱氨酸的连接体2、E-螺旋结构域和C-末端。这类优选的多肽的氨基酸序列是(SEQ ID NO:34)：
在SEQ ID NO:34中，氨基酸残基1-107是结合CD32B的抗体的VL结构域(VLCD32B)(SEQ ID NO:30)，氨基酸残基108-115是连接体1(SEQ ID NO:14)，氨基酸残基116-228是结合CD79B的抗体的VH结构域(VHCD79B)(SEQ ID NO:33)，氨基酸残基229-234是含有半胱氨酸的连接体2(SEQ ID NO:16)，氨基酸残基235-262是异源二聚体促进E-螺旋结构域(SEQ IDNO:21)。
这类示例性双抗体的第二多肽链在N-末端至C-末端方向具有(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列：
In SEQ ID NO:35中，氨基酸残基1-112是结合CD79B的抗体的VL结构域(VLCD79B)(SEQ ID NO:32)，氨基酸残基113-120是连接体1(SEQ ID NO:14)，氨基酸残基121-236是结合CD32B的抗体的VH结构域(VHCD32B)(SEQ ID NO:31)，氨基酸残基237-242是含有半胱氨酸的连接体2(SEQ ID NO:16)和氨基酸残基243-270是异源二聚体促进K-螺旋结构域(SEQ IDNO:22)。
本发明的第二示例性CD32B x CD79B双特异性双抗体具有两条多肽链，其中第一多肽链在N-末端至C-末端方向具有结构：N-末端、上述VLCD32B结构域、连接体1、上述VHCD79B结构域、连接体2、含有半胱氨酸的E-螺旋结构域和C-末端。这类优选的多肽的氨基酸序列是(SEQ ID NO:36)：
在SEQ ID NO:36中，氨基酸残基1-107是结合CD32B的抗体的VL结构域(VLCD32B)(SEQ ID NO:30)，氨基酸残基108-115是连接体1(SEQ ID NO:14)，氨基酸残基116-228是结合CD79B的抗体的VH结构域(VHCD79B)(SEQ ID NO:33)，氨基酸残基229-233是连接体2(SEQID NO:15)，氨基酸残基234-261是含有半胱氨酸的异源二聚体促进E-螺旋结构域(SEQ IDNO:23)。
这类第二示例性双抗体的第二多肽链在N-末端至C-末端方向具有(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列：
在SEQ ID NO:37中，氨基酸残基1-112是结合CD79B的抗体的VL结构域(VLCD79B)(SEQ ID NO:32)，氨基酸残基113-120是连接体1(SEQ ID NO:14)，氨基酸残基121-236是结合CD32B的抗体的VH结构域(VHCD32B)(SEQ ID NO:31)，氨基酸残基237-241是连接体2(SEQID NO:15)和氨基酸残基242-269是含有半胱氨酸的异源二聚体促进K-螺旋结构域(SEQ IDNO:24)。
4.示例性CD32B x CD79B双特异性Fc双抗体
本发明的第一示例性CD32B x CD79B双特异性Fc双抗体具有三条多肽链(图3A)。第一多肽链包含含有杵的IgG Fc区域的CH2和CH3结构域，所述CH2和CH3结构域具有序列(SEQ ID NO:38)：
因此，这类示例性Fc双抗体的第一多肽链在N-末端至C-末端方向具有结构：肽1、IgG Fc区域的CH2-CH3结构域、连接体1、结合CD32B的抗体的VL结构域(VLCD32B)、含有半胱氨酸的连接体2、结合CD79B的抗体的VH结构域(VHCD79B)、连接体3、E-螺旋结构域、连接体4和C-末端。这类优选的多肽的氨基酸序列是(SEQ ID NO:39)：
在SEQ ID NO:39中，氨基酸残基1-10是肽1(SEQ ID NO:25)，氨基酸残基11-227是含有杵的IgG Fc区域的CH2和CH3结构域(SEQ ID NO:38)，氨基酸残基228-235是连接体3(SEQ ID NO:28)，氨基酸残基236-342是结合CD32B的抗体的VL结构域(VLCD32B)(SEQ ID NO:30)，氨基酸残基343-350是连接体1(SEQ ID NO:14)，氨基酸残基351-463是结合CD79B的抗体的VH结构域(VHCD79B)(SEQ ID NO:33)，氨基酸残基464-469是含有半胱氨酸的连接体2(SEQ ID NO:16)，氨基酸残基470-497是异源二聚体促进E-螺旋结构域(SEQ ID NO:21)和氨基酸残基498-502是连接体4(SEQ ID NO:29)。
编码第一多肽链的优选的多核苷酸具有序列(SEQ ID NO:40)：
这类示例性Fc双抗体的第二多肽链在N-末端至C-末端方向具有结构：结合CD79B的抗体的VL结构域(VLCD79B)、连接体1、结合CD32B的抗体的VH结构域(VHCD32B)、含有半胱氨酸的连接体2、异源二聚体促进K-螺旋结构域和C-末端。
第二多肽链的优选序列是(SEQ ID NO:41)：
在SEQ ID NO:41中，氨基酸残基1-112是结合CD79B的抗体的VL结构域(VLCD79B)(SEQ ID NO:32)，氨基酸残基113-120是连接体1(SEQ ID NO:14)，氨基酸残基121-236是结合CD32B的抗体的VH结构域(VHCD32B)(SEQ ID NO:31)，氨基酸残基237-242是含有半胱氨酸的连接体2(SEQ ID NO:16)和氨基酸残基243-270是异源二聚体促进K-螺旋结构域(SEQ IDNO:22)。
编码第二多肽链的优选的多核苷酸具有序列(SEQ ID NO:42)：
这类示例性CD32B x CD79B双特异性Fc双抗体具有第三多肽链，所述第三多肽链包含含有臼的IgG Fc区域的CH2和CH3结构域，所述CH2和CH3结构域具有氨基酸序列(SEQID NO:43)：
因此，这类示例性CD32B x CD79B双特异性Fc双抗体的第三多肽链的氨基酸序列是SEQ ID NO:44：
在SEQ ID NO:44中，氨基酸残基1-10是肽1(SEQ ID NO:25)和氨基酸残基11-227是含有臼的IgG Fc区域的CH2和CH3结构域(SEQ ID NO:43)。
编码第三多肽链的优选的多核苷酸具有序列(SEQ ID NO:45)：
本发明的第二示例性CD32B x CD79B双特异性Fc双抗体也具有三条多肽链(图3B)。第一多肽链包含含有杵的IgG Fc区域的CH2和CH3结构域，其具有氨基酸序列SEQ IDNO:38。
因此，这类第二示例性Fc双抗体的第一多肽链在N-末端至C-末端方向具有结构：肽1、含有杵的IgG Fc区域的CH2-CH3结构域、连接体1、结合CD32B的抗体的VL结构域(VLCD32B)、连接体2、结合CD79B的抗体的VH结构域(VHCD79B)、连接体3、含有半胱氨酸的E-螺旋结构域、连接体4和C-末端。这类优选的多肽的氨基酸序列是(SEQ ID NO:46)：
在SEQ ID NO:46中，氨基酸残基1-10是肽1(SEQ ID NO:25)，氨基酸残基11-227是含有杵的IgG Fc区域的CH2和CH3结构域(SEQ ID NO:38)，氨基酸残基228-235是连接体3(SEQ ID NO:28)，氨基酸残基236-342是结合CD32B的抗体的VL结构域(VLCD32B)(SEQ ID NO:30)，氨基酸残基343-350是连接体1(SEQ ID NO:14)，氨基酸残基351-463是结合CD79B的抗体的VH结构域(VHCD79B)(SEQ ID NO:33)，氨基酸残基464-468是连接体2(SEQ ID NO:15)，氨基酸残基469-496是含有半胱氨酸的异源二聚体促进E-螺旋结构域(SEQ ID NO:23)和氨基酸残基497-501是连接体4(SEQ ID NO:29)。
这类第二示例性Fc双抗体的第二多肽链在N-末端至C-末端方向具有结构：结合CD79B的抗体的VL结构域(VLCD79B)、连接体1、结合CD32B的抗体的VH结构域(VHCD32B)、连接体2、含有半胱氨酸的异源二聚体促进、K-螺旋结构域和C-末端。
第二多肽链的优选序列是(SEQ ID NO:47)：
在SEQ ID NO:47中，氨基酸残基1-112是结合CD79B的抗体的VL结构域(VLCD79B)(SEQ ID NO:32)，氨基酸残基113-120是连接体1(SEQ ID NO:14)，氨基酸残基121-236是结合CD32B的抗体的VH结构域(VHCD32B)(SEQ ID NO:31)，氨基酸残基237-241是连接体2(SEQID NO:15)和氨基酸残基242-269是含有半胱氨酸的异源二聚体促进K-螺旋结构域(SEQ IDNO:24)。
这类第二示例性Fc双抗体的第三多肽链包含含有臼的IgG区域的CH2和CH3结构域(SEQ ID NO:43)。
因此，这类示例性CD32B x CD79B双特异性Fc双抗体的第三多肽链的氨基酸序列是SEQ ID NO:48：
在SEQ ID NO:48中，氨基酸残基1-10是肽1(SEQ ID NO:25)和氨基酸残基11-227是含有臼的IgG Fc区域的CH2和CH3结构域(SEQ ID NO:43)。
本发明可选的CD32B x CD79B双特异性单价Fc双抗体分子示意性地显示于图3C中。这类可选的CD32B x CD79B Fc双抗体分子具有三条多肽链，其中第一和第二多肽链彼此共价结合并且第一和第三多肽链彼此结合。相对于优选的CD32B x CD79B双特异性单价Fc双抗体分子中存在的顺序，可选的CD32B x CD79B双特异性单价Fc双抗体分子的结构域顺序不同。然而，如在优选的CD32B x CD79B Fc双抗体的情况中，可选的CD32B x CD79B双特异性单价Fc双抗体的第一多肽链的VL结构域与可选的CD32B x CD79B双特异性单价Fc双抗体的第二多肽链的VH结构域相互作用，从而形成对第一抗原(即，CD32B或CD79B)特异性的第一功能性抗原结合位点。类似地，可选的CD32B x CD79B双特异性单价Fc双抗体的第二多肽链的VL结构域与可选的CD32B x CD79B双特异性单价Fc双抗体的第一多肽链的VH结构域相互作用，从而形成第二对第二抗原(即，CD79B或CD32B，取决于第一抗原的身份)特异性的第二功能性抗原结合位点。因此，协同第一和第二多肽链的VL和VH结构域的选择，以便两条多肽链总共包含能够结合至CD32B和CD79B的VL和VH结构域(即，它们包含VLCD32B/VHCD32B和VLCD79B/VHCD79B)(图3C)。每一个这样的VL和VH结构域和分隔开它们的间插连接体统称为该分子的抗原结合结构域。
这类可选的CD32B x CD79B Fc双抗体的第一多肽链在N-末端至C-末端方向包含氨基末端、能够结合至CD32B或CD79B的单克隆抗体的VL结构域(即，VLCD32B或VLCD79B)、间插间隔体肽(连接体1)、能够结合至CD79B(如果这样的第一多肽链含有VLCD32B)或CD32B(如果这样的第一多肽链含有VLCD79B)的单克隆抗体的VH结构域、含有半胱氨酸的第三间插间隔体肽(连接体2)、异源二聚体促进结构域、为异源二聚体促进结构域(优选E-螺旋结构域)提供改善的稳定性的任选的第四间隔体肽(连接体4)、包含半胱氨酸的肽(肽1)、IgG Fc结构域(优选地，含有杵的IgG Fc区域的CH2和CH3结构域和C-末端。优选地，第一多肽链的Fc结构域具有对于FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB(CD16b)基本上降低的结合能力或没有结合能力(相对于野生型Fc区域展示的结合)(图3C)。
这类可选的CD32B x CD79B Fc双抗体的第二多肽链在N-末端至C-末端方向包括氨基末端、能够结合至CD79B或CD32B的单克隆抗体的VL结构域(即，VLCD79B或VLCD32B，取决于为双抗体的第一多肽链选择的VL结构域)、间插连接体肽(连接体1)、能够结合至CD32B(如果这样的第二多肽链含有VLCD79B)或CD32B(如果这样的第二多肽链含有VLCD32B)的单克隆抗体的VH结构域、含有半胱氨酸的间隔体肽(连接体2)、异源二聚体促进结构域(优选K-螺旋结构域)和C-末端(图3C)。
优选的CD32B x CD79B Fc双抗体的第三多肽链在N-末端至C-末端方向包含氨基末端、包含半胱氨酸的肽(肽1)、具有与第一多肽链的Fc结构域相同同种型的IgG Fc结构域(优选地，含有臼的IgG Fc区域的CH2和CH3结构域)和C-末端。优选地，第三多肽链的Fc结构域具有对于FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB(CD16b)(相对于野生型Fc区域展示的结合)基本上降低的结合能力或没有结合能力(图3C)。
图3D显示这类Fc双抗体的变体，其中含有半胱氨酸的连接体2(例如，GGCGGG(SEQID NO:16))已经被不含半胱氨酸的连接体(例如，ASTKG(SEQ ID NO:15))替换，并且其中各个异源二聚体促进结构域含有半胱氨酸残基(例如，EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK(SEQ ID NO:23)和KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE(SEQ ID NO:24))。
药物组合物
本发明的组合物包括可用于制造药物组合物的原料药物组合物(例如，不纯的或非无菌组合物)，和可用于制备单位剂型的药物组合物(即，适于施用至受试者或患者的组合物)。这类组合物包含预防上或治疗上有效量的本发明的CD32B x CD79B结合分子，尤其是本发明的任意CD32B x CD79B双抗体或Fc双抗体，或这类剂和药学上可接受的载体的组合。优选地，本发明的组合物包含预防上或治疗上有效量的本发明的一种或多种分子和药学上可接受的载体。
本发明还包括这样的药物组合物，所述药物组合物包含这类CD32B x CD79B结合分子，尤其是本发明的任意CD32B x CD79B双抗体或Fc双抗体，和对于特定自身免疫性疾病或炎症性疾病抗原特异性的第二治疗性抗体(例如，自身免疫性疾病或炎症性疾病抗原特异性单克隆抗体)，以及药学上可接受的载体。
在具体的实施方案中，术语“药学上可接受的”表示获得联邦政府或州政府管理机构的许可或列于美国药典(U.S.Pharmacopeia)或其他通常获得认可的药典中，供用于动物，特别是用于人类。术语“载体”指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全)、赋形剂或媒介。这类药物载体可以是无菌液体诸如水和油，包括石油、动物油、植物油或合成来源的油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。盐水溶液和含水右旋糖以及甘油溶液也可用作液体载体，特别是对于可注射溶液而言。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉(dried skim milk)、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。若需要，组合物也可以含有少量湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂等形式。
一般而言，本发明组合物的成分被单独提供或以单位剂型混合在一起，例如作为标明活性剂的量的密封容器中的冻干粉或无水浓缩物，所述密封容器如安瓿或小袋(sachette)。当待通过输注施用组合物时，所述组合物可以用含有无菌的药品等级水或盐水的输注瓶分配。如果通过注射施用所述组合物，则可以提供一安瓿注射用无菌水或盐水，以便可以在施用之前混合成分。
可以将本发明的组合物配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括但不限于用阴离子形成的盐，所述阴离子例如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的阴离子，以及用阳离子形成的盐，所述阳离子例如来自钠、钾、铵、钙、铁的氢氧化物、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的阳离子。
本发明还提供了药物包或试剂盒，其包含一个或多个容器，所述容器装有(单独地或与这类药学上可接受的载体一起)CD32B x CD79B结合分子，尤其是本发明的任意CD32Bx CD79B双抗体或Fc双抗体。另外，用于治疗疾病的一种或多种其他预防剂或治疗剂也可以包括于所述药物包或试剂盒中。本发明还提供了这样的药物包或试剂盒，其包含一个或多个容器，所述容器装有本发明药物组合物的一种或多种成分。任选地，与这类容器关联的可以是采用管理药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的公告(notice)，所述公告反映了管理机构许可制造、使用或销售，供施用于人类。
本发明提供了用于上述方法的试剂盒。在一实施方案中，试剂盒包含本发明的一种或多种分子。在另一实施方案中，试剂盒还包含在一个或多个容器中的可用于治疗自身免疫性疾病或炎症性疾病的一种或多种其他预防剂或治疗剂。在另一实施方案中，试剂盒还包含结合与自身免疫性疾病或炎症性疾病相关的一种或多种自身免疫性疾病或炎症性疾病抗原的一种或多种抗体。在某些实施方案中，其他预防剂或治疗剂是化学治疗剂。在其他实施方案中，预防剂或治疗剂是生物治疗剂或激素治疗剂。
本发明组合物的用途
本发明的CD32B x CD79B结合分子，尤其是任意CD32B x CD79B双抗体或Fc双抗体具有治疗与CD79B的表达相关或特征在于CD79B的表达或具有所述疾病的B细胞组分的任意疾病或病况的能力。因此，不受限制，包含这类分子的药物组合物可用于诊断或治疗自身免疫性疾病或炎症性疾病或病况。因此，本发明可用于治疗、预防、减缓B细胞介导的疾病或病症的进展和/或改善B细胞介导的疾病或病症的症状，所述B细胞介导的疾病或病症包括移植物排斥、移植物抗宿主病(GvHD)、类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化症(MS)和系统性红斑狼疮(SLE)。图5显示优选的CD32B x CD79B Fc双抗体降低小鼠中的异源GvHD的能力(见，WO2015/021089，通过引用并入本文)。类似地，本发明的CD32B x CD79B结合分子可被采用以降低或抑制B细胞介导的免疫应答(例如，对于抗原、包括自身抗原的应答)，减弱B细胞激活，和/或降低或抑制B细胞增殖。
施用方法
通过向受试者施用有效量的本发明的药物组合物，可以提供本发明的组合物用来治疗、预防和改善与疾病、病症或感染相关的一种或多种症状。在优选的方面，这类组合物基本上是纯的(即基本上不含限制其效果或产生不期望的副作用的物质)。在具体实施方案中，受试者是动物，优选哺乳动物，诸如非灵长类动物(例如牛、马、猫科动物、犬科动物、啮齿动物等)或灵长类动物(例如，猴子诸如食蟹猴(cynomolgous monkey)、人类等)。在优选的实施方案中，受试者是人类。
通过修饰诸如例如脂质化来增强这类结合分子的吸收和组织渗透，可以减少或改变本发明的CD32B x CD79B结合分子的施用的剂量和“剂量方案”(施用频率)。在一个实施方案中，在治疗过程中单剂量水平(见下面)被施用一次或多次。在第二实施方案中，在治疗过程中提供的剂量会变化，例如递增剂量方案或递减剂量方案。施用的剂量可另外被调节，以反映受试者对疗法的耐受性和与该疗法相关的治疗成功程度。
可通过标准临床技术确定有效治疗、预防或改善与病症有关的一种或多种症状的本发明的CD32B x CD79B结合分子的剂量。待用于制剂中的精确剂量还取决于施用途径和状况的严重程度，并且应当根据从业者的判断和每一患者的情况决定。有效剂量可以根据来源于体外或动物模型测试系统的剂量应答曲线来推断。然而，本发明的CD32B x CD79B结合分子优选以通常为至少大约0.1mg/kg、至少大约0.2mg/kg、至少大约0.3mg/kg、至少大约0.5mg/kg、至少大约1.0mg/kg、至少大约3.0mg/kg、至少大约5.0mg/kg、至少大约7.5mg/kg、至少大约10.0mg/kg、至少大约15mg/kg、至少大约20mg/kg受试者的体重或更多的剂量被施用。尤其地，本发明的CD32B x CD79B结合分子以大约1.0mg/kg、大约3.0mg/kg、大约10.0mg/kg、大约20.0mg/kg、或大约30.0mg/kg的剂量被施用。本发明的CD32B x CD79B结合分子，尤其是任意CD32B x CD79B双抗体或Fc双抗体优选被包装在指示这类分子的量的密封容器诸如安瓿或小袋中。如本文使用的，如果在用于描述所述剂量的有效数字内描述剂量，则剂量被认为是“大约”所述剂量(例如，如果剂量是0.1mg/kg的剂量±0.05mg/kg，则所述剂量是大约0.1mg/kg，和如果剂量是15mg/kg的剂量±0.5mg/kg，则所述剂量是大约15mg/kg)。
本发明的CD32B x CD79B结合分子的施用频率可在大范围内变化，这取决于例如患者应答或施用方法。因此，本发明的组合物可以以下面的频率施用：一日一次、一日两次或一日三次、一周一次、一周两次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、一月一次，每六周一次、每十二周一次、每两月一次、每三月一次、一年两次或一年一次等。应当认识到，用于治疗的分子的有效剂量可以随着具体治疗的过程增加或降低。
然而，优选在以下治疗过程中施用本发明的CD32B x CD79B结合分子：1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周或多于15周，并且，这样的单治疗过程可以重复1次、2次、3次、4次、5次或更多次。在优选的实施方案中，用本发明分子的以下治疗过程治疗受试者：每两周一次(Q2W)、每三周一次(Q3W)、每四周一次(Q4W)、每五周一次(Q5W)、每六周一次(Q6W)、每七周一次(Q7W)、每八周一次(Q8W)、每九周一次(Q9W)、每十周一次(Q10W)、每十一周一次(Q11W)或每十二周一次(Q2W)。尤其优选以下面的治疗过程施用本发明的CD32B x CD79B结合分子：每两周一次(Q2W)、每三周一次(Q3W)、或每四周一次(Q4W)。在任意这类单治疗过程结束时，可以以相同剂量方案或以不同剂量方案重新设立治疗，并且可以涉及施用的CD32B x CD79B结合分子的相同剂量或不同剂量。因此，用治疗有效量或预防有效量的本发明的CD32B x CD79B结合分子治疗受试者可包括单治疗过程或可包括多个治疗过程，所述治疗过程可以与之前的任意治疗过程相同或与之前的任意治疗过程不同。
在优选的实施方案中，本发明的一个CD32B x CD79B结合分子、多个CD32B xCD79B结合分子，尤其是任意CD32B x CD79B双抗体或Fc双抗体在治疗过程Q2W、Q3W、或Q4W中以大约3.0mg/kg、大约10.0mg/kg、大约20.0mg/kg或大约30.0mg/kg的剂量被施用。
在一个实施方案中，本发明的CD32B x CD79B Fc双抗体作为干燥无菌冻干粉或无水浓缩物提供于密封容器中，并且可以例如用水或盐水重构至适当浓度，以施用于受试者。优选地，本发明的CD32B x CD79B结合分子，尤其是任意CD32B x CD79B双抗体或Fc双抗体作为干燥无菌冻干粉提供于密封容器中，其单位剂量为至少1mg，更优选地，至少2mg、至少3mg、至少5mg、至少10mg、至少20mg、至少30mg、至少50mg、至少100mg、至少200mg、至少300mg、至少500mg或至少1000mg，以便例如在添加适当量的载体后，可制备0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg或10mg/kg的可施用的剂量。
本发明的冻干CD32B x CD79B结合分子，尤其是任意CD32B x CD79B双抗体或Fc双抗体应当在其最初的容器中储存于2℃和8℃之间，并且所述分子应当在重构后的12小时内、优选在6小时内、在5小时内、在3小时内或在1小时内施用。在可选的实施方案中，这类分子以液体的形式提供于指示所述分子、融合蛋白或缀合分子的量和浓度的密封容器中。优选地，本发明液体形式的CD32B x CD79B结合分子提供于这样的密封容器中：在所述容器中所述分子以至少1μg/ml，更优选至少2.5mg/ml、至少5mg/ml、至少10mg/ml、至少50mg/ml、至少100mg/ml或至少200mg/ml的浓度存在。
在一个实施方案中，对于用作单剂疗法，可计算施用至患者的本发明的CD32B xCD79B结合分子的剂量。在另一实施方案中，本发明的结合分子可与其他治疗组合物联合使用，并且向患者施用的剂量小于这类结合分子用作单剂疗法时的剂量。
施用本发明的CD32B x CD79B结合分子，尤其是任意CD32B x CD79B双抗体或Fc双抗体的优选方法包括但不限于肠胃外施用(例如，皮内、肌肉、腹膜内、静脉内以及皮下施用)、硬膜外施用以及粘膜施用(例如鼻内和口腔途径施用)。在具体实施方案中，本发明的分子经肌肉、静脉内或皮下施用。组合物可以通过任何方便途径施用，例如通过输注或弹丸注射、通过上皮或黏膜皮肤被覆(lining)(例如口腔粘膜、直肠粘膜和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。
在具体实施方案中，可期望将本发明的药物组合物局部施用至需要治疗的区域；这可通过例如，但不限于下述方式实现：局部注入、通过注射或通过植入物的手段，所述植入物是多孔的、非多孔的或胶状材料，包括膜，比如硅橡胶膜或纤维。优选地，当施用本发明的分子时，必须注意使用不吸收该分子的材料。
本发明的实施方案
在下文中提供了本发明的某些实施方案的非限制性实例。
实施方案1.一种治疗炎症疾病或病况的方法，包括向需要其的受试者施用治疗有效量的CD32B x CD79B结合分子，其中所述CD32B x CD79B结合分子能够免疫特异性结合CD32B的表位和CD79B的表位，并且其中所述CD32B x CD79B结合分子以大约1mg/kg和大约30mg/kg之间的剂量和以每周一个剂量和每8周一个剂量之间的剂量方案被施用。
实施方案2.一种降低或抑制B细胞介导的免疫应答的方法，包括向需要其的受试者施用治疗有效量的CD32B x CD79B结合分子，其中所述CD32B x CD79B结合分子能够免疫特异性结合CD32B的表位和CD79B的表位，并且其中所述CD32B x CD79B结合分子以大约1mg/kg和大约30mg/kg之间的剂量和以每周一个剂量和每8周一个剂量之间的剂量方案被施用。
实施方案3.一种减弱B细胞激活的方法，包括向需要其的受试者施用治疗有效量的CD32B x CD79B结合分子，其中所述CD32B x CD79B结合分子能够免疫特异性结合CD32B的表位和CD79B的表位，并且其中所述CD32B x CD79B结合分子以大约1mg/kg和大约30mg/kg之间的剂量和以每周一个剂量和每8周一个剂量之间的剂量方案被施用。
实施方案4.一种降低或抑制B细胞增殖的方法，包括向需要其的受试者施用治疗有效量的CD32B x CD79B结合分子，其中所述CD32B x CD79B结合分子能够免疫特异性结合CD32B的表位和CD79B的表位，并且其中所述CD32B x CD79B结合分子以大约1mg/kg和大约30mg/kg之间的剂量和以每周一个剂量和每8周一个剂量之间的剂量方案被施用。
实施方案5.实施方案1-4中任一项所述的方法，其中所述CD32B x CD79B结合分子以大约1mg/kg的剂量被施用。
实施方案6.实施方案1-4中任一项所述的方法，其中所述CD32B x CD79B结合分子以大约3mg/kg的剂量被施用。
实施方案7.实施例1或4中任一项所述的方法，其中所述CD32B x CD79B结合分子以大约10mg/kg的剂量被施用。
实施方案8.实施方案1-7中任一项所述的方法，其中所述剂量方案是每2周一次剂量(Q2W)。
实施方案9.实施方案1-7中任一项所述的方法，其中所述剂量方案是每3周一次剂量(Q3W)。
实施方案10.实施方案1-7中任一项所述的方法，其中所述剂量方案是每4周一次剂量(Q4W)。
实施方案11.实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述CD32B x CD79B结合分子是结合CD32B的表位和CD79B的表位的双特异性抗体，或包含所述抗体的CD32B-结合结构域和CD79B-结合结构域的分子。
实施方案12.实施方案1-11中任一项所述的方法，其中所述CD32B x CD79B结合分子是结合CD32B的表位和CD79B的表位的CD32B x CD79B双特异性双抗体。
实施方案13.实施方案12所述的方法，其中所述CD32B x CD79B双特异性双抗体是CD32B x CD79B Fc双抗体。
实施方案14.实施方案1或5-13中任一项所述的方法，其中所述炎症性疾病或病况是自身免疫性疾病。
实施方案15.实施方案14所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自：阿狄森氏病、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病、重症肌无力、克罗恩病、皮肌炎、家族性腺瘤性息肉病、移植物抗宿主病(GvHD)、格雷夫斯病、桥本氏甲状腺炎、红斑狼疮、多发性硬化症(MS)；恶性贫血、赖特氏综合征、类风湿性关节炎(RA)、斯耶格伦氏综合佂、系统性红斑狼疮(SLE)、1型糖尿病、原发性血管炎(例如，风湿性多肌痛、巨细胞动脉炎、白塞病)、天疱疮、视神经脊髓炎、抗NMDA受体脑炎、格-巴二氏综合征(Guillain-Barrésyndrome)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、格雷夫斯眼病、IgG4相关的疾病、原发性血小板减少性紫癜(ITP)和溃疡性结肠炎。
实施方案16.实施方案15所述的方法，其中所述炎症性疾病或病况是GvHD、RA、MS或SLE。
实施方案17.实施方案1-16中任一项所述的方法，其中在施用第一剂量的所述CD32B x CD79B结合分子之后第36天，免疫球蛋白的血清水平降低。
实施方案18.实施方案17所述的方法，其中所述免疫球蛋白是IgM、IgA或IgG。
实施方案19.实施方案18所述的方法，其中所述免疫球蛋白是IgM。
实施方案20.实施方案1-19中任一项所述的方法，其中在施用第一剂量的所述CD32B x CD79B结合分子之后24小时，BCR介导的外周B细胞激活受到抑制，其中所述B细胞激活通过离体钙动员测定进行测定。
实施方案21.实施方案20所述的方法，其中所述BCR介导的B细胞激活被抑制至少50％，并且其中所述抑制维持至少6天。
实施方案22.实施方案1-21中任一项所述的方法，其中在施用第一剂量的所述CD32B x CD79B结合分子之后6小时，外周B细胞上的至少20％的CD32B x CD79B结合位点被占据。
实施方案23.实施方案1-22中任一项所述的方法，其中：
(A)B细胞上CD40的表达被下调；和/或
(B)CD40介导的IgG分泌被抑制。
实施方案24.实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
实施方案25.实施方案1-24中任一项所述的方法，其中所述CD32B x CD79B结合分子包含：
(A)VLCD32B结构域，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；和
(B)VHCD32B结构域，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
实施方案26.实施方案1-24中任一项所述的方法，其中所述CD32B x CD79B结合分子包含：
(A)VLCD79B结构域，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；和
(B)VHCD79B结构域，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
实施方案27.实施方案1-24中任一项所述的方法，其中所述CD32B x CD79B结合分子包含：
(A)VLCD32B结构域，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；
(B)VHCD32B结构域，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；
(C)VLCD79B结构域，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；和
(D)VHCD79B结构域，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
实施方案28.实施方案25-27中任一项所述的方法，其中所述CD32B x CD79B结合分子是双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段。
实施方案29.实施方案25-27中任一项所述的方法，其中所述CD32B x CD79B结合分子是CD32B x CD79B双特异性双抗体。
实施方案30.实施方案29所述的方法，其中所述CD32B x CD79B双特异性双抗体是CD32B x CD79B Fc双抗体。
实施方案31.实施方案30所述的方法，其中所述CD32B x CD79B Fc双抗体包含：
(A)第一多肽链，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
(B)第二多肽链，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；和
(C)第三多肽链，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。
现在已经一般性地描述了本发明，通过参考下述实施例，会更容易地理解本发明，所述实施例以示例的方式提供，而非意图限制本发明，除非另有说明。
实施例
实施例1：CD32B x CD79B双特异性单价Fc双抗体和对照双抗体的构建
制备CD32B x CD79B Fc双抗体，将其用作本发明的示例性CD32B x CD79B结合分子。CD32B x CD79B Fc双抗体包含具有表1所示氨基酸序列的三条多肽链：
发现上述CD32B x CD79B Fc双抗体能够同时结合至CD32B和结合至CD79B。用于形成双特异性单价双抗体的方法提供在WO 2006/113665、WO 2008/157379、WO 2010/080538、WO 2012/018687、WO 2012/162068和WO 2012/162067中。
实施例2：体内施用CD32B x CD79B双特异性Fc双抗体的评估
为了评价本发明的CD32B x CD79B结合分子的安全性和耐受性，将实施例1的CD32B x CD79B Fc双抗体施用至健康人受试者(年龄18-50岁，BMI为18-30kg/m2)。受试者不包括怀孕妇女或具有生育潜力的妇女。另外，受试者不包括具有明显急性或慢性医学疾病的个体、在给药4周内使用了任意处方药的个体或在给药1周内使用了非处方药的个体、每天吸烟10支以上的个体、具有结核病、乙型肝炎感染、丙型肝炎感染或HIV感染的个体、具有已知的自身免疫性病症或血管病症历史的个体、或具有阳性药物测试结果的个体。受试者也不包括具有大于450msec的校正QT(QTc)、小于45bpm或大于120bpm的心率、大于140mmHg的收缩压(SBP)或大于90mm Hg的舒张压(DBP)的个体。本研究中涉及的受试者的基线人口统计学示于表2中。
评估包括使用6个剂量群组(cohort)(每一群组由8名受试者构成，其中受试者1-6被施用CD32B x CD79B Fc双抗体且受试者7-8用安慰剂处理)。在每一个群组内，CD32B xCD79B Fc双抗体的施用被错开，使得受试者2在受试者1之后24小时时接受处理，受试者3-5在受试者2之后24小时时接受处理，且受试者7-8在受试者3-5之后24小时时接受处理。剂量群组描述于表3中。
监测被给药的受试者的CD32B x CD79B Fc双抗体相关的副作用：二级或三级心脏传导阻滞、室性心律失常(包括T尖端扭转性室性心动过速)、或根据针对参加预防性疫苗临床试验的健康成人和青少年志愿者的毒性分级指导(Guidance of Toxicity GradingScale)，≥3级不良事件。对于未包括的问题(例如，输注相关的反应)，则使用NCI CTCAEv4.03。记录到十五件不良事件，其中4件被视为与CD32B x CD79B Fc双抗体的施用有关。表4总结了观察到的不良事件。
A.Fc双抗体对体液免疫应答的药效学作用
图6显示示例性CD32B x CD79B结合分子在施用至人类受试者之后的药代动力学特征。通过验证的ELISA测定测量结合分子浓度，并且由非房室分析计算PK参数。如图中所指示的，受试者以0.01mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg体重的剂量接受CD32B x CD79B Fc双抗体，并且，在施用后至多57天内测量血清双抗体浓度。发现随着提高剂量浓度，双抗体的血清浓度、最大血清浓度(Cmax)和AUC(曲线下面积)均增加。双抗体的半衰期范围为4-8天。在最低剂量(0.01mg/kg)观察到双抗体的快速分布。平均清除时间(CL)范围为1.426mL/h/kg(0.01mg/kg剂量)至0.350mL/h/kg(10mg/kg剂量)，并且，CL和剂量之间的关系是非线性的，其中CL随着剂量增加而降低。作为双抗体在血容量中的分布的指示，稳态分布容积(Vss)据发现不依赖于剂量。血清半衰期(T1/2)范围为92hr(大约4天)——对于以0.03mg/kg剂量施用的双抗体，至191hr(大约8天)——对于以10mg/kg剂量施用的双抗体，并且随着剂量增加而增加，这与CL的剂量依赖性下降向一致。注意到PK曲线的中断，表明抗药物抗体(ADA)的存在。药代动力学数据总结在表5中。
B.结合至外周B细胞上的CD32B和CD79B的能力
发现施用的CD32B x CD79B结合分子能够结合至外周B细胞，显示最大占据≥1mg/kg体重，其中在更高剂量水平持续50％B细胞占据。在≥0.3mg/kg观察到持续20％B细胞占据。图7总结了在研究过程中与外周B细胞结合的离体流式细胞术分析。
C.外周B细胞和B细胞子集的激活状态的评估
进行流式细胞术分析，以评价双抗体的施用是否与B细胞计数(图8A)、T细胞计数(图8B)、B细胞与T细胞的比例(图8C)和CD4+T细胞与CD8+T细胞的比例(图8D)的持续变化有关。如图8A-8B所示，没有观察到外周T细胞群体的持续变化，在该研究中在较高剂量观察到B细胞群体的短暂下降。如图8C-8D所示，没有观察到这类外周B细胞群体和T细胞群体的比例的持续变化。
D.外周B细胞对离体BCR刺激的应答评价
进行离体钙动员测定，以评价示例性CD32B x CD79B结合分子的接受者的B细胞功能。简言之，从在各种给药前和给药后时间点采集的血液样品新鲜分离PBMC，并且，通过BCR连接诱发Ca++通量。引入离子霉素，以诱发最大Ca++通量。用通过离子霉素产生的值将AUC的值或峰值归一化，使得比例(AUC)＝AUC(IgM)/AUC(离子霉素)。图9A-9B图解该研究中应用的实验程序和数据分析方法。
发现用示例性CD32B x CD79B结合分子进行处理响应抗IgM抗体的BCR连接而减小钙通量，从而证明本发明的CD32B x CD79B结合分子对外周B细胞的抑制活性(图9C-9D)。
E.CD32B x CD79B结合分子下调CD27+记忆B细胞上的BCR表达
为了进一步评价施用示例性CD32B x CD79B结合分子的作用，利用流式细胞术测定膜结合的免疫球蛋白水平。图10A-10C显示施用CD32B x CD79B结合分子下调CD27+记忆B细胞上的BCR表达，如通过膜结合的IgG(mIgG)(图10A)、膜结合的IgM(mIgM)(图10B)和膜结合的IgD(mIgD)(图10C)的表达所测定的。
类似的研究确认了施用CD32B x CD79B结合分子下调CD27初始记忆B细胞上的BCR表达(图11A：膜结合的IgD(mIgD)；图11B：膜结合的IgM；图11C：膜结合的IgM(mIgM)的百分比变化)。
F.CD32B x CD79B结合分子调节血清Ig水平
评价了施用CD32B x CD79B结合分子对IgM、IgA和IgG免疫球蛋白的血清水平的影响。发现结合分子调节这些免疫球蛋白的血清水平，其中IgM水平展示最大的降低和IgG水平被很大程度地维持(分别见图12A-12C)。IgG的避免是期望的。减少的血清IgM水平暗示着对浆母细胞的影响。这些结果与在浆细胞上不表达的CD79B的表达一致。
G.CD32B x CD79B结合分子降低共刺激分子CD40的水平
发现施用CD32B x CD79B结合分子降低B细胞上的CD40表面表达水平(图13A)，如通过外周B细胞的表面共刺激分子的流式细胞术分析所测定的。
示例性结合分子(实施例1的CD32B x CD79B Fc双抗体)的单静脉内给药没有实质上降低外周B细胞计数，表明本发明的结合分子不消耗B细胞。流式细胞学分析证明本发明的结合分子能够结合至外周B细胞。在≥1mg/kg剂量水平观察到外周B细胞上这类结合位点的完全饱和。发现这样的结合的持续时间与应用的剂量水平有关。
本发明的结合分子介导多种药效学剂量依赖性效应，包括：
1.离体BCR诱导的Ca++动员的减少；
2.CD27+记忆B细胞子集上表面IgG-BCR表达的下调；
3.IgM+初始B细胞群体的减少；
4.初始B细胞上表面IgD-BCR表达的下调；和
5.B细胞上CD40表达的下调。
本发明的结合分子介导适于临床给药的多种有利的药效学特征。在≥1mg/kg剂量水平，外周B细胞被实施例1的示例性CD32B x CD79B Fc双抗体完全饱和，并且，结合的持续时间与不断增加的剂量水平相关，其中在≥0.3mg/kg剂量水平观察到持续20％占据。本发明的结合分子不消耗外周B细胞，据发现，其以剂量依赖性方式下调B细胞活性：
1.减少BCR介导的Ca2+流入；
2.下调表面免疫球蛋白表达；
3.降低血清IgM水平；和
4.下调CD40表达。
数据支持本发明在治疗炎症性疾病、病况和病症，尤其在治疗自身免疫性疾病方面的功用。
实施例3：对CD32B X CD79B结合分子的药代动力学和药效学性质的研究
采用Emax(最大效应)PK/PD模型以便更充分地研究本发明的CD32B x CD79B结合分子的药代动力学(PK)和药效学(PD)性质。简言之，在各种浓度的结合分子的存在下孵育B细胞，并且测定了导致Emax的50％、60％、80％和90％抑制的结合分子的浓度。
接受受试者展示的基线值范围为6.3％至15.6％(平均值＝9.4％)。产生最大应答的50％的浓度(EC50)为1677ng/mL。随着施用的结合分子的浓度增加，B细胞结合百分比达到稳定状态，其展示对73.1％的％B细胞结合的最大应答(Emax)。数据示于表6。基于体内人源化小鼠模型，预测的显示对IgG和IgM完全抑制的靶浓度为1,500ng/mL。该研究中的PK/PD关系表明≥EC50的浓度可以是用于治疗目的的潜在靶浓度。
图14A-14B显示数据(在两个不同浓度范围)。图15A-15F通过人类中叠加的CD32Bx CD79B结合分子药代动力学曲线描绘了临床前靶浓度，以确定可实现靶浓度的剂量(以剂量0.01mg/kg(图15A)；以剂量0.1mg/kg(图15B)；以剂量0.3mg/kg(图15C)；以剂量1mg/kg(图15D)；以剂量3mg/kg(图15E)；以剂量10mg/kg(图15F)实现靶浓度)。
将个体受试者药代动力学数据建模，并使用最佳模型参数评估，以预测在每两周一次(Q2W)、每三周一次(Q3W)和每四周一次(Q4W)给药方案中施用的多次给药的曲线。研究的剂量是1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg。进行暴露(exposure)参数的比较(Cmax、Cmin和AUC)，并研究了一房室和二房室IV输注模型。针对每2周一次剂量(Q2W)、每3周一次剂量(Q3W)和每4周一次剂量(Q4W)给药方案，剂量为0.3mg/kg受试者体重(图16A)、1mg/kg受试者体重(图16B)、3mg/kg受试者体重(图16C)和10mg/kg受试者体重(图16D)，显示了这类建模的结果。上述建模曲线中预期的变化性示于(具有SD)图17A-17D中。
针对1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg剂量，分别在表7、8和9中示出了第一剂量之后(Cmax1、Cmin1和AUC1)和稳态时(Cmaxss、Cminss和AUCss)的暴露参数的概要统计。所有3个剂量作为Q2W、Q3W和Q4W方案施用。在表7、8、9和10中，对于Q2W、Q3W和Q4W方案分别在14天、21天和28天的给药间隔内测定AUC。
如表7、8、9和10关于第一剂量数据所指示的，平均值Cmax1值与Q2W、Q3W和Q4W方案(即，对于1mg/kg给药方案，大约22μg/mL；对于3mg/kg给药方案，大约54μg/mL；和对于10mg/kg给药方案，大约187μg/mL)类似。在3个方案之间的平均值AUC1值中观察到轻微差别。对于具有较短的给药间隔(14天)的Q2W方案(即，对于1mg/kg给药方案，大约1.1μg/mL；对于3mg/kg给药方案，大约5μg/mL；和对于10mg/kg给药方案，大约24μg/mL)，观察到的平均值Cmin1(谷浓度)相比具有28天的较长给药间隔的Q4W方案(即，对于1mg/kg给药方案，大约0.14μg/mL；对于3mg/kg给药方案，大约0.95μg/mL；和对于10mg/kg给药方案，大约5μg/mL)更高。观察到Q3W方案的平均值Cmin1在Q2W和Q4W方案(即，对于1mg/kg给药方案，大约0.38μg/mL；对于3mg/kg给药方案，大约2.2μg/mL；和对于10mg/kg给药方案，大约5μg/mL)的平均值Cmin1中间。
如表7、8、9和10中关于稳态所指示的，相比第一剂量值，观察到平均值Cmaxss、Cminss和AUCss在数值上更高，并且，与第一剂量数据相一致的是，观察到Q2W、Q3W和Q4W方案的平均值Cmaxss是类似的(<13％差异)。另外，与第一剂量数据相一致的是，观察到3个方案之间平均值AUCss值的轻微差异。然而，Q4W方案的给药间隔是28天，并且，在相同间隔内，针对Q2W方案施用的剂量的数目是Q4W方案的两倍。因此，在28天给药间隔中，Q2W方案的AUCss预期大约是Q4W方案的AUCss的两倍。不考虑施用的方案，稳态中的暴露参数提示，当与第一剂量数据相比时，CD32B x CD79B结合分子的最小积累。
总之，本发明的结合分子已经以高达10mg/kg的剂量被施用至人类受试者，并且展示0.3mg/kg至10mg/kg的临床剂量范围。然而，更高的剂量比率可产生另外的效应。对于Q2W方案，剂量≥1mg/kg应实现靶浓度。对于Q3W方案，剂量≥3mg/kg应实现靶浓度。然而，较低的剂量(例如，0.3mg/kg)可有效实现期望的生物学活性。发现施用在人类健康受试者中是安全的并且证明了免疫调节活性。施用本发明的结合分子随后不会出现不期望的细胞因子释放或不伴随不期望的细胞因子释放。不考虑施用的剂量，药代动力学/药效学(PK/PD)和建模和模拟(M&S)分析表明，第一剂量或稳态Cmax值对于Q2W、Q3W和Q4W方案是类似的。在稳态时，预期Q2W方案在28天间隔(Q2W方案的给药间隔)中的AUCss大约是Q4W方案的两倍。对于具有较短给药间隔的Q2W和Q3W方案(分别为14和21天)，第一剂量或稳态Cmin值比具有28天的较长给药间隔的Q4W方案(更长的冲洗持续时间)更高。
尽管本发明的CD32B x CD79B结合分子的血清半衰期(T1/2)范围为大约4-8天，甚至在已经已经过第一半衰期之后，仍观察到显著比例的施用的CD32B x CD79B结合分子保持结合至外周B细胞。例如，就实施例1的CD32B x CD79B Fc双抗体而言，在0.3mg/kg剂量方案，观察到大于20％的占据达至少8天，并且在3mg/kg和10mg/kg剂量方案，观察到大于20％的占据长达30至接近50天。
对外周B细胞激活的抑制(尤其如在AUC测量结果中反映的)在大约第30天返回至基线。CD32B x CD79B结合分子还下调记忆B细胞(图10A-10C)和初始B细胞(图11A-11C)上的BCR靶，并且这样的下调还持续大约27天或更久。类似地，对血清Ig水平的调节(图12A-12C)在甚至最低的剂量持续至少57天。这些结果来自单剂量施用。因此，优选的剂量方案可基于CD32B x CD79B结合分子的半衰期、基于CD32B x CD79B结合分子的长效生物学活性或基于半衰期和这样的长效生物学活性二者。
实施例4：体内施用CD32B x CD79B双特异性Fc双抗体对体液免疫应答的评价
如本文所述的，本发明的CD32B x CD79B结合分子，尤其是双特异性Fc双抗体被设计来通过引发基于激活-抑制偶联的生理学负反馈环而抑制激活的B细胞。可研究CD32B xCD79B结合分子对响应经免疫原诸如匙孔戚血蓝蛋白(KLH)的接种的体液免疫应答的抑制作用。尤其地，基于来自非人类灵长类动物的PK数据的推测，当以0.3mg/kg施用时，循环CD32B x CD79B Fc双抗体将被保持高于一定的水平，以维持CD32B x CD79B Fc双抗体结合位点在外周血液B细胞上的20％占据达6天。基于体外研究，预期这样的占据水平维持对BCR介导的B细胞激活的50％抑制的最小值达至少6天。考虑到人类中对KLH接种的免疫应答花费大约4至6天，预期在以≥0.3mg/ml的剂量施用CD32B x CD79B结合分子的受试者中实施KLH接种将导致可检测的药效学活性，如由对使用KLH抗原进行接种的B细胞应答的抑制所证明的。因此，对于接受0.3mg/kg或更高剂量的CD32B x CD79B结合分子的所有受试者，可在第2天以1.0mg的皮下(SC)剂量施用KLH。另外，从输注CD32B x CD79B结合分子起不少于24小时可给与KLH接种，以在接种之前确认这类CD32B x CD79B结合分子对于每一位受试者的安全性和耐受性。
抗KLH IgG和IgM滴度、和它们从基线的抑制百分比变化、以及达到可量化的抗KLH、IgG和IgM免疫后应答的受试者的比例将根据剂量组(dose panel)和时间被表格化和总结。使用描述统计学评价CD32B x CD79B结合分子处理和安慰剂之间的免疫应答差异。如果判断适当，可进行另外的分析(例如，暴露-应答分析)。
实施例5：体内施用CD32B x CD79B双特异性Fc双抗体对体液免疫应答的评价
如上所述，可评估CD32B x CD79B结合分子对响应接种的体液免疫应答的抑制作用。失活的甲型肝炎疫苗(HAV)是用于评价免疫受损情况下(Valdez H,等(2000)“ResponseTo Immunization With Recall And Neoantigens After Prolonged Administration OfAn Hiv-1Protease Inhibitor-Containing Regimen,”ACTG 375team.AIDS clinicaltrials group.AIDS 14:11-21)以及在使用B细胞消耗疗法的患者中(Van Der Kolk LE,等(2002)“Rituximab Treatment Results In Impaired Secondary Humoral ImmuneResponsiveness,”Blood 100:2257-9)的免疫应答的确认的新抗原。在本研究中，评估上述示例性CD32B x CD79B结合分子在对具有阴性血清甲型肝炎滴度的正常健康志愿者中的HAV施用的响应中的抑制作用。简言之，以3mg/kg或10mg/kg通过IV输注施用单剂量的CD32Bx CD79B结合分子或安慰剂，在第2天，受试者还经肌肉接受单剂量的HAV((失活的甲型肝炎疫苗，Merck，50U/1-mL)。通过在接种的受试者中监测血清IgG特异性抗HAV特异性抗体的出现，评估施用CD32B x CD79B结合分子对于针对单剂量的HAV的免疫应答的影响。ARCHITECT HAVAb-IgG测定(Abbott Laboratories)用于检测HAV特异性IgG的存在。ARCHITECT HAVAb-IgG测定是用于定性检测对于人类血清或血浆中HAV的IgG抗体的化学发光微粒子免疫分析法(CMIA)。还使用具有改良Abbott系统的定量测定。
表11总结了经安慰剂或示例性CD32B x CD79B结合分子以3mg/kg或10mg/kg处理的10名受试者的初始结果。表12汇总了在研究中来自全部受试者的在接种后第56天的结果。在表13中汇总了在各个接种组的血清中存在的HAV特异性IgG(抗-HAV IgG)的平均浓度。图18绘制了在各个接种的受试者的血清中存在的抗-HAV IgG的浓度。该研究的结果表明施用CD32B x CD79B结合分子抑制激活的B细胞和响应接种的体液免疫应答。
实施例6：CD32B x CD79B结合分子阻断CD40依赖性B细胞应答
如上所述，施用CD32B x CD79B结合分子降低共刺激分子CD40的水平。体外评估了示例性CD32B x CD79B结合分子对CD40依赖性应答的活性。这些研究使用了测定系统，其模拟在滤泡CD4-辅助细胞提供的刺激信号的存在下，B细胞分化成分泌抗体(例如，IgG)的细胞的过程，该过程发生于次级淋巴器官或三级(territory)淋巴器官的生发中心。简言之，使用阴性选择试剂盒从健康供体的外周全血液纯化人类B细胞。在存在或不存在未稀释的或作为3-倍连续稀释液(1、1/3、1/9和1/27)使用的刺激物(CD40配体(500ng/mL)、IL-4(100ng/mL)和IL-21(20ng/mL))的情况下，在存在或不存在上述示例性CD32B x CD79B结合分子(20μg/mL)的情况下，在5％CO2 37℃培养箱中，在完全RPMI1640培养基中培养纯化的人类B细胞，达5天。收集培养上清液，并通过ELISA测定分泌的人类IgG。该研究的结果绘制在图19中。
如图19所示，CD32B x CD79B结合分子可减少IgG分泌，表明CD32B x CD79B结合分子可抑制与IgG产生相关的CD40介导的通路。
本说明书提到的所有出版物和专利通过参考并入本文，达到如同具体和单独指出每个单个出版物或专利申请通过参考以其整体并入的相同程度。尽管已经结合其具体实施方案描述了本发明，但是应当理解，其能够被进一步修改，并且本申请旨在覆盖大体上根据本发明原理并且包括与本公开偏离的本发明的任何变型、用途或改变，只要在本发明所属领域的已知或习惯实践内并且可应用至本文之前所阐释的本质特征。
序列表
<110> 宏观基因有限公司
Chen, Wei
Moore, Paul A.
Pandya, Namish Bharat
Bonvini, Ezio
<120> 使用CD32B x CD79B结合分子治疗炎症性疾病和病症的方法
<130> 1301.0145PCT
<150> US 62/432,328
<151> 2016-12-09
<150> US 62/346,717
<151> 2016-06-07
<160> 48
<170> PatentIn 版本3.5
<210> 1
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(107)
<223> 人类IgG CL κ结构域
<400> 1
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 2
<211> 104
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(104)
<223> 人类IgG CL λ结构域
<400> 2
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35 40 45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
50 55 60
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
65 70 75 80
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
85 90 95
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100
<210> 3
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(98)
<223> 人类IgG1 CH1结构域
<400> 3
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val
<210> 4
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(98)
<223> 人类 IgG2 CH1 结构域
<400> 4
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val
<210> 5
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(98)
<223> 人类 IgG4 CH1 结构域
<400> 5
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(15)
<223> 人类 IgG1 铰链区
<400> 6
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(12)
<223> 人类 IgG2 铰链区
<400> 7
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(12)
<223> 人类 IgG4 铰链区
<400> 8
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有S228P取代的人类IgG4铰链区
<400> 9
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 10
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(217)
<223> 人类IgG1的CH2-CH3结构域
<220>
<221> MISC_特征
<222> (217)..(217)
<223> XAA是赖氨酸(K)或不存在
<400> 10
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa
210 215
<210> 11
<211> 216
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(216)
<223> 人类IgG2的CH2-CH3结构域
<220>
<221> MISC_特征
<222> (216)..(216)
<223> XAA是赖氨酸(K)或不存在
<400> 11
Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
1 5 10 15
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
20 25 30
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
35 40 45
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
50 55 60
Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln
65 70 75 80
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
85 90 95
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro
100 105 110
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
115 120 125
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
130 135 140
Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
145 150 155 160
Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
165 170 175
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
180 185 190
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
195 200 205
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa
210 215
<210> 12
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(217)
<223> 人类IgG3的CH2-CH3结构域
<220>
<221> MISC_特征
<222> (217)..(217)
<223> XAA是赖氨酸(K)或不存在
<400> 12
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa
210 215
<210> 13
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(217)
<223> 人类IgG4的CH2-CH3结构域
<220>
<221> MISC_特征
<222> (217)..(217)
<223> XAA是赖氨酸(K)或不存在
<400> 13
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Xaa
210 215
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 优选的间插间隔体肽(连接体1)
<400> 14
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体2
<400> 15
Ala Ser Thr Lys Gly
1 5
<210> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体2
<400> 16
Gly Gly Cys Gly Gly Gly
1 5
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 异源二聚体促进结构域
<400> 17
Gly Val Glu Pro Lys Ser Cys
1 5
<210> 18
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 异源二聚体促进结构域
<400> 18
Val Glu Pro Lys Ser Cys
1 5
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 异源二聚体促进结构域
<400> 19
Gly Phe Asn Arg Gly Glu Cys
1 5
<210> 20
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 异源二聚体促进结构域
<400> 20
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
1 5
<210> 21
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "E-螺旋" 异源二聚体促进结构域
<400> 21
Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys
20 25
<210> 22
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "K-螺旋" 异源二聚体促进结构域
<400> 22
Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
20 25
<210> 23
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含半胱氨酸的"E-螺旋" 异源二聚体促进结构域
<400> 23
Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys
20 25
<210> 24
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含半胱氨酸的"K-螺旋" 异源二聚体促进结构域
<400> 24
Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
20 25
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含半胱氨酸的肽(肽1)
<400> 25
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 26
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含半胱氨酸的肽(肽1)
<400> 26
Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 27
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Intervening Linker Peptide (Linker 3)
<400> 27
Ala Pro Ser Ser Ser
1 5
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间插连接体肽(连接体3)
<400> 28
Ala Pro Ser Ser Ser Pro Met Glu
1 5
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间插连接体肽(连接体4)
<400> 29
Gly Gly Gly Asn Ser
1 5
<210> 30
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(107)
<223> 抗人CD32B抗体的VL结构域
<400> 30
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Glu Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Phe Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 31
<211> 116
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(116)
<223> 抗人CD32B抗体的VH结构域
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala
20 25 30
Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Asn Lys Ala Lys Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Ile Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Gly Ala Leu Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(112)
<223> 抗人CD79B抗体的VL结构域
<400> 32
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Asn Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 33
<211> 113
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(113)
<223> 抗人CD79B抗体的VH结构域
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Met Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 34
<211> 262
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一示例性CD32B x CD79B双特异性双抗体的第一多肽链
<400> 34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Glu Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Phe Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
115 120 125
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
130 135 140
Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
145 150 155 160
Glu Trp Ile Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn
165 170 175
Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser
180 185 190
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
195 200 205
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Met Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
210 215 220
Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Leu Glu
225 230 235 240
Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu
245 250 255
Val Ala Ala Leu Glu Lys
260
<210> 35
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一示例性CD32B x CD79B双特异性双抗体的第二多肽链
<400> 35
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Asn Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
130 135 140
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala
145 150 155 160
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Asn Lys Ala Lys
165 170 175
Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Ile Gly Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
195 200 205
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Ala Leu Gly Leu Asp
210 215 220
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly
225 230 235 240
Gly Gly Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
245 250 255
Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265 270
<210> 36
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二示例性CD32B x CD79B双特异性双抗体的第一多肽链
<400> 36
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Glu Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Phe Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
115 120 125
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
130 135 140
Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
145 150 155 160
Glu Trp Ile Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn
165 170 175
Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser
180 185 190
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
195 200 205
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Met Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
210 215 220
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys
225 230 235 240
Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val
245 250 255
Ala Ala Leu Glu Lys
260
<210> 37
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二示例性CD32B x CD79B双特异性双抗体的第二多肽链
<400> 37
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Asn Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
130 135 140
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala
145 150 155 160
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Asn Lys Ala Lys
165 170 175
Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Ile Gly Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
195 200 205
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Ala Leu Gly Leu Asp
210 215 220
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
225 230 235 240
Gly Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys
245 250 255
Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265
<210> 38
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有杵的IgG Fc区域的CH2-CH3结构域
<400> 38
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 39
<211> 502
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一示例性CD32B x CD79B双特异性Fc双抗体的第一多肽链
<400> 39
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Ala Pro Ser Ser Ser Pro Met Glu Asp Ile Gln Met Thr
225 230 235 240
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
245 250 255
Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Ser Trp Leu Gln
260 265 270
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr
275 280 285
Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Glu Ser Gly Thr
290 295 300
Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
305 310 315 320
Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Phe Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly
325 330 335
Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val
340 345 350
Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val
355 360 365
Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met
370 375 380
Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met
385 390 395 400
Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp
405 410 415
Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
420 425 430
Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
435 440 445
Ala Met Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
450 455 460
Gly Cys Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala
465 470 475 480
Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu
485 490 495
Lys Gly Gly Gly Asn Ser
500
<210> 40
<211> 1506
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码第一示例性CD32B x CD79B双特异性Fc双抗体的第一多肽链的多核苷酸
<400> 40
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ccgcgggggg accgtcagtc 60
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 420
aaccaggtca gcctgtggtg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660
ctctccctgt ctccgggtaa agccccttcc agctccccta tggaagacat ccagatgacc 720
cagtctccat cctccttatc tgcctctgtg ggagatagag tcaccatcac ttgtcgggca 780
agtcaggaaa ttagtggtta cttaagctgg ctgcagcaga aaccaggcaa ggcccctaga 840
cgcctgatct acgccgcatc cactttagat tctggtgtcc catccaggtt cagtggcagt 900
gagtctggga ccgagttcac cctcaccatc agcagccttc agcctgaaga ttttgcaacc 960
tattactgtc tacaatattt tagttatccg ctcacgttcg gaggggggac caaggtggaa 1020
ataaaaggag gcggatccgg cggcggaggc caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag 1080
gtgaagaagc ctggcgcctc agtgaaggtc tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc 1140
agctactgga tgaactgggt gcgacaggcc cctggacaag ggcttgagtg gatcggaatg 1200
attgatcctt cagacagtga aactcactac aatcaaaagt tcaaggacag agtcaccatg 1260
accacagaca catccacgag cacagcctac atggagctga ggagcctgag atctgacgac 1320
acggccgtgt attactgtgc gagagctatg ggctactggg ggcaagggac cacggtcacc 1380
gtctcctccg gaggatgtgg cggtggagaa gtggccgcac tggagaaaga ggttgctgct 1440
ttggagaagg aggtcgctgc acttgaaaag gaggtcgcag ccctggagaa aggcggcggg 1500
aactct 1506
<210> 41
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一示例性CD32B x CD79B双特异性Fc双抗体的第二多肽链
<400> 41
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Asn Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
130 135 140
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala
145 150 155 160
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Asn Lys Ala Lys
165 170 175
Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Ile Gly Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
195 200 205
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Ala Leu Gly Leu Asp
210 215 220
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly
225 230 235 240
Gly Gly Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
245 250 255
Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265 270
<210> 42
<211> 810
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码第一示例性CD32B x CD79B双特异性Fc双抗体的第二多肽链的多核苷酸
<400> 42
gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc 60
atctcctgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120
tttcagcaga ggccaggcca atctccaaac cgcctaattt atctggtgtc taaactggac 180
tctggggtcc cagacagatt cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240
agcagggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgct ggcaaggtac acattttccg 300
ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaaggag gcggatccgg cggcggaggc 360
gaagtgcagc ttgtggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc cctgagactc 420
tcttgtgccg cctctggatt cacttttagt gacgcctgga tggactgggt ccgtcaggcc 480
ccaggcaagg ggcttgagtg ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca 540
tactatgctg agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgacgc caaaaacagt 600
ctgtacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg ccgtgtatta ctgtggggct 660
ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc ctggtgaccg tctcctccgg aggatgtggc 720
ggtggaaaag tggccgcact gaaggagaaa gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca 780
cttaaggaaa aggtcgcagc cctgaaagag 810
<210> 43
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有臼的IgG Fc区域的CH2-CH3结构域
<400> 43
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 44
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一示例性CD32B x CD79B双特异性Fc双抗体的第三多肽链
<400> 44
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 45
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码第一示例性CD32B x CD79B双特异性Fc双抗体的第三多肽链的多核苷酸
<400> 45
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ccgcgggggg accgtcagtc 60
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 420
aaccaggtca gcctgagttg cgcagtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540
gacggctcct tcttcctcgt cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accgctacac gcagaagagc 660
ctctccctgt ctccgggtaa a 681
<210> 46
<211> 501
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二示例性CD32B x CD79B双特异性Fc双抗体的第一多肽链
<400> 46
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Ala Pro Ser Ser Ser Pro Met Glu Asp Ile Gln Met Thr
225 230 235 240
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
245 250 255
Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Ser Trp Leu Gln
260 265 270
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr
275 280 285
Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Glu Ser Gly Thr
290 295 300
Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
305 310 315 320
Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Phe Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly
325 330 335
Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val
340 345 350
Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val
355 360 365
Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met
370 375 380
Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met
385 390 395 400
Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp
405 410 415
Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
420 425 430
Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
435 440 445
Ala Met Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
450 455 460
Ser Thr Lys Gly Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu
465 470 475 480
Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys
485 490 495
Gly Gly Gly Asn Ser
500
<210> 47
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二示例性CD32B x CD79B双特异性Fc双抗体的第二多肽链
<400> 47
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Asn Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
130 135 140
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala
145 150 155 160
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Asn Lys Ala Lys
165 170 175
Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Ile Gly Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
195 200 205
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Ala Leu Gly Leu Asp
210 215 220
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
225 230 235 240
Gly Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys
245 250 255
Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265
<210> 48
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二示例性CD32B x CD79B双特异性Fc双抗体的第三多肽链
<400> 48
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225

Claims (23)

1.一种治疗炎症性疾病或病况的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用治疗有效量的CD32B x CD79B结合分子，其中所述CD32B x CD79B结合分子能够免疫特异性结合CD32B的表位和CD79B的表位，并且其中所述CD32B x CD79B结合分子以大约3mg/kg和大约30mg/kg之间的剂量和以每周一个剂量和每8周一个剂量之间的剂量方案被施用。
2.一种降低或抑制免疫应答的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用治疗有效量的CD32B x CD79B结合分子，其中所述CD32B x CD79B结合分子能够免疫特异性结合CD32B的表位和CD79B的表位，并且其中所述CD32B x CD79B结合分子以大约3mg/kg和大约30mg/kg之间的剂量和以每周一个剂量和每8周一个剂量之间的剂量方案被施用。
3.如权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述CD32B x CD79B结合分子以大约3mg/kg的剂量被施用。
4.如权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述CD32B x CD79B结合分子以大约10mg/kg的剂量被施用。
5.如权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述CD32B x CD79B结合分子以大约30mg/kg的剂量被施用。
6.如权利要求1-5任意一项所述的方法，其中所述剂量方案是每2周一次剂量(Q2W)。
7.如权利要求1-5任意一项所述的方法，其中所述剂量方案是每3周一次剂量(Q3W)。
8.如权利要求1-5任意一项所述的方法，其中所述剂量方案是每4周一次剂量(Q4W)。
9.如权利要求1-8任意一项所述的方法，其中所述CD32B x CD79B结合分子是结合CD32B的表位和CD79B的表位的双特异性抗体，或包含所述双特异性抗体的CD32B-结合结构域和CD79B-结合结构域的分子。
10.如权利要求1-9任意一项所述的方法，其中所述CD32B x CD79B结合分子是CD32B xCD79B双特异性双抗体。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述CD32B x CD79B双特异性双抗体是CD32B xCD79B Fc双抗体。
12.如权利要求1-11任意一项所述的方法，其中所述炎症性疾病或病况是自身免疫性疾病。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自：阿狄森氏病、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病、重症肌无力、克罗恩病、皮肌炎、家族性腺瘤性息肉病、移植物抗宿主病(GvHD)、格雷夫斯病、桥本氏甲状腺炎、红斑狼疮、多发性硬化症(MS)；恶性贫血、赖特氏综合征、类风湿性关节炎(RA)、斯耶格伦氏综合征、系统性红斑狼疮(SLE)、1型糖尿病、原发性血管炎(例如，风湿性多肌痛、巨细胞动脉炎、白塞病)、天疱疮、视神经脊髓炎、抗NMDA受体脑炎、格-巴二氏综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、格雷夫斯眼病、IgG4相关的疾病、原发性血小板减少性紫癜(ITP)和溃疡性结肠炎。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述炎症性疾病或病况是GvHD、RA、MS或SLE。
15.如权利要求1-14任意一项所述的方法，其中在施用第一剂量的所述CD32B x CD79B结合分子之后第36天，免疫球蛋白的血清水平降低。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述免疫球蛋白是IgM、IgA或IgG。
17.如权利要求1-16任意一项所述的方法，其中在施用第一剂量的所述CD32B x CD79B结合分子之后24小时，BCR介导的外周B细胞激活受到抑制，其中所述B-细胞激活通过离体钙动员测定进行测定。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述BCR介导的B细胞激活被抑制至少50％，并且其中所述抑制维持至少6天。
19.如权利要求1-18任意一项所述的方法，其中在施用第一剂量的所述CD32B x CD79B结合分子之后6小时，外周B细胞上的至少20％的CD32B x CD79B结合位点被占据。
20.如权利要求1-19任意一项所述的方法，其中：
(A)B细胞上CD40的表达被下调；和/或
(B)CD40介导的IgG分泌被抑制。
21.如权利要求1-20任意一项所述的方法，其中所述受试者是人。
22.如权利要求1-21任意一项所述的方法，其中所述CD32B x CD79B结合分子包含：
(A)VLCD32B结构域，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；
(B)VHCD32B结构域，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；
(C)VLCD79B结构域，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
(D)VHCD79B结构域，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述CD32B x CD79B Fc双抗体包含：
(A)第一多肽链，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
(B)第二多肽链，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；和
(C)第三多肽链，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。
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