JP2019521103A - 炎症性疾患及び障害の治療におけるｃｄ３２ｂ×ｃｄ７９ｂ結合分子の使用方法 - Google Patents

炎症性疾患及び障害の治療におけるｃｄ３２ｂ×ｃｄ７９ｂ結合分子の使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＣＤ３２Ｂのエピトープに対して特異的な結合部位及びＣＤ７９Ｂのエピトープに対して特異的な結合部位を有し、従ってＣＤ３２Ｂ及びＣＤ７９Ｂに同時に結合できる、二重特異性結合分子の使用方法を対象とする。本発明は特に、二重特異性抗体又は二重特異性ダイアボディ（及び特にＦｃドメインを更に含む上記ダイアボディ）である、上記分子に関する。本発明は、上記分子の使用、及び炎症性疾患又は状態の治療における、上記分子を含有する医薬組成物の使用を対象とする。【選択図】 図４

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、米国特許出願第６２／３４６，７１７号（２０１６年６月７日出願；係属中）及び米国特許出願第６２／４３２，３２８号（２０１６年１２月９日出願；係属中）に対する優先権を主張するものであり、各上記出願はその全体が本出願に援用される。
［配列表の参照］
本出願は、連邦規則法典第３７巻第１．８２１節以下による１つ又は複数の配列表を含み、これらの配列表は、コンピュータ可読媒体（ファイル名：1301_0145PCT_ST25.txt、２０１７年５月１９日作成、サイズ：５９，７４８バイト）において開示されており、上記ファイルは、参照によりその全体が本出願に援用される。
本発明は、ＣＤ３２Ｂのエピトープに対して特異的な結合部位及びＣＤ７９Ｂのエピトープに対して特異的な結合部位を有し、従ってＣＤ３２Ｂ及びＣＤ７９Ｂに同時に結合できる、二重特異性結合分子の使用方法を対象とする。本発明は特に、二重特異性抗体又は二重特異性ダイアボディ（及び特にＦｃドメインを更に含む上記ダイアボディ）である、上記分子に関する。本発明は、上記分子の使用、及び炎症性疾患又は状態の治療における、上記分子を含有する医薬組成物の使用を対象とする。
Ｉ．Ｆｃγ受容体及びＣＤ３２Ｂ
抗体抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用は、抗体依存性細胞傷害、脂肪細胞の脱顆粒及び食作用といったエフェクタ機能から、リンパ球増殖及び抗体分泌の調節といった免疫変調シグナルにまで及ぶ、幅広い応答をもたらす。全てのこれらの相互作用は、抗体又は免疫複合体のＦｃドメインが、造血細胞上の、特別な細胞表面受容体に結合することによって開始される。抗体及び免疫複合体によってトリガされる細胞応答の多様性は、Ｆｃ受容体の構造的異質性によるものである。Ｆｃ受容体は、構造的に関連するリガンド結合ドメインを共有し、これが恐らく、細胞内シグナリングを仲介する。
Ｆｃ受容体は、タンパク質の免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーである。これらは、免疫グロブリン分子のＦｃ部分に結合できる表面糖タンパク質である。上記ファミリーの各メンバーは、Ｆｃ受容体のα鎖上の認識ドメインによって、１つ又は複数のアイソタイプの免疫グロブリンを認識する。
Ｆｃ受容体は、免疫グロブリンサブタイプに対するその特異性によって定義される（非特許文献１〜６を参照）。
ＩｇＧ抗体に結合できるＦｃ受容体は「ＦｃγＲ」と呼ばれる。このファミリーの各メンバーは膜貫通糖タンパク質であり、これは、免疫グロブリン関連ドメインのＣ２セットに関連する細胞外ドメイン、単一膜貫通ドメイン、及び可変長の細胞質内ドメインを有する。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）と呼ばれる、３つの公知のＦｃγＲが存在する。これら３つの受容体は、異なる遺伝子によってコードされるが、これら３つのファミリーメンバー間の幅広い相同性は、これらが共通の前駆体から、恐らく遺伝子重複によって生じたことを示唆している。
ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）タンパク質は、単量体Ｉｇ（１０6Ｍ-1）に対する低い親和性により、複合体化ＩｇＧにのみ結合する、４０ＫＤａ膜貫通糖タンパク質である。この受容体は、最も幅広く発現されるＦｃγＲであり、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、好中球、脂肪細胞及び血小板を含む全ての造血細胞上に存在する。ＦｃγＲＩＩは、その免疫グロブリン結合鎖中に２つの免疫グロブリン様領域しか有しておらず、従ってＩｇＧに対する親和性がＦｃγＲＩよりもはるかに低い。３つのヒトＦｃγＲＩＩ遺伝子（ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＣ（ＣＤ３２Ｃ））が存在し、これらは全て、凝集体又は免疫複合体中でＩｇＧに結合する。
ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢの細胞質ドメイン内の明確な差異により、受容体連結反応に対して２つの機能的に異質な応答が生じる。基本的な差異は、ＩｇＧ Ｆｃ領域への結合時、ＦｃγＲＩＩＡアイソフォームは免疫系の活性化（例えば食作用、呼吸バースト等）をもたらす細胞内シグナリングを開始するのに対して、ＩｇＧ Ｆｃ領域への結合時、ＦｃγＲＩＩＢアイソフォームは、免疫系の弱化又は阻害（例えばＢ細胞活性化の阻害等）をもたらすシグナルを開始することである。
このような活性化及び抑制性シグナルはいずれも、ＩｇＧ Ｆｃ領域への連結後にＦｃγＲを介して伝達される。これらの正反対の機能は、異なる受容体アイソフォーム間の構造的差異から生じる。免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif：ＩＴＡＭ）又は免疫受容体チロシン系阻害性モチーフ（Immunoreceptor Tyrosine-Based Inhibitory Motif：ＩＴＩＭ）と呼ばれる、受容体の細胞質シグナリングドメイン内の２つの異なるドメインにより、上記異なる応答が説明される。これらの構造に対する異なる細胞質酵素の補充は、ＦｃγＲ仲介細胞応答の結果を決定づける。ＩＴＡＭ含有ＦｃγＲ複合体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡを含み、その一方でＩＴＩＭ含有複合体はＦｃγＲＩＩＢしか含まない。
ヒト好中球は、ＦｃγＲＩＩＡ遺伝子を発現する。免疫複合体又は特異性抗体架橋によるＦｃγＲＩＩＡのクラスタリングは、ＩＴＡＭを、ＩＴＡＭリン酸化を促進する受容体関連キナーゼと凝集させる役割を果たす。ＩＴＡＭリン酸化は、Ｓｙｋキナーゼのドッキング部位として役立ち、その活性化は、下流基質（例えばＰＩ3Ｋ）の活性化をもたらす。細胞活性化は、炎症促進性メディエータの放出につながる。
ＦｃγＲＩＩＢ遺伝子は、Ｂリンパ球上で発現し、その細胞外ドメインはＦｃγＲＩＩＡと９６％同一であり、またＩｇＧ複合体に、区別できない様式で結合する。ＦｃγＲＩＩＢの細胞質ドメイン中のＩＴＩＭの存在は、ＦｃγＲの上述の阻害型サブクラスを定義する。この阻害の分子的基礎は確立されている。免疫複合体のＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃ領域によって、ＦｃγＲＩＩＢが活性化受容体に共連結されると、ＦｃγＲＩＩＢ ＩＴＩＭはリン酸化され、イノシトールポリリン酸５’ホスファターゼ（ＳＨＩＰ）のＳＨ２ドメインを引き付け、これによって、ＩＴＡＭ含有ＦｃγＲ仲介型チロシンキナーゼ活性化の結果として放出されたホスホイノシトールメッセンジャーが加水分解され、その結果、細胞内Ｃａ++の流入が防止される。このようにして、ＦｃγＲＩＩＢと活性化受容体とのこのような架橋は、活性化受容体の活性を減衰させ、従って細胞応答性を阻害する。これにより、Ｂ細胞上では、Ｂ細胞活性化、Ｂ細胞増殖及び抗体分泌が弱化するか又は中断される。よって、抗原検出の開始時に単量体ＩｇＧ抗原の結合が発生し、結合した抗体のＦｃ領域が、活性化ＦｃγＲのＩＴＡＭに結合することによって、免疫系の活性化を仲介する。宿主の応答が進行するに従って、多量体ＩｇＧ抗原免疫複合体が形成され、これはＦｃγＲＩＩＢに結合でき（従って上記複合体を活性化受容体と共連結でき）、これは、免疫応答の弱化及び最終的な停止につながる（例えば特許文献１〜５３を参照）。
ＩＩ．Ｂ細胞受容体及びＣＤ７９Ｂ
Ｂ細胞は、抗体の産生の役割を果たす免疫系細胞である。更にＢ細胞は、抗原を提示し、サイトカインを分泌する。抗原に対するＢ細胞の応答は、正常な免疫系に必須の構成要素である。Ｂ細胞は、特別な細胞表面受容体（Ｂ細胞受容体「ＢＣＲ」）を有する。Ｂ細胞が、該細胞のＢＣＲに結合できる抗原に出会うと、Ｂ細胞は刺激されて増殖し、結合した抗原に対して特異的な抗体を産生する。抗原に対する効率的な応答を生成するために、ＢＣＲ関連タンパク質及びＴ細胞の支援も必要となる。抗原／ＢＣＲ複合体は内在化され、抗原はタンパク質分解処理される。抗原のごく一部は、Ｂ細胞の表面上の主要組織適合性複合体ＩＩ（ＭＨＣ‐ＩＩ）分子と複合体化したままとなり、ここで上記複合体をＴ細胞によって認識できる。このような抗原提示によって活性化されたＴ細胞は、ＣＤ４０Ｌと、Ｂ細胞の成熟を誘導する様々なリンホカインとを分泌する。
ＢＣＲを介したシグナリングは、抗体の生成、自己免疫、及び免疫寛容の確立において重要な役割を果たす（非特許文献７）。まだ骨髄中にある間に自己抗原に結合する未成熟Ｂ細胞は、アポトーシスによって排除される。対照的に、成熟Ｂ細胞に対する抗原結合は、活性化、増殖、アネルギー及びアポトーシスをもたらす。観察される特定の機能的応答は、B細胞が他の表面受容体を介して共刺激シグナルを受け取るかどうか、及び活性化される特定のシグナル伝達経路に左右される。
ＢＣＲは、非共有結合で結合したＣＤ７９のα及びβサブユニット（それぞれ「ＣＤ７９ａ」及び「ＣＤ７９Ｂ」）と共にＢＣＲ複合体を形成する、膜免疫グロブリンからなる。ＣＤ７９ａ及びＣＤ７９Ｂは、シグナル伝達に必要な、保存された免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（「ＩＴＡＭ」）を含むシグナル伝達サブユニットである（非特許文献８、９）。多価抗原によるＢＣＲ複合体の凝集により、ＣＤ７９ａ及びＣＤ７９ＢのＩＴＡＭのトランスリン酸化、並びに受容体関連キナーゼの活性化が開始される（非特許文献１０〜１２）。リン酸化されたＩＴＡＭは、ＰＩ3Ｋ、ＰＬＣ‐γ、及びＲａｓ／ＭＡＰＫ経路のメンバーといった、更なるエフェクタを補充する。これらのシグナリングイベントは、Ｂ細胞増殖、並びにその後のＴヘルパー（「Ｔh」）細胞との相互作用のためのＢ細胞のプライミングに必要な活性化マーカー（ＭＨＣ‐ＩＩ及びＣＤ８６等）の発現増加の両方において役割を果たす。
ＩＩＩ．炎症性疾患又は状態
炎症は、体内の白血球及び化学物質が、微生物及びウイルス等の外来物質による感染から我々の身体を保護するプロセスである。炎症は通常、患部の痛み、腫れ、発熱及び発赤を特徴とする。サイトカイン及びプロスタグランジンとして知られる化学物質はこのプロセスを制御し、規則正しくかつ自己制限的なカスケードで血液又は罹患組織中へと放出される。化学物質のこの放出は、傷害又は感染領域への血流を増加させ、発赤及び発熱をもたらす場合がある。一部の化学物質は、組織への体液の漏出を引き起こし、これは腫れをもたらす。この保護プロセスは神経を刺激し、痛みを引き起こす場合がある。これらの変化は、関連する領域において限られた期間しか発生しなければ、身体にとって有益に作用する。
炎症性疾患又は状態は、身体自体の細胞及び組織に対する免疫系の攻撃（即ち「自己免疫（autoimmune）」応答）を反映したものである。身体に様々な方法で影響を及ぼす、多くの異なる自己免疫障害が存在する。例えば、多発性硬化症の個体では脳が影響を受け、クローン病の個体では腸が影響を受け、関節リウマチの個体では、様々な関節の滑膜、骨及び軟骨が影響を受ける。自己免疫障害の進行に従って、１つ又は複数のタイプの身体組織の破壊、器官の異常成長、又は器官機能の変化が発生し得る。自己免疫障害は、１つの器官若しくは組織タイプのみに影響を及ぼす場合があり、又は複数の器官及び組織に影響を及ぼす場合がある。自己免疫障害によって一般的に影響を受ける器官及び組織としては、赤血球、血管、結合組織、内分泌腺（例えば甲状腺又は膵臓）、筋肉、関節及び皮膚が挙げられる。自己免疫障害の例としては、限定するものではないが：アジソン病；自己免疫性肝炎；自己免疫性内耳疾患；重症筋無力症；クローン病；皮膚筋炎；家族性腺腫性ポリポーシス；移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）；グレーヴス病；橋本甲状腺炎；エリテマトーデス；多発性硬化症（ＭＳ）；悪性貧血；ライター症候群；関節リウマチ（ＲＡ）；シェーグレン症候群；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；１型糖尿病；原発性血管炎（例えばリウマチ性多発筋痛症、巨細胞性動脈炎、ベーチェット病）；天疱瘡；視神経脊髄炎；抗ＮＭＤＡ受容体脳炎；ギランバレー症候群；慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）；グレーヴス眼症；ＩｇＧ４関連疾患；特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）；及び潰瘍性大腸炎が挙げられる。
炎症性疾患又は状態はまた、身体の正常な保護免疫系が、その存在が身体にとって有益である外来細胞若しくは組織を攻撃することによって、損傷を引き起こした場合に（例えば移植の拒絶反応（宿主対宿主病））、又は免疫抑制された宿主の細胞が、導入された移植片の免疫適格細胞によって拒絶されることによって（移植片対宿主病）、発生し得る（非特許文献１３〜１８）。
このような疾患又は状態の治療における最近の進歩にもかかわらず、炎症性疾患又は状態を治療又は予防できる組成物に対する需要は存在し続けている。
ＩＶ．二重特異性結合分子
Ａ．二重特異性抗体
未修飾天然抗体（例えばＩｇＧ）の、抗原のエピトープに結合する能力は、上記抗体のエピトープ結合部位を形成するための、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖上の可変ドメイン（即ちその軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）及びその重鎖可変ドメイン（ＶＨドメイン））の存在及び相互作用に左右される。単一種の軽鎖及び単一種の重鎖しか存在しないと、その結果として、天然抗体は１つのエピトープ種にしか結合できない（即ち上記天然抗体は単一特異性である）が、当該種の複数の複製に結合できる（即ち２価性又は多価性を示す）。
しかしながら、従来技術は例えば、非特許文献１９（特許文献５３）に記載されているように、異なるエピトープ特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖‐軽鎖ペアを共発現させた後、アフィニティクロマトグラフィを用いて所望の分子を精製することによって、二重特異性抗体の産生に成功した。異なるアプローチでは、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体抗原結合部位）を、ヒンジ、ＣH2及びＣH3領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン定常ドメイン配列、例えば重鎖定常ドメインに融合させた。これらの融合物をコードする核酸を、同一の又は異なる発現ベクターに挿入してよく、また上記核酸は好適な宿主生物において発現される。二重特異性抗体は例えば、非特許文献２０〜２７によって概説されている。
無傷の二重特異性抗体に加えて、従来技術は、二重特異性単鎖抗体誘導体（例えば二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（Bispecific T-cell Engager：ＢｉＴＥ））を開発しており、これは、第１の結合分子に関するＶＬ及びＶＨドメイン、並びに第２の結合分子に関するＶＬ及びＶＨドメインを有する、単一のポリペプチド鎖からなる（例えば特許文献５５〜５８；非特許文献２８〜３０）。
Ｂ．二重特異性ダイアボディ
従来技術は、２つ以上の異なるエピトープ種に結合できる（即ち２価性又は多価性に加えて二重特異性又は多重特異性を示すことができる）点で天然抗体とは異なるダイアボディを産生できる可能性について記述している。ダイアボディの設計は単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）構造をベースとし、これは、介在リンカーによって隔てられたＶＬドメイン及び対応するＶＨドメインを有し、上記介在リンカーは、これらのドメインを互いに相互作用させることができる。ＶＬ及びＶＨドメインの上記相互作用が、不十分な長さ（約１２アミノ酸残基未満）のリンカーの使用によって不可能となった場合、２つのこのようなｓｃＦｖ構造が互いに相互作用することによって、一方の鎖のＶＬドメインが他方の鎖のＶＨドメインと結合する、２価ダイアボディ分子を形成できる（非特許文献３１、３２；特許文献５９、６０；非特許文献３３〜３５；特許文献６１；非特許文献３６〜３９に概説されている）。
非単一特異性ダイアボディの提供は、異なるエピトープを発現する複数の細胞を共連結（co-ligate）して共存させることができる能力という有意な利点を提供する。従って２価ダイアボディは、療法及び免疫診断を含む広範な用途を有する。２価性は、様々な用途におけるダイアボディの設計及び加工の大幅な柔軟性を可能とし、これにより、多量体抗原の結合活性の上昇、異なる複数の抗原の架橋、及び両標的抗原の存在に基づく特定の細胞タイプに対する指向性標的化を提供する。当該技術分野において公知のダイアボディ分子は、（〜５０ｋＤａ以下の小さいサイズのダイアボディに関して）その高い結合価、低い解離率及び循環からの迅速な排除により、腫瘍撮像の分野での特定の使用も示している（非特許文献４０）。特に重要なのは、異なる細胞の共連結、例えば細胞毒性Ｔ細胞と腫瘍細胞との架橋である（非特許文献４１、４２）。
ダイアボディエピトープ結合ドメインはまた、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は他の単核細胞上に発現される、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３２又はＣＤ６４といったいずれの免疫エフェクタ細胞の表面決定因子も対象としてよい。多くの研究において、エフェクタ細胞決定基（例えばＦｃγ受容体（ＦｃγＲ））に対するダイアボディ結合は、エフェクタ細胞を活性化させることも発見された（非特許文献４２、４３；特許文献６２〜６６）。通常、エフェクタ細胞の活性化は、抗原に結合した抗体がＦｃ‐ＦｃγＲ相互作用によってエフェクタ細胞に結合することによってトリガされる。従ってこれに関して、本発明のダイアボディ分子は、（例えば当該技術分野において公知の、又は本出願において例示されるいずれのエフェクタ機能アッセイ（例えばＡＤＣＣアッセイ）において分析されるように）Ｆｃドメインを含むかどうかとは独立して、Ｉｇのような機能性を呈し得る。腫瘍とエフェクタ細胞とを架橋することによって、ダイアボディはエフェクタ細胞を腫瘍細胞近傍にもたらすだけでなく、効果的な腫瘍の殺滅をもたらす（例えば非特許文献４４を参照）。
しかしながら、上述の利点は顕著なコストにつながる。このような非単一特異性ダイアボディの形成は、２つ以上の別個の異なるポリペプチドの良好な集合を必要とする（即ち上記形成は、ダイアボディが、異なるポリペプチド鎖種のヘテロ二量体形成によって形成されることを必要とする）。この事実は、同一のポリペプチド鎖のホモ二量体形成によって形成される単一特異性ダイアボディとは対照的である。非単一特異性ダイアボディを形成するために少なくとも２つの異なるポリペプチド（即ち２つのポリペプチド種）を提供しなければならないため、及びこのようなポリペプチドのホモ二量体形成は不活性分子をもたらす（非特許文献３９）ため、このようなポリペプチドの産生は、同一種のポリペプチド間での共有結合を防止するような方法で達成しなければならない（非特許文献４５）。従って本技術分野は、このようなポリペプチドの非共有結合的連結を教示している（例えば非特許文献３６、３８、３９、３５を参照）。
しかしながら、従来技術は、非共有結合的に連結したポリペプチドで構成される二重特異性ダイアボディが不安定であり、非機能性モノマーへと容易に分解することを認識している（例えば非特許文献３５を参照）。
この課題をものともせず、従来技術は、安定した共有結合ヘテロ二量体性非単一特異性ダイアボディの開発に成功した(例えば特許文献６２〜６６；非特許文献４５〜５４を参照）。このようなアプローチは、採用したポリペプチド鎖それぞれに１つ又は複数のシステイン残基を組み込むことを含む。例えば、このような構造のＣ末端へのシステイン残基の追加は、ポリペプチド鎖間のジスルフィド結合を可能とすることが分かっており、これは、２価分子の結合特性に干渉することなく、得られるヘテロ二量体を安定化させる。
このような成功に基づき、従来技術は、阻害性Ｆｃγ受容体ＩＩｂ（ＣＤ３２Ｂ）及びＢ細胞上のＢ細胞受容体（ＢＣＲ）の構成要素ＣＤ７９Ｂを共連結することによってＣＤ３２Ｂ及びＣＤ７９Ｂに同時に結合できる二重特異性２価ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディである、ＭｇＤ０１０を産生した（非特許文献５５）（図１Ａ）。本発明は、ＭＧＤ０１０と、他のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性分子、特にＦｃドメインを含む上記二重特異性分子との、改善された使用方法及び投与方法に関する。
米国特許第８，４４５，６４５号 米国特許第８，２１７，１４７号 米国特許第８，２１６，５７９号 米国特許第８，２１６，５７４号 米国特許第８，１９３，３１８号 米国特許第８，１９２，７３７号 米国特許第８，１８７，５９３号 米国特許第８，１３３，９８２号 米国特許第８，０４４，１８０号 米国特許第８，００３，７７４号 米国特許第７，９６０，５１２号 米国特許第７，７８６，２７０号 米国特許第７，６３２，４９７号 米国特許第７，５２１，５４２号 米国特許第７，４２５，６１９号 米国特許第７，３５５，００８号 米国特許出願公開第２０１２／０２７６０９４号 米国特許出願公開第２０１２／０２６９８１１号 米国特許出願公開第２０１２／０２６３７１１号 米国特許出願公開第２０１２／０２１９５５１号 米国特許出願公開第２０１２／０２１３７８１号 米国特許出願公開第２０１２／０１４１４７６号 米国特許出願公開第２０１１／０３０５７１４号 米国特許出願公開第２０１１／０２４３９４１号 米国特許出願公開第２０１０／０３２２９２４号 米国特許出願公開第２０１０／０２５４９８５号 米国特許出願公開第２０１０／０１９６３６２号 米国特許出願公開第２０１０／０１７４０５３号 米国特許出願公開第２００９／０２０２５３７号 米国特許出願公開第２００９／０１９１１９５号 米国特許出願公開第２００９／００９２６１０号 米国特許出願公開第２００９／００７６２５１号 米国特許出願公開第２００９／００７４７７１号 米国特許出願公開第２００９／００６０９１０号 米国特許出願公開第２００９／００５３２１８号 米国特許出願公開第２００９／００１７０２７号 米国特許出願公開第２００９／００１７０２６号 米国特許出願公開第２００９／００１７０２３号 米国特許出願公開第２００８／０１３８３４９号 米国特許出願公開第２００８／０１３８３４４号 米国特許出願公開第２００８／０１３１４３５号 米国特許出願公開第２００８／０１１２９６１号 米国特許出願公開第２００８／００４４４２９号 米国特許出願公開第２００８／００４４４１７号 米国特許出願公開第２００７／００７７２４６号 米国特許出願公開第２００７／００３６７９９号 米国特許出願公開第２００７／００１４７９５号 米国特許出願公開第２００７／０００４９０９号 米国特許出願公開第２００５／０２６０２１３号 米国特許出願公開第２００５／０２１５７６７号 米国特許出願公開第２００５／００６４５１４号 米国特許出願公開第２００５／００３７０００号 米国特許出願公開第２００４／０１８５０４５号 国際公開第９３／０８８２９号 米国特許第７，１１２，３２４号 米国特許第７，２３５，６４１号 米国特許第７，５７５，９２３号 米国特許第７，９１９，０８９号 米国特許出願公開第２００４／００５８４００号（Holliger et al.） 米国特許出願公開第２００４／０２２０３８８号（Mertens et al.） 国際公開第０２／０２７８１号（Mertens et al.） 国際公開第２００６／１１３６６５号 国際公開第２００８／１５７３７９号 国際公開第２０１０／０８０５３８号 国際公開第２０１２／０１８６８７号 国際公開第２０１２／１６２０６８号
Ravetch J.V. et al.(1991) "Fc Receptors," Annu. Rev. Immunol. 9:457‐92 Gerber J.S. et al.(2001) "Stimulatory And Inhibitory Signals Originating From The Macrophage Fcγ Receptors," Microbes and Infection, 3:131-139 Billadeau D.D. et al. (2002) "ITAMs Versus ITIMs: Striking A Balance During Cell Regulation," J. Clin. Invest. 2(109):161-168l Ravetch J.V. et al.(2000) "Immune Inhibitory Receptors," Science290:84-89 Ravetch J.V. et al. (2001) "IgG Fc Receptors," Annu. Rev. Immunol. 19:275-90 Ravetch J.V. (1994) "Fc Receptors: Rubor Redux," Cell, 78(4): 553-60 Gauld, S.B. et al. (2002) "B Cell Antigen Receptor Signaling: Roles In Cell Development And Disease," Science 296(5573):1641-1642 Dylke, J. et al. (2007) "Role of the extracellular and transmembrane domain of Ig-alpha/beta in assembly of the B cell antigen receptor (BCR)," Immunol. Lett. 112(1):47-57 Cambier, J.C. (1995) "New Nomenclature For The Reth Motif (or ARH1/TAM/ARAM/YXXL)," Immunol. Today 16:110 DeFranco, A.L. (1997) "The Complexity Of Signaling Pathways Activated By The BCR," Curr. Opin. Immunol. 9:296-308 Kurosaki, T. (1997) "Molecular Mechanisms In B-Cell Antigen Receptor Signaling," Curr. Opin. Immunol. 9:309-318 Kim, K.M. et al. (1993) "Signalling Function Of The B-Cell Antigen Receptors," Immun. Rev. 132:125-146 DePaoli, A.M. et al. (1992) "Graft-Versus-Host Disease And Liver Transplantation," Ann. Intern. Med. 117:170-171 Sudhindran, S. et al. (2003) "Treatment Of Graft-Versus-Host Disease After Liver Transplantation With Basiliximab Followed By Bowel Resection," Am J Transplant. 3:1024-1029 Pollack, M.S. et al. (2005) "Severe, Late-Onset Graft-Versus-Host Disease In A Liver Transplant Recipient Documented By Chimerism Analysis," Hum. Immunol. 66:28-31 Perri, R. et al. (2007) "Graft Vs. Host Disease After Liver Transplantation: A New Approach Is Needed," Liver Transpl. 13:1092-1099 Mawad, R. et al. (2009) "Graft-Versus-Host Disease Presenting With Pancytopenia After En Bloc Multiorgan Transplantation: Case Report And Literature Review," Transplant Proc. 41:4431-4433 Akbulut, S. et al. (2012) "Graft-Versus-Host Disease After Liver Transplantation: A Comprehensive Literature Review," World J. Gastroenterol. 18(37): 5240-5248 Milstein et al. (1983) "Hybrid Hybridomas And Their Use In Immunohistochemistry," Nature 305:537-39 Traunecker et al. (1991) "Bispecific Single Chain Molecules (Janusins) Target Cytotoxic Lymphocytes On HIV Infected Cells," EMBO J. 10:3655-3659 Zhukovsky, E.A. et al. (2016) "Bispecific Antibodies And Cars: Generalized Immunotherapeutics Harnessing T Cell Redirection," Curr. Opin. Immunol. 40:24-35 Kiefer, J.D. et al. (2016) "Immunocytokines And Bispecific Antibodies: Two Complementary Strategies For The Selective Activation Of Immune Cells At The Tumor Site," Immunol. Rev. 270(1):178-192 Solimando, A.G. et al. (2016) "Targeting B-Cell Non-Hodgkin Lymphoma: New And Old Tricks," Leuk. Res. 42:93-104 Fan, G. et al. (2015) "Bispecific Antibodies And Their Applications," J. Hematol. Oncol. 8:130 Grandjenette, C. et al. (2015) "Bispecific Antibodies: An Innovative Arsenal To Hunt, Grab And Destroy Cancer Cells," Curr. Pharm. Biotechnol. 16(8):670-683 Nunez-Prado, N. et al. (2015) "The Coming Of Age Of Engineered Multivalent Antibodies," Drug Discov. Today 20(5):588-594 Kontermann, R.E. et al. (2015) "Bispecific Antibodies," Drug. Discov. Today 20(7):838-847 Wu, J. et al. (2015) "Blinatumomab: A Bispecific T Cell Engager (BiTe) Antibody Against CD19/CD3 For Refractory Acute Lymphoid Leukemia," J. Hematol. Oncol. 8:104 Lutterbuese, R. et al. (2008) "Conversion Of Cetuximab, Panitumumab, Trastuzumab And Omalizumab Into T-Cell-Engaging BiTE Antibodies Creates Novel Drug Candidates Of High Potency," Proc. Am. Assoc. Cancer Res 99:Abs 2402 Baeuerle, P.A. et al. (2009) "Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy," Cancer Res. 69(12):4941-4944 Marvin et al. (2005) "Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies," Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658, Holliger et al. (1993) "’Diabodies’: Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448; Mertens, N. et al., "New Recombinant Bi- and Trispecific Antibody Derivatives," In: Novel Frontiers In The Production Of Compounds For Biomedical Use, A. VanBroekhoven et al. (Eds.), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands (2001), pages 195-208; Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94 Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672 Olafsen, T. et al. (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications," Protein Eng. Des. Sel. 17(1):21-27 Wu, A. et al. (2001) "Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fc Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange," Protein Engineering 14(2):1025-1033 Asano et al. (2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Region," Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992 Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588 Fitzgerald et al. (1997) "Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris," Protein Eng. 10:1221 Staerz et al. (1985) "Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells," Nature 314:628-631 Holliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody," Protein Eng. 9:299-305 Holliger et al. (1999) "Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Specific T-cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins," Cancer Res. 59:2909-2916 Cao et al. (2003) "Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics," Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197 Johnson, S. et al. (2010) "Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B-Cell Depletion," J. Molec. Biol. 399(3):436-449 Veri, M.C. et al. (2010) "Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold," Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943 Moore, P.A. et al. (2011) "Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma," Blood 117(17):4542-4551 Chen, X. et al. (2016) "Mechanistic Projection Of First In Human Dose For Bispecific Immuno-Modulatory P-Cadherin LP-DART - An Integrated PK/PD Modeling Approach," Clin. Pharmacol. Ther. doi: 10.1002/cpt.393 Tsai, P. et al. (2016) "CD19xCD3 DART Protein Mediates Human B-Cell Depletion In Vivo In Humanized BLT Mice," Mol. Ther. Oncolytics. 3:15024 Root et al. (2016) "Development of PF-06671008, a Highly Potent Anti-P-cadherin/Anti-CD3 Bispecific DART Molecule with Extended Half-Life for the Treatment of Cancer," Antibodies 5:6 Sloan, D.D. et al. (2015) "Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells," PLoS Pathog. 11(11):e1005233 Al-Hussaini, M. et al. (2016) "Targeting CD123 In Acute Myeloid Leukemia Using A T-Cell-Directed Dual-Affinity Retargeting Platform," Blood 127(1):122-131) Chichili, G.R. et al. (2015) "A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates," Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82 Zanin, M. et al. (2015) "An Anti-H5N1 Influenza Virus FcDART Antibody Is A Highly Efficacious Therapeutic Agent And Prophylactic Against H5N1 Influenza Virus Infection," J. Virol. 89(8):4549-4561 Chen, W. (2014) "Development Of Human B-Lymphocyte Targeted Bi-Specific DART(R) Molecules For The Treatment Of Autoimmune Disorders," J. Immunol. 192(1 Supp.):200.9
本発明は、ＣＤ３２Ｂのエピトープに対して特異的な結合部位及びＣＤ７９Ｂのエピトープに対して特異的な結合部位を有し、従ってＣＤ３２Ｂ及びＣＤ７９Ｂに同時に結合できる二重特異性結合分子の使用方法を対象とする。本発明は特に、二重特異性抗体（即ち「ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ抗体」）又は二重特異性ダイアボディ（即ち「ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂダイアボディ」）、及び特にＦｃドメインを更に含む上記ダイアボディ（即ち「ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ Ｆｃダイアボディ」）である、上記分子に関する。本発明は、上記分子の使用、及び炎症性疾患又は状態の治療における、上記分子を含有する医薬組成物の使用を対象とする。
詳細には、本発明は、治療的有効量のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子を、それを必要とする被験者に投与するステップを含む、炎症性疾患又は状態を治療する方法を提供し、上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、ＣＤ３２Ｂのエピトープ及びＣＤ７９Ｂのエピトープに免疫特異的に結合でき、上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、約３ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの用量、及び１週間に１用量〜８週間に１用量の投薬レジメンで投与される。
本発明は更に、治療的有効量のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子を、それを必要とする被験者に投与するステップを含む、免疫応答を低下させる又は阻害する方法に関し、上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、ＣＤ３２Ｂのエピトープ及びＣＤ７９Ｂのエピトープに免疫特異的に結合でき、上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、約３ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの用量、及び１週間に１用量〜８週間に１用量の投薬レジメンで投与される。
本発明は更に、上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子が約３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子が約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、又は上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子が約３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、上記方法の実施形態に関する。
本発明は更に、上記投薬レジメンが２週間に１用量（Ｑ２Ｗ）である、上記投薬レジメンが３週間に１用量（Ｑ３Ｗ）である、又は上記投薬レジメンが４週間に１用量（Ｑ４Ｗ）である、上記方法の実施形態に関する。
本発明は更に、上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子が、ＣＤ３２Ｂのエピトープ及びＣＤ７９Ｂのエピトープに結合する二重特異性抗体、又は上記二重特異性抗体のＣＤ３２Ｂ及びＣＤ７９Ｂ結合ドメインを含む分子である、上記方法の実施形態に関する。
本発明は更に、上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子が、ＣＤ３２Ｂのエピトープ及びＣＤ７９Ｂのエピトープに結合するＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性ダイアボディであり、特に上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性ダイアボディがＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性Ｆｃダイアボディである、上記方法の実施形態に関する。
本発明は更に、上記炎症性疾患又は状態が自己免疫疾患であり、特に上記自己免疫疾患が：アジソン病；自己免疫性肝炎；自己免疫性内耳疾患；重症筋無力症；クローン病；皮膚筋炎；家族性腺腫性ポリポーシス；移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）；グレーヴス病；橋本甲状腺炎；エリテマトーデス；多発性硬化症（ＭＳ）；悪性貧血；ライター症候群；関節リウマチ（ＲＡ）；シェーグレン症候群；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；１型糖尿病；原発性血管炎（例えばリウマチ性多発筋痛症、巨細胞性動脈炎、ベーチェット病）；天疱瘡；視神経脊髄炎；抗ＮＭＤＡ受容体脳炎；ギランバレー症候群；慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）；グレーヴス眼症；ＩｇＧ４関連疾患；特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）；及び潰瘍性大腸炎からなる群から選択される、上記方法の実施形態に関する。本発明は特に、上記炎症性疾患又は状態がＧｖＨＤ、ＭＳ、ＲＡ又はＳＬＥである、上記方法の実施形態に関する。
本発明は更に、免疫グロブリンの血清レベルが、上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の最初の用量の投与後３６日目までに低下する、上記方法の実施形態に関する。本発明は特に、免疫グロブリンがＩｇＭ、ＩｇＡ又はＩｇＧである、上記方法の実施形態に関する。
本発明は更に、ＢＣＲ仲介型末梢Ｂ細胞活性化が、上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の単一用量の投与後２４時間までに低下し、上記Ｂ細胞活性化は、生体外カルシウム動員アッセイによって決定される、上記方法の実施形態に関する。本発明は特に、ＢＣＲ仲介型Ｂ細胞活性化が少なくとも５０％阻害され、上記阻害が少なくとも６日間持続する、上記方法の実施形態に関する。
本発明は更に、末梢Ｂ細胞上の上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合部位の少なくとも２０％が、上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の最初の用量の投与後６時間占有される、上記方法の実施形態に関する。
本発明は更に、被験者がヒトである、上記方法の実施形態に関する。
本発明は特に、上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子が：
（Ａ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＶＬCD32Bドメイン；
（Ｂ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨCD32Bドメイン；
（Ｃ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬCD79Bドメイン；
（Ｄ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨCD79Bドメイン
を含む、全ての上記方法の実施形態に関する。
本発明は更に、上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ Ｆｃダイアボディが：
（Ａ）配列番号３９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖；
（Ｂ）配列番号４１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；
（Ｃ）配列番号４４のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖
を含む、上記方法の実施形態に関する。
図１は、それぞれＥコイル又はＫコイルヘテロ二量体促進ドメイン（選択できるヘテロ二量体促進ドメインは以下で提示する）を有する２つのポリペプチド鎖からなる２つのエピトープ結合部位を有する、代表的な共有結合ダイアボディの概略図である。図３Ａ／３Ｂに示すように、システイン残基がリンカー中及び／又はヘテロ二量体促進ドメイン中に存在してよい。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。 図２は、連結した鎖がＦｃ領域の全体又は一部を形成するように、それぞれＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する２つのポリペプチド鎖からなる２つのエピトープ結合部位を有する、代表的な共有結合ダイアボディ分子の概略図である。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。 図３Ａ〜３Ｅは、３つのポリペプチド鎖からなる２つのエピトープ結合ドメインを有する、代表的な共有結合ダイアボディ分子の概略図である。ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの２つの配向が示されている（図３Ａ／３Ｂ、及び図３Ｃ／３Ｄ）。上記ポリペプチド鎖のうちの２つは、連結した鎖がＦｃ領域の全体又は一部を形成するように、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する。ＶＬ及びＶＨドメインを含むポリペプチド鎖はそれぞれ、ヘテロ二量体促進ドメインを更に含み、リンカー（図３Ａ及び３Ｃ）中又はヘテロ二量体促進ドメイン（図３Ｄ及び３Ｂ）中に存在するシステイン残基の間に形成されるジスルフィド結合を介して、互いと共有結合する。図３Ｅは、図３Ａに示されているドメインの配向を有する例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ Ｆｃダイアボディの構造及び機能を示す。図３Ｅに示されているダイアボディは、図３Ａのダイアボディの３つのポリペプチド鎖を含むものの、任意に存在するヘテロ二量体促進ドメインを含まない、共有結合複合体である。この複合体は、ＣＨ２及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖ドメインを含むＦｃドメインと、ＣＤ３２Ｂに対して特異的な結合ドメイン及びＣＤ７９Ｂに対して特異的な結合ドメインとを含む。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。 図４は、本発明のダイアボディが免疫系の阻害を仲介し得る例示的な機序を示す。この図に示されているように、本発明のダイアボディは、ＢＣＲのＣＤ７９Ｂ分子及びＢ細胞のＣＤ３２Ｂ分子に同時に結合することによって、これらの分子を互いに共連結させることができる。このような共連結は、ＣＤ３２Ｂ分子のＩＴＩＭをリン酸化された状態とするため、及びＩＴＡＭ仲介型チロシンキナーゼ活性化の結果として放出されるホスホイノシトールメッセンジャーを加水分解するイノシトールポリリン酸５’ホスファターゼ（ＳＨＩＰ）のＳＨ２ドメインを引き付けるために役立つ。このような加水分解は、ＩＴＡＭ活性化シグナルを阻害することによって、Ｂ細胞活性化を減衰させるのに役立つ。 図５は、好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ Ｆｃダイアボディの、マウスモデルにおいて生体内の異種ＧｖＨＤを減少させる能力を示す。 図６は、ヒト被験者への投与時の、例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の生体内薬物動態を示す。 図７は、ヒト被験者への投与時の、例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の末梢Ｂ細胞への生体内結合の生体外フローサイトメトリー分析を、研究過程全体にわたってまとめたものである。 図８Ａ〜８Ｄは、生体外フローサイトメトリー分析によって決定される、例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子をヒト被験者に投与した後の、末梢Ｂ及びＴ細胞の数を、研究過程全体にわたって示す。 図９Ａ〜９Ｄは、Ｂ細胞の機能に関する研究の方法及び結果を示す。図９Ａ〜９Ｂは、例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子のレシピエントのＢ細胞の機能を評価するために使用した生体外カルシウム動員アッセイの、生体外実験手順及びデータ分析方法を示す。図９Ｃ〜９Ｄは、例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子をヒト被験者に投与した後の、ピーク応答の低減（図９Ｃ）と、曲線下面積（Area Under the Curve：ＡＵＣ）によって測定される全体の応答の持続的な低減（図９Ｄ）とを、研究過程全体にわたって示す。 図１０Ａ‐１０Ｃは、ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の投与により、ヒト被験者のＣＤ２７+記憶Ｂ細胞上でのＢＣＲ発現が下方制御されることを示す。図１０Ａ：膜結合ＩｇＧ（ｍＩｇＧ）；図１０Ｂ：膜結合ＩｇＭ；図１０Ｃ：膜結合ＩｇＤ（ｍＩｇＤ）。データは平均±ＳＥＭとして提示されている。 図１１Ａ〜１１Ｃは、ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の投与により、ヒト被験者のＣＤ２７-ナイーブＢ細胞上でのＢＣＲ発現が、研究過程全体にわたって下方制御されることを示す。図１１Ａ：膜結合ＩｇＤ（ｍＩｇＤ）；図１１Ｂ：膜結合ＩｇＭ；図１１Ｃ：膜結合ＩｇＭ（ｍＩｇＭ）におけるパーセント変化。膜結合免疫グロブリンレベルは、フローサイトメトリーによって決定した。データは平均±ＳＥＭとして提示されている。 図１２Ａ〜１２Ｃは、ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の投与が、ヒト被験者の血清Ｉｇレベルを、研究過程全体にわたって変調させることを示す。図１２Ａ：血清ＩｇＭ；図１２Ｂ：血清ＩｇＡ；図１２Ｃ：血清ＩｇＧ。血清免疫グロブリンＩｇＡ、ＩｇＧ及びＩｇＭレベルは、ＥＬＩＳＡによって決定した。データは平均±ＳＥＭとして提示されている。 図１３は、ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の投与が、末梢Ｂ細胞の表面共刺激分子の生体外フローサイトメトリー分析によって決定される共刺激分子ＣＤ４０のレベルを低減することを示す。データは平均±ＳＥＭとして提示されている。 図１４Ａ〜１４Ｂは、実施例１の例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ Ｆｃダイアボディの生体外飽和ＥmaxＰＫ／ＰＤ Ｂ細胞結合研究に関する（２つの異なる濃度範囲での）データを示す。データは、線形‐線形及び対数‐線形スケールにおいてグラフで評価した。 図１５Ａ〜１５Ｆは、標的濃度が得られる用量を同定するために、ヒトにおけるＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子薬物動態プロファイルを重ね合わせて、前臨床標的濃度を示す。図１５Ａ〜１５Ｆでは、Ｙ軸はＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子濃度［ｎｇ／ｍＬ］であり、Ｘ軸は時間（単位：時間）であり、上部、中央及び底部の水平な線はそれぞれ、インビトロＢ細胞結合／阻害研究の結合分子濃度値、本研究におけるＥＣ５０ Ｂ細胞結合の結合分子濃度値、並びにヒト化マウスモデルにおけるＩｇＧ及びＩｇＭの生体内阻害の結合分子濃度値である。 図１６Ａ〜１６Ｄは、２週間に１回（Ｑ２Ｗ）、３週間に１回（Ｑ３Ｗ）及び４週間に１回（Ｑ４Ｗ）の投薬レジメンに関する、被験者の体重に対して０．３ｍｇ／ｋｇ（図１６Ａ）、１ｍｇ／ｋｇ（図１６Ｂ）、３ｍｇ／ｋｇ（図１６Ｃ）及び１０ｍｇ／ｋｇ（図１６Ｄ）の用量のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の平均濃度のシミュレーションを示す。実際の時間及び濃度、並びに公称用量を使用した。図１６Ａ〜１６Ｄに関して、Ｙ軸はＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子濃度［ｎｇ／ｍＬ］であり、Ｘ軸は時間（単位：時間）である。 図１７Ａ〜１７Ｄは、図１６Ａ〜１６Ｄのモデル化されたプロファイルにおける予想変動性を（ＳＤと共に）示す。 図１８は、ＨＡＶを用いたワクチン接種後５７日目の、健康なヒト被験者の血清中に存在する、ＨＡＶ特異性ＩｇＧの濃度を示す。これらのデータは、ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の投与によって、ＨＡＶワクチン接種済みのヒト被験者のＨＡＶ特異性ＩｇＧレベルが低下することを示す。 図１９は、ＣＤ４０依存性Ｂ細胞ＩｇＧ分泌のインビトロ検出によって決定されるように、ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子がＣＤ４０依存性Ｂ細胞応答を阻害することを示す。ヒトＢ細胞は、例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子（２０μｇ／ｍＬ）の存在下又は不在下で、希釈せずに若しくは３倍希釈を続けて（１、１／３、１／９及び１／２７）使用される刺激因子（ＣＤ４０リガンド（５００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ‐４（１００ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ‐２１（２０ｎｇ／ｍＬ））を用いて又は用いずに５日間培養され、分泌されたＩｇＧをＥＬＩＳＡアッセイで決定した。
本発明は、ＣＤ３２Ｂのエピトープに対して特異的な結合部位及びＣＤ７９Ｂのエピトープに対して特異的な結合部位を有し、従ってＣＤ３２Ｂ及びＣＤ７９Ｂに同時に結合できる二重特異性結合分子の使用方法を対象とする。本発明は特に、二重特異性抗体（即ち「ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ抗体」）又は二重特異性ダイアボディ（即ち「ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂダイアボディ」）、及び特にＦｃドメインを更に含む上記ダイアボディ（即ち「ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ Ｆｃダイアボディ」）である、上記分子に関する。本発明は、上記分子の使用、及び上記分子を含有する医薬組成物の使用を対象とする。
上述のように、ＣＤ７９Ｂ及びＣＤ３２Ｂ（ＦｃγＲＩＩＢ）はいずれも、抗原認識に応答して増殖しているＢ細胞によって発現される。本発明の二重特異性結合分子は、これら両方の分子に免疫特異的に結合でき、従ってこれらの分子を共連結させることができる。このような共連結（例えば図４を参照）は、ＣＤ３２Ｂ分子のＩＴＩＭをリン酸化された状態とするため、及びＣＤ７９Ｂ ＩＴＡＭのチロシンキナーゼ仲介型活性化の結果として放出されるホスホイノシトールメッセンジャーを加水分解するイノシトールポリリン酸５’ホスファターゼ（ＳＨＩＰ）のＳＨ２ドメインを引き付けるために役立つ。このような加水分解は、ＣＤ７９ＢのＩＴＡＭ活性化シグナルを阻害することによって、Ｂ細胞活性化を弱化させるために役立つ。従って本発明の二重特異性結合分子は、望ましくないＢ細胞活性化、Ｂ細胞増殖及び抗体分泌に応答する宿主の免疫系を阻害又は弱化させる能力を有し、炎症性疾患及び障害、特に全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）及び移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の治療において有用である。
本明細書において使用される場合、用語「抗体（antibody）」は、特定のドメイン又は部分又は形態（「エピトープ（epitope）」）がこのような分子上に存在することにより、ポリペプチド又はタンパク質若しくは非タンパク質分子に免疫特異的に結合できる、免疫グロブリン分子を指す。エピトープ含有分子は免疫原性活性を有してよく、これにより上記エピトープ含有分子は、動物の体内で抗体産生応答を誘発し、このような分子は「抗原（antigen）」と呼ばれる。エピトープ含有分子が必ずしも免疫原性でなくてよい。
天然抗体（ＩｇＧ抗体等）は、２つの重鎖と複合体化した２つの軽鎖からなる。天然抗体（ＩｇＧ抗体等）の各軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬドメイン）及び定常ドメイン（ＣＬドメイン）を含有する。天然抗体の各重鎖は、重鎖可変ドメイン（ＶＨドメイン）、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン）、並びにＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に位置する「ヒンジ（Hinge）」ドメイン（「Ｈ」）を含有する。従って、自然に発生する免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）の基本構造単位は、通常は約１５０，０００Ｄａの糖タンパク質として発現される、軽鎖及び２つの重鎖を有する三量体である。各鎖のアミノ末端（「Ｎ末端（N-terminal）」）部分は、抗原認識に主要な役割を果たす約１００〜１１０個の可変ドメインを含む。各鎖のカルボキシ末端（「Ｃ末端（C-terminal）」）部分は定常領域を画定し、軽鎖は単一の定常ドメインを有し、重鎖は通常３つの定常ドメイン及び１つのヒンジドメインを有する。従って、ＩｇＧ分子の軽鎖の構造はｎ‐ＶＬ‐ＣＬ‐ｃであり、ＩｇＧ重鎖の構造はｎ‐ＶＨ‐ＣＨ１‐Ｈ‐ＣＨ２‐ＣＨ３‐ｃである（ここでｎ及びｃはそれぞれ、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端を表す）。ある抗体の、抗原のエピトープに結合する能力は、抗体のＶＬ及びＶＨドメインの存在並びにそのアミノ酸配列左右される。抗体軽鎖と抗体重鎖との相互作用、特にそのＶＬドメインとＶＨドメインとの相互作用は、天然抗体の２つのエピトープ結合部位のうちの１つを形成する。天然抗体は、１つのエピトープ種のみに結合できる（即ち天然抗体は単一特異性である）が、当該種の複数の複製に結合できる（即ち２価性又は多価性を示す）。ＩｇＧ分子の可変ドメインは、エピトープと接触した残基を含有する複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）、及びフレームワークセグメント（ＦＲ）と呼ばれる非ＣＤＲセグメントからなり、上記フレームワークセグメントは、一般にＣＤＲループの構造を維持してＣＤＲの位置を決定することにより、このような接触を可能とする（ただし特定のフレームワーク残基も抗原に接触し得る）。従って、ＶL及びＶＨドメインは、構造ｎ‐ＦＲ１‐ＣＤＲ１‐ＦＲ２‐ＣＤＲ２‐ＦＲ３‐ＣＤＲ３‐ＦＲ４‐ｃを有する。抗体軽鎖の第１、第２及び第３のＣＤＲである（又は第１、第２及び第３のＣＤＲとして機能し得る）ポリペプチドは、本明細書ではそれぞれＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインと呼ばれる。同様に、抗体重鎖の第１、第２及び第３のＣＤＲである（又は第１、第２及び第３のＣＤＲとして機能し得る）ポリペプチドは、本明細書ではそれぞれＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン、及びＣＤＲH３ドメインと呼ばれる。よって、ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン、ＣＤＲL３ドメイン、ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン、及びＣＤＲH３ドメインという用語は、あるタンパク質に組み込まれた場合に、当該タンパク質が、軽鎖及び重鎖若しくはダイアボディ若しくは単鎖結合分子（例えばｓｃＦｖ、ＢｉＴｅ等）を有する抗体であるか、又は別のタイプのタンパク質であるかにかかわらず、当該タンパク質を、特定のエピトープに結合できるようにする、ポリペプチドを対象としている。従って本明細書において使用される場合、用語「エピトープ結合ドメイン（epitope binding domain）」は、エピトープ結合分子の、このような分子があるエピトープに免疫特異的に結合する能力の原因となる部分を指す。エピトープ結合断片は、上記抗体のＣＤＲドメインのうちの１個、２個、３個、４個、５個又は６個全てを含有でき、またこのようなエピトープに免疫特異的に結合できる一方で、上記抗体のエピトープとは異なるエピトープに対する免疫特異性、親和性又は選択性を呈してよい。しかしながら好ましくは、エピトープ結合断片は、上記抗体のＣＤＲドメインのうちの６個全てを含有する。抗体のエピトープ結合断片は、単一のポリペプチド鎖であってよく（例えばｓｃＦｖ）、又はそれぞれアミノ末端及びカルボキシル末端を有する２つ以上のポリペプチド鎖を含んでよい（例えばダイアボディ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）2断片等）。
本明細書において使用される場合、用語「抗体（antibody）」は：モノクローナル抗体；多重特異性抗体；ヒト抗体；ヒト化抗体；合成抗体；キメラ抗体；ポリクローナル抗体；ラクダ化抗体；単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）；単鎖抗体；免疫学的に活性の抗体断片（例えば：Ｆａｂ断片；Ｆａｂ’断片；Ｆ（ａｂ’）2断片；Ｆｖ断片；ＶL及び／若しくはＶHドメインを含有する断片、又はある抗原等に特異的に結合するＶＬドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）（即ちＣＤＲL１、ＣＤＲL２及び／若しくはＣＤＲL３）若しくはＶＨドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）（即ちＣＤＲH１、ＣＤＲH２及び／若しくはＣＤＲH３）の相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの１つ、２つ若しくは３つを含有する断片等といったエピトープに結合できる、抗体断片）；二重官能性又は多重官能性抗体；ジスルフィド結合二重特異性Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）；細胞内抗体；及び以上のうちのいずれの、エピトープ結合断片を包含する。特に用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性の断片、即ちエピトープ結合部位を含有する分子を包含することを意図したものである。免疫グロブリン分子は、いずれのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＡ1及びＩｇＡ2）又はサブクラスのものとすることができる（例えば米国公開特許第２００４０１８５０４５号；米国公開特許第２００５００３７０００号；米国公開特許第２００５００６４５１４号；米国公開特許第２００５０２１５７６７号；米国公開特許第２００７０００４９０９号；米国公開特許第２００７００３６７９９号；米国公開特許第２００７００７７２４６号；及び米国公開特許第２００７０２４４３０３号参照）。この数十年、抗体の治療的潜在能力に対する関心が再び高まっており、抗体は、生命工学由来の薬剤の筆頭となるクラスの１つとなっている（Chan, C.E. et al. (2009) “The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases,” Singapore Med. J. 50(7):663-666）。２００を超える抗体系薬剤が使用認可済み、又は開発中である。
用語「キメラ抗体（chimeric antigen）」は、これらが所望の生物活性を示す限りにおいて、重鎖及び／又は軽鎖の一部分がある種（例えばマウス）由来のある抗体又は抗体クラス若しくはサブクラスと同一又は相同でありながら、残りの部分が別の種（例えばヒト）の抗体又は抗体クラス若しくはサブクラスと同一又は均質である、抗体を指す。本明細書における関心対象のキメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば旧世界ザル、類人猿等）由来の可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化（primatized）」抗体を含む。
本明細書において使用される場合、用語「モノクローナル抗体（monoclonal antibody）」は、略均質な抗体の集団のうちの１つの抗体を表し、即ち上記集団を構成する個々の抗体は、微量存在し得る自然発生的突然変異を有する抗体の可能性を除いて同一である。また本明細書において使用される場合、用語「ポリクローナル抗体（polyclonal antibody）は、不均質な抗体の集団から得られる抗体を指す。用語「モノクローナル（monoclonal）」は、抗体の略均質な集団であるという抗体の特性を示し、いずれの特定の方法によって（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組み換え発現、遺伝子導入動物等によって）抗体を産生することを要求するものとして解釈してはならない。この用語は、免疫グロブリン全体、及び「抗体」の定義において上述した断片等を含む。モノクローナル抗体の作製方法は当該技術分野において公知である。採用してよい１つの方法は、Kohler, G. et al. (1975) “Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity,” Nature 256:495-497の方法又はその修正例である。典型的には、モノクローナル抗体はマウス、ラット又はウサギにおいて発現する。上記抗体は、動物を、所望のエピトープを含有する免疫原性量の細胞、細胞抽出物又はタンパク製剤で免疫化することによって産生される。免疫原は、一次細胞、培養された細胞株、癌細胞、タンパク質、ペプチド、核酸又は組織とすることができるが、これらに限定されない。免疫化に使用してよい細胞は、これらを免疫原として使用するよりもある期間（例えば少なくとも２４時間）だけ前に、培養してよい。細胞は単独で、又はＲｉｂｉ等の非変性アジュバントと組み合わせて、免疫原として使用してよい（例えばJennings, V.M. (1995) “Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production,” ILAR J. 37(3):119-125参照）。一般に細胞は、免疫原として使用される際、完全な状態、及び好ましくは生存できる状態に維持しなければならない。完全な細胞は、破裂した細胞よりも、免疫性を与えられた動物が抗原をより良好に検出できるようにすることができる。変性又は強いアジュバント、例えばフロイントアジュバントの使用は、細胞を破裂させる場合があり、従って推奨されない。免疫原は、２週間に１回若しくは１週間に１回等、周期的な間隔で複数回投与してよく、又は動物中（例えば組織組み換え中）に生存能力を維持できるように投与してよい。あるいは、所望の病原性エピトープに対する免疫特異性を有する既存のモノクローナル抗体及び他の同等の抗体は、当該技術分野で公知のいずれの手段によって、組み換え配列及び産生できる。一実施形態では、このような抗体を配列し、続いてポリヌクレオチド配列を発現又は繁殖のためのベクターにクローン化する。関心対象の抗体をエンコードする配列は、宿主細胞中のベクター中に保持され、続いて上記宿主細胞を、将来使用するために膨張させて冷凍できる。このような抗体のポリヌクレオチド配列は、本発明の単一特異性又は多重特異性（例えば二重特異性、三重特異性及び四重特異性）分子、並びに親和性が最適化された抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及び／又はイヌ化抗体を生成することによって、抗体の親和性又は他の特徴を改善するための、遺伝子操作のために使用してよい。
用語「ｓｃＦｖ」は、単鎖可変ドメイン断片を指す。ｓｃＦｖ分子は、短い連結ペプチドを用いて軽鎖又は重鎖可変ドメインを連結することによって作製される。Bird et al.(1988)（"Single-Chain Antigen-Binding Proteins," Science 242:423-426）は、一方の可変ドメインのカルボキシ末端と他方の可変ドメインのアミノ末端との間の約３．５ｎｍを埋める連結ペプチドの例を記載している。他の配列のリンカーも設計及び使用されている（Bird et al. (1988), "Single-Chain Antigen-Binding Proteins," Science 242:423-426）。リンカーは、薬剤又はアタッチメントを固体支持体に取り付ける等の更なる機能のために修飾できる。単鎖変異型は、組み換え又は合成によって産生できる。ｓｃＦｖの合成産生のために、自動合成器を使用できる。ｓｃＦｖの組み換え産生のためには、ｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドを含有する好適なプラスミドを、酵母、植物、昆虫又は哺乳類細胞等の真核細胞又は大腸菌等の原核細胞といった、好適な宿主細胞に導入できる。関心対象のｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーションといった慣用の操作によって作製できる。得られたｓｃＦｖは、当該技術分野において公知の標準的なタンパク質精製技法を用いて単離できる。
用語「ヒト化（humanized）」抗体は、キメラ分子であって、一般に組み換え技術を用いて調製され、非ヒト種からの免疫グロブリンのエピトープ結合部位と、残りの、ヒト免疫グロブリンの構造及び／又は配列に基づく分子の免疫グロブリン構造とを有する、キメラ分子を指す。エピトープ結合部位は、定常ドメインに融合した完全な可変ドメイン、又は可変ドメイン内の適切なフレームワーク領域上に移植されたＣＤＲのみを含んでよい。エピトープ結合部位は野生型であってよく、又は１つ若しくは複数のアミノ酸置換によって修飾されてよい。これにより、ヒト個体の免疫原としての不変領域が削減されるが、外来の可変領域に対する免疫応答の可能性は残る（LoBuglio, A.F. et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224）。別のアプローチは、ヒト由来不変領域を提供することだけでなく、可変領域を修飾して、ヒト型に可能な限り近くなるように再成形することに焦点を当てている。重鎖及び軽鎖両方の可変領域は、問題となる抗原に応答して変化して結合能力を決定する、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）が隣接する３つのＣＤＲを内包することが知られており、上記フレームワーク領域は、ある所与の種において相対的に保存され、またＣＤＲのための足場を提供するものと推定される。ある特定の抗原に対して非ヒト抗体を調製する際、非ヒト抗体由来のＣＤＲを、修飾されるヒト抗体内に存在するＦＲに移植することによって、可変領域を「再成形」又は「ヒト化」できる。様々な抗体に対するこのアプローチの適用は：Sato, K. et al. (1993) “Reshaping A Human Antibody To Inhibit The Interleukin 6-Dependent Tumor Cell Growth,” Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) “Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation,” Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) “Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity,” Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. et al. (1991) “Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) “Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo,” Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. et al. (1991) “Humanized Antibodies For Antiviral Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) “Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; 及びCo, M.S. et al. (1992) “Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen,” J. Immunol. 148:1149-1154によって報告されている。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は全てのＣＤＲ配列を保存する（例えば、マウス抗体からの６つのＣＤＲ全てを含有するヒト化マウス抗体）。他の実施形態では、ヒト化抗体は、オリジナルの抗体に対してその１つ又は複数のアミノ酸配列が改変された１つ又は複数のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つ）を有し、これらは、オリジナルの抗体からの１つ又は複数のＣＤＲ「に由来する（derived from）」（即ち、このようなＣＤＲに由来する、このようなＣＤＲのアミノ酸配列の知識に由来する、等）１つ又は複数のＣＤＲとも呼ばれる。抗体の可変ドメインをエンコードするポリヌクレオチド配列は、上記誘導体を生成するため及び上記抗体の親和性又は他の特徴を改善するための遺伝子操作のために使用できる。抗体をヒト化する際の一般原理は、抗体のエピトープ結合部分の塩基配列を保持しながら、抗体の非ヒト残部をヒト抗体配列と交換するステップを伴う。モノクローナル抗体をヒト化するためには、４つの一般的なステップが存在する。上記ステップは以下の通りである：（１）開始抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインのヌクレオチド及び予測されるアミノ酸配列を決定するステップ；（２）ヒト化抗体又はイヌ化抗体を設計するステップ、即ちヒト化又はイヌ化プロセス中に使用する抗体フレームワーク領域を決定するステップ；（３）実際のヒト化又はイヌ化法／技術；並びに（４）ヒト化抗体のトランスフェクション及び発現。例えば米国特許第４，８１６，５６７号；米国特許第５，８０７，７１５号；米国特許第５，８６６，６９２号；及び米国特許第６，３３１，４１５号を参照。
上述のように、本発明の二重特異性結合分子は、少なくとも２つのエピトープ結合ドメインを有する。このようなエピトープ結合ドメインはそれぞれ、エピトープに「免疫特異的な（immunospecific）」様式で結合できる。本明細書中で使用される場合、本発明の抗体、ダイアボディ又は他の二重特異性結合分子は、別の分子のある領域（即ちエピトープ）に対して、代替的なエピトープに比べてより頻繁に、より迅速に、より長期間、及び／又はより高い親和性で反応又は連結する場合に、「免疫特異的に」結合する（又は「特異的」結合を示す）、と言い表される。例えば、ＣＤ３２Ｂのエピトープ（又はＣＤ７９Ｂのエピトープ）に特異的に結合する抗体は、ＣＤ３２Ｂの他のエピトープ（若しくはＣＤ７９Ｂの他のエピトープ）に又はＣＤ３２Ｂ（若しくはＣＤ７９Ｂ）以外の分子のエピトープに結合する場合よりも高い親和性で、高い結合活性で、より容易に、及び／又はより長期間、該エピトープに結合する。この定義を読めば、例えば第１の標的に免疫特異的に結合する抗体（又は部分若しくはエピトープ）は、第２の標的に特異的又は優先的に結合してもしなくてもよいことも理解される。従って「免疫特異的結合（immunospecific binding）」は、排他的結合を必ずしも必要としない（ただし含むことはできる）。一般に、ただし必ずしもそうではないが、結合に関する言及は「特異的」結合を意味する。ある抗体の、あるエピトープに免疫特異的に結合する能力は、例えばイムノアッセイによって決定できる。
本発明のヒト化分子のエピトープ結合ドメインは、定常ドメインに融合する完全可変ドメイン、又は適切なフレームワーク領域にグラフトされたこのような可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを含んでよい。エピトープ結合ドメインは野生型であってよく、又は例えば該分子のいずれの定常ドメインがヒト個体内で免疫原として作用する能力を低減するために、１つ若しくは複数のアミノ酸置換によって修飾してよい。これにより、ヒト個体の免疫原である定常領域が排除される場合があるが、外来可変ドメインの可能性は残る（LoBuglio, A.F. et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224）。別のアプローチは、ヒト由来定常領域を提供することだけでなく、上記可変ドメインをヒト形態に可能な限り近くなるように変形させるために上記可変ドメインを修飾することにも、焦点を当てている。重鎖及び軽鎖両方の可変ドメインは、問題となる抗原に応答して変化して結合能力を決定する、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）が隣接する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を内包することが知られており、上記フレームワーク領域は、ある所与の種において相対的に保存され、またＣＤＲのための足場を提供するものと推定される。ある特定の抗原に対して非ヒト抗体を調製する際、非ヒト抗体由来のＣＤＲを、修飾されるヒト抗体内に存在するＦＲに移植することによって、可変ドメインを「再成形」又は「ヒト化」できる。様々な抗体に対するこのアプローチの適用は、Sato, K. et al. (1993) “Reshaping A Human Antibody To Inhibit The Interleukin 6-Dependent Tumor Cell Growth,” Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) “Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation,” Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) “Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity,” Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. et al. (1991) “Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) “Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo,” Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. et al. (1991) “Humanized Antibodies For Antiviral Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) “Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; 及びCo, M.S. et al. (1992) “Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen,” J. Immunol. 148:1149-1154によって報告されている。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は全てのＣＤＲ配列を保存する（例えば、マウス抗体からの６つのＣＤＲ全てを含有するヒト化マウス抗体）。他の実施形態では、ヒト化抗体は、オリジナルの抗体に対して配列が異なる改変された１つ又は複数のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つ）を有する。
非ヒト免疫グロブリン由来のエピトープ結合部位を含む多数の「ヒト化（humanized）」抗体分子が説明されており、これらは、げっ歯類又は修飾げっ歯類可変ドメインと、ヒト定常ドメインに融合した、これらに関連する相補性決定領域（ＣＤＲ）とを有するキメラ抗体を含む（例えばWinter et al. (1991) “Man-made Antibodies,” Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989); Shaw et al. (1987) “Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen,” J. Immunol. 138:4534-4538;及びBrown et al. (1987) “Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody,” Cancer Res. 47:3577-3583を参照）。他の参照文献は、適切なヒト抗体定常ドメインと融合する前にヒト支持性フレームワーク領域（ＦＲ）にグラフと重合される、げっ歯類ＣＤＲについて説明している（例えば、Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1534-1536;及びJones et al. (1986) “Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse,” Nature 321:522-525を参照）。別の参照文献は、組み換えによってベニアリングされたげっ歯類フレームワーク領域によって支持されたげっ歯類ＣＤＲについて説明している。例えば欧州公開特許第５１９，５９６号を参照。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントのこれらの部分の治療的応用の期間及び効果を制限する、げっ歯類抗ヒト抗体分子に対する望ましくない免疫学的応答を最小化するよう設計される。抗体をヒト化するために利用してよい他の方法は、Daugherty et al. (1991) “Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins,” Nucl. Acids Res. 19:2471-2476並びに米国特許第６，１８０，３７７号；米国特許第６，０５４，２９７号；米国特許第５，９９７，８６７号；及び米国特許第５，８６６，６９２号によって開示されている。
ＩＩ．抗体定常領域
好ましいＣＬドメインは、ヒトＩｇＧ ＣＬκドメインである。例示的なヒトＩｇＧ ＣＬκドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１）：
RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG
NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK
SFNRGEC
である。
あるいは、例示的なＣＬドメインは、ヒトＩｇＧ ＣＬλドメインである。例示的なヒトＩｇＧ ＣＬλドメインのアミノ酸配列は、（配列番号２）：
QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA
GVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP
TECS
である。
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインである。例示的なヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号３）：
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV
である。
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインである。例示的なヒトＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号４）：
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTV
である。
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ４ ＣＨ１ドメインである。例示的なヒトＩｇＧ４ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号５）：
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRV
である。
ある例示的なヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。例示的なヒトＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ酸配列は、（配列番号６）：EPKSCDKTHTCPPCPである。
別の例示的なヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域である。例示的なヒトＩｇＧ２ヒンジ領域のアミノ酸配列は、（配列番号７）：ERKCCVECPPCPである。
別の例示的なヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域である。例示的なヒトＩｇＧ４ヒンジ領域のアミノ酸配列は、（配列番号８）：ESKYGPPCPSCPである。本明細書中に記載されているように、ＩｇＧ４ヒンジ領域は、Ｓ２２８Ｐ置換等の安定化突然変異を含んでよい。例示的な安定化ＩｇＧ４ヒンジ領域のアミノ酸配列は、（配列番号９）：ESKYGPPCPPCPである。
抗体重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインは相互作用してＦｃ領域を形成し、このＦｃ領域は、ＣＤ３２Ｂ等のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）を含むがこれに限定されない細胞Ｆｃ受容体によって認識されるＦｃドメインを含有する。例示的なヒトＩｇＧ１のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１０）：
231 240 250 260 270 280
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
340 350 360 370 380
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
440 447
ALHNHYTQKS LSLSPGX
であり、これはＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
例示的なヒトＩｇＧ２のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１１）：
231 240 250 260 270 280
APPVA-GPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFNWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQFNSTF RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA
340 350 360 370 380
PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDISVE
390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
440 447
ALHNHYTQKS LSLSPGX
であり、これはＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
例示的なヒトＩｇＧ３のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１２）：
231 240 250 260 270 280
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFKWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQYNSTF RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
340 350 360 370 380
PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
390 400 410 420 430
WESSGQPENN YNTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NIFSCSVMHE
440 447
ALHNRFTQKS LSLSPGX
であり、これはＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
例示的なヒトＩｇＧ４のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１３）：
231 240 250 260 270 280
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS
340 350 360 370 380
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE
440 447
ALHNHYTQKS LSLSLGX
であり、これはＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
本明細書全体を通して、ＩｇＧ重鎖の定常領域の残基の番号付与は、Kabat et al.、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5thEd. Public Health Service、NH1、MD (1991)（「Ｋａｂａｔ」、これは参照により明示的に本明細書に援用される）に記載のＥＵインデックスの番号付与である。用語「Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックス（EU index as in Kabat）」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の番号付与を指す。免疫グロブリンの成熟重鎖及び軽鎖の可変ドメインからのアミノ酸は、鎖内のアミノ酸の位置によって指定される。Ｋａｂａｔは、抗体に関する多数のアミノ酸配列を記載し、各サブグループに関するアミノ酸コンセンサス配列を識別し、また各アミノ酸に残基番号を割り当てており、ＣＤＲはＫａｂａｔによって定義されているように識別される（Chothia, C. & Lesk, A. M.（(1987) “Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobrins,”. J. Mol. Biol. 196:901-917）によって定義されるＣＤＲＨ１は、５残基前から始まることを理解されたい）。Ｋａｂａｔの番号付与スキームは、保存されたアミノ酸を参照して、問題となる抗体を、Ｋａｂａｔ中のコンセンサス配列のうちの１つと整列させることによって、Ｋａｂａｔの概要に含まれていない抗体にまで拡張可能である。残基番号を割り当てるための上記方法は、当該技術分野において標準的なものとなっており、キメラ又はヒト化変異体を含む異なる抗体中の同等の位置のアミノ酸を容易に識別する。例えば、ヒト抗体軽鎖の５０位のアミノ酸は、マウス抗体軽鎖の５０位のアミノ酸と同等の位置を占有する。
多型は、抗体定常領域内の多数の異なる位置（例えばＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスによる番号付与で２７０位、２７２位、３１２位、３１５位、３５６位及び３５８位を含むがこれらに限定されないＦｃ位置）において観察されており、従ってここで提示される配列と従来技術の配列との間にはわずかな差異が存在し得る。ヒト免疫グロブリンの多型形態は、十分に特性決定されている。現在、１８個のＧｍアロタイプが公知である：Ｇ１ｍ（１，２，３，１７）又はＧ１ｍ（ａ，ｘ，ｆ，ｚ）、Ｇ２ｍ（２３）又はＧ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（５，６，１０，１１，１３，１４，１５，１６，２１，２４，２６，２７，２８）又はＧ３ｍ（ｂ１，ｃ３，ｂ３，ｂ０，ｂ３，ｂ４，ｓ，ｔ，ｇ１，ｃ５，ｕ，ｖ，ｇ５）（Lefranc, et al., The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211）。特に、本発明の抗体が、いずれの免疫グロブリン遺伝子のいずれのアロタイプ、アイソアロタイプ又はハプロタイプを組み込むことができ、本明細書中で提示される配列のアロタイプ、アイソアロタイプ又はハプロタイプに限定されないと考えられる。更に、発現系によっては、ＣＨ３ドメインのＣ末端アミノ酸残基（上記太字）は、翻訳後に除去できる。従ってＣＨ３ドメインのＣ末端残基は、本発明のＦｃドメイン含有結合分子の任意のアミノ酸残基である。本発明によって具体的に包含されるのは、ＣＨ３ドメインのＣ末端残基が欠けた本発明の結合分子である。また本発明によって具体的に包含されるのは、ＣＨ３ドメインのＣ末端リシン残基を含む構造である。
ＩＩＩ．本発明の好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子
本発明は、ＣＤ３２Ｂのエピトープ及びＣＤ７９Ｂのエピトープに結合でき、これによって、Ｂ細胞の表面上に自然に配列された（即ち組み換えによって誘導された過剰発現なしの）これらの分子に同時に結合できる、二重特異性結合分子に関する。このような特異性結合分子は、単一のポリペプチド鎖（例えばＢｉＴｅ）からなってよく、又は好ましくはＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の個々のポリペプチド鎖間の複数のジスルフィド結合の存在によって共有結合複合体を形成する２つ、３つ、４つ、５つ若しくは６つ以上のポリペプチド鎖からなってよい。好ましくは、上記分子は、抗体の又はＦｃドメイン含有ダイアボディのＦｃドメインに結合するＣＤ３２Ｂ分子の能力に有意に干渉することなく、又は上記能力を妨害することなく、ＣＤ３２Ｂに免疫特異的に結合できる。
Ａ．二重特異性ｓｃＦｖ及び抗体
第１の好ましい実施形態では、本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、ＢｉＴＥ等の単鎖分子であり、これはＶＬCD32Bドメイン、ＶＬCD79Bドメイン、ＶＨCD32Bドメイン及びＶＬCD79Bドメインを有し、またこれらのドメインはペプチドリンカー分子によって隔てられており、上記ペプチドリンカー分子は、ＶＬCD32BドメインをＶＨCD32Bドメインと相互作用させてＣＤ３２Ｂエピトープ結合ドメインを形成し、またＶＬCD79BドメインをＶＨCD79Bドメインと相互作用させてＣＤ７９Ｂエピトープ結合ドメインを形成する。
第２の好ましい実施形態では、本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、二重特異性抗体又はそのエピトープ結合断片であり、これは、ＣＤ３２Ｂエピトープ結合ドメイン及びＣＤ７９Ｂエピトープ結合ドメインを形成するために、ＶＬCD32Bドメイン、ＶＬCD79Bドメイン、ＶＨCD32Bドメイン及びＶＬCD79Bドメインを有する。このような抗体は、Ｆｃドメインを含有してよい。
Ｂ．二重特異性ダイアボディ
１．非Ｆｃドメイン含有二重特異性ダイアボディ
更なる好ましい実施形態では、本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つ以上のポリペプチド鎖からなる二重特異性１価ダイアボディである。
例えば、図１は、ジスルフィド結合を介して互いに共有結合した２つのポリペプチド鎖からなる、ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性１価ダイアボディを示す。第１のポリペプチド鎖のＶＬドメインは、第２のポリペプチド鎖のＶＨドメインと相互作用して、第１の抗原（即ちＣＤ３２Ｂ又はＣＤ７９Ｂ）に対して特異的な第１の官能性抗原結合部位を形成する。同様に、第２のポリペプチド鎖のＶＬドメインは、第１のポリペプチド鎖のＶＨドメインと相互作用して、第２の抗原（即ちＣＤ７９Ｂ又はＣＤ３２Ｂ、第１の抗原の性質に左右される）に対して特異的な第２の官能性抗原結合部位を形成する。従って、第１及び第２のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインの選択は、これら２つのポリペプチド鎖が集合として、ＣＤ３２Ｂ及びＣＤ７９Ｂに結合できるＶＬ及びＶＨドメインを含む（即ちこれらがＶＬCD32B／ＶＨCD32B及びＶＬCD79B／ＶＨCD79Bを含む）ように整合される（図１）。このようなＶＬ及びＶＨドメインそれぞれ、並びにこれらを隔てる介在リンカーをまとめて、上記分子の抗原結合ドメインと呼ぶ。
上記好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性１価ダイアボディの第１のポリペプチド鎖は（Ｎ末端からＣ末端への方向に）：アミノ末端；ＣＤ３２Ｂ又はＣＤ７９Ｂに結合できるモノクローナル抗体ＶＬドメイン（即ちＶＬCD32B又はＶＬCD79B）；介在スペーサペプチド（リンカー１）；（上記第１のポリペプチド鎖がＶＬCD32Bを含有する場合は）ＣＤ７９Ｂ又は（上記第１のポリペプチド鎖がＶＬCD79Bを含有する場合は）ＣＤ３２Ｂに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン；介在スペーサペプチド（リンカー２）；ヘテロ二量体促進ドメイン；ヘテロ二量体促進ドメインに改善された安定性を提供するための任意の更なるドメイン；及びＣ末端を含む（図１）。
上記好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性１価ダイアボディの第２のポリペプチド鎖は（Ｎ末端からＣ末端への方向に）：アミノ末端；ＣＤ７９Ｂ又はＣＤ３２Ｂに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（即ちＶＬCD79B又はＶＬCD32B、該ダイアボディの第１のポリペプチド鎖に関して選択されるＶＬドメインに左右される）；介在リンカーペプチド（リンカー１）；（上記第２のポリペプチド鎖がＶＬCD79Bを含有する場合は）ＣＤ３２Ｂ又は（上記第２のポリペプチド鎖がＶＬCD32Bを含有する場合は）ＣＤ７９Ｂに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン；介在スペーサペプチド（リンカー２）、ヘテロ二量体促進ドメイン；及びＣ末端を含む（図１）。
最も好ましくは、上述のＶＬドメインとＶＨドメインとを隔てるリンカー１の長さは、上記ＶＬ及びＶＨドメインが互いに対して結合する（例えば１、２、３、４、５、６、７、８又は９個の介在リンカーアミノ酸残基からなる）のを実質的に又は完全に防止するよう選択される。従って第１のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、互いに対して結合することが実質的に又は全くできない。同様に、第２のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、互いに対して結合することが実質的に又は全くできない。好ましい介在スペーサペプチド（リンカー１）は、配列（配列番号１４）：GGGSGGGGを有する。
リンカー２の目的は、ポリペプチド鎖のＶＨドメインを、該ポリペプチド鎖の任意に存在するヘテロ二量体促進ドメインから隔てることである。多様なリンカーのいずれをリンカー２として使用することができる。上記リンカー２の好ましい配列は、ＩｇＧ ＣＨ１ドメイン由来のアミノ酸配列：ASTKG（配列番号１５）、又はジスルフィド結合を介して第１及び第２のポリペプチド鎖を互いに共有結合させるために使用できるシステイン残基を有するGGCGGG（配列番号１６）を有する。リンカー２であるASTKG（配列番号１５）はこのようなシステインを有していないため、上記リンカー２の使用は好ましくは、配列番号２３のＥコイル又は配列番号２４のＫコイル（以下を参照）といったシステイン含有ヘテロ二量体促進ドメインの使用を伴う。従って一実施形態では、ポリペプチド鎖のリンカー２は、（第１及び第２のポリペプチド鎖を互いに共有結合させるために）システイン残基を含有する。別の実施形態では、ポリペプチド鎖のリンカー２はシステインを有さず、上記ポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進ドメインがこのようなシステイン残基を含有することにより、第１及び第２のポリペプチド鎖を互いに共有結合させる。
第１及び第２のポリペプチド鎖のヘテロ二量体の形成は、ヘテロ二量体促進ドメインを含めることによって促進できる。このようなドメインは、一方のポリペプチド鎖上にGVEPKSC（配列番号１７）又はVEPKSC（配列番号１８）を、もう一方のポリペプチド鎖上にGFNRGEC（配列番号１９）又はFNRGEC（配列番号２０）を含む（米国特許出願公開第２００７／０００４９０９号）
しかしながらより好ましくは、本発明のヘテロ二量体促進ドメインは、少なくとも６つ、少なくとも７つ又は少なくとも８つの荷電アミノ酸残基を含む、反対の極の１つ、２つ、３つ又は４つのタンデム反復コイルドメインから形成される（Apostolovic, B. et al. (2008) “pH-Sensitivity of the E3/K3 Heterodimeric Coiled Coil,” Biomacromolecules 9:3173-3180; Arndt, K.M. et al. (2001) “Helix-stabilized Fv (hsFv) Antibody Fragments: Substituting the Constant Domains of a Fab Fragment for a Heterodimeric Coiled-coil Domain,” J. Molec. Biol. 312:221-228; Arndt, K.M. et al. (2002) “Comparison of In Vivo Selection and Rational Design of Heterodimeric Coiled Coils,” Structure 10:1235-1248; Boucher, C. et al. (2010) “Protein Detection By Western Blot Via Coiled-Coil Interactions,” Analytical Biochemistry 399:138-140; Cachia, P.J. et al. (2004) “Synthetic Peptide Vaccine Development: Measurement Of Polyclonal Antibody Affinity And Cross-Reactivity Using A New Peptide Capture And Release System For Surface Plasmon Resonance Spectroscopy,” J. Mol. Recognit. 17:540-557; De Crescenzo, G.D. et al. (2003) “Real-Time Monitoring of the Interactions of Two-Stranded de novo Designed Coiled-Coils: Effect of Chain Length on the Kinetic and Thermodynamic Constants of Binding,” Biochemistry 42:1754-1763; Fernandez-Rodriquez, J. et al. (2012) “Induced Heterodimerization And Purification Of Two Target Proteins By A Synthetic Coiled-Coil Tag,” Protein Science 21:511-519; Ghosh, T.S. et al. (2009) “End-To-End And End-To-Middle Interhelical Interactions: New Classes Of Interacting Helix Pairs In Protein Structures,” Acta Crystallographica D65:1032-1041; Grigoryan, G. et al. (2008) “Structural Specificity In Coiled-Coil Interactions,” Curr. Opin. Struc. Biol. 18:477-483; Litowski, J.R. et al. (2002) “Designing Heterodimeric Two-Stranded α-Helical Coiled-Coils: The Effects Of Hydrophobicity And α-Helical Propensity On Protein Folding, Stability, And Specificity,” J. Biol. Chem. 277:37272-37279; Steinkruger, J.D. et al. (2012) “The d′--d--d′ Vertical Triad is Less Discriminating Than the a′--a--a′ Vertical Triad in the Antiparallel Coiled-coil Dimer Motif,” J. Amer. Chem. Soc. 134(5): 2626-2633; Straussman, R. et al. (2007) “Kinking the Coiled Coil - Negatively Charged Residues at the Coiled-coil Interface,” J. Molec. Biol. 366:1232-1242; Tripet, B. et al. (2002) “Kinetic Analysis of the Interactions between Troponin C and the C-terminal Troponin I Regulatory Region and Validation of a New Peptide Delivery/Capture System used for Surface Plasmon Resonance,” J. Molec. Biol. 323:345-362; Woolfson, D.N. (2005) “The Design Of Coiled-Coil Structures And Assemblies,” Adv. Prot. Chem. 70:79-112; Zeng, Y. et al. (2008) “A Ligand-Pseudoreceptor System Based On de novo Designed Peptides For The Generation Of Adenoviral Vectors With Altered Tropism,” J. Gene Med. 10:355-367）。
このような反復コイルドメインは、完全な反復であってよく、又は置換を有してよい。例えば、第１のポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進ドメインは、８つの負荷電アミノ酸残基のシーケンスを含んでよく、第２のポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進ドメインのコイルドメインは、８つの正荷電アミノ酸残基のシーケンスを含んでよい。反対の電荷のコイルを他方のポリペプチド鎖に対して使用する場合、第１又は第２のポリペプチド鎖にどちらのコイルを設けるかは重要ではない。しかしながら、本発明の好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性１価ダイアボディは、負荷電コイルを有する第１のポリペプチド鎖を有する。正荷電アミノ酸は、リジン、アルギニン、ヒスチジン等であってよく、及び／又は負荷電アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸等であってよい。正荷電アミノ酸は好ましくはリジンであり、及び／又は負荷電アミノ酸は好ましくはグルタミン酸である。（このようなドメインはホモ二量体化を阻害し、これによってヘテロ二量体化を促進するため）単一のヘテロ二量体促進ドメインしか採用できないが、本発明のダイアボディの第１及び第２のポリペプチド鎖両方が、ヘテロ二量体促進ドメインを含有することが好ましい。
好ましい実施形態では、ヘテロ二量体促進ドメインのうちの１つは、４つのタンデム「Ｅコイル」螺旋ドメイン（配列番号２１：EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK）を含み、そのグルタミン酸残基は、ｐＨ７において負の電荷を形成し、またその一方で、ヘテロ二量体促進ドメインのうちのもう一方は、４つのタンデム「Ｋコイル」ドメイン（配列番号２２：KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE）を含み、そのリジン残基は、ｐＨ７において正の電荷を形成する。このような荷電ドメインの存在により、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の連結が促進され、従ってヘテロ二量体化が促進される。特に好ましいのは、配列番号２１の上記４つのタンデム「Ｅコイル」螺旋ドメインのうちの１つが、システイン残基：EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号２３）を含有するように修飾されている、ヘテロ二量体促進ドメインである。同様に、特に好ましいのは、配列番号２２の上記４つのタンデム「Ｋコイル」螺旋ドメインのうちの１つが、システイン残基：KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号２４）を含有するように修飾されている、ヘテロ二量体促進ドメインである。
２．Ｆｃドメイン含有二重特異性ダイアボディ
更なる好ましい実施形態では、本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂダイアボディは更にＦｃドメインを含む。このような本発明のＦｃドメイン含有ダイアボディのＦｃドメインは、完全Ｆｃ領域（例えば完全ＩｇＧ Ｆｃ領域）であってよく、又は完全Ｆｃ領域の断片のみであってよい。本発明の二重特異性１価ＦｃダイアボディのＦｃドメインは、１つ又は複数のＦｃ受容体（例えば１つ又は複数のＦｃγＲ）に結合できる能力を有してよいが、より好ましくは、上記Ｆｃドメインは、（野生型Ｆｃ領域が呈する結合に比べて）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）若しくはＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）に結合する能力が大幅に低下しているか、又は上記能力を有しない。本発明の二重特異性１価ＦｃダイアボディのＦｃドメインは、完全Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのうちのある程度若しくは全体及び／若しくはＣＨ３ドメインのうちのある程度若しくは全体を含んでよく、又は（例えば完全Ｆｃ領域のＣＨ２若しくはＣＨ３ドメインに対する１つ若しくは複数の挿入及び／若しくは１つ若しくは複数の欠失を含んでよい）変異型ＣＨ２及び／若しくは変異型ＣＨ３配列を含んでよい。本発明の二重特異性１価ＦｃダイアボディのＦｃドメインは、非Ｆｃポリペプチド部分を含んでよく、又は自然に発生しない完全Ｆｃ領域の部分を含んでよく、又はＣＨ２及び／若しくはＣＨ３ドメインの自然に発生しない配向を含んでよい（例えば２つのＣＨ２ドメイン若しくは２つのＣＨ３ドメイン、若しくはＮ末端からＣ末端への方向において、ＣＨ３ドメインと、これが連結したＣＨ２ドメイン、等）。
このような本発明のＦｃドメイン含有ダイアボディは、２つのポリペプチド鎖を含んでよく（例えば図２）、又は３つ（例えば図３Ａ〜３Ｅ）若しくは４つ以上のポリペプチド鎖を含んでよい。図２は、各ヘテロ二量体促進ドメインがＣＨ２‐ＣＨ３ドメインで置換されていることを除いて上述のものと同様の構造を有するダイアボディを示す。好ましくは、このようなポリペプチド鎖で形成されたＦｃドメインは、（野生型Ｆｃ領域が呈する結合に比べて）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）等の活性化ＦｃγＲに結合する能力が大幅に低下しているか、又は上記能力を有しない。
図３Ａ〜３Ｅは、３つのポリペプチド鎖からなる代替的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ Ｆｃダイアボディを示し、上記３つのポリペプチド鎖のうち、第１及び第２のポリペプチド鎖は互いに共有結合し、第１及び第３のポリペプチド鎖は互いに共有結合している。上述のダイアボディと同様、第１のポリペプチド鎖のＶＬドメインは、第２のポリペプチド鎖のＶＨドメインと相互作用して、第１の抗原（即ちＣＤ３２Ｂ又はＣＤ７９Ｂ）に対して特異的な第１の官能性抗原結合部位を形成する。同様に、第２のポリペプチド鎖のＶＬドメインは、第１のポリペプチド鎖のＶＨドメインと相互作用して、第２の抗原（即ちＣＤ７９Ｂ又はＣＤ３２Ｂ、第１の抗原の性質に左右される）に対して特異的な第２の官能性抗原結合部位を形成する。従って、第１及び第２のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインの選択は、これら２つのポリペプチド鎖が集合として、ＣＤ３２Ｂ及びＣＤ７９Ｂに結合できるＶＬ及びＶＨドメインを含む（即ちこれらがＶＬCD32B／ＶＨCD32B及びＶＬCD79B／ＶＨCD79Bを含む）ように整合される。このようなＶＬ及びＶＨドメインそれぞれ、並びにこれらを隔てる介在リンカーをまとめて、上記分子の抗原結合ドメインと呼ぶ。
図３Ａ及び図３Ｂに示すＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性Ｆｃダイアボディの実施形態では、第１のポリペプチド鎖は（Ｎ末端からＣ末端への方向に）：アミノ末端；システイン含有ペプチド（ペプチド１）；抗体Ｆｃ領域のＣＨ２及びＣＨ３ドメインの全て又は一部からなるＩｇＧ Ｆｃドメイン；介在リンカーペプチド（リンカー３）；ＣＤ３２Ｂ又はＣＤ７９Ｂに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（即ちＶＬCD32B又はＶＬCD79B）；介在ペプチド（リンカー１）；（上記第１のポリペプチド鎖がＶＬCD32Bを含有する場合は）ＣＤ７９Ｂ又は（上記第１のポリペプチド鎖がＶＬCD79Bを含有する場合は）ＣＤ３２Ｂに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン；介在スペーサペプチド（リンカー２）；ヘテロ二量体促進ドメイン；ヘテロ二量体促進ドメインに改善された安定性を提供するための任意の第４のスペーサペプチド（リンカー４）；並びにＣ末端を含む。
上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性Ｆｃダイアボディの実施形態の第２のポリペプチド鎖は（Ｎ末端からＣ末端への方向に）：アミノ末端；ＣＤ７９Ｂ又はＣＤ３２Ｂに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（即ちＶＬCD79B又はＶＬCD32B、該ダイアボディの第１のポリペプチド鎖に関して選択されるＶＬドメインに左右される）；介在リンカーペプチド（リンカー１）；（上記第２のポリペプチド鎖がＶＬCD79Bを含有する場合は）ＣＤ３２Ｂ又は（上記第２のポリペプチド鎖がＶＬCD32Bを含有する場合は）ＣＤ７９Ｂに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン；介在スペーサペプチド（リンカー２）；ヘテロ二量体促進ドメイン；及びＣ末端を含む。
上記好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性Ｆｃダイアボディの第３のポリペプチド鎖は（Ｎ末端からＣ末端への方向に）：アミノ末端；システイン含有ペプチド（ペプチド１）；第１のポリペプチド鎖のＦｃドメインと同一のアイソタイプを有するＩｇＧ Ｆｃドメイン（好ましくは抗体Ｆｃ領域のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン）；並びにＣ末端を含む。
図３Ａに示されているＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性Ｆｃダイアボディの実施形態は、第１及び第２のポリペプチド鎖の介在スペーサペプチド（リンカー２）がシステイン残基を含有せず、このようなシステイン残基がここではこれらのポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進ドメインの一部となっている点で、図３Ｂに示されているものとは異なる。
図３Ｃに示されているＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性Ｆｃダイアボディの実施形態では、第１のポリペプチド鎖は（Ｎ末端からＣ末端への方向に）：アミノ末端；ＣＤ３２Ｂ又はＣＤ７９Ｂに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（即ちＶＬCD32B又はＶＬCD79B）；介在ペプチド（リンカー１）；（上記第１のポリペプチド鎖がＶＬCD32Bを含有する場合は）ＣＤ７９Ｂ又は（上記第１のポリペプチド鎖がＶＬCD79Bを含有する場合は）ＣＤ３２Ｂに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン；システイン含有介在スペーサペプチド（リンカー２）；ヘテロ二量体促進ドメイン；システイン含有ペプチド（ペプチド１）；抗体Ｆｃ領域のＣＨ２及びＣＨ３ドメインの全て又は一部からなるＩｇＧ Ｆｃドメイン；並びにＣ末端を含む。
ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性Ｆｃダイアボディの実施形態の第２のポリペプチド鎖は（Ｎ末端からＣ末端への方向に）：アミノ末端；ＣＤ７９Ｂ又はＣＤ３２Ｂに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（即ちＶＬCD79B又はＶＬCD32B、該ダイアボディの第１のポリペプチド鎖に関して選択されるＶＬドメインに左右される）；介在リンカーペプチド（リンカー１）；（上記第２のポリペプチド鎖がＶＬCD79Bを含有する場合は）ＣＤ３２Ｂ又は（上記第２のポリペプチド鎖がＶＬCD32Bを含有する場合は）ＣＤ７９Ｂに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン；システイン含有介在スペーサペプチド（リンカー２）；ヘテロ二量体促進ドメイン；及びＣ末端を含む。
図３Ｃ及び図３ＤのＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性Ｆｃダイアボディの第３のポリペプチド鎖は（Ｎ末端からＣ末端への方向に）：アミノ末端；システイン含有ペプチド（ペプチド１）；第１のポリペプチド鎖のＦｃドメインと同一のアイソタイプを有するＩｇＧ Ｆｃドメイン（好ましくは抗体Ｆｃ領域のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン）；並びにＣ末端を含む。
図３Ｄに示されているＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性Ｆｃダイアボディの実施形態は、第１及び第２のポリペプチド鎖の介在スペーサペプチド（リンカー２）システイン残基を含有せず、このようなシステイン残基がここではこれらのポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進ドメインの一部となっている点で、図３Ｃに示されているものとは異なる。
第１及び第３のポリペプチド鎖システイン含有ペプチド（ペプチド１）は、同一のアミノ酸配列又は異なるアミノ酸配列から構成されていてよく、１つ、２つ、３つ又は４つ以上のシステイン残基を含有する。特に好ましいペプチド１は、アミノ酸配列（配列番号２５）：DKTHTCPPCP又は（配列番号２６）：GGGDKTHTCPPCPを有する。好ましい介在リンカーペプチド（リンカー３）は、アミノ酸配列（配列番号２７）：APSSSを含み、より好ましくは、アミノ酸配列（配列番号２８）：APSSSPMEを有する。好ましい第４のスペーサペプチド（リンカー４）は、配列GGGを有するか、又は配列番号２９：GGGNSである。
好ましくは、本発明のＦｃ含有ダイアボディの第１及び第３のポリペプチド鎖によって形成されるＦｃドメインは、（野生型Ｆｃ領域が呈する結合に比べて）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）等の活性化ＦｃγＲに結合する能力が大幅に低下しているか、又は上記能力を有しない。このような受容体への結合を低減させるか又は排除する突然変異を有するＦｃドメインは、当該技術分野において公知であり、２３４位及び２３５位のアミノ酸置換、２６５位の置換又は２９７位の置換を含む（例えば米国特許第５，６２４，８２１号を参照；この特許は参照により本出願に援用される）。ある好ましい実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、２３４位におけるアラニンでの置換、及び２３５位におけるアラニンでの置換を含む。
本発明のＦｃ含有ダイアボディの第１及び第３のポリペプチド鎖のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインは同一である必要はなく、有利には２つのポリペプチド間の複合体形成を促進するために修飾される。例えば、ＣＨ２又はＣＨ３ドメインにアミノ酸置換（好ましくは「ノブ（knob）」を形成する嵩高な側鎖基、例えばトリプトファンを含むアミノ酸による置換）を導入して、立体障害により、同様に変異させたドメインとの相互作用を防止し、上記変化させたドメインを、相補的な又は適応した変異（例えばグリシンによる置換）を施されたドメイン、即ち「ホール（hole）」とペアにすることができる。このような一連の突然変異は、Ｆｃダイアボディ分子を含むポリペプチドのいずれのペアに施すことができ、また上記ペアのポリペプチド鎖のいずれの部分に施すことができる。ホモ二量体化を抑えてヘテロ二量体化を促進するためのタンパク質加工の方法は、特に免疫グロブリン様分子の加工に関して当該技術分野で公知であり、本明細書に包含される（例えばRidgway et al. (1996) “‘Knobs-Into-Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617-621; Atwell et al. (1997) “Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270: 26-35;及びXie et al. (2005) “A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95-101を参照（これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される））。好ましくは、ノブは第１のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに加工され、ホールは第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに加工される。従って「ノブ」は、第１のポリペプチド鎖がそのＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを介してホモ二量体化するのを防止する役割を果たすことになる。第３のポリペプチド鎖は好ましくは「ホール」置換基を含有するため、第１のポリペプチド鎖とヘテロ二量体化し、かつそれ自体とホモ二量体化する。好ましいノブは、天然ＩｇＧ Ｆｃ領域を修飾して修飾基Ｔ３６６Ｗを含有させることによって生成される。好ましいホールは、天然ＩｇＧ Ｆｃ領域を修飾して修飾基Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含有させることによって生成される。第３のポリペプチド鎖ホモ二量体を、第１、第２及び第３のポリペプチド鎖を含む最終的な二重特異性１価Ｆｃダイアボディから精製するのを補助するために、好ましくは、第３のポリペプチド鎖のホール担持ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのタンパク質Ａ結合部位を、位置４３５（Ｈ４３５Ｒ）におけるアミノ酸置換によって突然変異させる。第３のポリペプチド鎖ホモ二量体を、第１、第２及び第３のポリペプチド鎖を含む最終的な二重特異性１価Ｆｃダイアボディから精製するのを補助するために、好ましくは、第３のポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインのタンパク質Ａ結合部位を、アミノ酸置換によって突然変異させる。このようにして、第３のポリペプチド鎖ホモ二量体はタンパク質Ａに結合せず、その一方で二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、第１のポリペプチド鎖のタンパク質Ａ結合部位を介してタンパク質Ａに結合する能力を有したままとなる。
３．例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性ダイアボディ
本発明の例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性ダイアボディは、２つ以上のポリペプチド鎖を含み、また：
（１）ＣＤ３２Ｂに結合する抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD32B）：上記ＶＬCD32Bドメインは、配列（配列番号３０）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA
ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG
GTKVEIK
を有する；
（２）ＣＤ３２Ｂに結合する抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD32B）：上記ＶＨCD32Bドメインは、配列（配列番号３１）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE
IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA
LGLDYWGQGT LVTVSS
を有する；
（３）ＣＤ７９Ｂに結合する抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD79B）：上記ＶＬCD79Bドメインは、配列（配列番号３２）：
DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN
RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP
LTFGGGTKLE IK
を有する；
（４）ＣＤ７９Ｂに結合する抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD79B）：上記ＶＨCD79Bドメインは、配列（配列番号３３）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGM
IDPSDSETHY NQKFKDRVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARAM
GYWGQGTTVT VSS
を有する
を含む。
本発明の第１の例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性ダイアボディは、２つのポリペプチド鎖を有する。このような例示的なダイアボディの第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；上述のＶＬCD32Bドメイン；リンカー１；上述のＶＨCD79Bドメイン；システイン含有リンカー２；Ｅコイルドメイン；及びＣ末端の構造を有する。このような好ましいポリペプチドのアミノ酸配列は、（配列番号３４）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA
ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG
GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN
WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQKFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS
LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSGG CGGGEVAALE KEVAALEKEV
AALEKEVAAL EK
である。
配列番号３４において、アミノ酸残基１〜１０７は、ＣＤ３２Ｂに結合する抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD32B）（配列番号３０）であり、アミノ酸残基１０８〜１１５はリンカー１（配列番号１４）であり、アミノ酸残基１１６〜２２８は、ＣＤ７９Ｂに結合する抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD79B）（配列番号３３）であり、アミノ酸残基２２９〜２３４はシステイン含有リンカー２（配列番号１６）であり、アミノ酸残基２３５〜２６２はヘテロ二量体促進Ｅコイルドメイン（配列番号２１）である。
このような例示的なダイアボディの第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、（配列番号３５）：
DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN
RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP
LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS
DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS
LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSGGCG GGKVAALKEK
VAALKEKVAA LKEKVAALKE
のアミノ酸配列を有する。
配列番号３５において、アミノ酸残基１〜１１２は、ＣＤ７９Ｂに結合する抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD79B）（配列番号３２）であり、アミノ酸残基１１３〜１２０はリンカー１（配列番号１４）であり、アミノ酸残基１２１〜２３６は、ＣＤ３２Ｂに結合する抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD32B）（配列番号３１）であり、アミノ酸残基２３７〜２４２はシステイン含有リンカー２（配列番号１６）であり、アミノ酸残基２４３〜２７０はヘテロ二量体促進Ｋコイルドメイン（配列番号２２）である。
本発明の第２の例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性ダイアボディは、２つのポリペプチド鎖を有し、そのうち第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；上述のＶＬCD32Bドメイン；リンカー１；上述のＶＨCD79Bドメイン；リンカー２；システイン含有Ｅコイルドメイン；及びＣ末端の構造を有する。このような好ましいポリペプチドのアミノ酸配列は、（配列番号３６）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA
ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG
GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN
WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQKFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS
LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSAS TKGEVAACEK EVAALEKEVA
ALEKEVAALE K
である。
配列番号３６において、アミノ酸残基１〜１０７は、ＣＤ３２Ｂに結合する抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD32B）（配列番号３０）であり、アミノ酸残基１０８〜１１５はリンカー１（配列番号１４）であり、アミノ酸残基１１６〜２２８は、ＣＤ７９Ｂに結合する抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD79B）（配列番号３３）であり、アミノ酸残基２２９〜２３３はリンカー２（配列番号１５）であり、アミノ酸残基２３４〜２６１はシステイン含有ヘテロ二量体促進Ｅコイルドメイン（配列番号２３）である。
上記第２の例示的なダイアボディの第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、（配列番号３７）：
DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN
RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP
LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS
DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS
LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSASTK GKVAACKEKV
AALKEKVAAL KEKVAALKE
のアミノ酸配列を有する。
配列番号３７において、アミノ酸残基１〜１１２は、ＣＤ７９Ｂに結合する抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD79B）（配列番号３２）であり、アミノ酸残基１１３〜１２０はリンカー１（配列番号１４）であり、アミノ酸残基１２１〜２３６は、ＣＤ３２Ｂに結合する抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD32B）（配列番号３１）であり、アミノ酸残基２３７〜２４１はリンカー２（配列番号１５）であり、アミノ酸残基２４２〜２６９はシステイン含有ヘテロ二量体促進Ｋコイルドメイン（配列番号２４）である。
４．例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性Ｆｃダイアボディ
本発明の第１の例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性Ｆｃダイアボディは、３つのポリペプチド鎖を有する（図３Ａ）。第１のポリペプチド鎖は、配列（配列番号３８）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSPGK
を有する、ノブ含有ＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。
従って、このような例示的なＦｃダイアボディの第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：ペプチド１；ＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン；リンカー１；ＣＤ３２Ｂに結合する抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD32B）；システイン含有リンカー２；ＣＤ７９Ｂに結合する抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD79B）；リンカー３；Ｅコイルドメイン；リンカー４；及びＣ末端の構造を有する。このような好ましいポリペプチドのアミノ酸配列は、（配列番号３９）：
DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED
PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK
CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK
GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG
NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGKAPS SSPMEDIQMT QSPSSLSASV
GDRVTITCRA SQEISGYLSW LQQKPGKAPR RLIYAASTLD SGVPSRFSGS
ESGTEFTLTI SSLQPEDFAT YYCLQYFSYP LTFGGGTKVE IKGGGSGGGG
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGM
IDPSDSETHY NQKFKDRVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARAM
GYWGQGTTVT VSSGGCGGGE VAALEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEKGGG
NS
である。
配列番号３９、アミノ酸残基１〜１０はペプチド１（配列番号２５）であり、アミノ酸残基１１〜２２７は、ノブ含有ＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（配列番号３８）であり、アミノ酸残基２２８〜２３５はリンカー３（配列番号２８）であり、アミノ酸残基２３６〜３４２は、ＣＤ３２Ｂに結合する抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD32B）（配列番号３０）であり、アミノ酸残基３４３〜３５０はリンカー１（配列番号１４）であり、アミノ酸残基３５１〜４６３は、ＣＤ７９Ｂに結合する抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD79B）（配列番号３３）であり、アミノ酸残基４６４〜４６９はシステイン含有リンカー２（配列番号１６）であり、アミノ酸残基４７０〜４９７はヘテロ二量体促進Ｅコイルドメイン（配列番号２１）であり、アミノ酸残基４９８〜５０２はリンカー４（配列番号２９）であり、
第１のポリペプチド鎖をコードする好ましいポリヌクレオチドは、配列（配列番号４０）：
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ccgcgggggg
accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct
cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac
cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc
caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca
gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc
caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat
cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgtggtg cctggtcaaa
ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc
ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct
tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac
gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa agccccttcc agctccccta
tggaagacat ccagatgacc cagtctccat cctccttatc tgcctctgtg
ggagatagag tcaccatcac ttgtcgggca agtcaggaaa ttagtggtta
cttaagctgg ctgcagcaga aaccaggcaa ggcccctaga cgcctgatct
acgccgcatc cactttagat tctggtgtcc catccaggtt cagtggcagt
gagtctggga ccgagttcac cctcaccatc agcagccttc agcctgaaga
ttttgcaacc tattactgtc tacaatattt tagttatccg ctcacgttcg
gaggggggac caaggtggaa ataaaaggag gcggatccgg cggcggaggc
caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggcgcctc
agtgaaggtc tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctactgga
tgaactgggt gcgacaggcc cctggacaag ggcttgagtg gatcggaatg
attgatcctt cagacagtga aactcactac aatcaaaagt tcaaggacag
agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac atggagctga
ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagctatg
ggctactggg ggcaagggac cacggtcacc gtctcctccg gaggatgtgg
cggtggagaa gtggccgcac tggagaaaga ggttgctgct ttggagaagg
aggtcgctgc acttgaaaag gaggtcgcag ccctggagaa aggcggcggg
aactct
を有する。
このような例示的なＦｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：ＣＤ７９Ｂに結合する抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD79B）；リンカー１；ＣＤ３２Ｂに結合する抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD32B）；システイン含有リンカー２；ヘテロ二量体促進Ｋコイルドメイン；及びＣ末端の構造を有する。
第２のポリペプチド鎖に関する好ましい配列は、（配列番号４１）：
DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN
RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP
LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS
DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS
LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSGGCG GGKVAALKEK
VAALKEKVAA LKEKVAALKE
である。
配列番号４１において、アミノ酸残基１〜１１２は、ＣＤ７９Ｂに結合する抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD79B）（配列番号３２）であり、アミノ酸残基１１３〜１２０はリンカー１（配列番号１４）であり、アミノ酸残基１２１〜２３６は、ＣＤ３２Ｂに結合する抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD32B）（配列番号３１）であり、アミノ酸残基２３７〜２４２はシステイン含有リンカー２（配列番号１６）であり、アミノ酸残基２４３〜２７０はヘテロ二量体促進Ｋコイルドメイン（配列番号２２）である。
第２のポリペプチド鎖をコードする好ましいポリヌクレオチドは、配列（配列番号４２）：
gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca
gccggcctcc atctcctgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg
gaaagacata tttgaattgg tttcagcaga ggccaggcca atctccaaac
cgcctaattt atctggtgtc taaactggac tctggggtcc cagacagatt
cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc agcagggtgg
aggctgagga tgttggggtt tattactgct ggcaaggtac acattttccg
ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaaggag gcggatccgg
cggcggaggc gaagtgcagc ttgtggagtc tggaggaggc ttggtgcaac
ctggaggatc cctgagactc tcttgtgccg cctctggatt cacttttagt
gacgcctgga tggactgggt ccgtcaggcc ccaggcaagg ggcttgagtg
ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg
agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgacgc caaaaacagt
ctgtacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg ccgtgtatta
ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc ctggtgaccg
tctcctccgg aggatgtggc ggtggaaaag tggccgcact gaaggagaaa
gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca cttaaggaaa aggtcgcagc
cctgaaagag
を有する。
このような例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性Ｆｃダイアボディは、第３のポリペプチド鎖を有し、これは、アミノ酸配列（配列番号４３）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNRYTQKS LSLSPGK
を有するホール含有ＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。
よって、このような例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性Ｆｃダイアボディの第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号４４：
DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED
PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK
CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK
GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG
NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGK
である。
配列番号４４において、アミノ酸残基１〜１０はペプチド１（配列番号２５）であり、アミノ酸残基１１〜２２７は、ホール含有ＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（配列番号４３）である。
第３のポリペプチド鎖をコードする好ましいポリヌクレオチドは、配列（配列番号４５）：
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ccgcgggggg
accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct
cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac
cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc
caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca
gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc
caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat
cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgagttg cgcagtcaaa
ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc
ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct
tcttcctcgt cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accgctacac
gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a
を有する。
本発明の第２の例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性Ｆｃダイアボディもまた、３つのポリペプチド鎖を有する（図３Ｂ）。第１のポリペプチド鎖は、配列番号３８のアミノ酸配列を有するノブ含有ＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。
よって、このような第２の例示的なＦｃダイアボディの第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：ペプチド１；ノブ含有ＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン；リンカー１；ＣＤ３２Ｂに結合する抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD32B）；リンカー２；ＣＤ７９Ｂに結合する抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD79B）；リンカー３；システイン含有Ｅコイルドメイン；リンカー４；及びＣ末端の構造を有する。このような好ましいポリペプチドのアミノ酸配列は、（配列番号４６）：
DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED
PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK
CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK
GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG
NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGKAPS SSPMEDIQMT QSPSSLSASV
GDRVTITCRA SQEISGYLSW LQQKPGKAPR RLIYAASTLD SGVPSRFSGS
ESGTEFTLTI SSLQPEDFAT YYCLQYFSYP LTFGGGTKVE IKGGGSGGGG
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGM
IDPSDSETHY NQKFKDRVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARAM
GYWGQGTTVT VSSASTKGEV AACEKEVAAL EKEVAALEKE VAALEKGGGN
S
である。
配列番号４６において、アミノ酸残基１〜１０はペプチド１（配列番号２５）であり、アミノ酸残基１１〜２２７は、ノブ含有ＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（配列番号３８）であり、アミノ酸残基２２８〜２３５はリンカー３（配列番号２８）であり、アミノ酸残基２３６〜３４２は、ＣＤ３２Ｂに結合する抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD32B）（配列番号３０）であり、アミノ酸残基３４３〜３５０はリンカー１（配列番号１４）であり、アミノ酸残基３５１〜４６３は、ＣＤ７９Ｂに結合する抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD79B）（配列番号３３）であり、アミノ酸残基４６４〜４６８はリンカー２（配列番号１５）であり、アミノ酸残基４６９〜４９６はシステイン含有ヘテロ二量体促進Ｅコイルドメイン（配列番号２３）であり、アミノ酸残基４９７〜５０１はリンカー４（配列番号２９）である。
上記第２の例示的なＦｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：ＣＤ７９Ｂに結合する抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD79B）；リンカー1；ＣＤ３２Ｂに結合する抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD32B）；リンカー２；システイン含有ヘテロ二量体促進Ｋコイルドメイン；及びＣ末端の構造を有する。
第２のポリペプチド鎖に関する好ましい配列は、（配列番号４７）：
DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN
RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP
LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS
DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS
LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSASTK GKVAACKEKV
AALKEKVAAL KEKVAALKE
である。
配列番号４７において、アミノ酸残基１〜１１２は、ＣＤ７９Ｂに結合する抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD79B）（配列番号３２）であり、アミノ酸残基１１３〜１２０はリンカー１（配列番号１４）であり、アミノ酸残基１２１〜２３６は、ＣＤ３２Ｂに結合する抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD32B）（配列番号３１）であり、アミノ酸残基２３７〜２４１はリンカー２（配列番号１５）であり、アミノ酸残基２４２〜２６９はシステイン含有ヘテロ二量体促進Ｋコイルドメイン（配列番号２４）である。
上記第２の例示的なＦｃダイアボディの第３のポリペプチド鎖は、ホール含有ＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（配列番号４３）を含む。
よって、このような例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性Ｆｃダイアボディの第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号４８：
DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED
PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK
CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK
GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG
NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGK
である。
配列番号４８において、アミノ酸残基１〜１０はペプチド１（配列番号２５）であり、アミノ酸残基１１〜２２７は、ホール含有ＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（配列番号４３）である。
本発明の代替的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性１価Ｆｃダイアボディ分子を、図３Ｃに概略図で示す。このような代替的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ Ｆｃダイアボディ分子は、３つのポリペプチド鎖を有し、そのうちの第１及び第２のポリペプチド鎖は互いに共有結合し、第１及び第３のポリペプチド鎖は互いに共有結合する。上記代替的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性１価Ｆｃダイアボディ分子は、そのドメインの順序が、上述の好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性１価Ｆｃダイアボディ分子中に存在する順序に対して異なる。しかしながら、上述の好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ Ｆｃダイアボディの場合と同様、この代替的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第１のポリペプチド鎖のＶＬドメインは、この代替的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖のＶＨドメインと相互作用して、第１の抗原（即ちＣＤ３２Ｂ又はＣＤ７９Ｂ）に対して特異的な第１の官能性抗原結合部位を形成する。同様に、この代替的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖のＶＬドメインは、この代替的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第１のポリペプチド鎖のＶＨドメインと相互作用して、第２の抗原（即ちＣＤ７９Ｂ又はＣＤ３２Ｂ、第１の抗原の性質に左右される）に対して特異的な第２の官能性抗原結合部位を形成する。従って、第１及び第２のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインの選択は、これら２つのポリペプチド鎖が集合として、ＣＤ３２Ｂ及びＣＤ７９Ｂに結合できるＶＬ及びＶＨドメインを含む（即ちこれらがＶＬCD32B／ＶＨCD32B及びＶＬCD79B／ＶＨCD79Bを含む）ように整合される（図３Ｃ）。このようなＶＬ及びＶＨドメインそれぞれ、並びにこれらを隔てる介在リンカーをまとめて、上記分子の抗原結合ドメインと呼ぶ。
上記代替的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ Ｆｃダイアボディの第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：アミノ末端；ＣＤ３２Ｂ又はＣＤ７９Ｂに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（即ちＶＬCD32B又はＶＬCD79B）；介在スペーサペプチド（リンカー１）；（上記第１のポリペプチド鎖がＶＬCD32Bを含有する場合は）ＣＤ７９Ｂ又は（上記第１のポリペプチド鎖がＶＬCD79Bを含有する場合は）ＣＤ３２Ｂに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン；システイン含有・第３の介在スペーサペプチド（リンカー２）；ヘテロ二量体促進ドメイン；ヘテロ二量体促進ドメイン（好ましくはＥコイルドメイン）に改善された安定性を提供するための任意の第４のスペーサペプチド（リンカー４）；システイン含有ペプチド（ペプチド１）；ＩｇＧ Ｆｃドメイン（好ましくはノブ含有ＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン）；並びにＣ末端を含む。好ましくは、第１のポリペプチド鎖のＦｃドメインは、（野生型Ｆｃ領域が呈する結合に比べて）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）に結合する能力が大幅に低下しているか、又は上記能力を有しない（図３Ｃ）。
上記代替的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ Ｆｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：アミノ末端；ＣＤ７９Ｂ又はＣＤ３２Ｂに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（即ちＶＬCD79B又はＶＬCD32B、該ダイアボディの第１のポリペプチド鎖に関して選択されるＶＬドメインに左右される）；介在リンカーペプチド（リンカー１）；（上記第２のポリペプチド鎖がＶＬCD79Bを含有する場合は）ＣＤ３２Ｂ又は（上記第２のポリペプチド鎖がＶＬCD32Bを含有する場合は）ＣＤ７９Ｂに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン；システイン含有スペーサペプチド（リンカー２）；ヘテロ二量体促進ドメイン（好ましくはＫコイルドメイン）；及びＣ末端を含む（図３Ｃ）。
上記好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ Ｆｃダイアボディの第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：アミノ末端；システイン含有ペプチド（ペプチド１）；第１のポリペプチド鎖のＦｃドメインと同一のアイソタイプを有するＩｇＧ Ｆｃドメイン（好ましくはホール含有ＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン）；並びにＣ末端を含む。好ましくは、第３のポリペプチド鎖のＦｃドメインは、（野生型Ｆｃ領域が呈する結合に比べて）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）に結合する能力が大幅に低下しているか、又は上記能力を有しない（図３Ｃ）。
図３Ｄは、システイン含有リンカー２（例えばGGCGGG（配列番号１６））が非システイン含有リンカー（例えばASTKG（配列番号１５））で置換され、各ヘテロ二量体促進ドメインがシステイン残基（例えばEVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号２３）及びKVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号２４））を含有する、上述のＦｃダイアボディの変形例を示す。
医薬組成物
本発明の組成物は、医薬組成物の製造に使用できるバルク薬剤組成物（例えば不純又は非滅菌組成物）、及び単位剤形の調製に使用できる医薬組成物（即ち被験体又は患者への投与に好適な組成物）を含む。これらの組成物は、予防的又は治療的有効量の本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子、及び特に本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂダイアボディ若しくはＦｃダイアボディのうちのいずれ、又はこのような作用剤と薬学的に許容可能なキャリアとの組み合わせを含む。好ましくは、本発明の組成物は、予防的又は治療的有効量の本発明の１つ又は複数の分子と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。
本発明はまた、上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子、及び特に本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂダイアボディ又はＦｃダイアボディのうちのいずれと、自己免疫又は炎症性疾患抗原に対して特異的な第２の治療用抗体（例えば自己免疫又は炎症性疾患抗原特異性モノクローナル抗体）と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む、医薬組成物を包含する。
ある具体的実施形態では、用語「薬学的に許容可能な（pharmaceutically acceptable）」は、動物、より詳細にはヒトにおける使用に関して、連邦規制当局若しくは州政府によって承認されている、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。用語「キャリア（carrier）」は、希釈剤、アジュバント（例えばフロイントアジュバント（完全及び不完全））、賦形剤、又は治療薬の投与に用いられるビヒクルを指す。これらの薬学的キャリアは、水及び石油、動物油、植物油若しくは合成油を含む油（例えば落花生油、大豆油、鉱物油、胡麻油等）等の、無菌液体とすることができる。医薬組成物を静脈投与する場合、水が好ましいキャリアである。特に注射用溶液のための液体キャリアとして、食塩水、並びに水性デキストロース及びグリセロール溶液も採用できる。好適な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。必要な場合は、上記組成物は、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳液、錠剤、ピル、カプセル、粉体、徐放性製剤等の形態を取ることができる。
一般に、本発明の組成物の成分は、例えば活性作用剤の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ中の凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、別個に、又は単位剤形にまとめて混合された状態で供給される。組成物を点滴によって投与する場合、組成物は、滅菌された薬学的グレードの水又は食塩水を内包する点滴ボトルを用いて吐出できる。組成物を注射によって投与する場合、投与前に成分を混合できるように、注射用無菌水又は食塩水のアンプルを提供できる。
本発明の組成物は、中性又は塩形態として処方できる。薬学的に許容可能な塩としては：塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等由来の陰イオンを有して形成されるもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２‐エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等由来の陽イオンを有して形成されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明はまた、ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子、及び特に本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂダイアボディ又はＦｃダイアボディのいずれを、単独で又は上記薬学的に許容可能なキャリアと共に充填した１つ又は複数のコンテナを含む、医薬パック又はキットも提供する。更に、疾患の治療に有用な１つ又は複数の他の予防剤又は治療剤も、上記医薬パック又はキットに含めることができる。本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分のうちの１つ又は複数で充填された１つ又は複数のコンテナを含む、医薬パック又はキットも提供する。任意に、このような１つ又は複数のコンテナは、医薬製品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知と関連するものとすることができ、上記通知は、ヒトへの投与のための製造、使用又は販売の機関による承認を反映したものである。
本発明は、上述の方法に使用できるキットを提供する。一実施形態では、キットは本発明の１つ又は複数の分子を含む。別の実施形態では、キットは更に、自己免疫又は炎症性疾患の治療に有用な１つ又は複数の他の予防剤又は治療剤を、１つ又は複数のコンテナ内に含む。別の実施形態では、キットは更に、自己免疫又は炎症性疾患に関連する１つ又は複数の自己免疫又は炎症性疾患抗原に結合する１つ又は複数の抗体を含む。特定の実施形態では、他の予防剤又は治療剤は、化学療法剤である。他の実施形態では、予防剤又は治療剤は生物学的治療剤又はホルモン療法剤である。
本発明の組成物の使用
本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子、及び特にＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂダイアボディ又はＦｃダイアボディのうちのいずれは、ＣＤ７９Ｂの発現に関連する若しくはＣＤ７９Ｂの発現を特徴とするいずれの疾患若しくは状態、又は該疾患に対するＢ細胞成分を有するいずれの疾患若しくは状態を治療する能力を有する。従って、限定するものではないが、上記分子を含む医薬組成物を、自己免疫又は炎症性疾患又は状態の診断又は治療に使用してよい。よって本発明は、移植片拒絶反応、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）及び全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を含むＢ細胞仲介型疾患又は障害の、治療、予防、進行の遅延、及び／又は症状の改善に使用してよい。図５は、好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ Ｆｃダイアボディの、マウスにおける異種ＧｖＨＤを低減する能力を示す（国際公開第２０１５／０２１０８９号を参照；この特許は参照により本出願に援用される）。同様に、本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子を、Ｂ細胞仲介型免疫応答（例えば自己抗原を含む抗原に対する応答）の低減若しくは阻害、Ｂ細胞活性化の弱化、及び／又はＢ細胞増殖の低減若しくは阻害に採用してよい。
投与方法
本発明の組成物は、有効量の本本発明の医薬組成物を被験体に投与することによる、疾患、障害又は感染症に関連する１つ又は複数の症状の治療、予防及び改善のために提供できる。好ましい態様では、上記組成物は実質的に精製される（即ち上記組成物の効果を制限する、又は望ましくない副作用を生成する物質を実質的に含まない）。ある具体的実施形態では、被験体は動物、好ましくは非霊長類（例えばウシ属、ウマ科、ネコ科、イヌ科、げっ歯類等）又は霊長類（例えばカニクイザル等のサル、ヒト等）といった哺乳類である。ある好ましい実施形態では、被験体はヒトである。
本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の投与の用量及び「投薬レジメン（dosage regimen）」（投与頻度）は、例えば脂質付加等の修飾によって上記結合分子の取り込み及び組織侵入を増強させることによって、減少させる又は変更することができる。一実施形態では、療法過程全体にわたって、単一の投薬量レベル（以下を参照）を、１回又は複数回投与してよい。第２の実施形態では、治療過程全体にわたって提供される投薬量は変動し、例えば漸増投薬レジメン又は漸減投薬レジメンである。投与される投薬量は更に、該療法に対する被験者の耐性、及び該療法に関連する治療の成功の度合いを反映して調整してよい。
障害に関連する１つ又は複数の症状の治療、予防及び改善に効果的な本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の用量は、標準的な臨床技術によって決定できる。処方において採用するべき正確な用量は、投与経路及び状態の重篤度にも左右され、施術者の判断及び各患者の状況に従って決定するべきである。効果的な用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から得られた用量‐応答曲線から外挿できる。しかしながら、本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は好ましくは、典型的には被験者の体重に対して少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約７．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１０．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２０ｍｇ／ｋｇ又はそれより多い投薬量で投与される。特に、本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、約１．０ｍｇ／ｋｇ、約３．０ｍｇ／ｋｇ、約１０．０ｍｇ／ｋｇ、約２０．０ｍｇ／ｋｇ又は約３０．０ｍｇ／ｋｇの投薬量で投与される。本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子、及び特にＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂダイアボディ又はＦｃダイアボディのうちのいずれは好ましくは、上記分子の量を示したアンプル又はサシェといった気密性コンテナ中に梱包される。本明細書中で使用される場合、「投薬量（dosage）」は、記載されている投薬量を記述するために使用される有効数字の範囲内として記述されている場合、「約（about）」記載されている投薬量と表現される（例えば投薬量が０．１ｍｇ／ｋｇ±０．０５ｍｇ／ｋｇである場合、投薬量は約０．１ｍｇ／ｋｇであり、投薬量が１５ｍｇ／ｋｇ±０．０５ｍｇ／ｋｇである場合、投薬量は約１５ｍｇ／ｋｇである）。
本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の投与の頻度は、例えば患者の応答又は投与の方法に大きく左右され得る。従って本発明の組成物は、１日１回、１日２回又は１日３回、１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１ヶ月に１回、６週間に１回、１２週間に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、１年に２回、１年に１回等で投与してよい。治療に使用される上記分子の有効な用量設定は、特定の治療の期間全体にわたって増減させてよいことも理解されるだろう。
しかしながら、本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子を、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、又は１５週間超の治療過程中に投与することが好ましく、このような１過程の治療を１，２、３、４、５又は６回以上繰り返してよい。ある好ましい実施形態では、被験者を、２週間に１回（Ｑ２Ｗ）、３週間に１回（Ｑ３Ｗ）、４週間に１回（Ｑ４Ｗ）、５週間に１回（Ｑ５Ｗ）、６週間に１回（Ｑ６Ｗ）、７週間に１回（Ｑ７Ｗ）、８週間に１回（Ｑ８Ｗ）、９週間に１回（Ｑ９Ｗ）、１０週間に１回（Ｑ１０Ｗ）、１１週間に１回（Ｑ１１Ｗ）、又は１２週間に１回（Ｑ１２Ｗ）という本発明の分子の療法過程を用いて、治療する。本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子を、２週間に１回（Ｑ２Ｗ）、３週間に１回（Ｑ３Ｗ）又は４週間に１回（Ｑ４Ｗ）という治療過程で投与することが特に好ましい。いずれのこのような単一の治療過程の終了時に、療法を同一の投薬スケジュール又は異なる投薬スケジュールで再構成してよく、また療法は、同一の投薬量又は異なる投薬量の、投与されるＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子を含んでよい。従って、治療的又は予防的有効量の本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子を用いた被験者の治療は、単一過程の治療を含むことができ、又は過去のいずれの治療経過と同一であってよい若しくは異なっていてよい複数過程の治療を含むことができる。
ある好ましい実施形態では、本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子、及び特にＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂダイアボディ又はＦｃダイアボディのうちのいずれを、Ｑ２Ｗ、Ｑ３Ｗ又はＱ４Ｗの治療過程において、約３．０ｍｇ／ｋｇ、約１０．０ｍｇ／ｋｇ、約２０．０ｍｇ／ｋｇ又は約３０．０ｍｇ／ｋｇの投薬量で投与する。
一実施形態では、本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ Ｆｃダイアボディは、気密性コンテナ内の乾燥滅菌凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として供給され、例えば水又は食塩水を用いて、被験体への投与に適切な濃度へと再構成できる。好ましくは、本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子、及び特にＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂダイアボディ又はＦｃダイアボディのうちのいずれは、少なくとも１ｍｇ、より好ましくは少なくとも２ｍｇ、少なくとも３ｍｇ、少なくとも５ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも２０ｍｇ、少なくとも３０ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも１００ｍｇ、少なくとも２００ｍｇ、少なくとも３００ｍｇ、少なくとも５００ｍｇ又は少なくとも１０００ｍｇの単位投薬量で、気密性コンテナ内の乾燥滅菌凍結乾燥粉末として供給され、これにより、例えば適切な体積のキャリアを添加すると、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇという投与可能な投薬量を調製できる。
凍結乾燥されたＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子、本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子、及び特にＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂダイアボディ又はＦｃダイアボディのうちのいずれは、その元々のコンテナ内において２℃〜８℃で保管するべきであり、またこの分子は、再構成後１２時間以内、好ましくは６時間以内、５時間以内、３時間以内又は１時間以内に投与するべきである。ある代替実施形態では、このような分子は、この分子、融合タンパク質又はコンジュゲート分子の量及び濃度を示す気密性コンテナ内に、液体形態で供給される。好ましくは、液体形態の本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、気密性コンテナに入れて供給され、上記気密性コンテナ内では、上記分子は少なくとも１μｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも２．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、又は少なくとも２００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
一実施形態では、患者に投与される本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の投薬量は、単剤療法としての使用のために算出してよい。別の実施形態では、本発明の結合分子は他の治療用組成物と併用され、患者に投与される投薬量は、上記結合分子を単剤療法として使用する場合より少ない。
本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子、及び特にＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂダイアボディ又はＦｃダイアボディのうちのいずれの好ましい投与方法としては、：非経口投与（例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下）；硬膜外；並びに粘膜（例えば鼻腔内及び経口経路）が挙げられるがこれらに限定されない。ある具体的実施形態では、本発明の分子は、筋肉内、静脈内又は皮下投与される。組成物は、いずれの便利な経路によって、例えば点滴又はボーラス注射によって、上皮又は粘膜皮膚層（例えば口腔粘膜、直腸及び腸粘膜等）を通した吸収によって投与してよく、他の生物学的活性作用剤と共に投与してよい。投与は全身性又は局所性とすることができる。
ある具体的実施形態では、本発明の医薬組成物を、治療が必要な領域に局所的に投与することが望ましい場合があり、これは、以下に限定されるものではないが、例えば局所的点滴によって、注射によって、又はインプラントを用いて達成してよく、上記インプラントは多孔性、非多孔性又はゼラチン材料性であり、シラスティック膜等の膜又は繊維を含む。好ましくは、本発明の分子を投与する際、この分子が吸収されない材料を使用するよう注意しなければならない。
本発明の実施形態
これより、本発明の特定の実施形態の非限定的な例を提供する。
実施形態１
治療的有効量のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子を、それを必要とする被験者に投与するステップを含む、炎症性疾患又は状態を治療する方法であって、上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、ＣＤ３２Ｂのエピトープ及びＣＤ７９Ｂのエピトープに免疫特異的に結合でき、上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの用量、及び１週間に１用量〜８週間に１用量の投薬レジメンで投与される、方法。
実施形態２
治療的有効量のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子を、それを必要とする被験者に投与するステップを含む、Ｂ細胞仲介型免疫応答を低下させる又は阻害する方法であって、上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、ＣＤ３２Ｂのエピトープ及びＣＤ７９Ｂのエピトープに免疫特異的に結合でき、上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの用量、及び１週間に１用量〜８週間に１用量の投薬レジメンで投与される、方法。
実施形態３
治療的有効量のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子を、それを必要とする被験者に投与するステップを含む、Ｂ細胞活性化を弱化させる方法であって、上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、ＣＤ３２Ｂのエピトープ及びＣＤ７９Ｂのエピトープに免疫特異的に結合でき、上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの用量、及び１週間に１用量〜８週間に１用量の投薬レジメンで投与される、方法。
実施形態４
治療的有効量のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子を、それを必要とする被験者に投与するステップを含む、Ｂ細胞増殖を低下させる又は阻害する方法であって、上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、ＣＤ３２Ｂのエピトープ及びＣＤ７９Ｂのエピトープに免疫特異的に結合でき、上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの用量、及び１週間に１用量〜８週間に１用量の投薬レジメンで投与される、方法。
実施形態５
上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、約１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６
上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、約３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７
上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８
上記投薬レジメンは、２週間に１用量（Ｑ２Ｗ）である、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９
上記投薬レジメンは、３週間に１用量（Ｑ３Ｗ）である、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０
上記投薬レジメンは、４週間に１用量（Ｑ４Ｗ）である、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１
上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、ＣＤ３２Ｂのエピトープ及びＣＤ７９Ｂのエピトープに結合する二重特異性抗体、又は上記抗体のＣＤ３２Ｂ及びＣＤ７９Ｂ結合ドメインを含む分子である、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２
上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、ＣＤ３２Ｂのエピトープ及びＣＤ７９Ｂのエピトープに結合するＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性ダイアボディである、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３
上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性ダイアボディは、ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ Ｆｃダイアボディである、実施形態１２に記載の方法。
実施形態１４
上記炎症性疾患又は状態は自己免疫疾患である、実施形態１又は５〜１３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５
上記自己免疫疾患は：アジソン病；自己免疫性肝炎；自己免疫性内耳疾患；重症筋無力症；クローン病；皮膚筋炎；家族性腺腫性ポリポーシス；移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）；グレーヴス病；橋本甲状腺炎；エリテマトーデス；多発性硬化症（ＭＳ）；悪性貧血；ライター症候群；関節リウマチ（ＲＡ）；シェーグレン症候群；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；１型糖尿病；原発性血管炎（例えばリウマチ性多発筋痛症、巨細胞性動脈炎、ベーチェット病）；天疱瘡；視神経脊髄炎；抗ＮＭＤＡ受容体脳炎；ギランバレー症候群；慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）；グレーヴス眼症；ＩｇＧ４関連疾患；特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）；及び潰瘍性大腸炎からなる群から選択される、実施形態１４に記載の方法。
実施形態１６
上記炎症性疾患又は状態は、ＧｖＨＤ、ＭＳ、ＲＡ又はＳＬＥである、実施形態１５に記載の方法。
実施形態１７
免疫グロブリンの血清レベルは、上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の最初の用量の投与後３６日目までに低下する、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８
上記免疫グロブリンはＩｇＭ、ＩｇＡ又はＩｇＧである、実施形態１７に記載の方法。
実施形態１９
上記免疫グロブリンはＩｇＭである、実施形態１８に記載の方法。
実施形態２０
ＢＣＲ仲介型末梢Ｂ細胞活性化は、上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の最初の用量の投与後２４時間までに低下し、上記Ｂ細胞活性化は、生体外カルシウム動員アッセイによって決定される、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１
上記ＢＣＲ仲介型Ｂ細胞活性化は少なくとも５０％阻害され、上記阻害は少なくとも６日間持続する、実施形態２０に記載の方法。
実施形態２２
末梢Ｂ細胞上の上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合部位の少なくとも２０％が、上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の最初の用量の投与後６時間占有される、実施形態１〜２１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２３
（Ａ）Ｂ細胞上のＣＤ４０の発現が下方制御され；及び／又は
（Ｂ）ＣＤ４０仲介型ＩｇＧ分泌が阻害される、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２４
上記被験者はヒトである、実施形態１〜２３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２５
上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は：
（Ａ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＶＬCD32Bドメイン；及び
（Ｂ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨCD32Bドメイン
を含む、実施形態１〜２４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２６
上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は：
（Ａ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬCD79Bドメイン；及び
（Ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨCD79Bドメイン
を含む、実施形態１〜２４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２７
上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は：
（Ａ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＶＬCD32Bドメイン；
（Ｂ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨCD32Bドメイン；
（Ｃ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬCD79Bドメイン；及び
（Ｄ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨCD79Bドメイン
を含む、実施形態１〜２４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２８
上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、二重特異性抗体又はその二重特異性抗原結合断片である、実施形態２５〜２７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２９
上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性ダイアボディである、実施形態２５〜２７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３０
上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性ダイアボディは、ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ Ｆｃダイアボディである、実施形態２９に記載の方法。
実施形態３１
上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ Ｆｃダイアボディは：
（Ａ）配列番号３９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖；
（Ｂ）配列番号４１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；及び
（Ｃ）配列番号４４のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖
を含む、実施形態３０に記載の方法。
ここまで本発明を概説してきたが、以下の実施例を参照することにより、本発明は更に容易に理解されるだろう。これらの実施例は例示として提供されており、そうでないことが明記されていない限り本発明を制限することを意図したものではない。
実施例１
ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性１価Ｆｃダイアボディ及び対照ダイアボディの構築
ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ Ｆｃダイアボディを調製し、本発明の例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子として採用した。上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ Ｆｃダイアボディは、表１に示すアミノ酸配列を有する３つのポリペプチド鎖を含んでいた。
上述のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ Ｆｃダイアボディは、ＣＤ３２Ｂ及びＣＤ７９Ｂに同時に結合できることが分かった。二重特異性１価ダイアボディを形成するための方法は、国際公開第２００６／１１３６６５号、国際公開第２００８／１５７３７９号、国際公開第２０１０／０８０５３８号、国際公開第２０１２／０１８６８７号、国際公開第２０１２／１６２０６８号、及び国際公開第２０１２／１６２０６７号において提供されている。
実施例２
ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性Ｆｃダイアボディの生体内投与の評価
本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の安全性及び耐容性を評価するために、実施例１のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ Ｆｃダイアボディを、年齢１８〜５０歳、ＢＭＩ１８〜３０ｋｇ／ｍ2の健康なヒト被験者に投与した。被験者は、妊婦又は出産の可能性がある女性を含まなかった。更に被験者は：重大な急性若しくは慢性の医学的疾患を有する個体；投薬の４週間以内にいずれの処方薬を使用した、若しくは投薬の１週間以内に市販薬を使用した個体；１日１０本超喫煙する個体；結核、Ｂ型肝炎感染症、Ｃ型肝炎感染症若しくはＨＩＶ感染症を有する個体；自己免疫障害若しくは血管障害の既往歴を有する個体；又は薬物検査結果が陽性の個体を含まなかった。被験者は更に、４５０ｍｓｅｃ超の補正済み（ＱＴ）、４５ｂｐｍ未満若しくは１２０ｂｐｍ超の心拍数、１４０ｍｍＨｇ超の収縮期血圧（ＳＢＰ）、又は９０ｍｍＨｇ超の拡張期血圧（ＤＢＰ）を有する個体を含まなかった。本研究に関与した被験者のベースライン統計を表２に提示する。
評価は、６つの投薬コホート（それぞれ８人の被験者からなり、この８人の被験者のうち、被験者１〜６はＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ Ｆｃダイアボディを投与され、被験者７〜８はプラセボで治療された）の使用を含んでいた。各コホート内において、被験者２が被験者１の２４時間後に治療を受け、被験者３〜５が被験者２の２４時間後に治療を受け、被験者７〜８が被験者３〜５の２４時間後に治療を受けるように、ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ Ｆｃダイアボディの投与をずらした。投薬コホートを表３に記載する。
投与を受けた被験者を、ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ＢＦｃダイアボディ関連副作用：第２度若しくは第３度房室ブロック、心室性不整脈（トルサード・ド・ポワントを含む）、又はGuidance of Toxicity Grading Scale for healthy adult and adolescent volunteers enrolled in preventive vaccine clinical trialに従って３級以上の有害事象に関して監視した。カバーされていない問題（例えば注入関連応答）に関しては、ＮＣＩ ＣＴＣＡＥ ｖ４．０３を用いた。１５の有害事象が記録され、そのうちの４つはＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ Ｆｃダイアボディの投与に関連すると思われた。表４は、観察された有害事象をまとめたものである。
Ａ．体液性免疫応答に対するＦｃダイアボディの薬力学的効果
図６は、ヒト被験者への投与時の、例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の薬物動態を示す。結合分子の濃度は、検証済みのＥＬＩＳＡアッセイで測定し、ＰＫパラメータはノンコンパートメント分析によって算出した。図示されているように、被験者はＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ Ｆｃダイアボディを０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、０．１ｍｇ／ｋｇ体重、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重又は１０ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で投与され、投与後最大５７日間にわたって、血清ダイアボディ濃度を測定された。ダイアボディの血清濃度、最大血清濃度（Ｃmax）及びＡＵＣ（曲線下面積）は全て、投薬濃度の上昇と共に上昇したことが分かった。ダイアボディの半減期は４〜８日であった。ダイアボディの迅速な排出が、最低用量（０．０１ｍｇ／ｋｇ）で観察された。平均クリアランス時間（ＣＬ）は、１．４２６ｍＬ／ｈ／ｋｇ（０．０１ｍｇ／ｋｇ用量）〜０．３５０ｍＬ／ｈ／ｋｇ（１０ｍｇ／ｋｇ用量）であり、ＣＬと用量との間の関係は非線形であり、用量の増大と共にＣＬは低下した。血液体積内のダイアボディの分布の指標である定常状態分布体積（ＶSS）は、用量とは無関係であることが分かった。血清半減期（Ｔ1/2）は、０．０３ｍｇ／ｋｇ用量で投与されたダイアボディに関する９２時間（〜４日）から、１０ｍｇ／ｋｇ用量で投与されたダイアボディに関する１９１時間（〜８日）までであり、用量の増大と共に増大し、これはＣＬの用量依存性低下と一致していた。ＰＫプロファイルの崩壊が記録され、これは抗薬物抗体（anti-drug-antibody：ＡＤＡ）の存在を示唆していた。薬物動態データを表５にまとめる。
Ｂ．末梢Ｂ細胞上のＣＤ３２Ｂ及びＣＤ７９Ｂに結合する能力
投与されたＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、末梢Ｂ細胞に結合できることが分かり、これは比較的高い用量レベルにおいて≧１ｍｇ／ｋｇ体重の最大占有度と、継続的な５０％Ｂ細胞占有率とを示した。継続的な２０％Ｂ細胞占有率が、≧０．３ｍｇ／ｋｇにおいて観察された。図７は、研究過程全体にわたる、末梢Ｂ細胞に対する結合の生体外フローサイトメトリー分析をまとめたものである。
Ｃ．末梢Ｂ細胞及びＢ細胞サブセットの活性化状態の評価
フローサイトメトリー分析を実施して、ダイアボディの投与がＢ細胞計数（図８Ａ）、Ｔ細胞計数（図８Ｂ）、Ｂ細胞とＴ細胞との比率（図８Ｃ）、及びＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との比率（図８Ｄ）の継続的な変化に関連するかどうかを評価した。図８Ａ〜８Ｂに示すように、末梢Ｔ細胞の個数には継続的な変化が観察されず、本研究の比較的高い用量では、Ｂ細胞の個数の一時的な減少が観察された。図８Ｃ〜８Ｄに示すように、末梢Ｂ細胞の個数と末梢Ｔ細胞の個数との比率には、継続的な変化が観察されなかった。
Ｄ．生体外ＢＣＲ刺激に対する末梢Ｂ細胞の応答の評価
生体外カルシウム動員アッセイを実施して、例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子のレシピエントのＢ細胞機能を評価した。簡潔に述べると、投薬前及び投薬後の様々な時点で回収した血液試料からＰＢＭＣを新たに単離し、ＢＣＲ連結によってＣａ++フラックスを誘導した。イオノマイシンを導入することによって、最大Ｃａ++フラックスを誘導した。ＡＵＣ又はピークの値を、イオノマイシンによって生成された値で正規化することにより、比（ＡＵＣ）＝ＡＵＣ（ＩｇＭ）／ＡＵＣ（イオノマイシン）とした。図９Ａ〜９Ｂは、本研究で採用した実験手順及びデータ分析方法を示す。
例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子を用いた治療は、抗ＩｇＭ抗体によるＢＣＲ連結に応答してカルシウムフラックスを低減させることが分かった。これは、本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の、末梢Ｂ細胞に対する阻害活性を実証している（図９Ｃ〜９Ｄ）。
Ｅ．ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、ＣＤ２７+メモリーＢ細胞上でのＢＣＲ発現を下方制御する
例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の投与の効果を更に評価するために、フローサイトメトリーを用いて、膜結合免疫グロブリンレベルを決定した。図１０Ａ〜１０Ｃは、ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の投与が、膜結合ＩｇＧ（ｍＩｇＧ）（図１０Ａ）、膜結合ＩｇＭ（ｍＩｇＭ）（図１０Ｂ）、及び膜結合ＩｇＤ（ｍＩｇＤ）（図１０Ｃ）の発現によって決定されるように、ＣＤ２７+メモリーＢ細胞上でのＢＣＲ発現を下方制御することを示している。
同様の研究により、ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の投与が、ＣＤ２７ナイーブメモリーＢ細胞上でのＢＣＲ発現を下方制御することが確認された（図１１Ａ：膜結合ＩｇＤ（ｍＩｇＤ）；図１１Ｂ：膜結合ＩｇＭ；図１１Ｃ：膜結合ＩｇＭ（ｍＩｇＭ）におけるパーセント変化）。
Ｆ．ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は血清Ｉｇレベルを変調する
ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の投与の、ＩｇＭ、ＩｇＡ及びＩｇＧ免疫グロブリンの血清レベルに対する影響を評価した。上記結合分子は、これらの免疫グロブリンの血清レベルを変調することが分かり、ＩｇＭレベルが最も大きな低下を示し、ＩｇＧレベルは概ね維持された（それぞれ図１２Ａ〜１２Ｃ）。ＩｇＧは割愛することが望ましい。血清ＩｇＭレベルの低下は、形質芽細胞への影響を示唆している。これらの結果は、形質細胞上では発現されないＣＤ７９Ｂの発現と一致している。
Ｇ．ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は共刺激分子ＣＤ４０のレベルを低下させる
ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の投与は、末梢Ｂ細胞の表面共刺激分子のフローサイトメトリー分析によって決定されるように、Ｂ細胞上でのＣＤ４０表面発現レベル（図１３Ａ）を低下させることが分かった。
例示的な結合分子（実施例１のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ Ｆｃダイアボディ）の単回静脈内投薬は、末梢Ｂ細胞計数を略減少させず、これは、本発明の結合分子がＢ細胞を枯渇させないことを示している。フローサイトメトリー分析により、本発明の結合分子が末梢Ｂ細胞に結合できることが実証された。末梢Ｂ細胞上のこのような結合部位の完全な飽和は、≧１ｍｇ／ｋｇの用量レベルにおいて観察された。上記結合の持続時間は、採用する用量レベルに関連することが分かった。
本発明の結合分子は、以下を含む複数の薬力学の用量依存性効果を仲介した：
１．生体外ＢＣＲ誘導型Ｃａ++動員の低減；
２．ＣＤ２７+メモリーＢ細胞サブセット上での表面ＩｇＧ‐ＢＣＲ発現の下方制御；
３．ＩｇＭ+ナイーブＢ細胞の個数の低減
４．ナイーブＢ細胞上での表面ＩｇＤ‐ＢＣＲ発現の下方制御；及び
５．Ｂ細胞上でのＣＤ４０発現の下方制御。
本発明の結合分子は、臨床投薬に好適な、複数の好ましい薬力学的特性を仲介した。末梢Ｂ細胞は、≧１ｍｇ／ｋｇ用量レベルの実施例１の例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ Ｆｃダイアボディによって完全に飽和され、結合の持続時間は、投薬量の増加に相関し、継続的な２０％占有率が≧０．３ｍｇ／ｋｇ用量レベルで観察される。本発明の結合分子は末梢Ｂ細胞を枯渇させず、Ｂ細胞活性を用量依存的に下方制御することが分かった：
１．ＢＣＲ仲介型Ｃａ2+流入の低減；
２．表面免疫グロブリン発現の下方制御；
３．血清ＩｇＭレベルの低減；及び
４．ＣＤ４０発現の下方制御。
上記データは、炎症性疾患、状態及び障害の治療、特に自己免疫疾患の治療における本発明の有用性を支持するものである。
実施例３
ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の薬物動態及び薬力学的特性の調査
Ｅmax（最大効果）ＰＫ／ＰＤモデルを用いて、本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の薬物動態（ＰＫ）及び薬力学（ＰＤ）的特性をより十分に調査した。簡潔に述べると、Ｂ細胞を様々な濃度の上記結合分子の存在下でインキュベートし、Ｅmaxの５０％、６０％、８０％及び９０％の阻害をもたらす結合分子の濃度を決定した。
レシピエント被験者は、６．３％〜１５．６％（平均＝９．４％）のベースライン値を示した。最大応答の５０％を生成する濃度（ＥＣ50）は、１６７７ｎｇ／ｍＬであった。投与される結合分子の濃度が上昇するに従って、パーセントＢ細胞結合は、７３．１％の％Ｂ細胞結合に関する最大応答（Ｅmax）を示す平坦域に達した。このデータを表６に示す。生体内ヒト化マウスモデルに基づき、ＩｇＧ及びＩｇＭの完全な阻害を示す予想標的濃度は１，５００ｎｇ／ｍＬである。本研究のＰＫ／ＰＤの関係は、≧ＥＣ50の濃度が、治療用の使用に関して可能性を有する標的濃度となり得ることを示唆している。
図１４Ａ〜１４Ｂは、（２つの異なる濃度範囲における）上記データを示す。図１５Ａ〜１５Ｆは、標的濃度が得られる用量を同定するために、ヒトにおけるＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子薬物動態プロファイルを重ね合わせて、前臨床標的濃度を示す（投薬量０．０１ｍｇ／ｋｇ（図１５Ａ）；投薬量０．１ｍｇ／ｋｇ（図１５Ｂ）；投薬量０．３ｍｇ／ｋｇ（図１５Ｃ）；投薬量１ｍｇ／ｋｇ（図１５Ｄ）；投薬量３ｍｇ／ｋｇ（図１５Ｅ）；投薬量１０ｍｇ／ｋｇ（図１５Ｆ）での標的濃度の達成）。
個々の被験者の薬物動態データをモデル化し、最良のモデルパラメータ推定値を用いて、２週間に１回（Ｑ２Ｗ）、３週間に１回（Ｑ３Ｗ）及び４週間に１回（Ｑ４Ｗ）の投薬レジメンでの投与で、複数回の投薬に関するプロファイルを予測した。調査した用量は、１、３及び１０ｍｇ／ｋｇであった。曝露パラメータ（Ｃmax、Ｃmin、及びＡＵＣ）の比較を実施し、１及び２コンパートメントＩＶ注入モデルを調査した。このようなモデル化の結果を、被験者の体重に対して０．３ｍｇ／ｋｇ（図１６Ａ）、被験者の体重に対して１ｍｇ／ｋｇ（図１６Ｂ）、被験者の体重に対して３ｍｇ／ｋｇ（図１６Ｃ）及び被験者の体重に対して１０ｍｇ／ｋｇ（図１６Ｄ）の用量に関して、２週間に１用量（Ｑ２Ｗ）、３週間に１用量（Ｑ３Ｗ）及び４週間に１用量（Ｑ４Ｗ）の投薬レジメンについて示す。上記モデル化プロファイルの予測される変動性は、図１７Ａ〜１７Ｄに（ＳＤと共に）示されている。
最初の投薬後の曝露パラメータ（Ｃmax1、Ｃmin1、及びＡＵＣ1)並びに定常状態の曝露パラメータ（Ｃmaxss、Ｃminss、及びＡＵＣss）に関する要約した統計を、１、３及び１０ｍｇ／ｋｇの用量に関して、それぞれ表７、８及び９に示す。これら３つの用量は全て、Ｑ２Ｗ、Ｑ３Ｗ及びＱ４Ｗレジメンで投与した。表７、８、９及び１０では、ＡＵＣは、Ｑ２Ｗ、Ｑ３Ｗ及びＱ４Ｗレジメンに関して、それぞれ１４、２１及び２８の投薬間隔にわたって決定した。
表７、８、９及び１０に示されているように、最初の投薬に関するデータに関して、平均Ｃmax1値は、Ｑ２Ｗ、Ｑ３Ｗ及びＱ４Ｗレジメンに関して（即ち１ｍｇ／ｋｇの投薬レジメン、およそ２２μｇ／ｍＬ；３ｍｇ／ｋｇの投薬レジメン、およそ５４μｇ／ｍＬ；及び１０ｍｇ／ｋｇの投薬レジメン、およそ１８７μｇ／ｍＬに関して）同様であった。これら３つのレジメンの間に、平均ＡＵＣ1値のわずかな差異が観察された。平均Ｃmin1（トラフ濃度）は、より長い２８日の投薬間隔を有するＱ４Ｗレジメン（即ち１ｍｇ／ｋｇの投薬レジメン、およそ０．１４μｇ／ｍＬ；３ｍｇ／ｋｇの投薬レジメン、およそ０．９５μｇ／ｍＬ；およそ１０ｍｇ／ｋｇの投薬レジメン、およそ５μｇ／ｍＬ）に比べて短い投薬間隔（１４日）を有するＱ２Ｗレジメンに関して（即ち１ｍｇ／ｋｇの投薬レジメン、およそ１．１μｇ／ｍＬ；３ｍｇ／ｋｇの投薬レジメン、およそ５μｇ／ｍＬ；及び１０ｍｇ／ｋｇの投薬レジメン、およそ２４μｇ／ｍＬに関して）、比較的高いことが観察された。Ｑ３Ｗレジメンに関する平均Ｃmin1は、Ｑ２Ｗレジメン及びＱ４Ｗレジメン（即ち１ｍｇ／ｋｇの投薬レジメン、およそ０．３８μｇ／ｍＬ；３ｍｇ／ｋｇの投薬レジメン、およそ２．２μｇ／ｍＬ；及び１０ｍｇ／ｋｇの投薬レジメン、およそ５μｇ／ｍＬ）の平均Ｃmin1の中間であることが観察された。
表７、８、９及び１０に示されているように、定常状態に関して、平均Ｃmaxss、Ｃminss、及びＡＵＣssは、最初の投薬の値に比べて数値的に高いことが観察され、また最初の投薬に関するデータと同様、Ｑ２Ｗ、Ｑ３Ｗ及びＱ４Ｗレジメンの平均Ｃmaxssは同様である（＜１３％の差異）ことが観察された。更に、最初の投薬に関するデータと同様、これら３つのレジメンの間に、平均ＡＵＣss値のわずかな差異が観察された。しかしながら、Ｑ４Ｗレジメンの投薬間隔は２８日であり、同一の間隔では、Ｑ２Ｗレジメンで投与された用量の数は、Ｑ４Ｗレジメンの２倍である。従って、２８日の投薬間隔において、Ｑ２Ｗレジメンに関するＡＵＣssはＱ４Ｗレジメンのおよそ２倍になると予測される。投与されるレジメンにかかわらず、定常状態の曝露パラメータは、最初の投薬に関するデータと比較した場合に、ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の蓄積が最小となることを示唆している。
要約すると、本発明の結合分子は、最大１０ｍｇ／ｋｇの投薬量でヒト被験者に投与され、０．３ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの臨床用量範囲を示した。しかしながら、投薬速度が速いほうが更に効果的となり得る。Ｑ２Ｗレジメンに関しては、≧１ｍｇ／ｋｇの用量が標的濃度を達成することになる。Ｑ３Ｗレジメンに関しては、≧３ｍｇ／ｋｇの用量が標的濃度を達成することになる。しかしながら、より小さい用量（例えば０．３ｍｇ／ｋｇ）が、所望の生物活性を達成するにあたって効果的となり得る。この投与は、ヒトの健康な被験者において安全であること、及び免疫変調活性を示すことが分かった。本発明の結合分子の投与は、望ましくないサイトカイン放出が後に続くことがなく、又は望ましくないサイトカイン放出と関連しなかった。投与される用量にかかわらず、薬物動態／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）及びモデル化＆シミュレーション（Ｍ＆Ｓ）分析は、最初の投薬時の又は定常状態のＣmax値が、Ｑ２Ｗ、Ｑ３Ｗ及びＱ４Ｗレジメンに関して同様であることを示す。定常状態では、２８日間隔（Ｑ２Ｗレジメンに関する投薬間隔）でのＡＵＣssは、Ｑ４Ｗレジメンに比べておよそ２倍高くなると予測される。投薬間隔がより短い（１４及び２１日）Ｑ２Ｗレジメン及びＱ３Ｗレジメンに関する最初の投薬時の又は定常状態のＣmin値は、より長い２８日の投薬間隔（より長い流失期間）を有するＱ４Ｗレジメンに比べて高くなる。
本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の血清半減期（Ｔ1/2）はおよそ４〜８日であったが、最初の半減期の経過後でさえ、投与されたＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子のうちの相当な割合が末梢Ｂ細胞に結合したままであることが観察された。例えば実施例１のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ Ｆｃダイアボディに関して、０．３ｍｇ／ｋｇの投薬レジメンにおいて少なくとも８日間、並びに３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの投薬レジメンにおいて３０〜略５０日間にもわたって、２０％を超える占有率が観察された。
（特にＡＵＣ測定値に反映されるものとしての）末梢Ｂ細胞活性化の阻害は、約３０日目にはベースラインに戻る。ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子はまた、メモリーＢ細胞（図１０Ａ〜１０Ｃ）及びナイーブＢ細胞（図１１Ａ〜１１Ｃ）上のＢＣＲ標的を下方制御し、この下方制御は、約２７日以上持続する。同様に、血清Ｉｇレベルの変調（図１２Ａ〜１２Ｃ）は、最低投薬量においてさえ、少なくとも５７日間持続する。これらの結果は、単一用量投与によるものである。従って好ましい投薬スケジュールは、ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の半減期、長期にわたって作用する生物活性、又は半減期と、このような長期にわたって作用する生物活性との両方に基づくものとすることができる。
実施例４
体液性免疫応答に対するＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性Ｆｃダイアボディの生体内投与の評価
本明細書中に記載されているように、本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子、特に二重特異性Ｆｃダイアボディは、活性化‐阻害カップリングに基づく生理学的ネガティブフィードバックループをトリガすることによって、活性化されたＢ細胞を阻害するよう設計される。キーホールリンペットヘモシアニン（Keyhole Limpet Hemocyanin：ＫＬＨ）等の免疫原によるワクチン接種に応答した体液性免疫応答に対するＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の阻害効果を調査した。特に非ヒト霊長類からのＰＫデータの外挿に基づくと、０．３ｍｇ／ｋｇで投与した場合、循環するＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ Ｆｃダイアボディは、末梢血Ｂ細胞上のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ Ｆｃダイアボディ結合部位の２０％の占有率を６日間持続させるようなレベルより高く維持される。インビトロ研究に基づくと、上述の占有率レベルは、ＢＣＲ仲介型Ｂ細胞活性化の最低５０％の阻害を少なくとも６日間持続させると予測される。ヒトにおけるＫＬＨワクチン接種に対する免疫応答におよそ４〜６日かかることを考慮すると、≧０．３ｍｇ／ｍｌの用量でＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子を被験者に投与した場合のＫＬＨワクチン接種の実施は、ＫＬＨ抗原によるワクチン接種に対するＢ細胞応答の阻害によって証明されるように、検出可能な薬力学的活性をもたらす。従ってＫＬＨは、０．３ｍｇ／ｋｇ以上のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の用量を投与された全ての被験者に対して、２日目に１．０ｍｇの皮下（ＳＣ）用量で投与してよい。更にワクチン接種前に各被験者に関して上記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の安全性及び耐容性を確立するために、ＫＬＨワクチン接種を、ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の注入から２４時間以上後に行ってよい。
抗ＫＬＨ ＩｇＧ、並びにＩｇＭ力価及びその阻害のベースラインからのパーセント変化、並びに免疫化後に定量化可能な抗ＫＬＨ、ＩｇＧ及びＩｇＭ応答を示した被験者の割合を、用量パネル及び時間によって作表及び要約する。ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子治療とプラセボとの間の免疫応答の差異を、記述統計を用いて評価する。適切であると判断された場合には、更なる分析（例えば曝露‐応答分析）を実施してよい。
実施例５
体液性免疫応答に対するＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性Ｆｃダイアボディの生体内投与の評価
上述のように、体液性免疫応答に対するＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の阻害活性を、ワクチン接種に応答して評価できる。不活性化Ａ型肝炎ワクチン（ＨＡＶ）は、Ｂ細胞枯渇療法（Van Der Kolk LE, et al. (2002) “Rituximab Treatment Results In Impaired Secondary Humoral Immune Responsiveness,” Blood 100:2257-9）を使用する患者間で、免疫不全状態における免疫応答を評価するために使用される、確立された新抗原である（Valdez H, et al. (2000) “Response To Immunization With Recall And Neoantigens After Prolonged Administration Of An Hiv-1 Protease Inhibitor-Containing Regimen,” ACTG 375 team. AIDS clinical trials group. AIDS 14:11-21）。この研究では、上述の例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の阻害効果を、陰性血清Ａ型肝炎力価を有する正常な健康な志願者におけるＨＡＶ投与に応答して評価する。簡潔に述べると、単一用量のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子又はプラセボを、３ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇでＩＶ注入によって投与し、被験者は２日目に、単一用量のＨＡＶ（ＶＡＱＴＡ（登録商標）（Ａ型肝炎ワクチン、不活性化、Ｍｅｒｃｋ、５０Ｕ／１‐ｍＬ）も筋肉内投与される。単一用量のＨＡＶに対する免疫応答に対する、ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の投与の影響を、ワクチン接種された被験者における血清ＩｇＧ特異的抗ＨＡＶ特異性抗体の出現を監視することによって評価する。ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ ＨＡＶＡｂ‐ＩｇＧアッセイ（Abbott Laboratories）を用いて、ＨＡＶ特異性ＩｇＧの存在を検出した。ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ ＨＡＶＡｂ‐ＩｇＧアッセイは、ヒト血清又は血漿中のＨＡＶに対するＩｇＧ抗体の定性的検出のための、化学発光微粒子イムノアッセイ（chemiluminescent microparticle immunoassay：ＣＭＩＡ）である。修正されたＡｂｂｏｔｔのシステムを用いた定量的アッセイも採用した。
表１１は、３ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇのプラセボ又は例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子で治療された１０人の被験者からの初期結果をまとめたものである。表１２は、本研究における全ての被験者からのワクチン接種後５６日目の結果をまとめたものである。各ワクチン接種グループの血清中に存在するＨＡＶ特異性ＩｇＧ（抗ＨＡＶ ＩｇＧ）の平均濃度は、表１３にまとめられている。ワクチン接種された被験者それぞれの血清中に存在する抗ＨＡＶ ＩｇＧの濃度は、図１８にプロットされている。本研究の結果は、ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の投与が、活性化Ｂ細胞及びワクチン接種に応答した体液性免疫応答を阻害することを示している。
実施例６
ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、ＣＤ４０依存性Ｂ細胞応答をブロックする
上述のように、ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の投与は、共刺激分子ＣＤ４０のレベルを低下させる。ＣＤ４０依存性応答に対する例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の活性を、インビトロで評価した。これらの研究は、二次又は三次リンパ系器官の胚中心に発生する濾胞ＣＤ４ヘルパー細胞によって提供される刺激シグナルの存在下での抗体（例えばＩｇＧ）分泌細胞へのＢ細胞分化のプロセスを模倣するアッセイシステムを使用する。簡潔に述べると、ヒトＢ細胞を、陰性選択キットを用いて健康なドナーの末梢全血から精製した。精製されたヒトＢ細胞を、５％ＣＯ2３７℃インキュベーター内において、上述の例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子（２０μｇ／ｍＬ）の存在下又は不在下で、希釈せずに若しくは３倍希釈を続けて（１、１／３、１／９及び１／２７）使用される刺激因子（ＣＤ４０リガンド（５００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ‐４（１００ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ‐２１（２０ｎｇ／ｍＬ））を用いて又は用いずに、完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で５日間培養した。培養物上清を回収し、分泌されたヒトＩｇＧをＥＬＩＳＡで決定した。本研究の結果は、図１９にプロットされている。
図１９に示すように、ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子はＩｇＧ分泌を低減させることができ、これは、ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子が、ＩｇＧ産生に関連するＣＤ４０仲介型経路を阻害できることを示している。
本明細書において言及されている全ての公刊物及び特許は、個々の公刊物又は特許出願それぞれの全体が参照により本明細書に援用されていることが具体的かつ独立に指示されている場合と同程度に、参照により本明細書に援用されている。本発明をその具体的実施形態に関して説明したが、更なる修正形態が可能であり、本出願は、本発明が属する分野の公知の方法又は慣例の範囲内であるような、及びこれまでに挙げた必須の特徴に適用できるような、本開示からの逸脱を含む、本発明の原理に概ね従う本発明のいずれの変形、使用又は改変を包含することを意図していることを理解されたい。
配列表の数字見出し＜２２３＞の記載は以下のとおりである。
配列番号１：ヒトＩｇＧ ＣＬκドメイン
配列番号２：ヒトＩｇＧ ＣＬλドメイン
配列番号３：ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメイン
配列番号４：ヒトＩｇＧ２ ＣＨ１ドメイン
配列番号５：ヒトＩｇＧ４ ＣＨ１ドメイン
配列番号６：ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域
配列番号７：ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域
配列番号８：ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域
配列番号９：Ｓ２２８Ｐ置換ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域
配列番号１０：ヒトＩｇＧ１のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン、ＸＡＡはリシン（Ｋ）又は不在である
配列番号１１：ヒトＩｇＧ２のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン、ＸＡＡはリシン（Ｋ）又は不在である
配列番号１２：ヒトＩｇＧ３のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン、ＸＡＡはリシン（Ｋ）又は不在である
配列番号１３：ヒトＩｇＧ４のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン、ＸＡＡはリシン（Ｋ）又は不在である
配列番号１４：好ましい介在スペーサペプチド（リンカー１）
配列番号１５、１６：リンカー２
配列番号１７〜２０：ヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号２１：「Ｅコイル」ヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号２２：「Ｋコイル」ヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号２３：システイン含有「Ｅコイル」ヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号２４：システイン含有「Ｋコイル」ヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号２５、２６：システイン含有ペプチド（ペプチド１）
配列番号２７、２８：介在リンカーペプチド（リンカー３）
配列番号２９：スペーサペプチド（リンカー４）
配列番号３０：抗ヒトＣＤ３２Ｂ抗体のＶＬドメイン
配列番号３１：抗ヒトＣＤ３２Ｂ抗体のＶＨドメイン
配列番号３２：抗ヒトＣＤ７９Ｂ抗体のＶＬドメイン
配列番号３３：抗ヒトＣＤ７９Ｂ抗体のＶＨドメイン
配列番号３４：第１の例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性ダイアボディの第１のポリペプチド鎖
配列番号３５：第１の例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性ダイアボディの第２のポリペプチド鎖
配列番号３６：第２の例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性ダイアボディの第１のポリペプチド鎖
配列番号３７：第２の例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性ダイアボディの第２のポリペプチド鎖
配列番号３８：ノブ含有ＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン
配列番号３９：第１の例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性Ｆｃダイアボディの第１のポリペプチド鎖
配列番号４０：第１の例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性Ｆｃダイアボディの第１のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号４１：第１の例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性Ｆｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖
配列番号４２：第１の例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性Ｆｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号４３：ホール含有ＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン
配列番号４４：第１の例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性Ｆｃダイアボディの第３のポリペプチド鎖
配列番号４５：第１の例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性Ｆｃダイアボディの第３のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号４６：第２の例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性Ｆｃダイアボディの第１のポリペプチド鎖
配列番号４７：第２の例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性Ｆｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖
配列番号４８：第２の例示的なＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性Ｆｃダイアボディの第３のポリペプチド鎖

Claims (23)

  1. 治療的有効量のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子を、治療を必要とする被験者に投与するステップを含む、炎症性疾患又は状態を治療する方法であって、前記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、ＣＤ３２Ｂのエピトープ及びＣＤ７９Ｂのエピトープに免疫特異的に結合でき、前記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、約３ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの用量、及び１週間に１用量〜８週間に１用量の投薬レジメンで投与される、方法。
  2. 治療的有効量のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子を、治療を必要とする被験者に投与するステップを含む、免疫応答を低下させる又は阻害する方法であって、前記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、ＣＤ３２Ｂのエピトープ及びＣＤ７９Ｂのエピトープに免疫特異的に結合でき、前記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、約３ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの用量、及び１週間に１用量〜８週間に１用量の投薬レジメンで投与される、方法。
  3. 前記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、約３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１又は２に記載の方法。
  5. 前記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、約３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１又は２に記載の方法。
  6. 前記投薬レジメンは、２週間に１用量（Ｑ２Ｗ）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記投薬レジメンは、３週間に１用量（Ｑ３Ｗ）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記投薬レジメンは、４週間に１用量（Ｑ４Ｗ）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、ＣＤ３２Ｂのエピトープ及びＣＤ７９Ｂのエピトープに結合する二重特異性抗体、又は前記二重特異性抗体のＣＤ３２Ｂ及びＣＤ７９Ｂ結合ドメインを含む分子である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は、ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性ダイアボディである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ二重特異性ダイアボディは、ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ Ｆｃダイアボディである、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記炎症性疾患又は状態は自己免疫疾患である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記自己免疫疾患は：アジソン病；自己免疫性肝炎；自己免疫性内耳疾患；重症筋無力症；クローン病；皮膚筋炎；家族性腺腫性ポリポーシス；移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）；グレーヴス病；橋本甲状腺炎；エリテマトーデス；多発性硬化症（ＭＳ）；悪性貧血；ライター症候群；関節リウマチ（ＲＡ）；シェーグレン症候群；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；１型糖尿病；原発性血管炎（例えばリウマチ性多発筋痛症、巨細胞性動脈炎、ベーチェット病）；天疱瘡；視神経脊髄炎；抗ＮＭＤＡ受容体脳炎；ギランバレー症候群；慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）；グレーヴス眼症；ＩｇＧ４関連疾患；特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）；及び潰瘍性大腸炎からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記炎症性疾患又は状態は、ＧｖＨＤ、ＭＳ、ＲＡ又はＳＬＥである、請求項１３に記載の方法。
  15. 免疫グロブリンの血清レベルは、前記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の最初の用量の投与後３６日目までに低下する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記免疫グロブリンはＩｇＭ、ＩｇＡ又はＩｇＧである、請求項１５に記載の方法。
  17. ＢＣＲ仲介型末梢Ｂ細胞活性化は、前記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の最初の用量の投与後２４時間までに低下し、前記Ｂ細胞活性化は、生体外カルシウム動員アッセイによって決定される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記ＢＣＲ仲介型Ｂ細胞活性化は少なくとも５０％阻害され、前記阻害は少なくとも６日間持続する、請求項１７に記載の方法。
  19. 末梢Ｂ細胞上の前記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合部位の少なくとも２０％が、前記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子の最初の用量の投与後６時間占有される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. （Ａ）Ｂ細胞上のＣＤ４０の発現が下方制御され；及び／又は
    （Ｂ）ＣＤ４０仲介型ＩｇＧ分泌が阻害される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記被験者はヒトである、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は：
    （Ａ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＶＬCD32Bドメイン；
    （Ｂ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨCD32Bドメイン；
    （Ｃ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬCD79Bドメイン；
    （Ｄ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨCD79Bドメイン
    を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ結合分子は：
    （Ａ）配列番号３９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖；
    （Ｂ）配列番号４１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；及び
    （Ｃ）配列番号４４のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖
    を含むＦｃダイアボディである、請求項２２に記載の方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI706960B (zh) * 2014-09-26 2020-10-11 美商宏觀基因股份有限公司 能夠結合cd19和cd3的雙特異性雙抗體及其用途
WO2018081448A1 (en) 2016-10-26 2018-05-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Modified immunoglobulin hinge regions to reduce hemagglutination
JP2022513338A (ja) * 2018-10-03 2022-02-07 ネペンザ・バイオサイエンシズ・エルエルシー 抗ｃｄ７９抗体およびその使用
US20210032333A1 (en) * 2019-07-30 2021-02-04 Provention Bio, Inc. Methods and Compositions for Reducing Immunogenicity By Non-Depletional B Cell Inhibitors
EP4004052A4 (en) * 2019-07-30 2023-11-01 Provention Bio, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR REDUCING IMMUNOGENICITY BY NON-DEPLETED B CELL INHIBITORS
EP4237095A1 (en) * 2020-11-01 2023-09-06 Provention Bio, Inc. Methods and compositions for treatment of lupus
AU2022324406A1 (en) * 2021-08-02 2024-03-14 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Anti-cd79b×cd3 bispecific antibody and use thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015021089A1 (en) * 2013-08-09 2015-02-12 Macrogenics, Inc. Bi-specific monovalent fc diabodies that are capable of binding cd32b and cd79b and uses thereof

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9284375B2 (en) * 2005-04-15 2016-03-15 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US9963510B2 (en) * 2005-04-15 2018-05-08 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US11384149B2 (en) * 2013-08-09 2022-07-12 Macrogenics, Inc. Bi-specific monovalent Fc diabodies that are capable of binding CD32B and CD79b and uses thereof
WO2016113665A1 (en) * 2015-01-13 2016-07-21 Agresearch Limited Agricultural composition

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015021089A1 (en) * 2013-08-09 2015-02-12 Macrogenics, Inc. Bi-specific monovalent fc diabodies that are capable of binding cd32b and cd79b and uses thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J IMMUNOL, vol. Vol.192, Suppl.1, JPN6021016262, 2014, pages 200 - 9, ISSN: 0004823095 *

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