CN109289760B - 二氧化硅纳米粒子在dna免疫吸附剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了二氧化硅纳米粒子在DNA免疫吸附剂中的应用。本发明是基于本发明发明人发现二氧化硅纳米粒子负载DNA得到的DNA免疫吸附剂吸附性能好、安全性能更佳的优点所提出的发明创造。本发明提供的二氧化硅纳米粒子负载DNA的免疫吸附剂是基于前述应用得到的,其分DNA修饰在纳米粒子MSNs和SiO2的表面或孔道内,固载量大,不易脱落,提高了免疫吸附剂的安全性,且DNA分子与抗ds‑DNA抗体充分接触,可最大限度发挥其特异性结合能力,从而制备得到的免疫吸附剂吸附性能良好、稳定。
Description
技术领域
本发明属于血液净化领域,特别涉及二氧化硅纳米粒子在DNA免疫吸附剂中的应用。
背景技术
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种多系统损害的慢性自身性免疫性疾病,确切病因不明,常引起多器官系统的不可逆性损害,可累及皮肤、浆膜、关节、肾及中枢神经系统等,病理表现为自身抗体及免疫复合物沉积,影响患者的寿命和生活质量。SLE的患病率因人群而异,我国患病以女性多见,尤其是育龄女性。患者血清中出现以抗核抗体(ANA)、抗双链DNA抗体(抗ds-DNA抗体)为代表的多种抗体,其中抗ds-DNA抗体是参与SLE发病的主要抗体,其特异性可达90%,是SLE特异性抗体。
早期清除患者血清中的自身抗体、控制疫病活动、保护肾功能是治疗的关键。免疫吸附疗法是近年来发展起来的新型血液净化技术,它利用吸附材料除去血浆中的致病抗体(如抗ds-DNA抗体),达到治疗疫病的目的。免疫吸附是通过抗原抗体免疫反应或物理化学作用除去致病因子,主要是血浆吸附,从而避免了离心式和一次膜血浆分离大量丢弃血浆的弊端。近年来,免疫吸附越来越多地应用于免疫性疾病的治疗。
其中,应用比较广泛的是DNA免疫吸附,采用DNA免疫吸附疗法可以特异性的吸附和清除抗ds-DNA抗体,从而对SLE患者进行有效的治疗。欧洲专利EP0272792A1制备了基于活性炭或者碳化树脂的DNA免疫吸附剂,他们以活性炭或者碳化树脂为载体,以小牛胸腺DNA(下文简称DNA)为配基,利用火棉胶包埋固载小牛胸腺DNA。但是,无论是活性炭还是碳化树脂,均存在碳颗粒易脱落的问题,因而使用之前需要增加时间进行充分预冲至无微粒,从而避免治疗时微粒随血液循环进入人体而导致发生血栓、过敏、刺激等严重的不良反应。此外,DNA采用火棉胶包埋方式固载还存在两个缺点:一是部分DNA会由于包埋不充分,在后续生产过程中可能发生脱落,导致DNA固载量下降;二是部分被包埋过深的DNA又无法与抗体接触。因此,提供一种吸附性能好的,微粒脱落率低的DNA免疫吸附剂成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供二氧化硅纳米粒子在DNA免疫吸附剂中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种二氧化硅纳米粒子负载DNA的免疫吸附剂。
本发明的再一目的在于提供上述二氧化硅纳米粒子负载DNA的免疫吸附剂的制备方法及应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现:二氧化硅纳米粒子在DNA免疫吸附剂中的应用,是基于本发明发明人发现二氧化硅纳米粒子负载DNA得到的DNA免疫吸附剂,具有吸附性能好,且安全性能更佳的优点。
所述的二氧化硅纳米粒子在DNA免疫吸附剂中的应用,包括如下步骤:将二氧化硅纳米粒子表面修饰氨基和羧基,再加入催化剂和DNA混合,反应,得到DNA免疫吸附剂。
所述的DNA优选为双链DNA;更优选为小牛胸腺DNA。
所述的二氧化硅纳米粒子优选为实心二氧化硅纳米粒子(SiO2)和介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)中的一种或至少两种;更优选为介孔二氧化硅纳米粒子。
所述的介孔二氧化硅纳米粒子优选通过如下步骤制备得到:以正硅酸乙酯(TEOS)为硅源,十六烷基三甲基溴化铵为表面活性剂,三乙胺为有机溶胀剂,搅拌回流反应,得到介孔二氧化硅纳米粒子。
所述的十六烷基三甲基溴化铵的用量优选为按其与所述的TEOS=1~1.5g:1mL配比计算;更优选为按其与所述的TEOS=4g:3mL配比计算。
所述的三乙胺的用量优选按其相当于所述的TEOS体积的32~38倍计算;更优选为按其相当于所述的TEOS体积的35.6倍计算。
所述的实心二氧化硅纳米粒子优选通过如下步骤制备得到:以硅酸四乙酯为硅源,加入到氨水、乙醇和水制备的混合溶液中,搅拌反应,离心,洗涤,干燥,得到实心二氧化硅纳米粒子。
所述的氨水的用量优选按其与所述的硅酸四乙酯=2~4:5~7(体积比)配比计算;更优选为按其与所述的硅酸四乙酯=3.14:6配比计算。
所述的乙醇的用量优选按其相当于所述的硅酸四乙酯体积的20~25倍计算;更优选为按其相当于所述的硅酸四乙酯体积的23.8倍计算。
所述的水的用量优选按其与所述的硅酸四乙酯体积的2~4倍计算;更优选为按其相当于所述的硅酸四乙酯体积的3.3倍计算。
一种二氧化硅纳米粒子负载DNA的免疫吸附剂,是基于上述应用设计得到的,包括二氧化硅纳米粒子和用于与抗DNA抗体结合的DNA,用于与抗DNA抗体结合的DNA负载在二氧化硅纳米粒子上。
所述的二氧化硅纳米粒子为实心二氧化硅纳米粒子(SiO2)和介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)中的一种或至少两种。
所述的用于与抗DNA抗体结合的DNA优选为双链DNA;更优选为小牛胸腺DNA。。
所述的介孔二氧化硅纳米粒子优选通过如下步骤制备得到:以正硅酸乙酯(TEOS)为硅源,十六烷基三甲基溴化铵为表面活性剂,三乙胺为有机溶胀剂,搅拌回流反应,洗涤,干燥,研磨,煅烧,得到介孔二氧化硅纳米粒子。
所述的十六烷基三甲基溴化铵的用量优选为按其与所述的TEOS=1~1.5g:1mL配比计算;更优选为按其与所述的TEOS=4g:3mL配比计算。
所述的三乙胺的用量优选按其相当于所述的TEOS体积的32~38倍计算;更优选为按其相当于所述的TEOS体积的35.6倍计算。
所述的反应的温度优选为85~95℃;更优选为90℃。
所述的反应的时间优选为1.5~2.5h;更优选为2h。
所述的介孔二氧化硅纳米粒子要通过一系列步骤进行后处理,之后才能用于制备介孔二氧化硅纳米粒子负载DNA的免疫吸附剂。
所述的洗涤优选为先后采用乙醇和水分别洗涤3~5遍。
所述的干燥优选为50~80℃烘干。
所述的煅烧优选为550℃煅烧5h。
所述的实心的二氧化硅纳米粒子优选通过如下步骤制备得到:以硅酸四乙酯为硅源,加入到氨水、乙醇和水制备的混合溶液中,搅拌反应,12000rpm离心,洗涤,干燥,得到实心二氧化硅纳米粒子。
所述的氨水的用量优选按其与所述的硅酸四乙酯=2~4:5~7(体积比)配比计算;更优选为按其与所述的硅酸四乙酯=3.14:6配比计算。
所述的乙醇的用量优选按其相当于所述的硅酸四乙酯体积的20~25倍计算;更优选为按其相当于所述的硅酸四乙酯体积的23.8倍计算。
所述的蒸馏水的用量优选按其与所述的硅酸四乙酯体积的2~4倍计算;更优选为按其相当于所述的硅酸四乙酯体积的3.3倍计算。
所述的搅拌反应的时间优选为1~5h;更优选为2h。
所述的洗涤优选为先后采用蒸馏水和乙醇分别洗3~5次。
所述的干燥的方式优选为冷冻干燥。
上述二氧化硅纳米粒子负载DNA的免疫吸附剂中,所述的二氧化硅纳米粒子为介孔二氧化硅纳米粒子时,其制备方法包括如下步骤:
(1)将介孔二氧化硅纳米粒子分散在有机溶剂中,加入3-氨丙基三乙氧基硅烷,搅拌,反应,离心,得到表面含氨基的介孔二氧化硅纳米粒子;
(2)洗涤步骤(1)获得的表面含氨基的介孔硅纳米粒子分散在有机溶剂中,加入丁二酸酐,反应,离心,洗涤,干燥,研磨,得到含羧基修饰的介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs);
(3)将步骤(2)获得的MSNs分散,加入催化剂,搅拌,加入用于与抗DNA抗体结合的DNA溶液,反应,离心,洗涤,干燥,研磨,得到介孔二氧化硅纳米粒子负载DNA的免疫吸附剂(DNA-MSNs)。
步骤(1)中所述的3-氨丙基三乙氧基硅烷的用量按其与所述的介孔硅纳米粒子=1~3mL:100mg配比计算;更优选为按其与所述的介孔二氧化硅纳米粒子=2mL:100mg配比计算。
步骤(1)中所述的有机溶剂优选为乙腈、甲苯;更优选为甲苯。
步骤(1)中所述的搅拌的时间优选为15~45min;更优选为30min。
步骤(1)中所述的反应优选为加热回流反应。
所述的加热回流反应的温度优选为100~120℃;更优选为110℃。
所述的加热回流反应的时间优选为20~30h;更优选为24h。
步骤(1)与步骤(2)中所述的离心的转速优选为10000~15000rpm;更优选为12000rpm。
步骤(1)与步骤(2)中所述的有机溶剂的作用是分散物质,其自身不参与反应。
步骤(2)中所述的有机溶剂优选为甲醇、乙醇;更优选为乙醇。
步骤(2)中所述的丁二酸酐的用量优选按其与所述的介孔二氧化硅纳米粒子=1~4:1(质量比)配比计算;更优选按其与所述的介孔二氧化硅纳米粒子=4:1配比计算。
步骤(2)中所述的反应优选为搅拌反应。
所述的搅拌反应的时间优选为2~10h;更优选为5h。
所述的搅拌反应的温度优选为20~40℃;更优选为37℃。
步骤(2)中所述的洗涤优选为先后采用乙醇和水分别洗涤3~5遍。
步骤(2)和(3)中所述的干燥的方式优选为冷冻干燥。
步骤(3)中所述的分散优选为采用超纯水或磷酸盐缓冲溶液分散。
所述的磷酸盐缓冲溶液优选为pH值为7.2~7.4、浓度为0.01~0.1M的磷酸盐缓冲液。
步骤(3)中所述的催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)中的至少一种;优选为EDC和NHS的混合物。
所述的EDC的用量优选为按其与所述的MSNs的质量比=1:1~5计算;更优选为按其与所述的MSNs的质量比=1:2.5计算。
所述的NHS的用量优选为按其与所述的MSNs的质量比=1:1~5计算;更优选为按其与所述的MSNs的质量比=1:2.5计算。
步骤(3)中所述的搅拌的时间优选为1~5h;更优选为2h。
所述的用于与抗DNA抗体结合的DNA溶液的浓度优选为1~5mg/mL;更优选为2.5mg/mL。
步骤(3)中所述的用于与抗DNA抗体结合的DNA溶液中的溶剂优选为pH值为7~9的缓冲液;更优选为pH值为7.8~8.2的缓冲液。
所述的缓冲液优选为Tris-HCl缓冲液。
所述的Tris-HCl缓冲液的浓度优选为0.01~0.1M;更优选为0.01~0.05M。
步骤(3)中所述的DNA的质量用量优选为按其与所述的MSNs的质量比=1:10~30计算;更优选为按其与所述的MSNs的质量比=1:20计算。
步骤(3)中的所述的反应优选为搅拌反应。
所述的搅拌反应的时间优选为20~30h;更优选为24h。
步骤(3)中的所述的离心的转速优选为10000~15000rpm;更优选为12000rpm。
步骤(3)中所述的洗涤优选为采用超纯水洗涤。
上述二氧化硅纳米粒子负载DNA的免疫吸附剂中,所述的二氧化硅纳米粒子为实心二氧化硅纳米粒子时,其制备方法包括如下步骤:
(A)将实心二氧化硅纳米粒子分散在有机溶剂中,加入3-氨丙基三乙氧基硅烷,搅拌,反应,离心,洗涤,得到表面含氨基的实心二氧化硅纳米粒子;
(B)将步骤(A)得到的表面含氨基的实心二氧化硅纳米粒子分散在有机溶剂中,加入丁二酸酐,反应,离心,洗涤,干燥,研磨,得到含羧基修饰的实心二氧化硅纳米粒子(SiO2);
(C)将步骤(B)得到的SiO2分散,加入催化剂,搅拌,加入用于与抗DNA抗体结合的DNA溶液,反应,离心,洗涤,干燥,研磨,得到实心二氧化硅纳米粒子负载DNA的免疫吸附剂(DNA-SiO2)。
步骤(A)中所述的3-氨丙基三乙氧基硅烷的用量按其与所述的实心二氧化硅纳米粒子=1~3mL:100mg配比计算;更优选为按其与所述的实心二氧化硅纳米粒子=2mL:100mg配比计算。
步骤(A)中所述的有机溶剂优选为乙腈、甲苯;更优选为甲苯。
步骤(A)中所述的搅拌的时间优选为15~45min;更优选为30min。
步骤(A)中所述的反应优选为加热回流反应。
所述的加热回流反应的温度优选为100~120℃;更优选为110℃。
所述的加热回流反应的时间优选为20~30h;更优选为24h。
步骤(A)与步骤(B)中所述的离心的转速优选为10000~15000rpm;更优选为12000rpm。
步骤(A)与步骤(B)中所述的有机溶剂的作用是分散物质,其自身不参与反应。
步骤(B)中所述的有机溶剂优选为甲醇、乙醇;更优选为乙醇。
步骤(B)中所述的丁二酸酐的用量优选按其与所述的实心二氧化硅纳米粒子=1~4:1(质量比)配比计算;更优选按其与所述的实心二氧化硅纳米粒子=4:1配比计算。
步骤(B)中所述的反应优选为搅拌反应。
所述的搅拌反应的时间优选为2~10h;更优选为5h。
所述的搅拌反应的温度优选为20~40℃;更优选为37℃。
步骤(B)中所述的洗涤优选为先后采用乙醇和水分别洗涤3~5遍。
步骤(B)和(C)中所述的干燥的方式优选为冷冻干燥。
步骤(C)中所述的分散优选为采用超纯水或磷酸盐缓冲溶液分散。
所述的磷酸盐缓冲溶液优选为pH值为7.2~7.4、浓度为0.01~0.1M的磷酸盐缓冲液。
步骤(C)中所述的催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)中的至少一种;优选为EDC和NHS的混合物。
所述的EDC的用量优选为按其与所述的MSNs的质量比=1:1~5计算;更优选为按其与所述的MSNs的质量比=1:2.5计算。
所述的NHS的用量优选为按其与所述的MSNs的质量比=1:1~5计算;更优选为按其与所述的MSNs的质量比=1:2.5计算。
步骤(C)中所述的搅拌的时间优选为1~5h;更优选为2h。
步骤(C)中所述的用于与抗DNA抗体结合的DNA溶液的浓度优选为1~5mg/mL;更优选为2.5mg/mL。
步骤(C)中所述的用于与抗DNA抗体结合的DNA溶液中的溶剂优选为pH值为7~9的缓冲液;更优选为pH值为8的缓冲液。
所述的缓冲液优选为Tris-HCl缓冲液。
所述的Tris-HCl缓冲液的浓度优选为0.01~0.1M;更优选为0.01~0.05M。
步骤(C)中所述的DNA的质量用量优选为按其与所述的SiO2的质量比=1:10~30计算;更优选为按其与所述的SiO2的质量比=1:20计算。
步骤(C)中的所述的反应优选为搅拌反应。
所述的搅拌反应的时间优选为2~30h;更优选为2h。
步骤(C)中的所述的离心的转速优选为10000~15000rpm;更优选为12000rpm。
步骤(C)中所述的洗涤优选为采用超纯水洗涤。
上述二氧化硅纳米粒子负载DNA的免疫吸附剂在制备血液净化制剂中的应用。
上述二氧化硅纳米粒子负载DNA的免疫吸附剂在制备用于治疗抗ds-DNA抗体升高导致的疾病的药物中的应用。
所述的抗ds-DNA抗体升高导致的疾病优选为系统性红斑狼疮。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
1.本发明的DNA免疫吸附剂的DNA分子脱落率低,无需预冲,节约资源,同时可提高免疫吸附剂使用的安全性。
2.本发明以MSNs作为载体,将DNA修饰在其表面,制备得到的介孔二氧化硅纳米粒子负载DNA的免疫吸附剂DNA固载量达到了408μg/mL,吸附性能良好。
3.本发明的DNA免疫吸附剂中,DNA分子与抗ds-DNA抗体充分接触,最大限度发挥其特异性结合能力。
附图说明
图1是不同的纳米粒子对病例血清中抗ds-DNA抗体的清除率对比图。
图2是DNA-MSNs对病人血清中抗ds-DNA抗体吸附的结果图;其中,图A是DNA-MSNs对128个病例的血清中抗ds-DNA抗体的清除率统计图;图B是128个病例的抗ds-DNA抗体滴度与抗体清除率的关系图。
图3是DNA-MSNs与市售产品的免疫吸附效果比较图;其中,图A是DNA-MSNs、市售产品1和市售产品2三种免疫吸附产品对同一病例血浆中抗ds-DNA抗体清除过程中抗ds-DNA抗体滴度变化图,图B是DNA-MSNs、市售产品1和市售产品2三种免疫吸附产品对同一病例血浆中抗ds-DNA抗体的清除率变化图。
图4是DNA-MSNs吸附病人血清中抗ds-DNA抗体前后透射电子显微镜的表征图;其中,图a是DNA-MSNs在吸附前自身的形貌图,图b-d分别是DNA-MSNs在吸附病例1~3血清中抗ds-DNA抗体后的形貌图。
图5是DNA-MSNs吸附病人血清中抗ds-DNA抗体前后纳米粒径大小分布图;其中,图a是DNA-MSNs在吸附前自身的粒径分布图,图b-d分别是DNA-MSNs在吸附病例1~3血清中抗ds-DNA抗体后的粒径分布图。
图6是DNA-MSNs吸附病人血清中抗ds-DNA抗体前后的电位图;其中,图a是DNA-MSNs在吸附前自身的电位图,图b-d分别是DNA-MSNs在吸附病例1~3血清中抗ds-DNA抗体后的电位图。
图7是DNA-MSNs吸附病人血清中抗ds-DNA抗体前后的红外光谱图;其中,图a是DNA-MSNs在吸附前自身的红外光谱图,图b-d分别是DNA-MSNs在吸附病例1~3血清中抗ds-DNA抗体后的红外光谱图。
图8是DNA-MSNs吸附病人血清中抗ds-DNA抗体前后的拉曼光谱图;其中,图a是DNA-MSNs在吸附前自身的拉曼光谱图,图b-d分别是DNA-MSNs在吸附病例1~3血清中抗ds-DNA抗体后的拉曼光谱图。
图9是DNA-MSNs的安全性评价结果图;其中,图A是不同浓度的DNA-MSNs与阳性对照Triton X-100分别孵育血红细胞2h后的溶血率对比图,图B是不同浓度的DNA-MSNs、阳性对照Triton X-100分别孵育血红细胞2h后的血红细胞形貌图。
具体实施例
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1DNA-MSNs纳米粒子的制备
(1)将4.0g十六烷基三甲基氯化铵(阿拉丁公司)在40mL水中超声分散均匀,滴加106.8mL三乙胺(阿拉丁公司),搅拌1h,逐滴加入3mL正硅酸乙酯(阿拉丁公司),90℃搅拌回流2h。反应完成后,收集样品,12000rpm离心,获得介孔二氧化硅纳米粒子。
(2)将介孔二氧化硅纳米粒子用乙醇和超纯水分别清洗三遍,60℃烘箱烘干,碾成粉末,550℃马弗炉煅烧5h。
(3)取100mg步骤(2)处理后的介孔二氧化硅纳米粒子分散在20mL甲苯中,加入2mL3-氨丙基三乙氧基硅烷(阿拉丁公司),搅拌30min,升温至110℃回流24h,12000rpm离心,获得白色固体,用乙醇和水分别洗3遍。
(4)将100mg步骤(3)中得到的白色固体用乙醇分散,然后加入用乙醇分散的400mg丁二酸酐(阿拉丁公司),37℃下搅拌5h,12000rpm离心,用乙醇和水分别洗三遍沉淀,冷冻干燥,研磨成粉末,获得含羧基修饰的介孔二氧化硅纳米粒子MSNs-COOH。
(5)将50mg步骤(4)得到的粉末在15mL水中分散均匀,分别加入浓度为10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,阿拉丁公司)和浓度为10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC,阿拉丁公司)各2mL,室温搅拌2h,加入Tris-HCl溶液(0.05M,pH=8.0)溶解的DNA(购自美国Sigma公司,CAS号:73049-39-5)溶液(浓度为2.5mg/mL,加入量为1mL),室温搅拌24h,12000rpm离心,用水洗3遍,冷冻干燥,研磨至粉末,即得DNA-MSNs纳米粒子。
实施例2DNA-SiO2纳米粒子的制备
(1)将142.8mL乙醇、20mL水以及3.14mL氨水溶液混合搅拌10min,然后缓慢加入6mL硅酸四乙酯(阿拉丁公司),搅拌反应2h后12000rpm离心,先后用水和乙醇分别各洗3次,冷冻干燥获得实心二氧化硅纳米粒子。
(2)将100mg实心二氧化硅纳米粒子分散在20mL甲苯中,加入2mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(阿拉丁公司),搅拌30min,升温至110℃回流24h,12000rpm离心,用乙醇和水分别洗3遍,获得表面含氨基的实心二氧化硅纳米粒子。
(3)将100mg步骤(2)中得到的表面含氨基的实心二氧化硅纳米粒子用乙醇分散,然后加入用乙醇分散的400mg丁二酸酐(阿拉丁公司),37℃下搅拌5h,12000rpm离心,用乙醇和水分别洗三遍沉淀,冷冻干燥,研磨成粉末,得到含羧基修饰的实心二氧化硅纳米粒子(SiO2)。
(4)将50mg含羧基修饰的实心二氧化硅纳米粒子在15mL水中分散均匀,分别加入浓度为10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,阿拉丁公司)和浓度为10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC,阿拉丁公司)各2mL,搅拌2h,加入Tris-HCl溶液(0.05M,pH=8.0)溶解的DNA(购自美国Sigma公司)溶液(浓度为2.5mg/mL,加入量为1mL),搅拌24h,12000rpm离心,用水洗3遍,冷冻干燥,研磨至粉末,即得DNA-SiO2纳米粒子。
实施例3AS1411-MSNs纳米粒子的制备
将实施例1步骤(4)中获得的含羧基修饰的介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs-COOH)取50mg在15mL水中分散均匀,分别加入10mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,阿拉丁公司)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC,阿拉丁公司)各2mL,室温搅拌2h,加入Tris-HCl溶液(0.05M,pH=8.0)溶解的AS1411核酸适配体(购自美国Sigma公司,核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)溶液(浓度为2.5mg/mL,加入量为1mL),室温搅拌24h,12000rpm离心,用水洗3遍,冷冻干燥,研磨至粉末,即得AS1411-MSNs纳米粒子。
实施例4DNA-MSNs对病人血清中抗ds-DNA抗体吸附性能的评价
利用酶联免疫试剂盒(QUANTALiteds-DNAELISA,708510,Inova Diagnostics,AWerfen Company,检测步骤按说明书操作)检测抗ds-DNA抗体的滴度。抗ds-DNA抗体清除率的计算方法如下:抗ds-DNA抗体清除率=(吸附前样本数值-吸附后样本数值)/吸附前样本数值*100%。
(1)取10mg介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs,实施例1制备)、实心二氧化硅纳米粒子(SiO2,实施例2制备)、DNA修饰的实心二氧化硅纳米粒子(DNA-SiO2,实施例2制备)、DNA修饰的介孔二氧化硅纳米粒子(DNA-MSNs,实施例1制备)以及AS1411核酸适配体修饰的介孔二氧化硅纳米粒子(AS1411-MSNs,实施例3制备)分别加入0.5mL红斑狼疮病人血清(来自中山大学第三附属医院),使5种纳米材料的浓度为20mg/mL,室温下混匀吸附2h。吸附结束后,8000rpm离心10min,分离上清和沉淀,并对上清中抗ds-DNA抗体的滴度进行检测,计算各种纳米材料对抗ds-DNA抗体的清除率。结果如图1所示,SiO2和MSNs对抗ds-DNA抗体的清除率分别为0%和6.7%,吸附前抗体滴度为409,吸附后抗体滴度分别为409和381。而DNA修饰这两种纳米粒子得到的DNA-SiO2和DNA-MSNs吸附血清后,抗ds-DNA抗体的滴度大大下降,分别下降到75和104,抗体清除率分别达到81.4%和74.4%,表明介孔和实心的二氧化硅进行DNA修饰后均具有高效的抗ds-DNA抗体清除率。而利用AS1411核酸适配体修饰的介孔二氧化硅纳米粒子MSNs-AS1411进行血清吸附后,抗体滴度降低为354,吸附率为16.5%,表明这种核酸适配体的修饰也具有一定的抗ds-DNA抗体清除率,但是清除效果远远低于DNA修饰的二氧化硅纳米粒子。
(2)将10mg实施例1制备的DNA-MSNs纳米粒子加入0.5mL红斑狼疮病人血清(分别来源于128个SLE病例)至DNA-MSNs纳米粒子浓度为20mg/mL,在室温下混匀(20rpm,试管旋转混匀器,TZL-5010,苏州珀西瓦尔实验设备有限公司)吸附2h。吸附结束后,通过8000rpm离心10min,分离上清和沉淀。检测上清中抗ds-DNA抗体的滴度,并计算血清中抗ds-DNA抗体清除率。对128个病例血清中抗ds-DNA抗体的清除率进行统计,DNA-MSNs对血清中抗ds-DNA抗体的清除率大于50%的病例数达到90.6%(图2A);128个SLE病例的血清中抗ds-DNA抗体滴度的范围在100-1000之间,表明DNA-MSNs对滴度不同的抗ds-DNA抗体的清除率并不具选择性,对不同程度滴度的病人血清均具有有效的抗ds-DNA抗体清除效果(图2B)。
(3)将实施例1制备的DNA-MSNs纳米粒子与市售DNA免疫吸附产品(市售产品1:选择性血浆成分吸附器,苯基丙氨酸固定化聚乙烯醇凝胶;市售产品2:DNA免疫吸附柱,碳化树脂上固定小牛胸腺DNA)进行血浆中抗ds-DNA抗体清除率对比。分别取10mgDNA-MSNs纳米粒子与10mg市售产品1、2的填充材料,分别加入1mL红斑狼疮病人血浆,使填充材料在血清中的浓度达到20mg/mL,在室温下混匀吸附2h,期间每隔15min取出0.1mL混悬液,8000rpm离心10min,分离上清和沉淀,并对上清中抗ds-DNA抗体的滴度进行检测,计算DNA-MSNs纳米粒子与市售产品1、2对抗ds-DNA抗体的清除率随吸附时间的变化。结果如图3所示,与市售产品相比,DNA-MSNs纳米粒子能快速有效的清除红斑狼疮病人血清中抗ds-DNA抗体。在孵育15min后,血清中抗ds-DNA抗体的滴度迅速由684下降至185,且经过2h的吸附后,滴度又进一步降低至134,其清除率达到80.3%。而市售产品1与对血清中抗ds-DNA抗体的清除是相对缓慢的,在孵育15min后,血清中抗ds-DNA抗体的滴度下降至564,而经过2h的吸附后,滴度又进一步降低至447,其清除率为34.5%,其效果远远低于DNA-MSNs纳米粒子。市售产品2对红斑狼疮病人血清中抗ds-DNA抗体几乎没有清除效果,即使孵育2h后,血清中抗体滴度依然为673,其抗体清除率仅为1.5%。因此,本发明的DNA-MSNs的吸附效果显著好于市售产品。
实施例5DNA-MSNs吸附抗ds-DNA抗体前后的表征
选取实施例4步骤(2)中DNA-MSNs纳米粒子对不同清除率的三个病例血浆中抗ds-DNA抗体吸附后的沉淀物进行化学结构的表征(通过透射电子显微镜(Hitachi,H-7650)、粒度和电位(马尔文粒度仪)、红外分光光度计(Equinox 55,Bruker)、拉曼光谱仪(LabRAM HREvolution)),对比DNA-MSNs纳米粒子在吸附抗ds-DNA抗体前后的化学结构变化,结果见图4~8。本发明实施例1制备的DNA-MSNs纳米粒子分散均匀,粒径均一,且纳米粒子的尺寸大约在100nm左右(图4a);该纳米粒子吸附抗ds-DNA抗体后,明显看出纳米粒子表面出现蛋白晕(图4b~d),并且高吸附率的病例1和2表面的蛋白晕明(箭头所示)明显多于低吸附率的病例3。病例1~3在吸附前抗ds-DNA抗体的滴度分别为:701、257、633,吸附后滴度下降为:118、12、519。吸附前DNA-MSNs的水合粒径大约为161nm,吸附病人血浆后DNA-MSNs的水合粒径分别增加到293nm、399nm和372nm(图5)。DNA-MSNs的电位为-16.06mV,在吸附病人血浆后,纳米粒子的电位变为-42.13、-38.5和-39.9mV(图6),这主要是由于血浆中蛋白为负电位,因此吸附血浆后,纳米粒子变成更强的负电位,进一步证明了病人血清中抗ds-DNA抗体被成功吸附到纳米粒子表面。从红外光谱可知,纳米粒子吸附血浆后,其特征吸收峰2942.42cm-1,1402.67cm-1分别为蛋白质肽链骨架亚甲基(-CH2-)的伸缩振动和弯曲振动的特征峰(图7)。拉曼光谱的特征吸收峰2942.42cm-1、1402.67cm-1分别为蛋白质肽链骨架亚甲基(-CH2-)的伸缩振动和弯曲振动的特征峰(图8)。以上结果均说明病人血浆中抗ds-DNA抗体被成功吸附到了DNA-MSNs纳米粒子表面。
实施例6DNA-MSNs安全性评价
将实施例1制备的DNA-MSNs纳米粒子采用磷酸盐缓冲溶液(pH7.4,浓度为0.01mol/L)配制成2.5mg/mL和5mg/mL两个浓度的溶液各2mL,取0.5mL两个浓度的DNA-MSNs纳米粒子溶液分别与0.5mL的血红细胞悬浮液混合,并用0.5mL磷酸盐缓冲溶液和0.5mLTriton X-100(10g/L)分别与0.5mL血红细胞孵育,作为阴性对照和阳性对照,在37℃水浴中孵育2h。孵育结束后,各取100μL红细胞在显微镜(Life technologies,FL Auto)下检查红细胞形貌变化并拍照,剩下的混合液3000rpm离心10min,取100μL上清液到96孔板,平行做三个复孔。用酶标仪(美国,Moleclure Devices)540nm处收集吸光值,并计算溶血率。溶血率计算方法:溶血率%=(样本OD540nm-阴性对照OD540nm)/(阳性对照OD540nm-阴性对照OD540nm)*100。结果如图9所示,2.5mg/mL和5mg/mL浓度下的DNA-MSNs纳米粒子对血红细胞并没有表现出明显的溶血现象,同时从血红细胞表面形貌来看,两个浓度的DNA-MSNs纳米粒子孵育血红细胞2h后,血红细胞依然和阴性对照组一样表现出表面光滑形状圆滑的正常形貌,阳性对照组则完全溶血,在显微镜下拍不到红细胞。表明该产品具有良好的生物安全性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 二氧化硅纳米粒子在DNA免疫吸附剂中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> AS1411核酸适配体的核苷酸序列
<400> 1
ggtggtggtg gttgtggtgg tggtgg 26
Claims (7)
1.二氧化硅纳米粒子在制备DNA免疫吸附剂中的应用,其特征在于包括如下步骤:将二氧化硅纳米粒子表面修饰氨基和羧基,再加入催化剂和DNA,反应,得到二氧化硅纳米粒子负载DNA的免疫吸附剂;
所述的二氧化硅纳米粒子为介孔二氧化硅纳米粒子时,所述的二氧化硅纳米粒子负载DNA的免疫吸附剂通过如下步骤制备得到:
(1)将介孔二氧化硅纳米粒子分散在有机溶剂中,加入3-氨丙基三乙氧基硅烷,搅拌,反应,离心,得到表面含氨基的介孔二氧化硅纳米粒子;
(2)洗涤步骤(1)获得的表面含氨基的介孔硅纳米粒子分散在有机溶剂中,加入丁二酸酐,反应,离心,洗涤,干燥,研磨,得到含羧基修饰的介孔二氧化硅纳米粒子;
(3)将步骤(2)获得的含羧基修饰的介孔二氧化硅纳米粒子分散,加入催化剂,搅拌,加入用于与抗DNA抗体结合的DNA溶液,反应,离心,洗涤,干燥,研磨,得到介孔二氧化硅纳米粒子负载DNA的免疫吸附剂;
步骤(1)中所述的3-氨丙基三乙氧基硅烷的用量按其与所述的介孔二氧化硅纳米粒子=1~3mL:100mg配比计算;
步骤(2)中所述的丁二酸酐的用量按其与所述的介孔二氧化硅纳米粒子=质量比1~4:1配比计算;
步骤(3)中所述的催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺中的至少一种;
所述的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量按其与所述含羧基修饰的介孔二氧化硅纳米粒子的质量比=1:1~5计算;
所述的N-羟基琥珀酰亚胺的用量按其与所述含羧基修饰的介孔二氧化硅纳米粒子的质量比=1:1~5计算;
步骤(3)中所述的DNA的质量用量按其与所述含羧基修饰的介孔二氧化硅纳米粒子的质量比=1:10~30计算;
所述的二氧化硅纳米粒子为实心二氧化硅纳米粒子时,所述的二氧化硅纳米粒子负载DNA的免疫吸附剂通过如下步骤制备得到:
(A)将实心二氧化硅纳米粒子分散在有机溶剂中,加入3-氨丙基三乙氧基硅烷,搅拌,反应,离心,洗涤,得到表面含氨基的实心二氧化硅纳米粒子;
(B)将步骤(A)得到的表面含氨基的实心二氧化硅纳米粒子分散在有机溶剂中,加入丁二酸酐,反应,离心,洗涤,干燥,研磨,得到含羧基修饰的实心二氧化硅纳米粒子;
(C)将步骤(B)得到的含羧基修饰的实心二氧化硅纳米粒子分散,加入催化剂,搅拌,加入用于与抗DNA抗体结合的DNA溶液,反应,离心,洗涤,干燥,研磨,得到实心二氧化硅纳米粒子负载DNA的免疫吸附剂;
步骤(A)中所述的3-氨丙基三乙氧基硅烷的用量按其与所述的实心二氧化硅纳米粒子=1~3mL:100mg配比计算;
步骤(B)中所述的丁二酸酐的用量按其与所述的实心二氧化硅纳米粒子=质量比1~4:1配比计算;
步骤(C)中所述的催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺中的至少一种;
所述的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量按其与所述含羧基修饰的实心二氧化硅纳米粒子的质量比=1:1~5计算;
所述的N-羟基琥珀酰亚胺的用量按其与所述含羧基修饰的实心二氧化硅纳米粒子的质量比=1:1~5计算;
步骤(C)中所述的DNA的质量用量按其与所述含羧基修饰的实心二氧化硅纳米粒子的质量比=1:10~30计算;
所述的DNA为双链DNA。
2.根据权利要求1所述的二氧化硅纳米粒子在制备DNA免疫吸附剂中的应用,其特征在于:所述的介孔二氧化硅纳米粒子通过如下步骤制备得到:以正硅酸乙酯为硅源,十六烷基三甲基溴化铵为表面活性剂,三乙胺为有机溶胀剂,搅拌回流反应,得到介孔二氧化硅纳米粒子;
所述的十六烷基三甲基溴化铵的用量为按其与所述的正硅酸乙酯=1~1.5g:1mL配比计算;
所述的三乙胺的用量按其相当于所述的正硅酸乙酯体积的32~38倍计算。
3.根据权利要求1所述的二氧化硅纳米粒子在制备DNA免疫吸附剂中的应用,其特征在于:
所述的实心二氧化硅纳米粒子通过如下步骤制备得到:以硅酸四乙酯为硅源,加入到氨水、乙醇和水制备的混合溶液中,搅拌反应,离心,洗涤,干燥,得到实心二氧化硅纳米粒子;
所述的氨水的用量按其与所述的硅酸四乙酯=体积比2~4: 5~7配比计算;
所述的乙醇的用量按其相当于所述的硅酸四乙酯体积的20~25倍计算;
所述的水的用量按其与所述的硅酸四乙酯体积的2~4倍计算。
4.一种二氧化硅纳米粒子负载DNA的免疫吸附剂,其特征在于:是基于权利要求1~3任一项所述的二氧化硅纳米粒子在制备DNA免疫吸附剂中的应用设计得到的,包括二氧化硅纳米粒子和用于与抗DNA抗体结合的DNA,用于与抗DNA抗体结合的DNA负载在二氧化硅纳米粒子上;
所述的二氧化硅纳米粒子为介孔二氧化硅纳米粒子时,所述的二氧化硅纳米粒子负载DNA的免疫吸附剂通过如下步骤制备得到:
(1)将介孔二氧化硅纳米粒子分散在有机溶剂中,加入3-氨丙基三乙氧基硅烷,搅拌,反应,离心,得到表面含氨基的介孔二氧化硅纳米粒子;
(2)洗涤步骤(1)获得的表面含氨基的介孔硅纳米粒子分散在有机溶剂中,加入丁二酸酐,反应,离心,洗涤,干燥,研磨,得到含羧基修饰的介孔二氧化硅纳米粒子;
(3)将步骤(2)获得的含羧基修饰的介孔二氧化硅纳米粒子分散,加入催化剂,搅拌,加入用于与抗DNA抗体结合的DNA溶液,反应,离心,洗涤,干燥,研磨,得到介孔二氧化硅纳米粒子负载DNA的免疫吸附剂;
步骤(1)中所述的3-氨丙基三乙氧基硅烷的用量按其与所述的介孔二氧化硅纳米粒子=1~3mL:100mg配比计算;
步骤(2)中所述的丁二酸酐的用量按其与所述的介孔二氧化硅纳米粒子=质量比1~4:1配比计算;
步骤(3)中所述的催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺中的至少一种;
所述的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量按其与所述含羧基修饰的介孔二氧化硅纳米粒子的质量比=1:1~5计算;
所述的N-羟基琥珀酰亚胺的用量按其与所述含羧基修饰的介孔二氧化硅纳米粒子的质量比=1:1~5计算;
步骤(3)中所述的DNA的质量用量按其与所述含羧基修饰的介孔二氧化硅纳米粒子的质量比=1:10~30计算;
所述的二氧化硅纳米粒子为实心二氧化硅纳米粒子时,所述的二氧化硅纳米粒子负载DNA的免疫吸附剂通过如下步骤制备得到:
(A)将实心二氧化硅纳米粒子分散在有机溶剂中,加入3-氨丙基三乙氧基硅烷,搅拌,反应,离心,洗涤,得到表面含氨基的实心二氧化硅纳米粒子;
(B)将步骤(A)得到的表面含氨基的实心二氧化硅纳米粒子分散在有机溶剂中,加入丁二酸酐,反应,离心,洗涤,干燥,研磨,得到含羧基修饰的实心二氧化硅纳米粒子;
(C)将步骤(B)得到的含羧基修饰的实心二氧化硅纳米粒子分散,加入催化剂,搅拌,加入用于与抗DNA抗体结合的DNA溶液,反应,离心,洗涤,干燥,研磨,得到实心二氧化硅纳米粒子负载DNA的免疫吸附剂;
步骤(A)中所述的3-氨丙基三乙氧基硅烷的用量按其与所述的实心二氧化硅纳米粒子=1~3mL:100mg配比计算;
步骤(B)中所述的丁二酸酐的用量按其与所述的实心二氧化硅纳米粒子=质量比1~4:1配比计算;
步骤(C)中所述的催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺中的至少一种;
所述的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量按其与所述含羧基修饰的实心二氧化硅纳米粒子的质量比=1:1~5计算;
所述的N-羟基琥珀酰亚胺的用量按其与所述含羧基修饰的实心二氧化硅纳米粒子的质量比=1:1~5计算;
步骤(C)中所述的DNA的质量用量按其与所述含羧基修饰的实心二氧化硅纳米粒子的质量比=1:10~30计算。
5.权利要求4所述的二氧化硅纳米粒子负载DNA的免疫吸附剂在制备血液净化制剂中的应用。
6.权利要求4所述的二氧化硅纳米粒子负载DNA的免疫吸附剂在制备用于治疗抗ds-DNA抗体升高导致的疾病的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的二氧化硅纳米粒子负载DNA的免疫吸附剂在制备用于治疗抗ds-DNA抗体升高导致的疾病的药物中的应用,其特征在于:所述的抗ds-DNA抗体升高导致的疾病为系统性红斑狼疮。
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