TW201742633A - 使用ＣＤ３２ＢｘＣＤ７９Ｂ結合分子治療炎症性疾病和病症的方法 - Google Patents

Abstract

本發明涉及使用雙特異性結合分子的方法，所述雙特異性結合分子具有對於CD32B的表位特異性的結合位點和對於CD79B的表位特異性的結合位點，從而能夠同時結合至CD32B和CD79B。本發明尤其涉及這樣的分子，所述分子是雙特異性抗體或雙特異性雙抗體(尤其是另外包含Fc結構域的這類雙抗體)。本發明涉及這類分子的用途以及涉及包含這類分子的藥物組合物在治療炎症性疾病或病況中的用途。

Description

使用CD32B x CD79B結合分子治療炎症性疾病和病症的方法

[相關申請的交叉引用]

本申請主張美國專利申請案號第62/346,717號(2016年6月7日提交；申請中)和第62/432,328號(2016年12月9日提交；申請中)的優先權，上述申請中的每一個通過引用以其整體併入本文。

[序列表的參考]

根據37 C.F.R. 1.821以及下面的條款，本申請包括一個或多個序列表，其以電腦-可讀介質(檔案名：1301_0145PCT_ST25.txt，2017年5月19日創建，並且大小為59,748位元組)公開，該檔通過引用以其整體併入本文。

本發明涉及使用雙特異性結合分子的方法，所述雙特異性結合分子具有對於CD32B的表位特異性的結合位點和對於CD79B的表位特異性的結合位點，從而能夠同時結合至CD32B和CD79B。本發明尤其涉及這類分子，所述分子是雙特異性抗體或雙特異性雙抗體 (尤其是另外包含Fc結構域的這類雙抗體)。本發明涉及這類分子的用途，並且涉及含有這類分子的藥物組合物在治療炎症性疾病或病況中的用途。

I . Fcγ 受體和 CD32B 抗體-抗原複合物與免疫系統細胞的相互作用產生各種各樣的應答，應答的範圍從效應功能諸如抗體依賴性細胞毒性、肥大細胞脫粒和噬菌到諸如調節淋巴細胞增殖和抗體分泌的免疫調節信號。所有這些相互作用通過抗體或免疫複合物的Fc結構域與造血細胞上特化的細胞表面受體的結合而引發。經抗體和免疫複合物觸發的細胞應答的多樣性由Fc受體的結構異質性造成。Fc受體共用據推測介導細胞內信號傳導的結構上相關的配體結合結構域。

Fc受體是蛋白質的免疫球蛋白基因超家族的成員。它們是能夠結合免疫球蛋白分子的Fc部分的表面糖蛋白。每一個家族成員均通過Fc受體α鏈上的識別結構域而識別具有一種或多種同種型的免疫球蛋白。

Fc受體通過其對免疫球蛋白亞型的特異性來定義(見，Ravetch J.V.等(1991) “Fc Receptors ,” Annu. Rev. Immunol. 9:457-92；Gerber J.S.等(2001) “Stimulatory And Inhibitory Signals Originating From The Macrophage Fcγ Receptors ,” Microbes and Infection, 3:131-139；Billadeau D.D.等(2002) “ITAMs Versus ITIMs: Striking A Balance During Cell Regulation ,” J. Clin. Invest. 2(109):161-168l；Ravetch J.V.等(2000) “Immune Inhibitory Receptors ,” Science 290:84-89；Ravetch J.V.等(2001) “IgG Fc Receptors ,” Annu. Rev. Immunol. 19:275-90；Ravetch J.V. (1994) “Fc Receptors: Rubor Redux ,”Cell , 78(4): 553-60)。

能夠結合至IgG抗體的Fc受體稱為“FcγR”。該家族的每一個成員均是膜內在糖蛋白，具有與免疫球蛋白相關結構域的C2-組有關的細胞外結構域、一個跨膜結構域和具有可變長度的細胞質內結構域。存在三種已知FcγR，命名為FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。這三種受體由不同的基因編碼；然而，這三個家族成員之間廣泛的同源性提示，它們可能由於基因複製而源於共同的祖先。

FcγRII(CD32)蛋白質是40KDa膜內在糖蛋白，由於對單體Ig低的親和力(10⁶ M^-1 )，其僅結合複合的IgG。該受體是所有造血細胞，包括單核細胞、巨噬細胞、B細胞、NK細胞、嗜中性粒細胞、肥大細胞和血小板上存在的最廣泛表達的FcγR。FcγRII在其免疫球蛋白結合鏈中僅具有兩個免疫球蛋白樣區域，因此相比FcγRI對IgG的親和力低很多。存在三種人類FcγRII基因(FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIC(CD32C))，其均結合聚集體或免疫複合物中的IgG。

FcγRIIA和FcγRIIB細胞質結構域中的明顯差異產生了對受體連接的兩種功能上異質的應答。根本的差異是，在結合至IgG Fc區域之後，FcγRIIA同等型引發細胞內信號傳導，導致免疫系統啟動(例如，吞噬、呼吸爆發等)，然而，在結合至IgG Fc區域之後，FcγRIIB同等型引發信號，該信號導致免疫系統的阻抑或抑制(例如，抑制B細胞啟動等)。

這類啟動信號和抑制信號在連接至IgG Fc區域之後經FcγR轉導。這些完全相反的功能由不同受體同等型之間的結構差異造成。受體的細胞質信號傳導結構域中的兩個不同結構域稱為基於免疫受體酪氨酸的啟動基序(ITAM)或基於免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)，其是造成不同應答的原因。將不同細胞質酶招募至這些結構決定了FcγR-介導的細胞應答的結果。含有ITAM的FcγR複合物包括FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA，而含有ITIM的複合物僅包括FcγRIIB。

人類嗜中性粒細胞表達FcγRIIA基因。經免疫複合物或特定抗體交聯而成簇的FcγRIIA用於聚集ITAM以及促進ITAM磷酸化的受體相關的激酶。ITAM磷酸化用作Syk激酶的泊靠位點，所述Syk激酶的啟動導致下游底物(例如，PI₃ K)的啟動。細胞啟動導致促炎介質的釋放。

FcγRIIB基因在B淋巴細胞上表達；它的細胞外結構域與FcγRIIA具有96%同一性，並且以不能區分的方式結合IgG複合物。ITIM在FcγRIIB細胞質結構域中的存在定義了該FcγR抑制亞類。已經確定了該抑制的分子基礎。當FcγRIIB經由免疫複合物的IgG免疫球蛋白的Fc區域共連接至啟動受體時，FcγRIIB ITIM成為磷酸化的，並且吸引肌醇聚磷酸鹽5’-磷酸酶(SHIP)的SH2結構域，肌醇聚磷酸鹽5’-磷酸酶(SHIP)水解由於含ITAM的FcγR介導的酪氨酸激酶啟動而釋放的磷酸肌醇信使，從而防止細胞內Ca⁺⁺ 的流入。因此，FcγRIIB與啟動受體的這類交聯阻抑啟動受體的活性，從而抑制細胞應答。因此，在B細胞上，B細胞啟動、B細胞增殖和抗體分泌受到阻抑或被中止。因此，在開始進行抗原檢測時，發生單體IgG-抗原鍵合，並且，結合的抗體的Fc區域結合至啟動FcγR的ITAM，從而介導免疫系統的啟動。隨著宿主的應答發展，形成了多聚體IgG-抗原免疫複合物，其能夠結合至FcγRIIB (從而共連接此類複合物與啟動受體)，導致免疫應答的阻抑和最後中斷(見，例如，美國專利號：8,445,645；8,217,147；8,216,579；8,216,574；8,193,318；,192,737；8,187,593；8,133,982；8,044,180；8,003,774；7,960,512；7,786,270；7,632,497；7,521,542；7,425,619；7,355,008和美國專利公開號：2012/0276094；2012/0269811；2012/0263711；2012/0219551；2012/0213781；2012/0141476；2011/0305714；2011/0243941；2010/0322924；2010/0254985；2010/0196362；2010/0174053；2009/0202537；2009/0191195；2009/0092610；2009/0076251；2009/0074771；2009/0060910；2009/0053218；2009/0017027；2009/0017026；2009/0017023；2008/0138349；2008/0138344；2008/0131435；2008/0112961；2008/0044429；2008/0044417；2007/0077246；2007/0036799；2007/0014795；2007/0004909；2005/0260213；2005/0215767；2005/0064514；2005/0037000；2004/0185045)。II . B 細胞受體和 CD79B

B細胞是負責產生抗體的免疫系統細胞。另外，B細胞呈遞抗原並分泌細胞因數。B細胞對抗原的應答是正常免疫系統的必要組分。B細胞具有特化的細胞表面受體(B細胞受體；“BCR”)。如果B細胞遇到能夠結合至該細胞的BCR的抗原，則B細胞會被刺激以增殖和產生對結合的抗原特異性的抗體。為了產生針對抗原有效的應答，還需要BCR相關蛋白質和T細胞協助。抗原/BCR複合物被內化，並且抗原經蛋白水解被加工。一小部分抗原保持與B細胞表面上的主要組織相容性複合物-II (“MHC-II”)類分子複合，其中複合物可由T細胞識別。經由此類抗原呈遞啟動的T細胞分泌CD40L和誘發B細胞成熟的多種淋巴因數。

通過BCR的信號傳導在抗體產生、在自身免疫性和在建立免疫學耐受性方面發揮重要的作用 (Gauld, S.B.等(2002) “B Cell Antigen Receptor Signaling: Roles In Cell Development And Disease ,” Science 296(5573):1641-1642)。結合自身抗原並仍然在骨髓中的非成熟B細胞通過細胞凋亡被消除。相比之下，成熟B細胞上結合的抗原導致啟動、增殖、無反應性和細胞凋亡。觀察到的具體功能應答取決於B細胞是否通過被啟動的其它表面受體和特定信號轉導通路來接收共刺激信號。

BCR由膜免疫球蛋白構成，其與CD79的非共價結合的α和β亞基(分別為“CD79a”和“CD79B”)一起形成BCR複合物。CD79a和CD79B為信號轉導亞基，其包含信號轉導所需的保守的基於免疫受體酪氨酸的啟動基序(“ITAM”) (Dylke, J.等(2007) “Role of the extracellular and transmembrane domain of Ig-alpha/beta in assembly of the B cell antigen receptor (BCR) ,” Immunol. Lett. 112(1):47-57；Cambier, J.C. (1995) “New Nomenclature For The Reth Motif (or ARH1/TAM/ARAM/YXXL) ,” Immunol. Today 16:110)。由多價抗原導致的BCR複合物的聚集引發CD79a和CD79B ITAM的轉磷酸化和受體相關的激酶的啟動(DeFranco, A.L. (1997) “The Complexity Of Signaling Pathways Activated By The BCR ,” Curr. Opin. Immunol. 9:296-308；Kurosaki, T. (1997) “Molecular Mechanisms In B-Cell Antigen Receptor Signaling ,” Curr. Opin. Immunol. 9:309-318；Kim, K.M.等(1993) “Signalling Function Of The B-Cell Antigen Receptors ,” Immun. Rev. 132:125-146)。磷酸化的ITAM招募額外的效應子，如PI₃ K、PLC-γ和Ras/MAPK通路的成員。這些信號傳導事件是造成B細胞增殖和啟動標誌物(諸如MHC-II和CD86)的表達增加的原因，所述啟動標誌物是使B細胞致敏以便它們隨後與T-輔助細胞(“T_h ”)相互作用所需要的。III . 炎症性疾病或病況

炎症是身體的白血細胞和化學物質保護我們的身體免受外來物質諸如細菌和病毒的感染的過程。炎症的特徵通常是受影響區域的疼痛、腫脹、發熱和發紅。已知作為細胞因數和前列腺素的化學物質控制該過程，並且以有序和自限制的級聯方式釋放到血液或受影響的組織中。這種化學物質的釋放增加了血液向損傷區域或感染區域的流量，並且可導致發紅和發熱。一些化學物質致使流體滲漏到組織中，導致腫脹。這種保護性過程可以刺激神經和引起疼痛。當在相關區域中發生有限的時間時，這些變化為身體的益處發揮作用。

炎症性疾病或病況反映了免疫系統對身體自身細胞和組織的攻擊(即“自身免疫”應答)。存在以不同方式影響身體的許多不同自身免疫性病症。例如，在患有多發性硬化症的個體中大腦受到影響，在患有克羅恩病的個體中腸受到影響，並且在患有類風濕性關節炎的個體中各種關節的滑膜、骨骼和軟骨受到影響。隨著自身免疫性病症發展，可導致一種或多種類型的身體組織的破壞、器官的異常生長或器官功能的變化。自身免疫性病症可只影響一個器官或一種組織類型，或可影響多個器官和多種組織。通常受到自身免疫性病症影響的器官和組織包括紅細胞、血管、結締組織、內分泌腺(例如甲狀腺或胰腺)、肌肉、關節和皮膚。自身免疫性病症的實例包括但不限於阿狄森氏病、自身免疫性肝炎、自身免疫性內耳疾病、重症肌無力、克羅恩病、皮肌炎、家族性腺瘤性息肉病、移植物抗宿主病(GvHD)、格雷夫斯病、橋本氏甲狀腺炎、紅斑狼瘡、多發性硬化症(MS)；惡性貧血、賴特氏綜合症、類風濕性關節炎(RA)、斯耶葛籣氏綜合症、系統性紅斑狼瘡(SLE)、1型糖尿病、原發性血管炎(例如，風濕性多肌痛、巨細胞動脈炎、白塞病(Behçets))、天皰瘡、視神經脊髓炎、抗NMDA受體腦炎、格-巴二氏綜合症、慢性炎症性脫髓鞘性多發性神經病(CIDP)、格雷夫斯眼病、IgG4相關疾病、原發性血小板減少性紫癜(ITP)和潰瘍性結腸炎。

當身體的正常保護性免疫系統通過攻擊外來細胞或組織(其存在有益於身體) (例如，排斥移植物(宿主抗宿主疾病))而引起損害時也產生炎症性疾病或病況，或者由於引入的移植移植物的免疫活性細胞對免疫抑制宿主的細胞的排斥(移植物抗宿主病)也產生炎症性疾病或病況(DePaoli, A.M.等(1992) “Graft-Versus-Host Disease And Liver Transplantation ,” Ann. Intern. Med. 117:170-171；Sudhindran, S.等(2003) “Treatment Of Graft-Versus-Host Disease After Liver Transplantation With Basiliximab Followed By Bowel Resection ,” Am J Transplant. 3:1024-1029；Pollack, M.S.等(2005) “Severe, Late-Onset Graft-Versus-Host Disease In A Liver Transplant Recipient Documented By Chimerism Analysis ,” Hum. Immunol. 66:28-31；Perri, R.等(2007) “Graft Vs. Host Disease After Liver Transplantation: A New Approach Is Needed ,” Liver Transpl. 13:1092-1099；Mawad, R.等(2009) “Graft-Versus-Host Disease Presenting With Pancytopenia After En Bloc Multiorgan Transplantation: Case Report And Literature Review ,” Transplant Proc. 41:4431-4433；Akbulut, S.等(2012) “Graft-Versus-Host Disease After Liver Transplantation: A Comprehensive Literature Review ,” World J. Gastroenterol. 18(37): 5240-5248。

儘管最近在治療這類疾病或病況方面的進步，但對於能夠治療或預防炎症性疾病或病況的組合物仍存在需要。IV . 雙特異性結合分子 A. 雙特異性抗體

未修飾的天然抗體(例如，IgG)結合抗原的表位的能力取決於免疫球蛋白輕鏈和重鏈上可變結構域(即，其輕鏈可變結構域(VL 結構域 )和其重鏈可變結構域(VH 結構域 ))的存在和形成抗體的表位結合位點的相互作用。由於僅存在單一種類的輕鏈和單一種類的重鏈，因此天然抗體能夠僅僅結合一個表位種類(即，它們是單特異性的)，但是它們可結合該種類的多個拷貝(即，展示雙價或多價)。

然而，本領域已經例如通過如下手段成功地產生了雙特異性抗體：共表達具有不同表位特異性的兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對，接下來利用親和色譜法純化期望的分子，如Milstein等(1983) “Hybrid Hybridomas And Their Use In Immunohistochemistry ,” Nature 305:537-39、WO 93/08829描述的。在不同方法中，已經將具有期望的結合特異性(抗體-抗原結合位點)的抗體可變結構域融合至免疫球蛋白恒定結構域序列，例如融合至重鏈恒定結構域(包含至少一部分鉸鏈區、C_H2 區和C_H3 區)。可將編碼這些融合物的核酸插入到相同表達載體或不同表達載體中，並在合適的宿主有機體中表達。雙特異性抗體由例如以下文獻綜述：Traunecker等(1991) “Bispecific Single Chain Molecules (Janusins) Target Cytotoxic Lymphocytes On HIV Infected Cells ,” EMBO J. 10:3655-3659；Zhukovsky, E.A.等(2016) “Bispecific Antibodies And Cars: Generalized Immunotherapeutics Harnessing T Cell Re 方向 ,” Curr. Opin. Immunol. 40:24-35；Kiefer, J.D.等(2016) “Immunocytokines And Bispecific Antibodies: Two Complementary Strategies For The Selective Activation Of Immune Cells At The Tumor Site ,” Immunol. Rev. 270(1):178-192；Solimando, A.G.等(2016) “Targeting B-Cell Non Hodgkin Lymphoma: New And Old Tricks ,” Leuk. Res. 42:93-104；Fan, G.等(2015) “Bispecific Antibodies And Their Applications ,” J. Hematol. Oncol. 8:130；Grandjenette, C.等(2015) “Bispecific Antibodies: An Innovative Arsenal To Hunt, Grab And Destroy Cancer Cells ,” Curr. Pharm. Biotechnol. 16(8):670-683；Nuñez-Prado, N.等(2015) “The Coming Of Age Of Engineered Multivalent Antibodies ,” Drug Discov. Today 20(5):588-594；and Kontermann, R.E.等(2015) “Bispecific Antibodies,” Drug. Discov. Today 20(7):838-847。

除了完整的雙特異性抗體以外，本領域還開發了雙特異性單鏈抗體衍生物(例如，雙特異性T細胞銜接體(Engager) (BiTE))，其由具有針對第一結合分子的VL和VH結構域和針對第二結合分子的VL和VH結構域的單多肽鏈構成(例如，美國專利號7,112,324、7,235,641、7,575,923、7,919,089；Wu, J.等(2015) “Blinatumomab: A Bispecific T Cell Engager (BiTe) Antibody Against CD19/CD3 For Refractory Acute LymphoidLeukemia ,” J. Hematol. Oncol. 8:104；Lutterbuese, R.等(2008) “Conversion Of Cetuximab, Panitumumab, Trastuzumab And Omalizumab Into T-Cell-Engaging Bite Antibodies Creates Novel Drug Candidates Of High Potency ,” Proc. Am. Assoc. Cancer Res 99:Abs 2402；Baeuerle, P.A.等(2009) “Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy ,” Cancer Res. 69(12):4941-4944。B. 雙特異性雙抗體

本領域已經指出產生在能夠結合兩種或多種不同表位種類(即除了二價或多價外還展示雙特異性或多特異性)方面不同於天然抗體的雙抗體的能力。雙抗體的設計基於單鏈Fv構建體(scFv)，其具有由間插連接體分隔的VL結構域和相應的VH結構域，這允許這類結構域彼此相互作用。在由於使用了長度不足(小於約12個氨基酸殘基)的連接體而使VL和VH結構域的相互作用變得不可能的情況下，兩個這類scFv構建體可彼此相互作用形成雙價雙抗體分子，在所述雙價雙抗體分子中，一條鏈的VL結構域與另一條鏈的VH結構域締合(在以下文獻中綜述：Marvin等(2005)“Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies,” Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658；Holliger等(1993) “’Diabodies’: Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments, ” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448；US 2004/0058400 (Holliger等)；US 2004/0220388 (Mertens等)；Mertens, N.等, “New Recombinant Bi- and Trispecific Antibody Derivatives ,” 在Novel Frontiers In The Production Of Compounds For Biomedical Use中, A. VanBroekhoven等(編輯), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands (2001), 第195-208頁；Alt等(1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94；Lu, D.等(2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity ,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672；WO 02/02781 (Mertens等)；Olafsen, T.等(2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications ,” Protein Eng. Des. Sel. 17(1):21-27；Wu, A.等(2001) “Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fc Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange ,” Protein Engineering 14(2):1025-1033；Asano等(2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Region ,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992；Takemura, S.等(2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, ” Protein Eng. 13(8):583-588；Baeuerle, P.A.等(2009) “Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy ,” Cancer Res. 69(12):4941-4944)。

非單特異性雙抗體的供給帶來了明顯優勢：共連接和共定位表達不同表位的細胞的能力。二價雙抗體因此具有廣泛的應用，包括治療和免疫診斷。二價使得在各種應用中設計和工程化改造雙抗體時具有很大的靈活性，提供了對多聚抗原增強的親合力、不同抗原的交聯、以及依賴於兩個靶抗原的存在而對特定細胞類型的定向靶向。由於它們提高的價、低解離速率以及從迴圈中快速清除(對於小尺寸的雙抗體，為約50 kDa或低於約50 kDa)，本領域已知的雙抗體分子還在腫瘤造影領域顯示出特定用途(Fitzgerald等(1997)“Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris,” Protein Eng. 10:1221)。特別重要的是不同細胞的共連接，例如細胞毒性T細胞與腫瘤細胞的交聯(Staerz等(1985)“Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells,” Nature 314:628-631；和Holliger等(1996)“Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305)。

雙抗體表位元結合結構域也可以被引導至在T淋巴細胞、自然殺傷(NK)細胞或其它單核細胞上表達的任何免疫效應細胞的表面決定簇，諸如CD3、CD16、CD32或CD64。在許多研究中，還發現與效應細胞決定簇例如Fcγ受體(FcγR)結合的雙抗體啟動效應細胞(Holliger等(1996)“Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305；Holliger等(1999)“Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Specific T-cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins,” Cancer Res. 59:2909-2916；WO 2006/113665；WO 2008/157379；WO 2010/080538；WO 2012/018687；WO 2012/162068)。通常，效應細胞啟動通過抗原結合抗體與效應細胞經Fc-FcγR相互作用的結合而觸發；因此，就這一點而言，本發明的雙抗體分子可不依賴它們是否包含Fc結構域而展示Ig樣功能(例如如在本領域已知的任何效應功能測定中測定的或本文示例的(例如ADCC測定))。通過交聯腫瘤細胞和效應細胞，雙抗體不僅使效應細胞臨近腫瘤細胞，而且還導致有效的腫瘤殺傷(見例如，Cao等(2003)“Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics,” Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197)。

然而，實現上述優勢需要很高的成本。這類非單特異性雙抗體的形成需要成功組裝兩條或更多條獨特而不同的多肽(即這樣的形成要求雙抗體通過不同多肽鏈種類的異源二聚化而形成)。這一事實與單特異性雙抗體相反，其通過相同多肽鏈的同源二聚化而形成。因為為了形成非單特異性雙抗體，必須提供至少兩條不同的多肽(即兩條多肽種類)，且因為這類多肽的同源二聚化導致無活性分子(Takemura, S.等(2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, ” Protein Eng. 13(8):583-588)，因此這類多肽的產生必須以防止相同種類多肽之間的共價結合的方式實現(Takemura, S.等(2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, ” Protein Eng. 13(8):583-588)。因此，現有技術教導了這類多肽的非共價締合(見例如，Olafsen等(2004)“Covalent Dissulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27；Asano等(2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Region ,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992；Takemura, S.等(2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, ” Protein Eng. 13(8):583-588；Lu, D.等( 2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity ,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672)。

然而，本領域已經認識到，由非共價締合的多肽構成的雙特異性雙抗體不穩定，且易於解離成非功能性單體(見例如，Lu, D.等( 2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity ,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672)。

在面對這種挑戰時，本領域已經成功地開發了穩定的、共價結合的異源二聚非單特異性雙抗體(見例如，WO 2006/113665；WO 2008/157379；WO 2010/080538；WO 2012/018687；WO 2012/162068；Johnson, S.等(2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B-Cell Depletion ,” J. Molec. Biol. 399(3):436-449；Veri, M.C.等(2010) “Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold ,” Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943；Moore, P.A.等(2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma ,” Blood 117(17):4542-4551；Chen, X.等(2016) “Mechanistic Projection Of First In Human Dose For Bispecific Immuno-Modulatory P-Cadherin LP-DART - An Integrated PK/PD Modeling Approach ,” Clin. Pharmacol. Ther. doi: 10.1002/cpt.393；Tsai, P.等(2016) “CD19xCD3 DART Protein Mediates Human B-Cell Depletion In Vivo In Humanized BLT Mice ,” Mol. Ther. Oncolytics. 3:15024；Root等 (2016) “Development of PF-06671008, a Highly Potent Anti-P-cadherin/Anti-CD3 Bispecific DART Molecule with Extended Half-Life for the Treatment of Cancer ,” Antibodies 5:6；Sloan, D.D.等(2015) “Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells ,” PLoS Pathog. 11(11):e1005233；Al-Hussaini, M.等(2016) “Targeting CD123 In Acute Myeloid Leukemia Using A T-Cell-Directed Dual-Affinity Retargeting Platform ,” Blood 127(1):122-131)；Chichili, G.R.等(2015) “A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates ,” Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82；Zanin, M.等(2015) “An Anti-H5N1 Influenza Virus FcDART Antibody Is A Highly Efficacious Therapeutic Agent And Prophylactic Against H5N1 Influenza Virus Infection ,” J. Virol. 89(8):4549-4561)。這類方法涉及將一個或多個半胱氨酸殘基工程化到每一種應用的多肽種類中。例如，已經證明向這類構建體的C末端添加半胱氨酸殘基允許多肽鏈之間的二硫鍵合，從而穩定了所得的異源二聚體而不干擾二價分子的結合特性。

基於這些成就，本領域已經產生了一種雙特異性二價DART®雙抗體MGD010，其共連接抑制性Fcγ受體IIb (CD32B)和B細胞上的B細胞受體(BCR)組分CD79B，以便能夠同時結合CD32B和CD79B (Chen, W. (2014) “Development Of Human B-Lymphocyte Targeted Bi-Specific DART® Molecules For The Treatment Of Autoimmune Disorders ,” J. Immunol. 192(1 Supp.):200.9) (圖 1A )。本發明涉及用於使用和施用MGD010和其它CD32B x CD79B雙特異性分子，尤其是包含Fc結構域的這類雙特異性分子的改進的方法。

本發明涉及使用雙特異性結合分子的方法，所述雙特異性結合分子具有對於CD32B的表位特異性的結合位點和對於CD79B的表位特異性的結合位點，並因此能夠同時結合至CD32B和CD79B。本發明尤其涉及這類分子，所述分子是雙特異性抗體(即，“CD32B x CD79B抗體”)或雙特異性雙抗體(即，“CD32B x CD79B雙抗體”，尤其是另外包含Fc結構域的這類雙抗體(即，“CD32B x CD79B Fc雙抗體”)。本發明涉及這類分子的用途，並涉及包含這類分子的藥物組合物在治療炎症性疾病或病況中的用途。

詳細地，本發明提供了一種治療炎症性疾病或病況的方法，所述方法包括向需要其的受試者施用治療有效量的CD32B x CD79B結合分子，其中所述CD32B x CD79B結合分子能夠免疫特異性結合CD32B的表位和CD79B的表位，並且其中所述CD32B x CD79B結合分子以大約0.1 mg/kg和大約10 mg/kg之間的劑量以及以每週一個劑量和每15週一個劑量之間的劑量方案被施用。

本發明還涉及這類方法的實施方案，其中所述CD32B x CD79B結合分子以大約0.3 mg/kg的劑量被施用，其中所述CD32B x CD79B結合分子以大約1 mg/kg的劑量被施用，其中所述CD32B x CD79B結合分子以大約3 mg/kg的劑量被施用或其中所述CD32B x CD79B結合分子以大約10 mg/kg的劑量被施用。

本發明還涉及這類方法的實施方案，其中所述劑量方案是每2週一個劑量(Q2W)，其中所述劑量方案是每3週一個劑量(Q3W)，其中所述劑量方案是每4週一個劑量(Q4W)或其中所述劑量方案是每8週一個劑量(Q8W)。

本發明還涉及這類方法的實施方案，其中所述CD32B x CD79B結合分子是結合CD32B的表位和CD79B的表位的雙特異性抗體，或包含抗體的CD32B-和CD79B-結合結構域的分子。

本發明還涉及這類方法的實施方案，其中所述CD32B x CD79B結合分子是結合CD32B的表位和CD79B的表位的CD32B x CD79B雙特異性雙抗體，尤其地，其中所述CD32B x CD79B雙特異性雙抗體是CD32B x CD79B雙特異性Fc雙抗體。

本發明還涉及這類方法的實施方案，其中所述炎症性疾病或病況是自身免疫性疾病，尤其地，其中所述自身免疫性疾病選自：阿狄森氏病、自身免疫性肝炎、自身免疫內耳疾病、重症肌無力、克羅恩病、皮肌炎、家族性腺瘤性息肉病、移植物抗宿主病(GvHD)、格雷夫斯病、橋本氏甲狀腺炎、紅斑狼瘡、多發性硬化症(MS)；惡性貧血、賴特氏綜合症、類風濕性關節炎(RA)、斯耶葛籣氏綜合症、系統性紅斑狼瘡(SLE)、1型糖尿病、原發性血管炎(例如，風濕性多肌痛、巨細胞動脈炎、白塞病)、天皰瘡、視神經脊髓炎、抗NMDA受體腦炎、格-巴二氏綜合症、慢性炎症性脫髓鞘性多發性神經病(CIDP)、格雷夫斯眼病、IgG4相關疾病、原發性血小板減少性紫癜(ITP)和潰瘍性結腸炎。本發明尤其涉及這類方法的實施方案，其中所述炎症性疾病或病況是GvHD、MS、RA或SLE。

本發明還涉及這類方法的實施方案，其中所述免疫球蛋白的血清水準在施用第一劑量的CD32B x CD79B結合分子之後第36天降低。本發明尤其涉及這類方法的實施方案，其中免疫球蛋白是IgM、IgA或IgG。

本發明還涉及這類方法的實施方案，其中BCR介導的外周B細胞啟動在施用單劑量的CD32B x CD79B結合分子之後第24小時受到抑制，其中所述B細胞啟動通過離體鈣動員測定而確定。本發明尤其涉及這類方法的實施方案，其中BCR介導的B細胞啟動受到至少50%的抑制，並且其中所述抑制維持至少6天。

本發明還涉及這類方法的實施方案，其中在施用第一劑量的所述CD32B x CD79B結合分子之後6小時，外周B細胞上至少20%的CD32B x CD79B結合位點被佔據。

本發明還涉及這類方法的實施方案，其中受試者是人類。

本發明尤其涉及所有這類方法的實施方案，其中所述CD32B x CD79B結合分子包含： (A) VL_CD32B 結構域，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列； (B) VH_CD32B 結構域，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列； (C) VL_CD79B 結構域，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列； (D) VH_CD79B 結構域，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。

本發明還涉及這類方法的實施方案，其中所述CD32B x CD79B結合分子是雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段。

本發明還涉及這類方法的實施方案，其中所述CD32B x CD79B結合分子是結合CD32B的表位和CD79B的表位的CD32B x CD79B雙特異性雙抗體，尤其地，其中所述CD32B x CD79B雙特異性雙抗體是CD32B x CD79B Fc雙抗體。

本發明還涉及這類方法的實施方案，其中所述CD32B x CD79B Fc雙抗體包含： (A) 第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列； (B) 第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列； (C) 第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。

本發明涉及使用雙特異性結合分子的方法，所述雙特異性結合分子具有對於CD32B的表位特異性的結合位點和對於CD79B的表位特異性的結合位點，因而能夠同時結合至CD32B和CD79B。本發明尤其涉及這類分子，其是雙特異性抗體(即，“CD32B x CD79B抗體”)或雙特異性雙抗體(即，“CD32B x CD79B雙抗體”，尤其是另外包含Fc結構域的這類雙抗體(即，“CD32B x CD79B Fc雙抗體”)。本發明涉及這類分子的用途以及涉及含有這類分子的藥物組合物的用途。

如上所述，CD79B和CD32B (FcγRIIB)均由響應抗原識別而增殖的B細胞表達。本發明的雙特異性結合分子能夠免疫特異性結合至兩種分子，因而能夠共連接所述分子。這類共連接(見例如，圖 4 )允許CD32B分子的ITIM成為磷酸化的，並且吸引肌醇聚磷酸鹽5’-磷酸酶(SHIP)的SH2結構域，肌醇聚磷酸鹽5’-磷酸酶(SHIP)水解由於酪氨酸激酶-介導的CD79B ITAM的啟動而釋放的磷酸肌醇信使。這類水解抑制CD79B的ITAM啟動信號，從而用於減弱B細胞啟動。因此，本發明的雙特異性結合分子具有回應不需要的B細胞啟動、B細胞增殖和抗體分泌而抑制或阻抑宿主的免疫系統的能力，並且可用於治療炎症性疾病和病症，尤其是系統性紅斑狼瘡(SLE)、多發性硬化症(MS)和移植物抗宿主病(GVHD)。I . 抗體特徵和結構

如本文使用的，術語“抗體”是指由於在多肽或蛋白質或非蛋白質分子上存在特定結構域或部分或構象(“表位”)而能夠免疫特異性結合至這類分子的免疫球蛋白分子。含有表位的分子可具有免疫原性活性，以便其在動物中引起抗體產生應；這類分子稱為“抗原”)。含有表位的分子不一定是免疫原性的。

天然抗體(諸如IgG抗體)由與兩條重鏈與兩條輕鏈複合而構成。天然抗體(諸如IgG抗體)的每條輕鏈含有可變結構域(VL結構域)和恒定結構域(CL結構域)。天然抗體的每條重鏈含有重鏈可變結構域(VH結構域)、三個恒定結構域(CH1、CH2和CH3結構域)、和位於CH1和CH2結構域之間的“鉸鏈”結構域(“H”)。天然產生的免疫球蛋白(例如，IgG)的基本結構單元因此是具有兩條輕鏈和兩條重鏈的四聚體，通常以大約150,000 Da的糖蛋白表達。每條鏈的氨基末端(“N-末端”)部分包含主要負責抗原識別的大約100至110或更多個氨基酸的可變結構域。每條鏈的羧基末端(“C-末端”)部分限定恒定區域，其中輕鏈具有單一恒定結構域而重鏈通常具有三個恒定結構域和鉸鏈結構域。因此，IgG分子的輕鏈結構是n-VL-CL-c和IgG重鏈結構是n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c (其中n和c分別代表多肽的N-末端和C-末端)。抗體結合抗原表位的能力取決於抗體VL和VH結構域的存在和氨基酸序列。抗體輕鏈和抗體重鏈的相互作用，尤其是其VL和VH結構域的相互作用形成天然抗體的兩個表位結合位點之一。天然抗體能夠僅結合一個表位種類(即，它們是單特異性的)，但是它們可結合該種類的多個拷貝(即，展示二價或多價)。IgG分子的可變結構域由互補決定區(CDR)和稱為框架區段(FR)的非CDR區段組成，所述互補決定區(CDR)包含與表位接觸的殘基，所述框架區段一般維持結構和決定CDR環的定位，以便允許這類接觸(儘管某些框架殘基也可接觸抗原)。因此，V_L 和VH結構域具有結構n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c。作為(或可用作)抗體輕鏈的第一、第二和第三CDR的多肽在本文分別命名為CDR_L 1 結構域、 CDR_L 2 結構域和 CDR_L 3 結構域 。類似地，作為(或可用作)抗體重鏈的第一、第二和第三CDR的多肽在本文分別命名為CDR_H 1 結構域、 CDR_H 2 結構域和 CDR_H 3 結構域 。因此，術語CDR_L 1結構域、CDR_L 2結構域、CDR_L 3結構域、CDR_H 1結構域、CDR_H 2結構域和CDR_H 3結構域涉及的是當併入到蛋白質中時使得該蛋白質能夠結合至特異性表位的多肽，無論這類蛋白質是否是具有輕鏈和重鏈的抗體或雙抗體或單鏈結合分子(例如，scFv、BiTe等)或是另一類型的蛋白質。因此，如本文所使用，術語“表位元結合結構域 ”指負責這類分子免疫特異性結合表位的能力的表位元結合分子的部分。表位結合片段可包含這類抗體的1、2、3、4、5或所有6個CDR結構域，並且儘管能夠免疫特異性結合至這類表位，但可展示對與這類抗體的表位不同的這類表位的免疫特異性、親和力或選擇性。然而，優選地，表位結合片段將包含這類抗體的所有6個CDR結構域。抗體的表位結合片段可以是單多肽鏈(例如，scFv)，或可包含兩條或更多條多肽鏈，每條多肽鏈均具有氨基末端和羧基末端(例如，雙抗體、Fab片段、F(ab')₂ 片段等)。

如本文使用的，術語“抗體 ”包括單克隆抗體、多特異性抗體、人類抗體、人源化抗體、合成抗體、嵌合抗體、多克隆抗體、駱駝源化(camelized)抗體、單鏈Fv (scFv)、單鏈抗體、免疫學活性抗體片段(例如，能夠結合至表位的抗體片段，例如Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂ 片段、Fv片段、含有V_L 和/或V_H 結構域的片段、或含有特異性結合抗原等的這類VL結構域的1、2或3個互補決定區(CDR) (即，CDR_L 1、CDR_L 2和/或CDR_L 3)或VH結構域的1、2或3個互補決定區(CDR) (即，CDR_H 1、CDR_H 2和/或CDR_H 3))的片段、雙功能或多功能抗體、二硫化物連接的雙特異性Fv (sdFv)、胞內抗體和雙抗體、和任意上述各項的表位結合片段。尤其地，術語“抗體”意圖包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫學活性片段，即含有表位結合位點的分子。免疫球蛋白分子可以屬於任意類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、類別(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亞類(見，例如，美國專利公開號：20040185045；20050037000；20050064514；20050215767；20070004909；20070036799；20070077246；和20070244303)。最近數十年已經看到對抗體的治療潛能的興趣的復興，並且抗體已經成為一種主要類型的生物技術衍生的藥物(Chan, C.E.等(2009) “The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases ,” Singapore Med. J. 50(7):663-666)。超過200種基於抗體的藥物已經被批准使用或正在開發。

術語“嵌合抗體 ”指這樣的抗體，在所述抗體中，重鏈和/或輕鏈的一部分與來自一個物種(例如，小鼠)的抗體或抗體類別或亞類相同或同源，而剩餘部分與來自另一物種(例如，人類)的抗體或抗體類別或亞類相同或同源，只要它們展示期望的生物學活性。本文感興趣的嵌合抗體包括“靈長類動物源化(primatized)”抗體，其包含源自非人類靈長類動物(例如，舊大陸猴、猿等)的可變結構域抗原結合序列和人類恒定區域序列。

本文使用的術語“單克隆抗體 ”指基本上同質的(homogeneous)抗體群體中的抗體，即構成群體的單個抗體是相同的，除了可少量存在具有天然產生的突變的可能抗體，並且，本文使用的術語“多克隆抗體 ”指獲自異質抗體群體的抗體。術語“單克隆”指示抗體的特徵為基本上同質的一群抗體，而不應被理解為要求抗體以任何具體方法(例如，通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達、轉基因動物等)產生。該術語包括完整的免疫球蛋白以及上面根據“抗體”的定義描述的片段等。製備單克隆抗體的方法是本領域已知的。可採用的一種方法是Kohler, G.等(1975) “Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity ,” Nature 256:495-497的方法或其改良。典型地，單克隆抗體在小鼠、大鼠或兔子中開發。通過用免疫原性量的細胞、細胞提取物或包含期望表位的蛋白質製品免疫動物而產生抗體。免疫原可以是但不限於原代細胞、培養細胞系、癌細胞、蛋白質、肽、核酸或組織。用於免疫的細胞可被培養一段時間(例如，至少24小時)，然後將它們用作免疫原。細胞本身或聯合非變性佐劑，比如Ribi，可用作免疫原(見例如，Jennings, V.M. (1995) “Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production ,” ILAR J. 37(3):119-125)。一般而言，在用作免疫原時，細胞應保持完整並且優選是存活的。相比於破裂的細胞，完整的細胞可允許抗原被經免疫的動物更好地檢測。變性或烈性佐劑，例如弗氏佐劑的使用可使細胞破裂，因此，其應用受阻。免疫原可以以週期性間隔被多次施用，諸如兩週一次或一週一次，或者可以以維持動物中(例如，組織重組體中)的生存力這樣的方式被施用。可選地，對於期望的致病表位是免疫特異性的現有單克隆抗體和任意其它等價抗體可被測序，並通過本領域中已知的任意手段重組產生。在一個實施方案中，對這樣的抗體測序，然後將多核苷酸序列克隆至載體用於表達或增殖。編碼感興趣的抗體的序列可在宿主細胞中保持在載體中，並且，可然後擴增和冷凍宿主細胞，用於將來的使用。這類抗體的多核苷酸序列可用於基因操作，以產生本發明的單特異性或多特異性(例如，雙特異性、三特異性和四特異性)分子以及親和力優化的嵌合抗體、人源化抗體和/或犬源化(caninized)抗體，以改善抗體的親和力或其它特徵。

術語“scFv ”指單鏈可變結構域片段。通過使用短連接肽連接輕鏈和/或重鏈可變結構域而製備scFv分子。Bird等(1988) (“Single-Chain Antigen-Binding Proteins ,” Science 242:423-426)描述了連接肽的例子，其在一個可變結構域的羧基末端和另一可變結構域的氨基末端之間橋接約3.5 nm。已經設計和使用了其它序列的連接體(Bird等(1988) “Single-Chain Antigen-Binding Proteins ,” Science 242:423-426)。為了另外的功能，比如藥物的附著或附著至固體載體，連接體進而可被修飾。可經重組或合成產生單鏈變體。為了合成產生scFv，可使用自動合成儀。為了重組產生scFv，可將包含編碼scFv的多核苷酸的合適質粒引入到適當的宿主細胞中，所述宿主細胞可以是真核細胞，比如酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞，或原核細胞，比如大腸桿菌。可通過常規操作比如多核苷酸的連接製備編碼感興趣的scFv的多核苷酸。可使用本領域已知的標準蛋白質純化技術分離所得scFv。

術語“人源化抗體 ”指通常使用重組技術製備的嵌合分子，其具有來自非人類物種的免疫球蛋白的表位結合位點和基於人類免疫球蛋白結構和/或序列的分子的剩餘免疫球蛋白結構。表位元結合位元點可包含融合到恒定結構域上的完整可變結構域或僅僅包含移植至可變結構域中的適當框架區上的CDR。表位結合位點可以是野生型或通過一個或多個氨基酸取代被修飾。這消除了人個體中作為免疫原的恒定區，但是仍保留對外源可變區域的免疫應答的可能性(LoBuglio, A.F.等(1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224)。另一種方法不僅僅關注提供源自人類的恒定區域，而且也修飾可變區域，以便重塑它們使其盡可能地與人類形式接近。已知重鏈和輕鏈的可變區域都包含三個CDR，側翼是四個框架區域(FR)，所述CDR對所討論的抗原的應答不同並且決定結合能力，所述框架區域(FR)在給定物種中相對保守並且推定其為CDR提供支架。當針對特定抗原製備非人抗體時，通過將源自非人抗體的CDR移植在待修飾的人抗體中存在的FR上，可“重塑”或“人源化”可變區域。下面已經報導了該方法在各種抗體中的應用：Sato, K.等(1993) “Reshaping A Human Antibody To Inhibit The Interleukin 6-Dependent Tumor Cell Growth ,” Cancer Res 53:851-856；Riechmann, L.等(1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy ,” Nature 332:323-327；Verhoeyen, M.等(1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity ,” Science 239:1534-1536；Kettleborough, C. A.等(1991) “Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation ,” Protein Engineering 4:773-3783；Maeda, H.等(1991) “Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity ,” Human Antibodies Hybridoma 2:124-134；Gorman, S. D.等(1991) “Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185；Tempest, P.R.等(1991) “Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo ,” Bio/Technology 9:266-271；Co, M. S.等(1991) “Humanized Antibodies For Antiviral Therapy ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873；Carter, P.等(1992) “Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289；和Co, M.S.等(1992) “Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen ,” J. Immunol. 148:1149-1154。在一些實施方案中，人源化抗體保留所有的CDR序列(例如，人源化小鼠抗體，其包含來自小鼠抗體的所有六個CDR)。在其它實施方案中，人源化抗體具有一個或多個CDR (一個、兩個、三個、四個、五個或六個)，其氨基酸序列相對於初始抗體不同，也稱為“源自 ”初始抗體的一個或多個CDR (即，源自這類CDR、源自這類CDR的氨基酸序列的知識等)的一個或多個CDR。編碼抗體可變結構域的多核苷酸序列可用於產生這類衍生物和改善這類抗體的親和力或其它特徵。人源化抗體的一般原則涉及保留抗體的表位元結合部分的基本序列，同時用人抗體序列交換抗體的非人剩餘部分。人源化單克隆抗體有四個基本步驟。這些步驟是：(1)確定起始抗體輕鏈和重鏈可變結構域的核苷酸和預測的氨基酸序列；(2)設計人源化抗體或犬源化抗體，即，決定在人源化或犬源化過程中使用哪種抗體框架區域；(3)實際人源化或犬源化方法/技術；和(4)轉染和表達人源化抗體。見例如，美國專利號4,816,567；5,807,715；5,866,692；和6,331,415。

如上所述，本發明的雙特異性結合分子具有至少兩個表位元結合結構域。這類表位元結合結構域中的每一個均能夠以“免疫特異性 ”方式結合至表位元。如本文使用的，如果本發明的抗體、雙抗體或其它雙特異性結合分子，相對於可選的表位，與另一分子的區域(即，表位元)更經常、更快速、以更長的持久性和/或以更大的親和力反應或締合，則認為抗體、雙抗體或其它雙特異性結合分子“免疫特異性 ”結合該表位(或展示對該表位的“特異性 ”結合)。例如，特異性結合至CD32B的表位(或CD79B的表位)的抗體是，相比其結合至CD32B的其它表位(或結合至CD79B的其它表位)或結合至不是CD32B (或CD79B)的分子的表位，以更大的親和力、親合力、更容易和/或以更大的持久性結合這類表位的抗體。通過閱讀該定義，應理解，例如，免疫特異性結合至第一靶的抗體(或部分或表位元)可特異性或優先或非特異性或非優先結合至第二靶。因此，“免疫特異性結合”不必要求(儘管其可包括)排他性結合。一般而言(但不是必要的)，提及結合意思是“特異性”結合。抗體免疫特異性結合至表位的能力可經例如免疫測定來測定。

本發明的人源化分子的表位元結合結構域可包含融合至恒定結構域的完整可變結構域或僅包含移植至合適的框架區域的這類可變結構域的互補決定區(CDR)。表位元結合結構域可以是野生型或可以經一種或多種氨基酸取代而被修飾，例如以減小分子的任意恒定結構域 用作人類個體中的免疫原的能力。儘管這可消除人類個體中作為免疫原的恒定區域，但是仍保留了對外源可變結構域的免疫應答的可能性(LoBuglio, A.F.等(1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224)。另一種方法不僅僅關注提供源自人類的恒定區域，而且也修飾可變區域，以便重塑它們使其盡可能地與人類形式接近。已知重鏈和輕鏈二者的可變結構域都包含三個互補決定區(CDR)，側翼是四個框架區域(FR)，所述互補決定區(CDR)對所討論的抗原的應答不同並且決定結合能力，所述框架區域(FR)在給定物種中相對保守並且推定其為CDR提供支架。當針對特定抗原製備非人抗體時，通過將源自非人抗體的CDR移植在待修飾的人抗體中存在的FR上，可“重塑”或“人源化”可變結構域。下面已經報導了該方法在各種抗體中的應用：Sato, K.等(1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L.等(1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy ,” Nature 332:323-327；Verhoeyen, M.等(1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity ,” Science 239:1534-1536；Kettleborough, C. A.等(1991) “Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation ,” Protein Engineering 4:773-3783；Maeda, H.等(1991) “Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity ,” Human Antibodies Hybridoma 2:124-134；Gorman, S. D.等(1991) “Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185；Tempest, P.R.等(1991) “Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo ,” Bio/Technology 9:266-271；Co, M. S.等(1991) “Humanized Antibodies For Antiviral Therapy ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873；Carter, P.等(1992) “Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289；和Co, M.S.等(1992) “Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen ,” J. Immunol. 148:1149-1154。 在一些實施方案中，人源化抗體保留所有CDR序列(例如，人源化小鼠抗體，其含有來自小鼠抗體的所有六個CDR)。在其它實施方案中，人源化抗體具有一個或多個CDR(一個、兩個、三個、四個、五個或六個)，其序列相對於初始抗體不同。

已經描述了包含源自非人免疫球蛋白的表位結合位點的一些“人源化”抗體分子，包括具有齧齒動物或修飾的齧齒動物可變結構域、和融合至人類恒定結構域的它們的締合的互補決定區(CDR)的嵌合抗體(見例如，Winter等(1991) “Man-made Antibodies ,” Nature 349:293-299；Lobuglio等(1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989)；Shaw等(1987) “Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen ,” J. Immunol. 138:4534-4538；和Brown等(1987) “Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody ,” Cancer Res. 47:3577-3583)。其他參考文獻描述了移植至人支撐框架區域(FR)的齧齒動物CDR，其然後與適當的人抗體恒定結構域融合(見，例如，Riechmann, L.等(1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy ,” Nature 332:323-327；Verhoeyen, M.等(1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity ,” Science 239:1534-1536；和Jones等(1986) “Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse ,” Nature 321:522-525)。另外的參考文獻描述了由重組修飾的齧齒動物框架區域支撐的齧齒動物CDR。見例如，歐洲專利公開號519,596。這些“人源化的”分子被設計，以使對齧齒動物抗人抗體分子的不利免疫應答最小化，所述不利免疫應答限制了這些部分在人類接受者中治療應用的持續時間和效力。也可使用的人源化抗體的其他方法公開在以下文獻中：Daugherty等(1991) “Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins ,” Nucl. Acids Res. 19:2471-2476；和美國專利號6,180,377；6,054,297；5,997,867；和5,866,692。II . 抗體恒定區域

優選的CL結構域是人類IgG CL К結構域。示例性人類CL К結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:1)： RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC

可選地，示例性CL結構域是人類IgG CL λ結構域。示例性人類CL λ結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:2)： QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA GVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP TECS

示例性CH1結構域是人類IgG1 CH1結構域。示例性人類IgG1 CH1結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:3)： ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV

示例性CH1結構域是人類IgG2 CH1結構域。示例性人類IgG2 CH1結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:4)： ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTV

示例性CH1結構域是人類IgG4 CH1結構域。示例性人類IgG4 CH1結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:5)： ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRV

一個示例性鉸鏈區是人類IgG1鉸鏈區。示例性人類IgG1鉸鏈區的氨基酸序列是(SEQ ID NO:6)：EPKSCDKTHTCPPCP。

另一示例性鉸鏈區是人類IgG2鉸鏈區。示例性人類IgG2鉸鏈區的氨基酸序列是(SEQ ID NO:7)：ERKCCVECPPCP。

另一示例性鉸鏈區是人類IgG4鉸鏈區。示例性人類IgG4鉸鏈區的氨基酸序列是(SEQ ID NO:8)：ESKYGPPCPSCP。如本文所述的，IgG4鉸鏈區可包含穩定化突變諸如S228P取代。示例性穩定化的IgG4鉸鏈區的氨基酸序列是(SEQ ID NO:9)：ESKYGPPCP P CP。

抗體重鏈的CH2和CH3結構域相互作用形成Fc區域，其含有由細胞Fc受體識別的Fc結構域，所述細胞Fc受體包括但不限於Fc γ受體(FcγR) 諸如CD32B。示例性人類IgG1的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:10)： 231 240 250 260 270 280 APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 290 300 310 320 330 GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 340 350 360 370 380 PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 390 400 410 420 430 WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 440 447 ALHNHYTQKS LSLSPG X 通過Kabat闡釋的EU索引編號，其中X是賴氨酸(K)或不存在。

示例性人類IgG2的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:11)： 231 240 250 260 270 280 APPVA-GPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFNWYVD 290 300 310 320 330 GVEVHNAKTK PREEQFNSTF RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA 340 350 360 370 380 PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDISVE 390 400 410 420 430 WESNGQPENN YKTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 440 447 ALHNHYTQKS LSLSPG X 通過Kabat闡釋的EU索引編號，其中X是賴氨酸(K)或不存在。

示例性人類IgG3的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:12)： 231 240 250 260 270 280 APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFKWYVD 290 300 310 320 330 GVEVHNAKTK PREEQYNSTF RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 340 350 360 370 380 PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 390 400 410 420 430 WESSGQPENN YNTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NIFSCSVMHE 440 447 ALHNRFTQKS LSLSPG X 通過Kabat闡釋的EU索引編號，其中X是賴氨酸(K)或不存在。

示例性人類IgG4的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:13)： 231 240 250 260 270 280 APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD 290 300 310 320 330 GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS 340 350 360 370 380 SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 390 400 410 420 430 WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE 440 447 ALHNHYTQKS LSLSLG X 通過Kabat闡釋的EU索引編號，其中X是賴氨酸(K)或不存在。

在整個本說明書中，IgG重鏈的恒定區域中殘基的編號是如在Kabat等(Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第五版Public Health Service, NH1, MD (1991) (“Kabat”)）中的EU索引的編號，其通過參考明確併入本文。術語“在Kabat中的EU索引”指人類IgG1 EU抗體的編號。通過鏈中氨基酸的位置來命名免疫球蛋白的成熟重鏈和輕鏈的可變結構域中的氨基酸。Kabat描述了抗體的許多氨基酸序列，鑒定了每個亞組的氨基酸共有序列，並且為每個氨基酸指定殘基編號，並且，如Kabat定義的來鑒定CDR (應當理解，如Chothia, C. ＆Lesk, A.M. ((1987)“Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins, ” J.Mol.Biol.196: 901-917)限定的CDR_H 1提前五個殘基開始)。通過參考保守的氨基酸來比對所討論的抗體與Kabat中的共有序列中的一條，Kabat的編號方案可擴展至未包括在其綱要中的抗體。這種用於指定殘基編號的方法已經成為本領域的標準並且容易鑒定在不同抗體(包括嵌合變體或人源化的變體)中等同位置處的氨基酸。例如，在人抗體輕鏈50位的氨基酸佔據與在小鼠抗體輕鏈的50位氨基酸等同的位置。

已經在抗體恒定區域中的許多不同位置(例如，Fc位置，包括但不限於270、272、312、315、356和358位，通過Kabat闡釋的EU索引編號)處觀察到了多態性，因此示出的序列和現有技術的序列之間可能存在輕微的差別。已經充分表徵了人免疫球蛋白的多態性形式。目前，已知18個Gm同種異型(allotype)：G1m (1、2、3、17)或G1m (a、x、f、z)、G2m (23)或G2m (n)、G3m (5、6、10、11、13、14、15、16、21、24、26、27、28)或G3m (b1、c3、b3、b0、b3、b4、s、t、g1、c5、u、v、g5) (Lefranc, 等, “The Human IgG Subclasses: Molecular Analysis Of Structure, Function And Regulation. ”Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990)；Lefranc, G. 等1979, Hum. Genet.: 50, 199-211)。具體考慮本發明的抗體可併入任何免疫球蛋白基因的任何同種異型、異同種異型(isoallotype)或單倍型(haplotype)，並且不限於本文提供的序列的同種異型、異同種異型或單倍型。此外，在一些表達體系中，CH3結構域的C-末端氨基酸殘基(上面粗體顯示的)可在翻譯後去除。因此，CH3結構域的C-末端殘基是本發明的包含Fc結構域的結合分子中任選的氨基酸殘基。本發明尤其包括缺乏CH3結構域的C-末端殘基的本發明的結合分子。本發明還尤其包括的是包含CH3結構域的C-末端賴氨酸殘基的這類構建體。III . 本發明優選的 CD32B x CD79B 結合分子

本發明涉及雙特異性結合分子，其能夠結合至CD32B的表位和Cd79B的表位，以便能夠同時結合至在B細胞表面上自然排列的(即，不存在重組誘發的超表達)這類分子。這類特異性結合分子可由單條多肽鏈構成(例如，BiTe)，或可由一起(優選通過CD32B x CD79B結合分子的單條多肽鏈之間多個二硫鍵的存在)形成共價結合的複合物的兩條、三條、四條、五條或更多條多肽鏈構成。優選地，這類分子能夠免疫特異性結合至CD32B而基本上不干擾或妨礙CD32B分子結合至抗體的Fc結構域或結合至含Fc結構域的雙抗體的Fc結構域的能力。A. 雙特異性 ScFv 和抗體

在第一優選的實施方案中，本發明的CD32B x CD79B結合分子是單鏈分子諸如BiTe，其具有VL_CD32B 結構域、VL_CD79B 結構域、VH_CD32B 結構域和VL_CD79B 結構域，並且其中這類結構域由肽連接體分子分隔開，所述肽連接體分子允許VL_CD32B 結構域與VH_CD32B 結構域相互作用形成CD32B表位元結合結構域，並允許VL_CD79B 結構域與VH_CD79B 結構域相互作用形成CD79B表位元結合結構域。

在第二優選的實施方案中，本發明的CD32B x CD79B結合分子是雙特異性抗體或其表位結合片段，其具有VL_CD32B 結構域、VL_CD79B 結構域、VH_CD32B 結構域和VL_CD79B 結構域，從而形成CD32B表位元結合結構域和CD79B表位元結合結構域。這類抗體可包含Fc結構域。B. 雙特異性雙抗體 1. 不含 Fc- 結構域的雙特異性雙抗體

在進一步優選的實施方案中，本發明的CD32B x CD79B結合分子是雙特異性單價雙抗體，其由兩條、三條、四條、五條或更多條多肽鏈構成。

例如，圖1顯示由經二硫鍵彼此共價結合的兩條多肽鏈構成的CD32B x CD79B雙特異性單價雙抗體。第一多肽鏈的VL結構域與第二多肽鏈的VH結構域相互作用，從而形成對第一抗原(即，CD32B或CD79B)特異性的第一功能性抗原結合位點。類似地，第二多肽鏈的VL結構域與第一多肽鏈的VH結構域相互作用，從而形成對第二抗原(即，CD79B或CD32B，取決於第一抗原的身份)特異性的第二功能性抗原結合位點。因此，協同第一和第二多肽鏈的VL和VH結構域的選擇，以便兩條多肽鏈總共包含能夠結合至CD32B和CD79B的VL和VH結構域(即，它們包含VL_CD32B /VH_CD32B 和VL_CD79B /VH_CD79B ) (圖 1 )。共同地，每一種這樣的VL和VH結構域和分隔開它們的間插連接體統稱為該分子的抗原結合結構域。

優選的CD32B x CD79B雙特異性單價雙抗體的第一多肽鏈包含(在N-末端至C-末端方向)：氨基末端、能夠結合至CD32B或CD79B的單克隆抗體的VL結構域(即，VL_CD32B 或VL_CD79B )、間插間隔體肽(連接體 1 )、能夠結合至CD79B (如果這樣的第一多肽鏈含有VL_CD32B )或CD32B (如果這樣的第一多肽鏈含有VL_CD79B )的單克隆抗體的VH結構域、間插間隔體肽(連接體 2 )、異源二聚體促進結構域、為異源二聚體促進結構域提供改善的穩定性的任選的另外的結構域和C-末端(圖 1 )。

這類優選的CD32B x CD79B雙特異性單價Fc雙抗體的第二多肽鏈包含(在N-末端至C-末端方向)：氨基末端、能夠結合至CD79B或CD32B的單克隆抗體的VL結構域(即，VL_CD79B 或VL_CD32B ，取決於為雙抗體的第一多肽鏈選擇的VL結構域)、間插連接體肽 (連接體 1 )、能夠結合至CD32B (如果這樣的第二多肽鏈含有VL_CD79B )或CD32B (如果這樣的第二多肽鏈含有VL_CD32B )的單克隆抗體的VH結構域、間插間隔體肽(連接體 2 )、異源二聚體促進結構域和C-末端(圖 1 )。

最優選地，選擇分隔開這類VL和VH結構域的連接體1的長度，以基本上或完全防止這類VL和VH結構域彼此結合(例如由1、2、3、4、5、6、7、8或9個氨基酸殘基組成)。因此，第一多肽鏈的VL和VH結構域基本上或完全不能彼此結合。類似地，第二多肽鏈的VL和VH結構域基本上或完全不能彼此結合。優選的間插間隔體肽(連接體1)具有序列(SEQ ID NO:14)：GGGSGGGG。

連接體2的目的是分隔開多肽鏈的VH結構域與該多肽鏈的任選存在的異源二聚體促進結構域。多種連接體中的任意一種均可用於連接體2的目的。這類連接體2的優選的序列具有氨基酸序列：ASTKG (SEQ ID NO:15)，其源自IgG CH1結構域；或GGCGGG (SEQ ID NO:16)，其具有可用於經二硫鍵彼此共價結合第一和第二多肽鏈的半胱氨酸殘基。由於連接體2：ASTKG (SEQ ID NO:15)不具有這樣的半胱氨酸，因此，這類連接體2的使用優選與含有半胱氨酸的異源二聚體促進結構域，諸如SEQ ID NO:23的E-螺旋或SEQ ID NO:24的K-螺旋(見下面)的使用結合。因此，在一個實施方案中，多肽鏈的連接體2含有半胱氨酸殘基(以便彼此共價連接第一和第二多肽鏈)。在另一實施方案中，多肽鏈的連接體2不具有半胱氨酸，並且這類多肽鏈的異源二聚體促進結構域含有這樣的半胱氨酸殘基，從而彼此共價連接第一和第二多肽鏈。

第一和第二多肽鏈的異源二聚體的形成可通過包含異源二聚體促進結構域而驅動。這類結構域包括一條多肽鏈上的GVEPKSC (SEQ ID NO:17)或VEPKSC (SEQ ID NO:18)和另一條多肽鏈上的GFNRGEC (SEQ ID NO:19)或FNRGEC (SEQ ID NO:20) (US2007/0004909)。

然而，更優選地，本發明的異源二聚體促進結構域由具有相反電荷的一個、兩個、三個或四個串聯重複的螺旋結構域形成，所述螺旋結構域包含具有至少六個、至少七個或至少八個帶電荷的氨基酸殘基的序列(Apostolovic, B.等(2008) “pH-Sensitivity of the E3/K3 Heterodimeric Coiled Coil ,” Biomacromolecules 9:3173–3180；Arndt, K.M.等(2001) “Helix-stabilized Fv (hsFv) Antibody Fragments: Substituting the Constant Domains of a Fab Fragment for a Heterodimeric Coiled-coil Domain ,” J. Molec. Biol. 312:221-228；Arndt, K.M.等(2002) “Comparison of In Vivo Selection and Rational Design of Heterodimeric Coiled Coils ,” Structure 10:1235-1248；Boucher, C.等(2010) “Protein Detection By Western Blot Via Coiled–Coil Interactions ,” Analytical Biochemistry 399:138-140；Cachia, P.J. 等(2004) “Synthetic Peptide Vaccine Development: Measurement Of Polyclonal Antibody Affinity And Cross-Reactivity Using A New Peptide Capture And Release System For Surface Plasmon Resonance Spectroscopy ,” J. Mol. Recognit. 17:540-557；De Crescenzo, G.D.等(2003) “Real-Time Monitoring of the Interactions of Two-Stranded de novo Designed Coiled-Coils: Effect of Chain Length on the Kinetic and Thermodynamic Constants of Binding ,” Biochemistry 42:1754-1763；Fernandez-Rodriquez, J.等(2012) “Induced Heterodimerization And Purification Of Two Target Proteins By A Synthetic Coiled-Coil Tag ,” Protein Science 21:511-519；Ghosh, T.S.等(2009) “End-To-End And End-To-Middle Interhelical Interactions: New Classes Of Interacting Helix Pairs In Protein Structures ,” Acta Crystallographica D65:1032-1041；Grigoryan, G.等(2008) “Structural Specificity In Coiled-Coil Interactions ,” Curr. Opin. Struc. Biol. 18:477-483；Litowski, J.R.等(2002) “Designing Heterodimeric Two-Stranded α-Helical Coiled-Coils: The Effects Of Hydrophobicity And α-Helical Propensity On Protein Folding, Stability, And Specificity ,” J. Biol. Chem. 277:37272-37279；Steinkruger, J.D. 等(2012) “The d ′ --d--d ′ Vertical Triad is Less Discriminating Than the a ′ --a--a ′ Vertical Triad in the Antiparallel Coiled-coil Dimer Motif ,” J. Amer. Chem. Soc. 134(5):2626–2633；Straussman, R.等(2007) “Kinking the Coiled Coil – 帶負電荷的 Residues at the Coiled-coil Interface ,” J. Molec. Biol. 366:1232-1242；Tripet, B.等(2002) “Kinetic Analysis of the Interactions between Troponin C and the C-terminal Troponin I Regulatory Region and Validation of a New Peptide Delivery/Capture System used for Surface Plasmon Resonance ,” J. Molec. Biol. 323:345–362；Woolfson, D.N. (2005) “The Design Of Coiled-Coil Structures And Assemblies ,” Adv. Prot. Chem. 70:79-112；Zeng, Y.等(2008) “A Ligand-Pseudoreceptor System Based On de novo Designed Peptides For The Generation Of Adenoviral Vectors With Altered Tropism ,” J. Gene Med. 10:355-367)。

這類重複的螺旋結構域可以是精確的重複或可具有取代。例如，第一多肽鏈的異源二聚體促進結構域可包含具有八個帶負電荷的氨基酸殘基的序列和第二多肽鏈的異源二聚體促進結構域可包含具有八個帶負電荷的氨基酸殘基的序列。哪個螺旋被提供至第一或第二多肽鏈不重要，條件是具有相反電荷的螺旋被用於另一多肽鏈。然而，本發明的優選的CD32B x CD79B雙特異性單價雙抗體的第一多肽鏈具有帶負電荷的螺旋。帶正電荷的氨基酸可以是賴氨酸、精氨酸、組氨酸等和/或帶負電荷的氨基酸可以是谷氨酸、天冬氨酸等。帶正電荷的氨基酸優選地是賴氨酸和/或帶負電荷的氨基酸優選地是谷氨酸。僅僅採用一個異源二聚體促進結構域是可能的(因為這類結構域抑制同源二聚化，從而促進異源二聚化)，然而，優選本發明雙抗體的第一多肽鏈和第二多肽鏈都含有異源二聚體促進結構域。

在優選的實施方案中，異源二聚體促進結構域之一包含四個串聯的“E-螺旋”螺旋結構域(SEQ ID NO:21： E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K)，其谷氨酸殘基在pH 7形成負電荷，而另一個異源二聚體促進結構域包含四個串聯的“K-螺旋”結構域(SEQ ID NO:22: K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E)，其賴氨酸殘在pH 7形成正電荷。這類帶電荷結構域的存在促進第一多肽和第二多肽之間的締合，從而促進異源二聚化。尤其優選的是這樣的異源二聚體促進結構域，其中SEQ ID NO:21的四個串聯的“E-螺旋”螺旋結構域之一已經被修飾成含有半胱氨酸殘基： E VAA C E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:23)。類似地，尤其優選的是這樣的異源二聚體促進結構域，其中SEQ ID NO:22的四個串聯的“K-螺旋”螺旋結構域之一已經被修飾成含有半胱氨酸殘基： K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:24)。2. 含有 Fc 結構域的雙特異性雙抗體

在進一步優選的實施方案中，本發明的CD32B x CD79B雙抗體另外包含Fc結構域。本發明的這類含有Fc結構域的雙抗體的Fc結構域可以是完整的Fc區域(例如，完整的IgG Fc區域)或僅僅是完整的Fc區域的片段。儘管本發明的雙特異性單價Fc雙抗體的Fc結構域可具有結合至一種或多種Fc受體(例如，FcγR(一種或多種))的能力，但更優選這類Fc結構域具有對FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b)基本上降低的結合能力或沒有結合能力(相對於野生型Fc區域展示的結合)。本發明的雙特異性單價Fc雙抗體的Fc結構域可包括完整的Fc區域的一些或所有CH2結構域和/或一些或所有CH3結構域，或可包含變異的CH2和/或變異的CH3序列(相對於完整的Fc區域的CH2或CH3結構域，其可包括，例如一個或多個插入和/或一個或多個缺失)。本發明的雙特異性單價Fc雙抗體的Fc結構域可包含非Fc多肽部分，或可包含非天然的完整Fc區域的一部分，或可包含非天然產生的取向的CH2和/或CH3結構域(諸如例如，兩個CH2結構域或兩個CH3結構域或在N-末端至C-末端方向，與CH2結構域連接的CH3結構域等)。

本發明的這類含有Fc結構域的雙抗體可包含兩條多肽鏈(例如，圖2)或可包含三條多肽鏈(例如，圖3A-3E)或更多條多肽鏈。圖2顯示的雙抗體具有類似於上述結構的結構，除了各個異源二聚體促進結構域被CH2-CH3結構域取代。優選地，由這類多肽鏈形成的Fc結構域具有對於啟動的FcγR，諸如FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b)基本上降低的結合能力或沒有結合能力(相對於野生型Fc區域展示的結合)。

圖3A-3E顯示由三條多肽鏈構成的、可選的CD32B x CD79B Fc雙抗體，其中第一和第二多肽鏈彼此共價結合和第一和第三多肽鏈彼此共價結合。如在上述雙抗體中，第一多肽鏈的VL結構域與第二多肽鏈的VH結構域相互作用，從而形成對第一抗原(即，CD32B或CD79B)特異性的第一功能性抗原結合位點。類似地，第二多肽鏈的VL結構域與第一多肽鏈的VH結構域相互作用，從而形成對第二抗原(即，CD79B或CD32B，取決於第一抗原的身份)特異性的第二功能性抗原結合位點。因此，協同第一和第二多肽鏈的VL和VH結構域的選擇，以便兩條多肽鏈總共包含能夠結合至CD32B和CD79B的VL和VH結構域(即，它們包含VL_CD32B /VH_CD32B 和VL_CD79B /VH_CD79B )。每一個這樣的VL和VH結構域和分隔開它們的間插連接體統稱為該分子的抗原結合結構域。

在圖3A和圖3B所示的CD32B x CD79B雙特異性Fc雙抗體實施方案中，第一多肽鏈包含(在N-末端至C-末端方向)：氨基末端、包含半胱氨酸的肽(肽1)、由抗體Fc區域的CH2和CH3結構域的全部或一部分構成的IgG Fc結構域、間插連接體肽(連接體3)、能夠結合至CD32B或CD79B的單克隆抗體的VL結構域(即，VL_CD32B 或VL_CD79B )、間插肽(連接體1)、能夠結合至CD79B (如果這樣的第一多肽鏈含有VL_CD32B )或CD32B (如果這樣的第一多肽鏈含有VL_CD79B )單克隆抗體的VH結構域、間插間隔體肽(連接體2)、異源二聚體促進結構域、為異源二聚體促進結構域提供改善的穩定性的任選的第四間隔體肽(連接體4)和C-末端。

這類CD32B x CD79B雙特異性Fc雙抗體實施方案的第二多肽鏈包含(在N-末端至C-末端方向)：氨基末端、能夠結合至CD79B或CD32B的單克隆抗體的VL結構域(即，VL_CD79B 或VL_CD32B ，取決於為雙抗體的第一多肽鏈選擇的VL結構域)、間插連接體肽(連接體1)、能夠結合至CD32B (如果這樣的第二多肽鏈含有VL_CD79B )或CD32B (如果這樣的第二多肽鏈含有VL_CD32B )的單克隆抗體的VH結構域、間插間隔體肽(連接體2)、異源二聚體促進結構域和C-末端。

這類優選的CD32B x CD79B雙特異性Fc雙抗體的第三多肽鏈包含(在N-末端至C-末端方向)：氨基末端、包含半胱氨酸的肽(肽1)、與第一多肽鏈的Fc結構域具有相同同種型的IgG Fc結構域(優選地，抗體Fc區域的CH2和CH3結構域)和C-末端。

圖3A所示的CD32B x CD79B雙特異性Fc雙抗體的實施方案與圖3B所示實施方式的不同之處在於第一和第二多肽鏈的間插間隔體肽(連接體2)不含有半胱氨酸殘基，這類半胱氨酸殘基現在是這些多肽鏈的異源二聚體促進結構域的一部分。

在圖3C所示CD32B x CD79B雙特異性Fc雙抗體實施方案中，第一多肽鏈包含(在N-末端至C-末端方向)：氨基末端、能夠結合至CD32B或CD79B的單克隆抗體的VL結構域(即，VL_CD32B 或VL_CD79B )、間插肽(連接體1)、能夠結合至CD79B (如果這樣的第一多肽鏈含有VL_CD32B )或CD32B (如果這樣的第一多肽鏈含有VL_CD79B )的單克隆抗體的VH結構域、含有半胱氨酸的間插間隔體肽(連接體2)、異源二聚體促進結構域、包含半胱氨酸的肽(肽1)、由抗體Fc區域的CH2和CH3結構域的全部或一部分構成的IgG Fc結構域和C-末端。

這類CD32B x CD79B雙特異性Fc雙抗體實施方案的第二多肽鏈包含(在N-末端至C-末端方向)：氨基末端、能夠結合至CD79B或CD32B的單克隆抗體的VL結構域(即，VL_CD79B 或VL_CD32B ，取決於為雙抗體的第一多肽鏈選擇的VL結構域)、間插連接體肽(連接體1)、能夠結合至CD32B (如果這樣的第二多肽鏈含有VL_CD79B )或CD32B (如果這樣的第二多肽鏈含有VL_CD32B )的單克隆抗體的VH結構域、含有半胱氨酸的間插間隔體肽(連接體2)、異源二聚體促進結構域和C-末端。

圖3C和圖3D的CD32B x CD79B雙特異性Fc雙抗體的第三多肽鏈包含(在N-末端至C-末端方向)：氨基末端、包含半胱氨酸的肽(肽1)、具有與第一多肽鏈的Fc結構域相同同種型的IgG Fc結構域(優選地，抗體Fc區域的CH2和CH3結構域)和C-末端。

圖3D所示CD32B x CD79B雙特異性Fc雙抗體的實施方案中與圖3C所示實施方案的不同之處在於第一和第二多肽鏈的間插間隔體肽(連接體2)不含有半胱氨酸殘基，這類半胱氨酸殘基現在是這些多肽鏈的異源二聚體促進結構域的一部分。

第一和第三多肽鏈的包含半胱氨酸的肽(肽1)可包含相同的氨基酸序列或包含不同的氨基酸序列，並且含有1、2、3或更多個半胱氨酸殘基。尤其優選的肽1具有氨基酸序列(SEQ ID NO:25)：DKTHTCPPCP或(SEQ ID NO:26) GGGDKTHTCPPCP。優選的間插連接體肽(連接體3)包含氨基酸序列(SEQ ID NO:27)：APSSS，更優選具有氨基酸序列(SEQ ID NO:28)：APSSSPME。優選的第四間隔體肽(連接體4)具有序列GGG或是SEQ ID NO:29：GGGNS。

優選地，由本發明的含有Fc的雙抗體的第一和第三多肽鏈形成的Fc結構域具有對於啟動的FcγR，諸如FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b)基本上降低的結合能力或沒有結合能力(相對於野生型Fc區域展示的結合)。具有降低或消除與這類受體的結合的突變的Fc結構域是本領域中已知的，所示突變包括234和235位的氨基酸取代、265位的取代或297位的取代(見，例如，美國專利號5,624,821，通過引用併入本文)。在優選的實施方案中，CH2和CH3結構域包括在234位元用丙氨酸進行的取代和在235位用丙氨酸進行的取代。

本發明的含有Fc的雙抗體的第一和第三多肽鏈的CH2和/或CH3結構域不需要相同，並且有利地被修飾以促進兩條多肽鏈之間的複合。例如，氨基酸取代(優選以包含形成“杵(knob)”的大側基的氨基酸例如色氨酸進行取代)可被引入CH2或CH3結構域中，以便空間干擾防止與類似的突變結構域的相互作用並迫使突變結構域與其中互補或適應性突變已經被工程化的結構域——即“臼(hole)”(例如，用甘氨酸進行的取代)——配對。這樣的突變組可被工程化到構成Fc雙抗體分子的任意多肽對中，並且，進一步地被工程化到所述多肽鏈對的任何部分中。蛋白質工程化以相對於同源二聚化利於異源二聚化的方法在本領域中是悉知的，尤其就工程化免疫球蛋白樣分子而言，這些都包括在本文中(見例如，Ridgway 等(1996)“‘Knobs-Into-Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617-621；Atwell 等(1997)“Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270: 26-35；和Xie 等(2005)“A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95-101；其每一篇通過引用以其整體併入本文)。優選地，‘杵’被工程化到第一多肽鏈的CH2-CH3結構域中和‘臼’被工程化到第三多肽鏈的CH2-CH3結構域中。因此，‘杵’將有助於防止第一多肽鏈經其CH2和/或CH3結構域而同源二聚化。由於第三多肽鏈優選地含有‘臼’取代，其會與第一多肽鏈異源二聚化以及同其自身同源二聚化。通過修飾天然的IgG Fc區域以含有修飾T366W而產生優選的杵。通過修飾天然的IgG Fc區域以含有修飾T366S、L368A和Y407V而產生優選的臼。為了有助於從包含第一、第二和第三多肽鏈的、最終的雙特異性單價Fc雙抗體純化第三多肽鏈同源二聚體，優選地通過在435位的氨基酸取代(H435R)來突變第三多肽鏈的CH2和CH3結構域的蛋白質A結合位點。為了有助於從包含第一、第二和第三多肽鏈的、最終的雙特異性單價Fc雙抗體純化第三多肽鏈同源二聚體，優選地通過氨基酸取代來突變第三多肽鏈的CH2和CH3結構域的蛋白質A結合位點。因此，第三多肽鏈同源二聚體不結合蛋白質A，而雙特異性單價Fc雙抗體保持其經在第一多肽鏈上的蛋白質A結合位點而結合蛋白質A的能力。3. 示例性 CD32B x CD79B 雙特異性雙抗體

本發明的示例性CD32B x CD79B雙特異性雙抗體包含兩條或更多條多肽鏈，其包含： (1) 結合CD32B的抗體的VL結構域(VL_CD32B )，這類VL_CD32B 結構域具有序列(SEQ ID NO:30)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG GTKVEIK (2) 結合CD32B的抗體的VH結構域(VH_CD32B )，這類VH_CD32B 結構域具有序列(SEQ ID NO:31)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSS (3) 結合CD79B的抗體的VL結構域(VL_CD79B )，這類VL_CD79B 結構域具有序列(SEQ ID NO:32)： DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP LTFGGGTKLE IK (4) 結合CD79B的抗體的VH結構域(VH_CD79B )，這類VH_CD79B 結構域具有序列(SEQ ID NO:33)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGM IDPSDSETHY NQKFKDRVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARAM GYWGQGTTVT VSS

本發明的第一示例性CD32B x CD79B雙特異性雙抗體具有兩條多肽鏈。這類示例性雙抗體的第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向具有結構：N-末端、上述VL_CD32B 結構域、連接體1、上述VH_CD79B 結構域、含有半胱氨酸的連接體2、E-螺旋結構域和C-末端。這類優選的多肽的氨基酸序列是(SEQ ID NO:34)： IQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQKFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSGG CGGGEVAALE KEVAALEKEV AALEKEVAAL EK

在SEQ ID NO:34中，氨基酸殘基1-107是結合CD32B的抗體的VL結構域(VL_CD32B ) (SEQ ID NO:30)，氨基酸殘基108-115是連接體1 (SEQ ID NO:14)，氨基酸殘基116-228是結合CD79B的抗體的VH結構域(VH_CD79B ) (SEQ ID NO:33)，氨基酸殘基229-234是含有半胱氨酸的連接體2 (SEQ ID NO:16)，氨基酸殘基235-262是異源二聚體促進E-螺旋結構域(SEQ ID NO:21)。

這類示例性雙抗體的第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向具有(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列： DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSGGCG GGKVAALKEK VAALKEKVAA LKEKVAALKE

In SEQ ID NO:35中，氨基酸殘基1-112是結合CD79B的抗體的VL結構域(VL_CD79B ) (SEQ ID NO:32)，氨基酸殘基113-120是連接體1 (SEQ ID NO:14)，氨基酸殘基121-236是結合CD32B的抗體的VH結構域(VH_CD32B ) (SEQ ID NO:31)，氨基酸殘基237-242是含有半胱氨酸的連接體2 (SEQ ID NO:16)和氨基酸殘基243-270是異源二聚體促進K-螺旋結構域(SEQ ID NO:22)。

本發明的第二示例性CD32B x CD79B雙特異性雙抗體 具有兩條多肽鏈，其中第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向具有結構：N-末端、上述VL_CD32B 結構域、連接體1、上述VH_CD79B 結構域、連接體2、含有半胱氨酸的E-螺旋結構域和C-末端。這類優選的多肽的氨基酸序列是(SEQ ID NO:36)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQKFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSAS TKGEVAACEK EVAALEKEVA ALEKEVAALE K

在SEQ ID NO:36中，氨基酸殘基1-107是結合CD32B的抗體的VL結構域(VL_CD32B ) (SEQ ID NO:30)，氨基酸殘基108-115是連接體1 (SEQ ID NO:14)，氨基酸殘基116-228是結合CD79B的抗體的VH結構域(VH_CD79B ) (SEQ ID NO:33)，氨基酸殘基229-233是連接體2 (SEQ ID NO:15)，氨基酸殘基234-261是含有半胱氨酸的異源二聚體促進E-螺旋結構域(SEQ ID NO:23)。

這類第二示例性雙抗體的第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向具有(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列： DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSASTK GKVAACKEKV AALKEKVAAL KEKVAALKE

在SEQ ID NO:37中，氨基酸殘基1-112是結合CD79B的抗體的VL結構域(VL_CD79B ) (SEQ ID NO:32)，氨基酸殘基113-120是連接體1 (SEQ ID NO:14)，氨基酸殘基121-236是結合CD32B的抗體的VH結構域(VH_CD32B ) (SEQ ID NO:31)，氨基酸殘基237-241是連接體2 (SEQ ID NO:15)和氨基酸殘基242-269是含有半胱氨酸的異源二聚體促進K-螺旋結構域(SEQ ID NO:24)。4. 示例性 CD32B x CD79B 雙特異性 Fc 雙抗體

本發明的第一示例性CD32B x CD79B雙特異性Fc雙抗體具有三條多肽鏈(圖3A)。第一多肽鏈包含含有杵的IgG Fc區域的CH2和CH3結構域，所述CH2和CH3結構域具有序列(SEQ ID NO:38)： APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK

因此，這類示例性Fc雙抗體的第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向具有結構：肽1、IgG Fc區域的CH2-CH3結構域、連接體1、結合CD32B的抗體的VL結構域(VL_CD32B )、含有半胱氨酸的連接體2、結合CD79B的抗體的VH結構域(VH_CD79B )、連接體3、E-螺旋結構域、連接體4和C-末端。這類優選的多肽的氨基酸序列是(SEQ ID NO:39)： DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGKAPS SSPMEDIQMT QSPSSLSASV GDRVTITCRA SQEISGYLSW LQQKPGKAPR RLIYAASTLD SGVPSRFSGS ESGTEFTLTI SSLQPEDFAT YYCLQYFSYP LTFGGGTKVE IKGGGSGGGG QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGM IDPSDSETHY NQKFKDRVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARAM GYWGQGTTVT VSSGGCGGGE VAALEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEKGGG NS

在SEQ ID NO:39中，氨基酸殘基1-10是肽1 (SEQ ID NO:25)，氨基酸殘基11-227是含有杵的IgG Fc區域的CH2和CH3結構域(SEQ ID NO:38)，氨基酸殘基228-235是連接體3 (SEQ ID NO:28)，氨基酸殘基236-342是結合CD32B的抗體的VL結構域(VL_CD32B ) (SEQ ID NO:30)，氨基酸殘基343-350是連接體1 (SEQ ID NO:14)，氨基酸殘基351-463是結合CD79B的抗體的VH結構域(VH_CD79B ) (SEQ ID NO:33)，氨基酸殘基464-469是含有半胱氨酸的連接體2 (SEQ ID NO:16)，氨基酸殘基470-497是異源二聚體促進E-螺旋結構域(SEQ ID NO:21)和氨基酸殘基498-502是連接體4 (SEQ ID NO:29)。

編碼第一多肽鏈的優選的多核苷酸具有序列(SEQ ID NO:40)： gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ccgcgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgtggtg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa agccccttcc agctccccta tggaagacat ccagatgacc cagtctccat cctccttatc tgcctctgtg ggagatagag tcaccatcac ttgtcgggca agtcaggaaa ttagtggtta cttaagctgg ctgcagcaga aaccaggcaa ggcccctaga cgcctgatct acgccgcatc cactttagat tctggtgtcc catccaggtt cagtggcagt gagtctggga ccgagttcac cctcaccatc agcagccttc agcctgaaga ttttgcaacc tattactgtc tacaatattt tagttatccg ctcacgttcg gaggggggac caaggtggaa ataaaaggag gcggatccgg cggcggaggc caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggcgcctc agtgaaggtc tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctactgga tgaactgggt gcgacaggcc cctggacaag ggcttgagtg gatcggaatg attgatcctt cagacagtga aactcactac aatcaaaagt tcaaggacag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagctatg ggctactggg ggcaagggac cacggtcacc gtctcctccg gaggatgtgg cggtggagaa gtggccgcac tggagaaaga ggttgctgct ttggagaagg aggtcgctgc acttgaaaag gaggtcgcag ccctggagaa aggcggcggg aactct

這類示例性Fc雙抗體的第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向具有結構：結合CD79B的抗體的VL結構域(VL_CD79B )、連接體1、結合CD32B的抗體的VH結構域(VH_CD32B )、含有半胱氨酸的連接體2、異源二聚體促進K-螺旋結構域和C-末端。

第二多肽鏈的優選序列是(SEQ ID NO:41)： DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSGGCG GGKVAALKEK VAALKEKVAA LKEKVAALKE

在SEQ ID NO:41中，氨基酸殘基1-112是結合CD79B的抗體的VL結構域(VL_CD79B ) (SEQ ID NO:32)，氨基酸殘基113-120是連接體1 (SEQ ID NO:14)，氨基酸殘基121-236是結合CD32B的抗體的VH結構域(VH_CD32B ) (SEQ ID NO:31)，氨基酸殘基237-242是含有半胱氨酸的連接體2 (SEQ ID NO:16)和氨基酸殘基243-270是異源二聚體促進K-螺旋結構域(SEQ ID NO:22)。

編碼第二多肽鏈的優選的多核苷酸具有序列(SEQ ID NO:42)： gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc atctcctgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg tttcagcaga ggccaggcca atctccaaac cgcctaattt atctggtgtc taaactggac tctggggtcc cagacagatt cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc agcagggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgct ggcaaggtac acattttccg ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaaggag gcggatccgg cggcggaggc gaagtgcagc ttgtggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc cctgagactc tcttgtgccg cctctggatt cacttttagt gacgcctgga tggactgggt ccgtcaggcc ccaggcaagg ggcttgagtg ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgacgc caaaaacagt ctgtacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg ccgtgtatta ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc ctggtgaccg tctcctccgg aggatgtggc ggtggaaaag tggccgcact gaaggagaaa gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca cttaaggaaa aggtcgcagc cctgaaagag

這類示例性CD32B x CD79B雙特異性Fc雙抗體具有第三多肽鏈，所述第三多肽鏈包含含有臼的IgG Fc區域的CH2和CH3結構域，所述CH2和CH3結構域具有氨基酸序列(SEQ ID NO:43)： APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGK

因此，這類示例性CD32B x CD79B雙特異性Fc雙抗體的第三多肽鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO:44： DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGK

在SEQ ID NO:44中，氨基酸殘基1-10是肽1 (SEQ ID NO:25)和氨基酸殘基11-227是含有臼的IgG Fc區域的CH2和CH3結構域(SEQ ID NO:43)。

編碼第三多肽鏈的優選的多核苷酸具有序列(SEQ ID NO:45)： gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ccgcgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgagttg cgcagtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcgt cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accgctacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a

本發明的第二示例性CD32B x CD79B雙特異性Fc雙抗體也具有三條多肽鏈(圖3B)。第一多肽鏈包含含有杵的IgG Fc區域的CH2和CH3結構域，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:38。

因此，這類第二示例性Fc雙抗體的第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向具有結構：肽1、含有杵的IgG Fc區域的CH2-CH3結構域、連接體1、結合CD32B的抗體的VL結構域(VL_CD32B )、連接體2、結合CD79B的抗體的VH結構域(VH_CD79B )、連接體3、含有半胱氨酸的E-螺旋結構域、連接體4和C-末端。這類優選的多肽的氨基酸序列是(SEQ ID NO:46)： DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGKAPS SSPMEDIQMT QSPSSLSASV GDRVTITCRA SQEISGYLSW LQQKPGKAPR RLIYAASTLD SGVPSRFSGS ESGTEFTLTI SSLQPEDFAT YYCLQYFSYP LTFGGGTKVE IKGGGSGGGG QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGM IDPSDSETHY NQKFKDRVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARAM GYWGQGTTVT VSSASTKGEV AACEKEVAAL EKEVAALEKE VAALEKGGGN S

在SEQ ID NO:46中，氨基酸殘基1-10是肽1 (SEQ ID NO:25)，氨基酸殘基11-227是含有杵的IgG Fc區域的CH2和CH3結構域(SEQ ID NO:38)，氨基酸殘基228-235是連接體3 (SEQ ID NO:28)，氨基酸殘基236-342是結合CD32B的抗體的VL結構域(VL_CD32B ) (SEQ ID NO:30)，氨基酸殘基343-350是連接體1 (SEQ ID NO:14)，氨基酸殘基351-463是結合CD79B的抗體的VH結構域(VH_CD79B ) (SEQ ID NO:33)，氨基酸殘基464-468是連接體2 (SEQ ID NO:15)，氨基酸殘基469-496是含有半胱氨酸的異源二聚體促進E-螺旋結構域(SEQ ID NO:23)和氨基酸殘基497-501是連接體4 (SEQ ID NO:29)。

這類第二示例性Fc雙抗體的第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向具有結構：結合CD79B的抗體的VL結構域(VL_CD79B )、連接體1、結合CD32B的抗體的VH結構域(VH_CD32B )、連接體2、含有半胱氨酸的異源二聚體促進、K-螺旋結構域和C-末端。

第二多肽鏈的優選序列是(SEQ ID NO:47)： DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSASTK GKVAACKEKV AALKEKVAAL KEKVAALKE

在SEQ ID NO:47中，氨基酸殘基1-112是結合CD79B的抗體的VL結構域(VL_CD79B ) (SEQ ID NO:32)，氨基酸殘基113-120是連接體1 (SEQ ID NO:14)，氨基酸殘基121-236是結合CD32B的抗體的VH結構域(VH_CD32B ) (SEQ ID NO:31)，氨基酸殘基237-241是連接體2 (SEQ ID NO:15)和氨基酸殘基242-269是含有半胱氨酸的異源二聚體促進K-螺旋結構域(SEQ ID NO:24)。

這類第二示例性Fc雙抗體的第三多肽鏈包含含有臼的IgG區域的CH2和CH3結構域(SEQ ID NO:43)。

因此，這類示例性CD32B x CD79B雙特異性Fc雙抗體的第三多肽鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO:48： DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGK

在SEQ ID NO:48中，氨基酸殘基1-10是肽1 (SEQ ID NO:25)和氨基酸殘基11-227是含有臼的IgG Fc區域的CH2和CH3結構域(SEQ ID NO:43)。

本發明可選的CD32B x CD79B雙特異性單價Fc雙抗體分子示意性地顯示於圖3C中。這類可選的CD32B x CD79B Fc雙抗體分子具有三條多肽鏈，其中第一和第二多肽鏈彼此共價結合並且第一和第三多肽鏈彼此結合。相對於優選的CD32B x CD79B雙特異性單價Fc雙抗體分子中存在的順序，可選的CD32B x CD79B雙特異性單價Fc雙抗體分子的結構域順序不同。然而，如在優選的CD32B x CD79B Fc雙抗體的情況中，可選的CD32B x CD79B雙特異性單價Fc雙抗體的第一多肽鏈的VL結構域與可選的CD32B x CD79B雙特異性單價Fc雙抗體的第二多肽鏈的VH結構域相互作用，從而形成對第一抗原(即，CD32B或CD79B)特異性的第一功能性抗原結合位點。類似地，可選的CD32B x CD79B雙特異性單價Fc雙抗體的第二多肽鏈的VL結構域與可選的CD32B x CD79B雙特異性單價Fc雙抗體的第一多肽鏈的VH結構域相互作用，從而形成第二對第二抗原(即，CD79B或CD32B，取決於第一抗原的身份)特異性的第二功能性抗原結合位點。因此，協同第一和第二多肽鏈的VL和VH結構域的選擇，以便兩條多肽鏈總共包含能夠結合至CD32B和CD79B的VL和VH結構域(即，它們包含VL_CD32B /VH_CD32B 和VL_CD79B /VH_CD79B ) (圖3C)。每一個這樣的VL和VH結構域和分隔開它們的間插連接體統稱為該分子的抗原結合結構域。

這類可選的CD32B x CD79B Fc雙抗體的第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向包含氨基末端、能夠結合至CD32B或CD79B的單克隆抗體的VL結構域(即，VL_CD32B 或VL_CD79B )、間插間隔體肽(連接體1)、能夠結合至CD79B (如果這樣的第一多肽鏈含有VL_CD32B )或CD32B (如果這樣的第一多肽鏈含有VL_CD79B )的單克隆抗體的VH結構域、含有半胱氨酸的第三間插間隔體肽(連接體2)、異源二聚體促進結構域、為異源二聚體促進結構域(優選E-螺旋結構域)提供改善的穩定性的任選的第四間隔體肽(連接體4)、包含半胱氨酸的肽(肽1)、IgG Fc結構域(優選地，含有杵的IgG Fc區域的CH2和CH3結構域和C-末端。優選地，第一多肽鏈的Fc結構域具有對於FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b)基本上降低的結合能力或沒有結合能力(相對於野生型Fc區域展示的結合) (圖3C)。

這類可選的CD32B x CD79B Fc雙抗體的第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向包括氨基末端、能夠結合至CD79B或CD32B的單克隆抗體的VL結構域(即，VL_CD79B 或VL_CD32B ，取決於為雙抗體的第一多肽鏈選擇的VL結構域)、間插連接體肽(連接體1)、能夠結合至CD32B (如果這樣的第二多肽鏈含有VL_CD79B )或CD32B (如果這樣的第二多肽鏈含有VL_CD32B )的單克隆抗體的VH結構域、含有半胱氨酸的間隔體肽(連接體2)、異源二聚體促進結構域(優選K-螺旋結構域)和C-末端(圖3C)。

優選的CD32B x CD79B Fc雙抗體的第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向包含氨基末端、包含半胱氨酸的肽(肽1)、具有與第一多肽鏈的Fc結構域相同同種型的IgG Fc結構域(優選地，含有臼的IgG Fc區域的CH2和CH3結構域)和C-末端。優選地，第三多肽鏈的Fc結構域具有對於FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b) (相對於野生型Fc區域展示的結合)基本上降低的結合能力或沒有結合能力(圖3C)。

圖3D顯示這類Fc雙抗體的變體，其中含有半胱氨酸的連接體2 (例如，GGCGGG (SEQ ID NO:16))已經被不含半胱氨酸的連接體(例如，ASTKG (SEQ ID NO:15))替換，並且其中各個異源二聚體促進結構域含有半胱氨酸殘基(例如， E VAA C E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:23 )和 K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:24 ))。藥物組合物

本發明的組合物包括可用於製造藥物組合物的原料藥物組合物(例如，不純的或非無菌組合物)，和可用於製備單位劑型的藥物組合物(即，適於施用至受試者或患者的組合物)。這類組合物包含預防上或治療上有效量的本發明的CD32B x CD79B結合分子，尤其是本發明的任意CD32B x CD79B雙抗體或Fc雙抗體，或這類劑和藥學上可接受的載體的組合。優選地，本發明的組合物包含預防上或治療上有效量的本發明的一種或多種分子和藥學上可接受的載體。

本發明還包括這樣的藥物組合物，所述藥物組合物包含這類CD32B x CD79B結合分子，尤其是本發明的任意CD32B x CD79B雙抗體或Fc雙抗體，和對於特定自身免疫性疾病或炎症性疾病抗原特異性的第二治療性抗體(例如，自身免疫性疾病或炎症性疾病抗原特異性單克隆抗體)，以及藥學上可接受的載體。

在具體的實施方案中，術語“藥學上可接受的”表示獲得聯邦政府或州政府管理機構的許可或列於美國藥典(U.S. Pharmacopeia)或其他通常獲得認可的藥典中，供用於動物，特別是用於人類。術語“載體”指與治療劑一起施用的稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(完全和不完全)、賦形劑或媒介。這類藥物載體可以是無菌液體諸如水和油，包括石油、動物油、植物油或合成來源的油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當靜脈內施用藥物組合物時，水是優選的載體。鹽水溶液和含水右旋糖以及甘油溶液也可用作液體載體，特別是對於可注射溶液而言。合適的藥物賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊(chalk)、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉(dried skim milk)、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。若需要，組合物也可以含有少量濕潤劑或乳化劑或pH緩衝劑。這些組合物可以採用溶液、懸浮劑、乳劑、片劑、丸劑、膠囊、粉劑、緩釋製劑等形式。

一般而言，本發明組合物的成分被單獨提供或以單位劑型混合在一起，例如作為標明活性劑的量的密封容器中的凍乾粉或無水濃縮物，所述密封容器如安瓿或小袋(sachette)。當待通過輸注施用組合物時，所述組合物可以用含有無菌的藥品等級水或鹽水的輸注瓶分配。如果通過注射施用所述組合物，則可以提供一安瓿注射用無菌水或鹽水，以便可以在施用之前混合成分。

可以將本發明的組合物配製為中性或鹽形式。藥學上可接受的鹽包括但不限於用陰離子形成的鹽，所述陰離子例如來源於鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的陰離子，以及用陽離子形成的鹽，所述陽離子例如來自鈉、鉀、銨、鈣、鐵的氫氧化物、異丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的陽離子。

本發明還提供了藥物包或試劑盒，其包含一個或多個容器，所述容器裝有(單獨地或與這類藥學上可接受的載體一起) CD32B x CD79B結合分子，尤其是本發明的任意CD32B x CD79B雙抗體或Fc雙抗體。另外，用於治療疾病的一種或多種其他預防劑或治療劑也可以包括於所述藥物包或試劑盒中。本發明還提供了這樣的藥物包或試劑盒，其包含一個或多個容器，所述容器裝有本發明藥物組合物的一種或多種成分。任選地，與這類容器關聯的可以是採用管理藥物或生物產品的製造、使用或銷售的政府機構規定的形式的公告(notice)，所述公告反映了管理機構許可製造、使用或銷售，供施用於人類。

本發明提供了用於上述方法的試劑盒。在一實施方案中，試劑盒包含本發明的一種或多種分子。在另一實施方案中，試劑盒還包含在一個或多個容器中的可用於治療自身免疫性疾病或炎症性疾病的一種或多種其他預防劑或治療劑。在另一實施方案中，試劑盒還包含結合與自身免疫性疾病或炎症性疾病相關的一種或多種自身免疫性疾病或炎症性疾病抗原的一種或多種抗體。在某些實施方案中，其他預防劑或治療劑是化學治療劑。在其他實施方案中，預防劑或治療劑是生物治療劑或激素治療劑。本發明組合物的用途

本發明的CD32B x CD79B結合分子，尤其是任意CD32B x CD79B雙抗體或Fc雙抗體具有治療與CD79B的表達相關或特徵在於CD79B的表達或具有所述疾病的B細胞組分的任意疾病或病況的能力。因此，不受限制，包含這類分子的藥物組合物可用於診斷或治療自身免疫性疾病或炎症性疾病或病況。因此，本發明可用於治療、預防、減緩B細胞介導的疾病或病症的進展和/或改善B細胞介導的疾病或病症的症狀，所述B細胞介導的疾病或病症包括移植物排斥、移植物抗宿主病(GvHD)、類風濕性關節炎(RA)、多發性硬化症(MS)和系統性紅斑狼瘡(SLE)。圖5顯示優選的CD32B x CD79B Fc雙抗體降低小鼠中的異源GvHD的能力(見，WO 2015/021089，通過引用併入本文)。施用方法

通過向受試者施用有效量的本發明的藥物組合物，可以提供本發明的組合物用來治療、預防和改善與疾病、病症或感染相關的一種或多種症狀。在優選的方面，這類組合物基本上是純的(即基本上不含限制其效果或產生不期望的副作用的物質)。在具體實施方案中，受試者是動物，優選哺乳動物，諸如非靈長類動物(例如牛、馬、貓科動物、犬科動物、齧齒動物等)或靈長類動物(例如，猴子諸如食蟹猴(cynomolgous monkey)、人類等)。在優選的實施方案中，受試者是人類。

通過修飾諸如例如脂質化來增強這類結合分子的吸收和組織滲透，可以減少或改變本發明的CD32B x CD79B結合分子的施用的劑量和“劑量方案”(施用頻率)。在一個實施方案中，在治療過程中單劑量水準(見下面)被施用一次或多次。在第二實施方案中，在治療過程中提供的劑量會變化，例如遞增劑量方案或遞減劑量方案。施用的劑量可另外被調節，以反映受試者對療法的耐受性和與該療法相關的治療成功程度。

可通過標準臨床技術確定有效治療、預防或改善與病症有關的一種或多種症狀的本發明的CD32B x CD79B結合分子的劑量。待用於製劑中的精確劑量還取決於施用途徑和狀況的嚴重程度，並且應當根據從業者的判斷和每一患者的情況決定。有效劑量可以根據來源於體外或動物模型測試系統的劑量應答曲線來推斷。然而，本發明的CD32B x CD79B結合分子優選以通常為至少大約0.1 mg/kg、至少大約0.2 mg/kg、至少大約0.3 mg/kg、至少大約0.5 mg/kg、至少大約1.0 mg/kg、至少大約3.0 mg/kg、至少大約5.0 mg/kg、至少大約7.5 mg/kg、至少大約10.0 mg/kg、至少大約15 mg/kg、至少大約20 mg/kg受試者的體重或更多的劑量被施用。尤其地，本發明的CD32B x CD79B結合分子以大約0.3 mg/kg、大約1.0 mg/kg、大約3.0 mg/kg或大約10.0 mg/kg的劑量被施用。本發明的CD32B x CD79B結合分子，尤其是任意CD32B x CD79B雙抗體或Fc雙抗體優選被包裝在指示這類分子的量的密封容器諸如安瓿或小袋中。如本文使用的，如果在用於描述所述劑量的有效數字內描述劑量，則劑量被認為是“大約”所述劑量(例如，如果劑量是0.1 mg/kg的劑量± 0.05 mg/kg，則所述劑量是大約0.1 mg/kg，和如果劑量是15 mg/kg的劑量± 0.5 mg/kg，則所述劑量是大約15 mg/kg)。

本發明的CD32B x CD79B結合分子的施用頻率可在大範圍內變化，這取決於例如患者應答或施用方法。因此，本發明的組合物可以以下面的頻率施用：一日一次、一日兩次或一日三次、一週一次、一週兩次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、一月一次，每六週一次、每十二週一次、每兩月一次、每三月一次、一年兩次或一年一次等。應當認識到，用於治療的分子的有效劑量可以隨著具體治療的過程增加或降低。

然而，優選在以下治療過程中施用本發明的CD32B x CD79B結合分子：1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15週或多於15週，並且，這樣的單治療過程可以重複1次、2次、3次、4次、5次或更多次。在優選的實施方案中，用本發明分子的以下治療過程治療受試者：每兩週一次(Q2W)、每三週一次(Q3W)、每四週一次(Q4W)、每五週一次(Q5W)、每六週一次(Q6W)、每七週一次(Q7W)、每八週一次(Q8W)、每九週一次(Q9W)、每十週一次(Q10W)、每十一週一次(Q11W)或每十二週一次(Q2W)。尤其優選以下面的治療過程施用本發明的CD32B x CD79B結合分子：每兩週一次(Q2W)、每三週一次(Q3W)、每四週一次(Q4W)或每八週一次(Q8W)。在任意這類單治療過程結束時，可以以相同劑量方案或以不同劑量方案重新設立治療，並且可以涉及施用的CD32B x CD79B結合分子的相同劑量或不同劑量。因此，用治療有效量或預防有效量的本發明的CD32B x CD79B結合分子治療受試者可包括單治療過程或可包括多個治療過程，所述治療過程可以與之前的任意治療過程相同或與之前的任意治療過程不同。

在優選的實施方案中，本發明的CD32B x CD79B結合分子、CD32B x CD79B結合分子，尤其是任意CD32B x CD79B雙抗體或Fc雙抗體在治療過程Q2W、Q3W、Q4W或Q8W中以大約0.3 mg/kg、大約1.0 mg/kg、大約3.0 mg/kg或大約10.0 mg/kg的劑量被施用。

在一個實施方案中，本發明的CD32B x CD79B Fc雙抗體作為乾燥無菌凍乾粉或無水濃縮物提供於密封容器中，並且可以例如用水或鹽水重構至適當濃度，以施用於受試者。優選地，本發明的CD32B x CD79B結合分子，尤其是任意CD32B x CD79B雙抗體或Fc雙抗體作為乾燥無菌凍乾粉提供於密封容器中，其單位劑量為至少1 mg，更優選地，至少2 mg、至少3 mg、至少5 mg、至少10 mg、至少20 mg、至少30 mg、至少50 mg、至少100 mg、至少200 mg、至少300 mg、至少500 mg或至少1000 mg，以便例如在添加適當量的載體後，可製備0.1 mg/kg、0.3 mg/kg、1 mg/kg或10 mg/kg的可施用的劑量。

本發明的凍乾CD32B x CD79B結合分子，尤其是任意CD32B x CD79B雙抗體或Fc雙抗體應當在其最初的容器中儲存於2°C和8°C之間，並且所述分子應當在重構後的12小時內、優選在6小時內、在5小時內、在3小時內或在1小時內施用。在可選的實施方案中，這類分子以液體的形式提供於指示所述分子、融合蛋白或綴合分子的量和濃度的密封容器中。優選地，本發明液體形式的CD32B x CD79B結合分子提供於這樣的密封容器中：在所述容器中所述分子以至少1 μg/ml，更優選至少2.5 μg/ml、至少5 μg/ml、至少10 μg/ml、至少50 μg/ml或至少100 μg/ml的濃度存在。

在一個實施方案中，對於用作單劑療法，可計算施用至患者的本發明的CD32B x CD79B結合分子的劑量。在另一實施方案中，本發明的結合分子可與其他治療組合物聯合使用，並且向患者施用的劑量小於這類結合分子用作單劑療法時的劑量。

施用本發明的CD32B x CD79B結合分子，尤其是任意CD32B x CD79B雙抗體或Fc雙抗體的優選方法包括但不限於腸胃外施用(例如，皮內、肌肉、腹膜內、靜脈內以及皮下施用)、硬膜外施用以及粘膜施用(例如鼻內和口腔途徑施用)。在具體實施方案中，本發明的分子經肌肉、靜脈內或皮下施用。組合物可以通過任何方便途徑施用，例如通過輸注或彈丸注射、通過上皮或黏膜皮膚被覆(lining) (例如口腔粘膜、直腸粘膜和腸粘膜等)吸收，並且可以與其他生物活性劑一起施用。施用可以是全身的或局部的。

在具體實施方案中，可期望將本發明的藥物組合物局部施用至需要治療的區域；這可通過例如，但不限於下述方式實現：局部注入、通過注射或通過植入物的手段，所述植入物是多孔的、非多孔的或膠狀材料，包括膜，比如矽橡膠膜或纖維。優選地，當施用本發明的分子時，必須注意使用不吸收該分子的材料。

現在已經一般性地描述了本發明，通過參考下述實施例，會更容易地理解本發明，所述實施例以示例的方式提供，而非意圖限制本發明，除非另有說明。

實施例 1 ： CD32B x CD79B 雙特異性單價 Fc 雙抗體和對照雙抗體的構建

製備CD32B x CD79B Fc雙抗體，將其用作本發明的示例性CD32B x CD79B結合分子。CD32B x CD79B Fc雙抗體包含具有表1所示氨基酸序列的三條多肽鏈：

發現上述CD32B x CD79B Fc雙抗體能夠同時結合至CD32B和結合至CD79B。用於形成雙特異性單價雙抗體的方法提供在WO 2006/113665、WO 2008/157379、WO 2010/080538、WO 2012/018687、WO 2012/162068和WO 2012/162067中。

實施例 2 ：體內施用 CD32B x CD79B 雙特異性 Fc 雙抗體的評估

為了評價本發明的CD32B x CD79B結合分子的安全性和耐受性，將實施例1的CD32B x CD79B Fc雙抗體施用至健康人受試者(年齡18-50歲，BMI為18-30 kg/m² )。受試者不包括懷孕婦女或具有生育潛力的婦女。另外，受試者不包括具有明顯急性或慢性醫學疾病的個體、在給藥4週內使用了任意處方藥的個體或在給藥1週內使用了非處方藥的個體、每天吸煙10支以上的個體、具有結核病、乙型肝炎感染、丙型肝炎感染或HIV感染的個體、具有已知的自身免疫性病症或血管病症歷史的個體、或具有陽性藥物測試結果的個體。受試者也不包括具有大於450 msec的校正QT (QTc)、小於45 bpm或大於120 bpm的心率、大於140 mm Hg的收縮壓(SBP)或大於90 mm Hg的舒張壓(DBP)的個體。本研究中涉及的受試者的基線人口統計學示於表2中。

評估包括使用6個劑量群組(cohort)(每一群組由8名受試者構成，其中受試者1-6被施用CD32B x CD79B Fc雙抗體且受試者7-8用安慰劑處理)。在每一個群組內，CD32B x CD79B Fc雙抗體的施用被錯開，使得受試者2在受試者1之後24小時時接受處理，受試者3-5在受試者2之後24小時時接受處理，且受試者7-8在受試者3-5之後24小時時接受處理。劑量群組描述於表3中。

監測被給藥的受試者的CD32B x CD79B Fc雙抗體相關的副作用：二級或三級心臟傳導阻滯、室性心律失常(包括T尖端扭轉性室性心動過速)、或根據針對參加預防性疫苗臨床試驗的健康成人和青少年志願者的毒性分級指導(Guidance of Toxicity Grading Scale)，≥ 3級不良事件。對於未包括的問題(例如，輸注相關的反應)，則使用NCI CTCAE v4.03。記錄到十五件不良事件，其中4件被視為與CD32B x CD79B Fc雙抗體的施用有關。表4總結了觀察到的不良事件。 A. Fc 雙抗體對體液免疫應答的藥效學作用

圖6顯示示例性CD32B x CD79B結合分子在施用至人類受試者之後的藥代動力學特徵。通過驗證的ELISA測定測量結合分子濃度，並且由非房室分析計算PK參數。如圖中所指示的，受試者以0.01 mg/kg、0.1 mg/kg、0.3 mg/kg、1 mg/kg、3 mg/kg或10 mg/kg體重的劑量接受CD32B x CD79B Fc雙抗體，並且，在施用後至多57天內測量血清雙抗體濃度。發現隨著提高劑量濃度，雙抗體的血清濃度、最大血清濃度(C_max )和AUC (曲線下面積)均增加。雙抗體的半衰期範圍為4-8天。在最低劑量(0.01 mg/kg)觀察到雙抗體的快速分佈。平均清除時間(CL)範圍為1.426 mL/h/kg (0.01 mg/kg劑量)至0.350 mL/h/kg (10mg/kg劑量)，並且，CL和劑量之間的關係是非線性的，其中CL隨著劑量增加而降低。作為雙抗體在血容量中的分佈的指示，穩態分佈容積(Vss)據發現不依賴於劑量。血清半衰期(T_1/2 )範圍為92 hr (大約4天)——對於以0.03 mg/kg劑量施用的雙抗體，至191 hr (大約8天) ——對於以10 mg/kg劑量施用的雙抗體，並且隨著劑量增加而增加，這與CL的劑量依賴性下降向一致。注意到PK曲線的中斷，表明抗藥物抗體(ADA)的存在。藥代動力學資料總結在表5中。 B. 結合至外周 B 細胞上的 CD32B 和 CD79B 的能力

發現施用的CD32B x CD79B結合分子能夠結合至外周B細胞，顯示最大佔據 ≥ 1 mg/kg體重，其中在更高劑量水準持續50% B細胞佔據。在≥0.3 mg/kg觀察到持續20% B細胞佔據。圖7總結了在研究過程中與外周B細胞結合的離體流式細胞術分析。C. 外周 B 細胞和 B 細胞子集的啟動狀態的評估

進行流式細胞術分析，以評價雙抗體的施用是否與B細胞計數(圖8A)、T細胞計數(圖8B)、B細胞與T細胞的比例(圖8C)和CD4+ T細胞與CD8+ T細胞的比例(圖8D)的持續變化有關。如圖8A-8B所示，沒有觀察到外周T細胞群體的持續變化，在該研究中在較高劑量觀察到B細胞群體的短暫下降。如圖8C-8D所示，沒有觀察到這類外周B細胞群體和T細胞群體的比例的持續變化。D. 外周 B 細胞對離體 BCR 刺激的應答評價

進行離體鈣動員測定，以評價示例性CD32B x CD79B結合分子的接受者的B細胞功能。簡言之，從在各種給藥前和給藥後時間點採集的血液樣品新鮮分離PBMC，並且，通過BCR連接誘發Ca⁺⁺ 通量。引入離子黴素，以誘發最大Ca⁺⁺ 通量。用通過離子黴素產生的值將AUC的值或峰值歸一化，使得比例(AUC) = AUC (IgM)/AUC (離子黴素)。圖9A-9B圖解該研究中應用的實驗程式和資料分析方法。

發現用示例性CD32B x CD79B結合分子進行處理回應抗IgM抗體的BCR連接而減小鈣通量，從而證明本發明的CD32B x CD79B結合分子對外周B細胞的抑制活性(圖9C-9D)。E. CD32B x CD79B 結合分子下調 CD27⁺ 記憶 B 細胞上的 BCR 表達

為了進一步評價施用示例性CD32B x CD79B結合分子的作用，利用流式細胞術測定膜結合的免疫球蛋白水準。圖10A-10C顯示施用CD32B x CD79B結合分子下調CD27⁺ 記憶B細胞上的BCR表達，如通過膜結合的IgG (mIgG) (圖10A)、膜結合的IgM (mIgM) (圖10B)和膜結合的IgD (mIgD) (圖10C)的表達所測定的。

類似的研究確認了施用CD32B x CD79B結合分子下調CD27初始記憶B細胞上的BCR表達(圖11A：膜結合的IgD (mIgD)；圖11B：膜結合的IgM；圖11C：膜結合的IgM (mIgM)的百分比變化)。F. CD32B x CD79B 結合分子調節血清 Ig 水準

評價了施用CD32B x CD79B結合分子對IgM、IgA和IgG免疫球蛋白的血清水準的影響。發現結合分子調節這些免疫球蛋白的血清水準，其中IgM水準展示最大的降低和IgG水準被很大程度地維持(分別見圖12A-12C)。IgG的避免是期望的。G. CD32B x CD79B 結合分子降低共刺激分子 CD40 的水準

發現施用CD32B x CD79B結合分子降低B細胞上的CD40表面表達水準(圖13A)，如通過外周B細胞的表面共刺激分子的流式細胞術分析所測定的。

示例性結合分子(實施例1的CD32B x CD79B Fc雙抗體)的單靜脈內給藥沒有實質上降低外周B細胞計數，表明本發明的結合分子不消耗B細胞。流式細胞學分析證明本發明的結合分子能夠結合至外周B細胞。在≥ 1 mg/kg劑量水準觀察到外周B細胞上這類結合位點的完全飽和。發現這樣的結合的持續時間與應用的劑量水準有關。

本發明的結合分子介導多種藥效學劑量依賴性效應，包括： 1. 離體BCR誘導的Ca⁺⁺ 動員的減少； 2. CD27⁺ 記憶B細胞子集上表面IgG-BCR表達的下調； 3. IgM⁺ 初始B細胞群體的減少； 4. 初始B細胞上表面IgD-BCR表達的下調；和 5. B細胞上CD40表達的下調。

本發明的結合分子介導適於臨床給藥的多種有利的藥效學特徵。在≥ 1mg/kg劑量水準，外周B細胞被實施例1的示例性CD32B x CD79B Fc雙抗體完全飽和，並且，結合的持續時間與不斷增加的劑量水準相關，其中在≥0.3 mg/kg劑量水準觀察到持續20%佔據。本發明的結合分子不消耗外周B細胞，據發現，其以劑量依賴性方式下調B細胞活性： 1. 減少BCR介導的Ca2+流入； 2. 下調表面免疫球蛋白表達； 3. 降低血清IgM水準；和 4. 下調CD40表達。

資料支援本發明在治療炎症性疾病、病況和病症，尤其在治療自身免疫性疾病方面的功用。

實施例 3 ：對 CD32B X CD79B 結合分子的藥代動力學和藥效學性質的研究

採用E_max (最大效應) PK/PD模型以便更充分地研究本發明的CD32B x CD79B結合分子的藥代動力學(PK)和藥效學(PD)性質。簡言之，在各種濃度的結合分子的存在下孵育B細胞，並且測定了導致E_max 的50%、60%、80%和90%抑制的結合分子的濃度。

接受受試者展示的基線值範圍為6.3%至15.6% (平均值= 9.4%)。產生最大應答的50%的濃度(EC50)為1677 ng/mL。隨著施用的結合分子的濃度增加，B細胞結合百分比達到穩定狀態，其展示對73.1%的%B細胞結合的最大應答(Emax)。數據示於表6。基於體內人源化小鼠模型，預測的顯示對IgG和IgM完全抑制的靶濃度為1,500 ng/mL。該研究中的PK/PD關係表明≥ EC50的濃度可以是用於治療目的的潛在靶濃度。

圖14A-14B顯示資料(在兩個不同濃度範圍)。圖15A-15F通過人類中疊加的CD32B x CD79B結合分子藥代動力學曲線描繪了臨床前靶濃度，以確定可實現靶濃度的劑量(以劑量0.01 mg/kg (圖15A)；以劑量0.1 mg/kg (圖15B)；以劑量0.3 mg/kg (圖15C)；以劑量1 mg/kg (圖15D)；以劑量3 mg/kg (圖15E)；以劑量10 mg/kg (圖15F)實現靶濃度)。

將個體受試者藥代動力學資料建模，並使用最佳模型參數評估，以預測在每兩週一次(Q2W)、每三週一次(Q3W)和每四週一次(Q4W)給藥方案中施用的多次給藥的曲線。研究的劑量是1 mg/kg、3 mg/kg和10 mg/kg。進行曝光(exposure)參數的比較(C_max 、C_min 和AUC)，並研究了一房室和二房室IV輸注模型。針對每2週一次劑量(Q2W)、每3週一次劑量(Q3W)和每4週一次劑量(Q4W)給藥方案，劑量為0.3 mg/kg受試者體重(圖16A)、1 mg/kg受試者體重(圖16B)、3 mg/kg受試者體重(圖16C)和10 mg/kg受試者體重(圖16D)，顯示了這類建模的結果。上述建模曲線中預期的變化性示於(具有SD)圖 17A-17D 中。

針對1 mg/kg、3 mg/kg和10 mg/kg劑量，分別在表7、8和9中示出了第一劑量之後(C_max1 、C_min1 和AUC₁ )和穩態時(C_maxss 、C_minss 和AUC_ss )的曝光參數的概要統計。所有3個劑量作為Q2W、Q3W和Q4W方案施用。在表7、8、9和10中，對於Q2W、Q3W和Q4W方案分別在14天、21天和28天的給藥間隔內測定AUC。

如表7、8、9和10關於第一劑量資料所指示的，平均值C_max1 值與Q2W、Q3W和Q4W方案(即，對於1 mg/kg給藥方案，大約22 µg/mL；對於3 mg/kg給藥方案，大約54 µg/mL；和對於10 mg/kg給藥方案，大約187 µg/mL)類似。在3個方案之間的平均值AUC₁ 值中觀察到輕微差別。對於具有較短的給藥間隔(14天)的Q2W方案(即，對於1 mg/kg給藥方案，大約1.1 µg/mL；對於3 mg/kg給藥方案，大約5 µg/mL；和對於10 mg/kg給藥方案，大約24 µg/mL)，觀察到的平均值C_min1 (穀濃度)相比具有28天的較長給藥間隔的Q4W方案(即，對於1 mg/kg給藥方案，大約0.14 µg/mL；對於3 mg/kg給藥方案，大約0.95 µg/mL；和對於10 mg/kg給藥方案，大約5 µg/mL)更高。觀察到Q3W方案的平均值C_min1 在Q2W和Q4W方案(即，對於1 mg/kg給藥方案，大約0.38 µg/mL；對於3 mg/kg給藥方案，大約2.2 µg/mL；和對於10 mg/kg給藥方案，大約5 µg/mL)的平均值C_min1 中間。

如表7、8、9和10中關於穩態所指示的，相比第一劑量值，觀察到平均值C_maxss 、C_minss 和AUC_ss 在數值上更高，並且，與第一劑量資料相一致的是，觀察到Q2W、Q3W和Q4W方案的平均值C_maxss 是類似的(＜ 13%差異)。另外，與第一劑量資料相一致的是，觀察到3個方案之間平均值AUC_ss 值的輕微差異。然而，Q4W方案的給藥間隔是28天，並且，在相同間隔內，針對Q2W方案施用的劑量的數目是Q4W方案的兩倍。因此，在28天給藥間隔中，Q2W方案的AUC_ss 預期大約是Q4W方案的AUC_ss 的兩倍。不考慮施用的方案，穩態中的曝光參數提示，當與第一劑量資料相比時，CD32B x CD79B結合分子的最小積累。

總之，本發明的結合分子已經以高達10 mg/kg的劑量被施用至人類受試者，並且展示0.3 mg/kg至10 mg/kg的臨床劑量範圍。然而，更高的劑量比率可產生另外的效應。對於Q2W方案，劑量≥ 1 mg/kg應實現靶濃度。對於Q3W方案，劑量 ≥ 3 mg/kg應實現靶濃度。然而，較低的劑量(例如，0.3 mg/kg)可有效實現期望的生物學活性。發現施用在人類健康受試者中是安全的並且證明了免疫調節活性。施用本發明的結合分子隨後不會出現不期望的細胞因數釋放或不伴隨不期望的細胞因數釋放。不考慮施用的劑量，藥代動力學/藥效學(PK/PD)和建模和模擬(M&S)分析表明，第一劑量或穩態C_max 值對於Q2W、Q3W和Q4W方案是類似的。在穩態時，預期Q2W方案在28天間隔(Q2W方案的給藥間隔)中的AUC_ss 大約是Q4W方案的兩倍。對於具有較短給藥間隔的Q2W和Q3W方案(分別為14和21天)，第一劑量或穩態C_min 值比具有28天的較長給藥間隔的Q4W方案(更長的沖洗持續時間)更高。

儘管本發明的CD32B x CD79B結合分子的血清半衰期 (T_1/2 )範圍為大約4-8天，甚至在已經已經過第一半衰期之後，仍觀察到顯著比例的施用的CD32B x CD79B結合分子保持結合至外周B細胞。例如，就實施例1的CD32B x CD79B Fc雙抗體而言，在0.3 mg/kg劑量方案，觀察到大於20%的佔據達至少8天，並且在3 mg/kg和10 mg/kg劑量方案，觀察到大於20%的佔據長達30至接近50天。

對外周B細胞啟動的抑制(尤其如在AUC測量結果中反映的)在大約第30天返回至基線。CD32B x CD79B結合分子還下調記憶B細胞(圖10A-10C)和初始B細胞(圖11A-11C)上的BCR靶，並且這樣的下調還持續大約27天或更久。類似地，對血清Ig水準的調節(圖12A-12C)在甚至最低的劑量持續至少57天。這些結果來自單劑量施用。因此，優選的劑量方案可基於CD32B x CD79B結合分子的半衰期、基於CD32B x CD79B結合分子的長效生物學活性或基於半衰期和這樣的長效生物學活性二者。

實施例 4 ：體內施用 CD32B x CD79B 雙特異性 Fc 雙抗體對體液免疫應答的評價

如本文所述的，本發明的CD32B x CD79B結合分子，尤其是雙特異性Fc雙抗體被設計來通過引發基於啟動-抑制偶聯的生理學負反饋環而抑制啟動的B細胞。可研究CD32B x CD79B結合分子對回應經免疫原諸如匙孔戚血藍蛋白(KLH)的接種的體液免疫應答的抑制作用。尤其地，基於來自非人類靈長類動物的PK資料的推測，當以0.3 mg/kg施用時，迴圈CD32B x CD79B Fc雙抗體將被保持高於一定的水準，以維持CD32B x CD79B Fc雙抗體結合位點在外周血液B細胞上的20%佔據達6天。基於體外研究，預期這樣的佔據水準維持對BCR介導的B細胞啟動的50%抑制的最小值達至少6天。考慮到人類中對KLH接種的免疫應答花費大約4至6天，預期在以≥0.3 mg/ml的劑量施用CD32B x CD79B結合分子的受試者中實施KLH接種將導致可檢測的藥效學活性，如由對使用KLH抗原進行接種的B細胞應答的抑制所證明的。因此，對於接受0.3 mg/kg或更高劑量的CD32B x CD79B結合分子的所有受試者，可在第2天以1.0 mg的皮下(SC)劑量施用KLH。另外，從輸注CD32B x CD79B結合分子起不少於24小時可給與KLH接種，以在接種之前確認這類CD32B x CD79B結合分子對於每一位受試者的安全性和耐受性。

抗KLH IgG和IgM滴度、和它們從基線的抑制百分比變化、以及達到可量化的抗KLH、IgG和IgM免疫後應答的受試者的比例將根據劑量組(dose panel)和時間被表格化和總結。使用描述統計學評價CD32B x CD79B結合分子處理和安慰劑之間的免疫應答差異。如果判斷適當，可進行另外的分析(例如，暴露-應答分析)。

實施例 5 ：體內施用 CD32B x CD79B 雙特異性 Fc 雙抗體對體液免疫應答的評價

如上所述，可評估CD32B x CD79B結合分子對回應接種的體液免疫應答的抑制作用。失活的甲型肝炎疫苗(HAV)是用於評價免疫受損情況下(Valdez H, 等(2000) “Response To Immunization With Recall And Neoantigens After Prolonged Administration Of An Hiv-1 Protease Inhibitor-Containing Regimen ,” ACTG 375 team. AIDS clinical trials group. AIDS 14:11-21)以及在使用B細胞消耗療法的患者中(Van Der Kolk LE, 等(2002) “Rituximab Treatment Results In Impaired Secondary Humoral Immune Responsiveness ,” Blood 100:2257-9)的免疫應答的確認的新抗原。在本研究中，評估上述示例性CD32B x CD79B結合分子在對具有陰性血清甲型肝炎滴度的正常健康志願者中的HAV施用的響應中的抑制作用。簡言之，以3 mg/kg或10 mg/kg通過IV輸注施用單劑量的CD32B x CD79B結合分子或安慰劑，在第2天，受試者還經肌肉接受單劑量的HAV (VAQTA® (失活的甲型肝炎疫苗，Merck，50 U/1-mL)。通過在接種的受試者中監測血清IgG特異性抗HAV特異性抗體的出現，評估施用CD32B x CD79B結合分子對於針對單劑量的HAV的免疫應答的影響。ARCHITECT HAVAb-IgG測定(Abbott Laboratories)用於檢測HAV特異性IgG的存在。ARCHITECT HAVAb-IgG測定是用於定性檢測對於人類血清或血漿中HAV的IgG抗體的化學發光微粒子免疫分析法(CMIA)。還使用具有改良Abbott系統的定量測定。

表11總結了經安慰劑或示例性CD32B x CD79B結合分子以3 mg/kg或10 mg/kg處理的受試者的結果。該研究的結果表明施用CD32B x CD79B結合分子抑制啟動的B細胞和回應接種的體液免疫應答。

實施例 6 ： CD32B x CD79B 結合分子阻斷 CD40 依賴性 B 細胞應答

如上所述，施用CD32B x CD79B結合分子降低共刺激分子CD40的水準。體外評估了示例性CD32B x CD79B結合分子對CD40依賴性應答的活性。這些研究使用了測定系統，其類比在濾泡CD4-輔助細胞提供的刺激信號的存在下，B細胞分化成分泌抗體(例如，IgG)的細胞的過程，該過程發生於次級淋巴器官或三級(territory)淋巴器官的生髮中心。簡言之，使用陰性選擇試劑盒從健康供體的外周全血液純化人類B細胞。在存在或不存在未稀釋的或作為3-倍連續稀釋液(1、1/3、1/9和1/27)使用的刺激物(CD40配體(500 ng/mL)、IL-4 (100 ng/mL)和IL-21 (20 ng/mL))的情況下，在存在或不存在上述示例性CD32B x CD79B結合分子(20 μg/mL)的情況下，在5% CO₂ 37°C培養箱中，在完全RPMI1640培養基中培養純化的人類B細胞，達5天。收集培養上清液，並通過ELISA測定分泌的人類IgG。該研究的結果繪製在圖18中。

如圖18所示，CD32B x CD79B結合分子可減少IgG分泌，表明CD32B x CD79B結合分子可抑制與IgG產生相關的CD40介導的通路。

本說明書提到的所有出版物和專利通過參考併入本文，達到如同具體和單獨指出每個單個出版物或專利申請通過參考以其整體併入的相同程度。儘管已經結合其具體實施方式描述了本發明，但是應當理解，其能夠被進一步修改，並且本申請旨在覆蓋大體上根據本發明原理並且包括與本公開偏離的本發明的任何變型、用途或改變，只要在本發明所屬領域的已知或習慣實踐內並且可應用至本文之前所闡釋的本質特徵。

無

圖 1 提供由兩條多肽鏈構成的、共價結合的代表性雙抗體的示意圖，所述雙抗體具有兩個表位元結合結構域，每條多肽鏈具有E-螺旋或K-螺旋異源二聚體促進結構域(可選的異源二聚體促進結構域在下面提供)。半胱氨酸殘基可存在於連接體中和/或存在於異源二聚體促進結構域中，如圖 3A/3B 所示。識別相同表位元的VL和VH結構域使用相同陰影或填充式樣顯示。

圖 2 提供由兩條多肽鏈構成的、共價結合的代表性雙抗體分子的示意圖，所述雙抗體分子具有兩個表位元結合結構域，每條多肽鏈具有CH2和CH3結構域，以便締合的鏈形成全部的Fc區域或形成一部分Fc區域。識別相同表位元的VL和VH結構域使用相同陰影或填充式樣顯示。

圖 3A-3E 提供由三條多肽鏈構成的、共價結合的代表性雙抗體分子的示意圖，所述雙抗體分子具有兩個表位元結合結構域。顯示了CH2-CH3結構域的兩個取向(圖 3A/3B 對比圖 3C/3D )。多肽鏈中的兩條具有CH2和CH3結構域，以便締合的鏈形成全部的F區域或形成一部分Fc區域。包含VL和VH結構域的多肽鏈各自進一步包含異源二聚體促進結構域，並且經存在於連接體中的半胱氨酸殘基(圖 3A 和3C )或存在於異源二聚體促進結構域中的半胱氨酸殘基(圖 3D 和3B )之間形成的二硫鍵彼此共價結合。圖 3E 圖解具有圖 3A 所示結構域取向的示例性CD32B x CD79B Fc雙抗體的結構和功能。圖 3E 所示雙抗體是共價結合的複合物，其包含圖 3A 的雙抗體的三條多肽鏈，但不沒有任選存在的異源二聚體促進結構域。複合物包括包含CH2和CH3 IgG重鏈結構域的Fc結構域和對於CD32B和對於CD79B特異性的結合結構域。識別相同表位元的VL和VH結構域使用相同陰影或填充式樣顯示。

圖 4 圖解了一種示例性機制，通過該機制，本發明的雙抗體可介導它們對免疫系統的抑制。如圖所示，本發明的雙抗體能夠同時結合至BCR的CD79B分子和結合至B細胞的CD32B分子，從而彼此共連接這類分子。這類共連接用於允許CD32B分子的ITIM成為磷酸化的，並且吸引肌醇聚磷酸鹽5’-磷酸酶(SHIP)的SH2結構域，肌醇聚磷酸鹽5’-磷酸酶(SHIP)水解由於ITAM-介導的酪氨酸激酶啟動而釋放的磷酸肌醇信使。這類水解抑制ITAM啟動信號，從而用於減弱B細胞啟動。

圖 5 顯示優選的CD32B x CD79B Fc雙抗體在鼠科模型中降低體內異源GvHD的能力。

圖 6 顯示示例性CD32B x CD79B結合分子在施用至人類受試者之後的體內藥代動力學。

圖 7 概括了示例性CD32B x CD79B結合分子在施用至人類受試者之後在研究過程中與外周B細胞的體內結合的離體流式細胞術分析。

圖 8A-8D 顯示在施用示例性CD32B x CD79B結合分子至人類受試者之後在研究過程中的外周B細胞和T細胞群體，如通過離體流式細胞術分析測定的。

圖 9A-9D 顯示B細胞功能研究的方法和結果。圖 9A-9B 圖解離體鈣動員測定的離體實驗程式和資料分析方法，所述離體鈣動員測定用於評估示例性CD32B x CD79B結合分子的接受者的B細胞功能。圖 9C-9D 顯示在施用示例性CD32B x CD79B結合分子至人類受試者之後在研究過程中峰值回應的降低(圖 9C )和整體回應的持續降低，如通過曲線下面積所測量的(AUC；圖 9D )。

圖 10A-10C 顯示在研究過程中施用CD32B x CD79B結合分子下調人類受試者CD27⁺ 記憶B細胞上的BCR表達。圖 10A ：膜結合的IgG (mIgG)；圖 10B ：膜結合的IgM；圖 10C ：膜結合的IgD (mIgD)。數據以平均值±SEM呈現。

圖 11A-11C 顯示在研究過程中施用CD32B x CD79B結合分子下調人類受試者CD27^- 初始B細胞上的BCR表達。圖 11A ：膜結合的IgD (mIgD)；圖 11B ：膜結合的IgM；圖 11C ：膜結合的IgM (mIgM)的百分比變化。膜結合的免疫球蛋白水準經流式細胞術測定。數據以平均值±SEM呈現。

圖 12A-12C 顯示在研究過程中施用CD32B x CD79B結合分子調節人類受試者的血清Ig水準。圖 12A ：血清IgM；圖 12B ：血清IgA；圖 12C ：血清IgG。血清免疫球蛋白IgA、IgG和IgM水準經ELISA測定。數據以平均值±SEM呈現。

圖 13 顯示施用CD32B x CD79B結合分子降低共刺激分子CD40的水準，如通過外周B細胞的表面共刺激分子的離體流式細胞術分析測定的。數據以平均值±SEM呈現。

圖 14A-14B 顯示實施例1的示例性CD32B x CD79B Fc雙抗體的離體飽和E_max PK/PD B細胞結合研究的資料(以兩個不同濃度範圍)。在線性-線性和對數-線性尺度上對資料進行圖解評估。

圖 15A-15F 通過人類中疊加的CD32B x CD79B結合分子藥代動力學曲線描繪了臨床前靶濃度，以確定可實現靶濃度的劑量。在圖 15A-15F 中，y-軸是CD32B x CD79B結合分子濃度[ng/mL]和x-軸是以小時計的時間，上水平線、中水平線和下水平線分別是體外B細胞結合/抑制研究的結合分子濃度值、當前研究中EC50 B細胞結合的結合分子濃度值、和體內抑制人源化小鼠模型中的IgG和IgM的結合分子濃度值。

圖 16A-16D 顯示劑量為0.3 mg/kg (圖 16A )、1 mg/kg (圖 16B )、3 mg/kg (圖 16C) 和10 mg/kg (圖 16D )受試者體重，給藥方案為每兩週一次(Q2W)、每三週一次(Q3W)和每四週一次(Q4W)的CD32B x CD79B結合分子的平均濃度的模擬。使用了實際的時間和濃度以及名義劑量。對於圖 16A-16D ，y-軸是CD32B x CD79B結合分子濃度[ng/mL]和x-軸是以小時計的時間。

圖 17A-17D 顯示圖 16A-16D 的建模曲線中預期的變化性(具有SD)。

圖 18 顯示CD32B x CD79B結合分子阻斷CD40依賴性B細胞應答，如通過CD40依賴性B細胞IgG分泌的體外檢測所測定的。在存在或不存示例性CD32B x CD79B結合分子(20 μg/mL)的情況下，在未稀釋的或連續3倍稀釋(1、1/3、1/9和1/27)的刺激物(CD40-配體(500 ng/mL)、IL-4 (100 ng/mL)和IL-21 (20 ng/mL))存在或不存在的情況下，培養人類B細胞達5天，並且經ELISA測定測定分泌的IgG。

Claims (27)

1. 一種治療炎症性疾病或病況的方法，所述方法包括向需要其的受試者施用治療有效量的CD32B x CD79B結合分子，其中所述CD32B x CD79B結合分子能夠免疫特異性結合CD32B的表位和CD79B的表位，並且其中所述CD32B x CD79B結合分子以大約0.1 mg/kg和大約10 mg/kg之間的劑量和以每週一個劑量和每15週一個劑量之間的劑量方案被施用。
2. 如請求項1所述的方法，其中所述CD32B x CD79B結合分子以大約0.3 mg/kg的劑量被施用。
3. 如請求項1所述的方法，其中所述CD32B x CD79B結合分子以大約1 mg/kg的劑量被施用。
4. 如請求項1所述的方法，其中所述CD32B x CD79B結合分子以大約3 mg/kg的劑量被施用。
5. 如請求項1所述的方法，其中所述CD32B x CD79B結合分子以大約10 mg/kg的劑量被施用。
6. 如請求項1-5任意一項所述的方法，其中所述劑量方案是每2週一次劑量(Q2W)。
7. 如請求項1-5任意一項所述的方法，其中所述劑量方案是每3週一次劑量(Q3W)。
8. 如請求項1-5任意一項所述的方法，其中所述劑量方案是每4週一次劑量(Q4W)。
9. 如請求項1-5任意一項所述的方法，其中所述劑量方案是每8週一次劑量(Q8W)。
10. 如請求項1-9任意一項所述的方法，其中所述CD32B x CD79B結合分子是結合CD32B的表位和CD79B的表位的雙特異性抗體，或包含所述抗體的CD32B-結合結構域和CD79B-結合結構域的分子。
11. 如請求項1-10任意一項所述的方法，其中所述CD32B x CD79B結合分子是結合CD32B的表位和CD79B的表位的CD32B x CD79B雙特異性雙抗體。
12. 如請求項11所述的方法，其中所述CD32B x CD79B雙特異性雙抗體是CD32B x CD79B Fc雙抗體。
13. 如請求項1-12任意一項所述的方法，其中所述炎症性疾病或病況是自身免疫性疾病。
14. 如請求項13所述的方法，其中所述自身免疫性疾病選自：阿狄森氏病、自身免疫性肝炎、自身免疫性內耳疾病、重症肌無力、克羅恩病、皮肌炎、家族性腺瘤性息肉病、移植物抗宿主病(GvHD)、格雷夫斯病、橋本氏甲狀腺炎、紅斑狼瘡、多發性硬化症(MS)；惡性貧血、賴特氏綜合症、類風濕性關節炎(RA)、斯耶葛籣氏綜合症、系統性紅斑狼瘡(SLE)、1型糖尿病、原發性血管炎(例如，風濕性多肌痛、巨細胞動脈炎、白塞病)、天皰瘡、視神經脊髓炎、抗NMDA受體腦炎、格-巴二氏綜合症、慢性炎症性脫髓鞘性多發性神經病(CIDP)、格雷夫斯眼病、IgG4相關的疾病、原發性血小板減少性紫癜(ITP)和潰瘍性結腸炎。
15. 如請求項14所述的方法，其中所述炎症性疾病或病況是GvHD、RA、MS或SLE。
16. 如請求項1-15任意一項所述的方法，其中在施用第一劑量的所述CD32B x CD79B結合分子之後第36天，免疫球蛋白的血清水準降低。
17. 如請求項16所述的方法，其中所述免疫球蛋白是IgM、IgA或IgG。
18. 如請求項1-17任意一項所述的方法，其中在施用第一劑量的所述CD32B x CD79B結合分子之後24小時，BCR介導的外周B細胞啟動受到抑制，其中所述B-細胞啟動通過離體鈣動員測定進行測定。
19. 如請求項18所述的方法，其中所述BCR介導的B細胞啟動被抑制至少50%，並且其中所述抑制維持至少6天。
20. 如請求項1-19任意一項所述的方法，其中在施用第一劑量的所述CD32B x CD79B結合分子之後6小時，外周B細胞上的至少20%的CD32B x CD79B結合位點被佔據。
21. 如請求項1-20任意一項所述的方法，其中： (A) B細胞上CD40的表達被下調；和/或 (B) CD40介導的IgG分泌被抑制。
22. 如請求項1-21任意一項所述的方法，其中所述受試者是人。
23. 如請求項22所述的方法，其中所述CD32B x CD79B結合分子包含： (A) VL_CD32B 結構域，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列； (B) VH_CD32B 結構域，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列； (C) VL_CD79B 結構域，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列； (D) VH_CD79B 結構域，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
24. 如請求項23所述的方法，其中所述CD32B x CD79B結合分子是雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段。
25. 如請求項24所述的方法，其中所述CD32B x CD79B結合分子是結合CD32B的表位和CD79B的表位的CD32B x CD79B雙特異性雙抗體。
26. 如請求項25所述的方法，其中所述CD32B x CD79B雙特異性雙抗體是CD32B x CD79B Fc雙抗體。
27. 如請求項26所述的方法，其中所述CD32B x CD79B Fc雙抗體包含： (A) 第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列； (B) 第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；和 第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。