CN109276559A - 一种生物合成银纳米颗粒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物合成银纳米颗粒的制备方法。本发明还公开了一种载microRNA的生物合成银纳米颗粒的制备方法。本发明还公开了一种载microRNA的生物合成银纳米颗粒在制备靶向诱导耐药肝癌细胞凋亡的纳米药物递送系统方面的应用。本发明还公开了一种靶向诱导耐药肝癌细胞凋亡的纳米药物递送系统。本发明的药物递送系统通过生物体组织来合成纳米材料,从而提高了材料的生物相容性;通过负载非化疗药物的microRNA而降低毒副作用、避免多药耐药,从而提高对耐药肝癌的治疗效果。并且,该药物递送系统还具有靶向、控释、可视化的优点,可实现耐药肝癌的诊疗一体化。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,具体为一种生物合成银纳米颗粒的制备方法。
背景技术
纳米药物载体在肿瘤诊疗领域的应用日渐被关注。然而,不能回避的问题是,为了集诸个功能于某种载体一身,纳米药物载体必然经过了复杂的合成与修饰过程,这不仅使技术上的难度大大增加,其功能上的兼容性也定然受到影响。故此,需根据肿瘤特点,构建具有生物相容性、药物控释、避免耐药、肿瘤靶向性及可视化的纳米药物载体,尝试解决上述难点并兼顾合成步骤的简化。
目前各种纳米药物载体的构建方案,一般包括:①合成纳米材料→②在材料表面包裹相应分子以实现生物相容→③继续在材料表面交联特异性分子以实现肿瘤靶向→④负载抗肿瘤药物。上述四步骤的顺序在实际操作过程中会有所调换,但基本上都要经过。所有步骤、参数均需考虑和优化,无疑将大大增加技术的难度,也必将影响各个功能的相互兼容,尤其影响载体的生物相容性。毫无疑问,针对纳米载体表面进行修饰以增加生物相容性,是纳米药物载体能够实际应用于临床肿瘤治疗的基础。目前,增加纳米药物载体生物相容性主要有以下三种思路。第一、利用多聚化合物修饰纳米载体。例如:聚乙二醇PEG常被用来包覆毒性较高的纳米载体以降低其细胞毒性、提高生物相容性与生物可降解性;同时,带有PEG活性基团的纳米载体表面可以连接诸如抗体、蛋白质、核酸等生物大分子,从而实现载药和肿瘤靶向;更进一步的,对多聚化合物表面基团进行修饰,还可能实现pH和温度等方式的智能释药性能。然而,化学修饰纳米载体的步骤繁琐,且相对于生物体本身,其生物相容性仍有相当的局限性。
第二、利用生物体的自身成分修饰纳米载体。例如:以红细胞、血小板、白细胞、癌细胞和干细胞各种细胞膜,甚至不同种类的融合细胞膜,作为原料修饰纳米载体表面,使其生物相容性与生物可降解性更加优越;并且,细胞膜可避免被自身免疫细胞所识别而清除,从而在生物体内有更长的循环时间、更加稳定;另外,利用基因编辑技术改造细胞膜,其肿瘤靶向性更是得以大大提高。然而,其不足之处在于,当血型不相匹配、细胞膜包裹被外翻或细胞膜边缘外翻时,此类纳米载体会诱发一定的免疫反应;并且,就大多数细胞膜而言,其本身的靶向性较弱,需另外连接靶向分子或基因改造才能实现肿瘤靶向性。
第三、直接利用“生物反应器”合成纳米载体。生物合成纳米材料较早起源于Green等科学家在《Nature》杂志上发表的文献:将蚯蚓暴露于CdCl2和Na2TeO3盐环境下,从蚯蚓肠道组织中可分离出碲化镉量子点,用于巨噬细胞成像。由此开辟了纳米材料生物合成的新兴领域。随后,众多科学家分别以细菌、真菌、植物细胞、动物细胞等作为“生物反应器”,合成了硫化镉量子点、硒化镉量子点、氧化铁颗粒、铂颗粒等一系列纳米材料,并成功用于疾病诊疗。但是,体外生物合成纳米材料的不足之处在于——所使用的生物反应器均是细胞,关于合成机理的了解不够深入,不利于后续的应用研究;在体外利用非自身来源的细胞作为生物反应器合成的产物,临床实际使用将存在免疫原性、甚至伦理学问题,需要改进。
在生物治疗领域,除了传统的核酸制剂、蛋白制剂,microRNA(miRNAs)的作用日益受到关注。miRNAs是一类长度为18-25个核苷酸的单链非编码RNA,广泛存在于真核生物中,自其1993年在秀丽隐杆线虫中被发现以来,作为基因调节的新工具迅速进入医学界各领域研究工作者的视野,也在肿瘤预测、分型、治疗、药敏、预后等方面的研究中掀起了一轮轮热潮,大大丰富了肿瘤的生物学知识。作为上游调节分子,miRNAs能调控肿瘤发生/进展/转移/耐药相关的一系列基因,是极具潜力的抗肿瘤药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物合成银纳米颗粒的制备方法,以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:一种生物合成银纳米颗粒的制备方法,包括以下步骤:S1:构建了耐药肝癌的裸鼠模型;
S2:从其血液中分离T细胞并与硝酸银溶液共培养;
S3:再利用超高速梯度离心和HPLC进行分离纯化而获得了银纳米颗粒,该银纳米颗粒具有近红外荧光特性的,表面吸附有分子质量为66547的血清白蛋白。
优选的,一种载microRNA的生物合成银纳米颗粒的制备,包括以下步骤:
S1:由于生物合成银纳米颗粒表面已包裹有SA,故可利用还原剂将SA中的二硫键打开,使其呈开放状态;
S2:通过控速搅拌将microRNA包埋于其中;
S3:继而经过超高速分离将载microRNA的银纳米颗粒沉淀、弃上清、加水重悬,在低浓度还原剂的水中,SA中的二硫键自动闭合,microRNA即被包裹;而当该载microRNA银纳米颗粒处于高浓度GSH环境时,SA中的二硫键将自动开放并释放药物。
优选的,一种载miR-122的生物合成银纳米颗粒的制备,包括以下步骤:
S1:利用还原剂谷胱甘肽将SA中的二硫键打开,使其呈开放状态;
S2:通过控速搅拌将miR-122包埋于其中;
S3:继而经过超高速分离将载miR-122的银纳米颗粒沉淀、弃上清、加水重悬,在此低浓度GSH的条件下,SA中的二硫键自动闭合,miR-122即被包裹;而当该载miR-122银纳米颗粒处于肝癌细胞内高浓度GSH环境时,SA中的二硫键将自动开放并释放miR-122。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
1.采用生物体的组织来合成纳米材料,再将合成的该纳米材料应用于此生物体中,从而可达到最低的免疫原性与最高的生物相容性;
2.以T细胞作为“生物反应器”,我们合成了具有良好生物相容性与肿瘤靶向性、兼具可视化潜能的银纳米颗粒,应用研究显示该银纳米颗粒具备负载microRNA、控制释放、靶向治疗肿瘤的性能;
3.利用生物合成的银纳米颗粒负载microRNA,仅通过自体合成和药物修饰两个步骤即构建了针对耐药肿瘤细胞的、具有良好的生物相容性、药物控释、肿瘤靶向性、克服耐药、可视化等优点合一的载药系统,合成步骤得到了大大简化,同时提高了合成效率,有望为肿瘤治疗的药物载体研发提供新契机。
附图说明
图1为利用HPLC分析生物合成银纳米颗粒的特征峰图,从而利用该条件分离纯化均一的银纳米颗粒。
图2为生物合成银纳米颗粒的表征图。图2A为生物合成银纳米颗粒的生物透射电镜图;图2B为生物合成银纳米颗粒的高分辨透射电镜图;图2C为生物合成银纳米颗粒的元素分析图;图2D为生物合成银纳米颗粒紫外吸收光谱图;图2E为生物合成银纳米颗粒荧光发射光谱图。
图3为生物合成银纳米颗粒载miR-122靶向治疗肝癌的效果图。图3A为不同处理方式对于裸鼠移植瘤体积大小的影响:1)对照组(尾静脉注射生理盐水);2)尾静脉注射1mg/kg的miR-122;3)尾静脉注射10 mg/kg 载有miR-122的商品化银纳米颗粒;4)尾静脉注射10mg/kg 载有miR-122的生物合成银纳米颗粒。图3B为不同处理方式对于裸鼠移植瘤凋亡的影响:1)对照组(尾静脉注射生理盐水);2)尾静脉注射1mg/kg的miR-122;3)尾静脉注射10mg/kg 载有miR-122的商品化银纳米颗粒;4)尾静脉注射10 mg/kg 载有miR-122的生物合成银纳米颗粒。
具体实施方式
下面将请参阅图1至图3并结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例一
本发明提供一种技术方案:一种生物合成银纳米颗粒的制备方法,包括以下步骤:
S1:将107个HepG2细胞从裸鼠的腹沟处进针注入裸鼠体内,构建了耐药肝癌的裸鼠模型;
S2:从其0.5mL的血液中分离T细胞,并在10mL的培养基中扩大培养;
S3:将105个细胞与0.1mg硝酸银在10mL的培养基中共培养,再利用超高速梯度离心(100000g)和HPLC(流速0.1mL/min,C18柱)进行分离纯化而获得了银纳米颗粒,该银纳米颗粒具有近红外荧光特性的,表面吸附有分子质量为66547的血清白蛋白(Serum albumin,SA)。
实施例二
本发明提供一种技术方案:一种载microRNA的生物合成银纳米颗粒的制备,包括以下步骤:
S1:由于生物合成银纳米颗粒表面已包裹有SA,故可利用还原剂将SA中的二硫键打开,使其呈开放状态;
S2:通过控速搅拌将microRNA包埋于其中;
S3:继而经过超高速分离将载microRNA的银纳米颗粒沉淀、弃上清、加水重悬,在低浓度还原剂的水中,SA中的二硫键自动闭合,microRNA即被包裹;而当该载microRNA银纳米颗粒处于高浓度GSH环境时,SA中的二硫键将自动开放并释放药物。
其中,对生物合成银纳米颗粒进行表征,以生物透射电镜观察生物合成银纳米颗粒的尺寸约为30nm;以高分辨透射电镜观察生物合成银纳米颗粒的核心银颗粒尺寸约为6nm,晶格为0.24 nm;以EDS分析生物合成银纳米颗粒的元素组成;以紫外光谱仪分析生物合成银纳米颗粒的光谱性质;以荧光光谱仪观察生物合成银纳米颗粒的近红外荧光特性。
实施例三
本发明提供一种技术方案:一种载miR-122的生物合成银纳米颗粒的制备,包括以下步骤:
S1:利用还原剂谷胱甘肽将SA中的二硫键打开,使其呈开放状态;
S2:通过控速搅拌将miR-122包埋于其中;
S3:继而经过超高速分离将载miR-122的银纳米颗粒沉淀、弃上清、加水重悬,在此低浓度GSH的条件下,SA中的二硫键自动闭合,miR-122即被包裹;而当该载miR-122银纳米颗粒处于肝癌细胞内高浓度GSH环境时,SA中的二硫键将自动开放并释放miR-122。
其中,在四周龄裸鼠皮下种植HepG2细胞,尾静脉注射载miR-122的生物合成银纳米颗粒至成瘤裸鼠,1)对照组(尾静脉注射生理盐水);2)尾静脉注射10 mg/kg的miR-122;3)尾静脉注射10 mg/kg 载有miR-122的商品化银纳米颗粒;4)尾静脉注射10 mg/kg 载有miR-122的生物合成银纳米颗粒,它们的肿瘤体积分别为3800 mm3、2900 mm3、2700 mm3、1300 mm3,结果说明经过载miR-122的生物合成银纳米颗粒处理荷瘤裸鼠的肿瘤体积明显减小,表明其具有明显的抑制肿瘤作用。对上述四组裸鼠肿瘤细胞进行凋亡检测,1)对照组(尾静脉注射生理盐水);2)尾静脉注射10 mg/kg的miR-122;3)尾静脉注射10 mg/kg 载有miR-122的商品化银纳米颗粒;4)尾静脉注射10 mg/kg 载有miR-122的生物合成银纳米颗粒,它们的肿瘤细胞凋亡率分别为9%、25%、37%、68%,结果说明经过载miR-122的生物合成银纳米颗粒处理荷瘤裸鼠,显著诱导了肿瘤细胞的凋亡。
上述三组实施例分别制备出生物合成银纳米颗粒、载microRNA的生物合成银纳米颗粒和载miR-122的生物合成银纳米颗粒,其中实施例三制得的载miR-122的生物合成银纳米颗粒相比其他两组实施例制得的生物合成银纳米颗粒和载microRNA的生物合成银纳米颗粒,显著诱导了肿瘤细胞的凋亡。
本发明的优点是:采用生物体的组织来合成纳米材料,再将合成的该纳米材料应用于此生物体中,从而可达到最低的免疫原性与最高的生物相容性;
以T细胞作为“生物反应器”,我们合成了具有良好生物相容性与肿瘤靶向性、兼具可视化潜能的银纳米颗粒,应用研究显示该银纳米颗粒具备负载microRNA、控制释放、靶向治疗肿瘤的性能;
利用生物合成的银纳米颗粒负载microRNA,仅通过自体合成和药物修饰两个步骤即构建了针对耐药肿瘤细胞的、具有良好的生物相容性、药物控释、肿瘤靶向性、克服耐药、可视化等优点合一的载药系统,合成步骤得到了大大简化,同时提高了合成效率,有望为肿瘤治疗的药物载体研发提供新契机。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (3)
1.一种生物合成银纳米颗粒的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1:构建了耐药肝癌的裸鼠模型;
S2:从其血液中分离T细胞并与硝酸银溶液共培养;
S3:再利用超高速梯度离心和HPLC进行分离纯化而获得了银纳米颗粒,该银纳米颗粒具有近红外荧光特性的,表面吸附有分子质量为66547的血清白蛋白。
2.一种由权利要求1所述的一种载microRNA的生物合成银纳米颗粒的制备,其特征在于:包括以下步骤:
S1:由于生物合成银纳米颗粒表面已包裹有SA,故可利用还原剂将SA中的二硫键打开,使其呈开放状态;
S2:通过控速搅拌将microRNA包埋于其中;
S3:继而经过超高速分离将载microRNA的银纳米颗粒沉淀、弃上清、加水重悬,在低浓度还原剂的水中,SA中的二硫键自动闭合,microRNA即被包裹;而当该载microRNA银纳米颗粒处于高浓度GSH环境时,SA中的二硫键将自动开放并释放药物。
3.一种由权利要求2所述的一种载miR-122的生物合成银纳米颗粒的制备,其特征在于:包括以下步骤:
S1:利用还原剂谷胱甘肽将SA中的二硫键打开,使其呈开放状态;
S2:通过控速搅拌将miR-122包埋于其中;
S3:继而经过超高速分离将载miR-122的银纳米颗粒沉淀、弃上清、加水重悬,在此低浓度GSH的条件下,SA中的二硫键自动闭合,miR-122即被包裹;而当该载miR-122银纳米颗粒处于肝癌细胞内高浓度GSH环境时,SA中的二硫键将自动开放并释放miR-122。
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