CN109288971A - 铁皮石斛叶抗增生性瘢痕应用 - Google Patents
铁皮石斛叶抗增生性瘢痕应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种铁皮石斛叶抗增生性瘢痕应用,将铁皮石斛叶提取物用于制备抗增生性瘢痕的药物和/或化妆品,通过将干燥铁皮石斛叶粗粉加18~26倍重量的热水提取1~3次,每次1h~3h,提取液浓缩至1.8~2.2g生药/mL,加乙醇至体积分数达60%~90%,混匀后4℃静置6h~12h,上清液浓缩得到有效部位,主要含黄酮和黄酮碳苷类物质。本发明的铁皮石斛叶提取物能够抑制瘢痕增生,主要通过抑制真皮成纤维细胞增殖,降低微血管密度和减少细胞外基质堆积,施用于受损皮肤,抗增生性瘢痕疗效显著,无毒副作用。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种植物药材领域的技术,具体是一种铁皮石斛叶抗增生性瘢痕应用。
背景技术
铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo),兰科石斛属多年生附生草本植物,其茎为名贵中药,味甘,性微寒,生津养胃,滋阴清热,明目强腰。
瘢痕是因剖腹产、火烧灼伤、机械性切割伤等导致的伤口愈合后皮肤组织外观形态和组织病理学改变的统称,当瘢痕生长超过一定限度,引发凸出于皮肤表面的增生性瘢痕。目前临床上常用的瘢痕修复治疗手段有手术切除治疗、激光治疗和药物治疗。相关治疗药物包括硅酮疤痕膏、MEBO润湿烧伤膏、曲安奈德注射液等。以上治疗方法存在高复发率,易产生紫斑病、间接性灼烧等问题。因此,开发疗效显著,无毒副作用的抗增生性瘢痕产品具有深远的意义和广阔的应用前景。
铁皮石斛传统药用部位为干燥茎,在炮制过程中去除包括叶在内的非药用部分,造成了铁皮石斛资源的浪费。此发明有助于减少铁皮石斛资源浪费,推动铁皮石斛资源综合利用。
发明内容
本发明针对现有药物和手术疗法治疗增生性瘢痕存在的配方复杂、疗效不佳、高复发率和副作用较多的问题,对比研究了铁皮石斛茎、叶植物部位提取物对兔耳增生性瘢痕的影响,明确了铁皮石斛叶,而非茎抑制瘢痕增生,并进一步提取有效部位,鉴定出主要化学成分,提出一种铁皮石斛叶抗增生性瘢痕应用,该技术简易可行,并实现铁皮石斛叶资源利用。通过该技术制备的铁皮石斛叶提取物,能够降低温哥华瘢痕量表评分,降低瘢痕增生指数,降低成纤维细胞密度,改善胶原分布,降低微血管密度,使瘢痕组织中总胶原含量接近正常皮肤组织,施用于受损皮肤,抗增生性瘢痕疗效显著,无毒副作用。
本发明是通过以下技术方案实现的:
本发明涉及一种铁皮石斛叶应用,将铁皮石斛叶提取物用于制备抗增生性瘢痕的药物。
所述的铁皮石斛叶提取物包括:
芹菜素-6,8-二-C-β-D-葡糖苷(C27H30O15)、芹菜素-6-C-β-D-木糖-8-C-β-D-葡萄糖苷(C26H28O14)、芹菜素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-葡萄糖苷(C26H28O14)、芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-鼠李糖苷(C27H30O14)。
所述的铁皮石斛叶提取物,采用水提醇沉法处理铁皮石斛叶提取得到,具体为:采用加热回流法处理铁皮石斛叶,将水提物浓缩后进一步加乙醇沉淀,取上清液浓缩得到。
所述的加热回流法是指:取干燥铁皮石斛叶粗粉加水加热后过滤得提取液,重复该操作1~3次,具体为:取干燥铁皮石斛叶粗粉,加入药材重量18~26倍水,提取1~3次,每次1h~3h,6层纱布过滤得提取液;提取液浓缩至1.8~2.2g生药/mL。
所述的乙醇,优选采用95%v/v浓度。
所述的乙醇,其用量为体积分数达60%~90%,混匀后4℃静置6h~12h。
所述的取上清液浓缩是指:将乙醇混合液减压抽滤后分离固形物和上清液,将上清液浓缩至0.95~1.05g生药/mL,即铁皮石斛叶提取物。
所述的抗增生性瘢痕,包括:降低温哥华瘢痕量表评分、降低瘢痕增生指数、降低成纤维细胞密度、改善胶原分布、降低微血管密度、使瘢痕组织总胶原含量接近正常皮肤组织。
所述的药物,其形式采用但不限于:精华乳、面霜、面膜等化妆品,及中药巴布剂、膜剂、中药凝胶剂、涂膜剂、中药黑膏药、中药软膏剂或中药橡胶膏等中药外用制剂。
附图说明
图1实施例2铁皮石斛叶提取物对瘢痕外观形态的影响示意图;
图中:a为模型组,b为阳性对照组,c为高剂量组,d为低剂量组;
图2为实施例2铁皮石斛叶提取物对温哥华瘢痕量表评分的影响示意图;
图中:*p<0.05,**p<0.01,与模型组比较;
图3为实施例2铁皮石斛叶提取物对瘢痕增生指数(SEI)的影响示意图;
图中:##p<0.01,与空白对照组比较;*p<0.05,**p<0.01,与模型组比较;
图4为实施例2中铁皮石斛叶提取物对瘢痕组织成纤维细胞(FBs)分布情况的影响示意图;
图中:a为空白对照组,b为模型组,c为阳性对照组,d为高剂量组,e为低剂量组;
图5为实施例2中铁皮石斛叶提取物对瘢痕组织成纤维细胞(FBs)密度的影响示意图;
图中:##p<0.01,与空白对照组比较;*p<0.05,**p<0.01,与模型组比较;
图6为实施例2中铁皮石斛叶提取物对瘢痕组织Masson染色后所呈现胶原分布影响示意图;
图中:a为空白对照组,b为模型组,c为阳性对照组,d为高剂量组,e为低剂量组;
图7为实施例2中铁皮石斛叶提取物对瘢痕组织CD34免疫组化染色结果影响示意图;
图中:a为空白对照组,b为模型组,c为阳性对照组,d为高剂量组,e为低剂量组;
图8为实施例2中铁皮石斛叶提取物对瘢痕组织CD34免疫组化染色后,所统计的微血管密度(MVD)的影响示意图;
图中:##p<0.01,与空白对照组比较;**p<0.01,与模型组比较;
图9为实施例2中铁皮石斛叶提取物对瘢痕组织中羟脯氨酸含量的影响示意图;
图中:##p<0.01,与空白对照组比较;*p<0.05,**p<0.01,与模型组比较;
图10为本发明流程示意图。
具体实施方式
本实施例通过以下方式提取得到铁皮石斛叶提取物:取干燥铁皮石斛叶粗粉,加入药材重量20倍双蒸水,提取2次,每次2h,6层纱布过滤得提取液;提取液浓缩至2g生药/mL,缓慢加入95%乙醇至乙醇体积分数达75%,搅拌混匀后4℃静置过夜;减压抽滤,分离固形物和上清液,将上清液浓缩至1g生药/mL,即得到铁皮石斛叶提取物。
所述的铁皮石斛叶提取物包括:芹菜素-6,8-二-C-β-D-葡糖苷(C27H30O15)、芹菜素-6-C-β-D-木糖-8-C-β-D-葡萄糖苷(C26H28O14)、芹菜素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-葡萄糖苷(C26H28O14)、芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-鼠李糖苷(C27H30O14)。
本实施例针对上述铁皮石斛叶提取物进行抗增生性瘢痕应用:
试验动物:日本大耳白兔12只,雌雄不限,体重2.0~2.5kg。
实施例1:积雪苷霜软膏(0.025g积雪草总苷/g药膏,阳性药)
实施例2:铁皮石斛叶提取物(1g提取物相当于1g生药,高剂量组)
实施例3:铁皮石斛叶提取物(1g提取物相当于0.5g生药,低剂量组)
检测过程:取CL级日本大耳白兔,适应性饲养48h,耳缘静脉注射戊巴比妥钠30mg/kg进行麻醉,兔耳腹侧面酒精棉、碘伏棉交替擦拭,备皮,避开肉眼可见血管,用直径10mm皮钻于每只兔耳上作6个圆形全层皮肤创口,各创口间距离不小于1cm。术后无菌纱布常规按压止血,棉签蘸涂碘伏,预防感染。造模后第二天即开始以涂抹方式给药,连续给药21天。
末次给药结束后,相机拍摄瘢痕照片。按照温哥华瘢痕量表(Vancouver scarscale)评分标准,对瘢痕进行评分,区间范围是0~15,分数越高,瘢痕增生越严重。
评分后,30mg/kg剂量腹腔注射戊巴比妥钠麻醉实验兔,待趾蹼反射消失,耳缘静脉注射空气处死实验兔。剪取整只兔耳,用电子数显千分尺测量瘢痕增生中央厚度及邻近正常组织厚度,再以瘢痕为中心向外扩约4mm,切下全层瘢痕组织。沿瘢痕最高处一分为二,一份置于4%多聚甲醛固定24h,常规石蜡包埋切片;另一份于﹣80℃冰箱保存备用。
石蜡切片H&E染色,拍摄40倍光镜下照片,Image J软件分别测量增生最高处全层瘢痕组织厚度的像素值a,邻近的正常全层皮肤厚度像素值b,a/b即为瘢痕增生指数(SEI)。
同时,400倍光镜下拍摄瘢痕中央中部、中央左侧、中央右侧照片,Image J软件分别统计各视野下成纤维细胞(FBs)数量,以三者平均值记为该组织FBs密度(个/mm2)。
石蜡切片Masson染色,200倍光镜下观察其胶原纤维分布情况。
石蜡切片CD34免疫组化染色,200倍光镜下拍摄瘢痕中央中部、中央左侧、中央右侧照片。CD34分布于哺乳动物造血祖细胞表面,采用weidner计数法对CD34阳性细胞或阳性细胞簇计数,以3张照片所记数值的平均值作为该组织微血管密度(个/mm2)。
羟脯氨酸在胶原组织中所占比例恒定,约13.4%,在弹性蛋白中比重极少,其他蛋白中不存在,因此测定Hyp含量,反映瘢痕组织中总胶原的含量。-80℃冰箱中取出皮肤组织,切下瘢痕部分,分析天平准确称得重量,将组织置于ep管中,参考南京建成羟脯氨酸(碱水解法)试剂盒说明书,进行皮肤组织羟脯氨酸(Hyp)含量测定。
数据用Mean±SD表示,采用SPSS 24.0对上述的药效学指标测定结果进行描述统计,对各组数据进行One-way ANOVA分析,P<0.05表示有显著性差异,P<0.01表示有极显著性差异。
检测数据:
①对兔耳瘢痕形态影响:铁皮石斛叶提取物对兔耳瘢痕形态的影响由图1和触诊可知,模型组瘢痕增生明显,色泽较邻近正常组织深,表面凹凸不平,瘢痕增生部分触之较硬,不易发生形变,说明模型组增生性瘢痕造模成功;阳性对照组瘢痕表面较为光滑,无明显凸起,触之较为柔软,色泽相比于模型组,接近邻近正常组织;石斛叶提取物高剂量组瘢痕易发生形变,与积雪苷霜软膏组比较,仅表面光泽感较差;石斛叶提取物低剂量组瘢痕表面可见凸起,触之较为柔软,瘢痕中央着色略深。该结果表明,铁皮石斛叶提取物可明显改善兔耳瘢痕形态。
②对温哥华瘢痕量表评分的影响:根据表1评分标准对各实验组瘢痕进行评分,结果见图2。模型组平均分大于6,相比于模型组,铁皮石斛叶提取物高剂量组评分极显著降低(P<0.01),低剂量组评分显著降低(P<0.05)。
表1温哥华瘢痕量表评分标准(Vancouver scar scale scores)
③对瘢痕增生指数的影响:铁皮石斛叶提取物对兔耳瘢痕增生指数(SEI)的影响见图3。空白对照组无瘢痕增生,SEI为1,模型组瘢痕SEI均值大于3,说明模型组增生性瘢痕造模成功;铁皮石斛叶提取物高剂量极显著降低瘢痕组织SEI(P<0.01),低剂量则具有显著降低瘢痕组织SEI的作用(P<0.05),说明铁皮石斛叶提取物具有抑制瘢痕增生的作用,高剂量抑制效果与阳性药接近。
④对成纤维细胞密度的影响:实验各组瘢痕组织石蜡切片HE染色效果图见图4,成纤维细胞(FBs)细胞核呈蓝紫色。模型组FBs密度明显高于空白对照组,铁皮石斛叶提取物高剂量组FBs密度明显小于模型组。
实验各组成纤维细胞密度统计结果见图5。与空白对照组相比,模型组成纤维细胞密度极显著升高(P<0.01),说明模型组造模成功;积雪苷霜软膏组、铁皮石斛叶提取物高、低剂量组成纤维细胞密度均较模型组显著性降低,其中,铁皮石斛叶提取物高、低剂量组呈现一定的量效关系,随着剂量升高,瘢痕组织中FBs密度减小,对瘢痕组织中FBs增殖的抑制作用增强。该结果表明,铁皮石斛叶提取物抗瘢痕增生与抑制真皮层成纤维细胞过量增殖有关。
由图6可知,与空白对照组相比,模型组表皮层乳状凸起增多,真皮层胶原纤维束排布无序,纤维束间无可见间隙;铁皮石斛叶提取物高剂量组胶原纤维束间隙较为分明,胶原密度高;铁皮石斛叶提取物低剂量组胶原束排布秩序较模型组有所改善,表皮层乳状凸起较少。表明铁皮石斛叶提取物具有使瘢痕真皮层胶原纤维排布趋于有序的作用。
铁皮石斛叶提取物对兔耳瘢痕组织微血管密度影响见图7和图8。从图7可看出,空白对照组染色较浅,阳性细胞或细胞簇数量较少,模型组染色较深,阳性细胞或细胞簇密布;铁皮石斛叶提取物高剂量组微血管分布明显少于模型组;低剂量组阳性细胞或阳性细胞簇比高剂量组稍多。根据各组微血管密度统计结果(图8),实验各组按密度由大到小排序:模型组>阳性对照组≈铁皮石斛叶提取物低剂量组>铁皮石斛叶提取物高剂量组>空白对照组,说明铁皮石斛叶提取物具有抑制瘢痕组织微血管大量增生,延缓瘢痕增生进程的作用。
由图9可知,模型组羟脯氨酸(Hyp)含量极显著高于空白对照组(P<0.01),说明增生性瘢痕组织中存在大量异常的胶原堆积。铁皮石斛叶提取物高剂量具有极显著降低瘢痕组织中Hyp含量的作用(P<0.01),低剂量显著降低瘢痕组织中Hyp含量(P<0.05)。表明铁皮石斛叶提取物参与胶原生成和代谢相关过程,体现出抑制瘢痕组织中胶原堆积,抗瘢痕增生的新功效。
上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整,本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限,在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。
Claims (7)
1.一种铁皮石斛叶应用,其特征在于,将铁皮石斛叶提取物用于制备抗增生性瘢痕的药物;
所述的铁皮石斛叶提取物,采用水提醇沉法处理铁皮石斛叶提取得到;
所述的铁皮石斛叶提取物包括:芹菜素-6,8-二-C-β-D-葡糖苷(C27H30O15)、芹菜素-6-C-β-D-木糖-8-C-β-D-葡萄糖苷(C26H28O14)、芹菜素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-葡萄糖苷(C26H28O14)、芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-鼠李糖苷(C27H30O14)。
所述的药物中铁皮石斛叶提取物的含量为70%以上。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征是,所述的铁皮石斛叶提取物,采用加热回流法处理铁皮石斛叶,将水提物浓缩后进一步加乙醇沉淀,取上清液浓缩得到。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征是,所述的加热回流法是指:取干燥铁皮石斛叶粗粉加水加热后过滤得提取液,重复该操作1~3次,具体为:取干燥铁皮石斛叶粗粉,加入药材重量18~26倍水,提取1~3次,每次1h~3h,6层纱布过滤得提取液;提取液浓缩至1.8~2.2g生药/mL。
4.根据权利要求2所述的应用,其特征是,所述的乙醇,其用量为体积分数达60%~90%,混匀后4℃静置6h~12h。
5.根据权利要求2所述的应用,其特征是,所述的取上清液浓缩是指:将乙醇混合液减压抽滤后分离固形物和上清液,将上清液浓缩至0.95~1.05g生药/mL,即铁皮石斛叶提取物。
6.根据权利要求1所述的应用,其特征是,所述的抗增生性瘢痕,包括:降低温哥华瘢痕量表评分、降低瘢痕增生指数、降低成纤维细胞密度、改善胶原分布、降低微血管密度、使瘢痕组织总胶原含量接近正常皮肤组织。
7.根据权利要求1所述的应用,其特征是,所述的药物,其形式采用:精华乳、面霜、面膜、中药巴布剂、膜剂、中药凝胶剂、涂膜剂、中药黑膏药、中药软膏剂或中药橡胶膏。
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