CN114796271B - 一种治疗口腔癌的miR-181a-5p纳米复合物及制备方法、应用 - Google Patents

一种治疗口腔癌的miR-181a-5p纳米复合物及制备方法、应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种治疗口腔癌的miR‑181a‑5p纳米复合物及制备方法、应用；本发明选用聚乙烯亚胺修饰的银纳米颗粒，由于细胞转染时一般需要使用无双抗的培养基，而纳米银本身就具有一定的抑菌作用，能在转染时有效地降低细胞被污染的风险，因而在使用该纳米载体时操作更加简洁方便，安全有效，可提升实验效率。此外，聚乙烯亚胺修饰的纳米银复合物具有一定的pH响应性，能够显著提高纳米药物对肿瘤部位的靶向及基因序列的释放效率，更便于体内、外抗肿瘤机制的研究。本发明利用该纳米载体递送具有口腔癌抑制功能的miR‑181a‑5p，能够在显著提高miR‑181a‑5p mimics的血清稳定性和RNA酶稳定性的同时提高miR‑181a‑5p在细胞中的表达量，从而有效抑制口腔癌细胞的增殖、迁移及侵袭等恶性行为。

Description

一种治疗口腔癌的miR-181a-5p纳米复合物及制备方法、应用
技术领域
本发明属于医药领域；尤其涉及一种治疗口腔癌的miR-181a-5p纳米复合物及制备方法、应用。
背景技术
口腔癌是一种全球性的恶性肿瘤；每年癌症相关的死亡例数中有40万例是口腔癌导致的。同时，口腔鳞状细胞癌的发生率也在逐年增加，并且逐年趋于年轻化。近年来，尽管临床治疗和诊断技术已取得了较大的进步，但是患者的5年生存率和生存质量并没有得到明显改善。与此同时，口腔癌的临床治疗仍会严重影响患者的语言表达、咀嚼吞咽、还可能引发牙齿健康和社会交往能力缺损等功能性疾病，甚至严重影响患者的面部整体形象；而且由于大众普遍对口腔卫生的忽视，导致在患者自身觉得应该去医院检查的时候，就已经病变达到了恶性癌症的阶段。
目前，临床上对于口腔癌的治疗主要有手术治疗以及放化疗、近几年国外更多的采用联合化疗方案。但是，这些治疗方案具有并发症较多、复发率及远处转移率较高、存在多药耐药等现象以及严重的不良反应和并发症等缺点。随着近年来研究手段的不断进步，基因靶向治疗逐渐成为肿瘤综合治疗策略中的重要组成部分。但是，口腔癌的单一治疗方式，临床疗效有限，所以近年来研究的热点主要集中在进行各种方案的综合治疗以提高临床疗效。
纳米材料，又被称为超微颗粒材料，其大小介于1-100nm之间，具有诸如量子尺寸效应、自组装效应、表面效应、宏观量子隧道效应等异于本体材料的独特性质。已在纳米医学、药物输送、化妆品、电子、能源、环境保护、化学催化等多个领域迅猛发展，逐渐成为材料、化学、生物等学科的交叉前沿研究方向。纳米材料与生物医药相结合产生的纳米医药为癌症的诊疗提供了新的方法。由于实体瘤的高通透性和滞留效应(EPR效应)的存在使得纳米药物能够有效的靶向并提高药物的利用率和转染效率，同时将药物大量募集到肿瘤组织也可以增加药效并减少系统副作用。基于以上诸多的优势，纳米材料有望在新型原癌早期诊断工具的开发以及选择性靶向杀伤肿瘤细胞治疗方法的建立等方面发挥关键作用。其中纳米银作为金属纳米材料家族的重要一员，已经被证实在多种疾病中均有着良好的治疗效果。同时，纳米银材料与普通银相比，其性能更加稳定，因此在化工、医学和生物等众多领域得到了大量应用。
在癌症治疗领域，纳米银不需要外部载体即可进入癌细胞，同时可诱导产生活性氧并释放乳酸脱氢酶，可诱导细胞周期失调、凋亡相关基因上调、微核形成、染色体畸变以及DNA损伤等途径对癌细胞产生毒性，从而抑制其增殖并诱导凋亡。与传统的化学抗癌药物相比，纳米药物特别是纳米银生物相容性好，合成时形状和尺寸能够得到较好的控制，抗癌效果更佳。相关研究表明，纳米银对肺鳞癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌等癌症均具有良好的治疗效果。同时，能够搭载其他药物的纳米银比单一的纳米银具有更高的抗癌活性，其在低剂量时就具有较高的抗癌潜力。而传统的脂质体受限于其自身的局限性，在实施体内治疗时具有稳定性差、不能较好的保护所负载的药物、无靶向性及滞留聚集效应等，故而很难应用于体内治疗中。由于纳米药物所特有的高靶向性、专一性及滞留效应等，使得纳米银作为纳米载体时相较于传统的脂质体具有独特的优势，在实施体内治疗时利用其特性可以将负载的药物顺利的载入肿瘤部位。此外，聚乙烯亚胺修饰的纳米银复合物具有一定的pH响应性，能够显著提高纳米药物对肿瘤部位的靶向及基因序列的释放效率，更便于体内、外抗肿瘤机制的研究。纳米银的抗癌活性，已经在大量的实验中得到了证实，但是其对口腔癌的治疗和预防作用我们仍然知之甚少。
由于纳米银容易进入靶细胞，并且在癌细胞中富集，加之其本身所固有的抗癌活性而被视为是有效的药物输送系统。国外的一项研究发现，负载BBR的AgNPs复合物对MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞系表现出剂量依赖性的细胞毒性。由于纳米银本身就具有较强的抗肿瘤效果，因而使用其作为载体时往往会具有协同抗癌作用，对癌症的治疗产生单一药物难以企及的效果。此外，我们在体外利用脂质体等传统载体实施转染时，为了防止抗生素对脂质体的无差别攻击，需要使用无双抗的培养基来作为转染时的介质。而我们的纳米银由于其自身就具有良好的抗菌功效，即使在转染时不在介质中加入抗生素也依然能够达到很好的抑菌效果。因而相比于传统的脂质体转染，利用纳米银来作为搭载的载体能够有效的降低细胞在转染过程中被污染的风险。
人类基因组中非编码RNA的发现是后基因组测序时代的重要突破，其中微小RNA(miRNA)，是由前体miRNA的茎环区域产生的长约20-25nt的内源性、小非编码RNA；它主要通过与靶基因mRNA的3’非翻译区结合来调控其翻译水平。同时，单个mRNA也可以被一个或几个miRNA调节。近来，越来越多的证据表明，miRNA在诸多人类恶性肿瘤的形成中起关键调控作用，其可通过参与多种疾病相关的信号通路来调节细胞的浸润、增殖、凋亡、侵袭、迁移、以及细胞周期等生命活动。因此miRNA也常常被称为是“癌症的起因或指示剂”。同时，一些研究发现在口腔癌中显著差异表达的miRNA参与口腔癌的各种生理和病理过程。
课题组在前期应用DMBA诱导法建立了中国地鼠口腔癌变过程中四个阶段的动物模型，对各阶段的病变组织进行测序及生物信息学分析后，发现miR-181a-5p的表达在单纯增生组、异常增生组及鳞癌组中逐渐降低，直至鳞癌阶段时表达量达到最低。在miRbase数据库中搜索后，发现miR-181a-5p在哺乳动物中是高度保守的。随后对其表达进行验证后发现，其在动物模型、人口腔癌组织以及人口腔癌细胞系中均显著下调表达。经过进一步文献的查阅发现，miR-181a-5p是最近新发现的一个miRNA，为pre-miR-181a的剪接体之一，其在癌症中所发挥作用的研究相对较少，在口腔癌中所扮演的角色更是鲜有报道。在细胞水平进行的功能验证实验发现，在两种口腔癌细胞系中显著高表达miR-181a-5p后，细胞系的细胞增殖、迁移、侵袭及平板克隆能力显著被抑制，同时细胞周期受到一定程度的阻滞，而凋亡能力显著提高。在miR-181a-5p抑制物组中可观察到完全相反的结果。
前期结果充分表明miR-181a-5p可能在口腔癌中扮演着抑癌基因的角色，虽然目前采用了多种技术对miRNA与多种肿瘤的关系进行了验证，但仍缺乏miR-181a-5p在口腔鳞癌中参与调控信号通路、具体调控机制以及是否可以通过将miR-181a-5p与其它新型抗癌药物结合起来而起到药物治疗与基因治疗的双重作用等方面的研究。同时，目前将miRNA实际用于临床治疗仍面临着诸多的问题，传统脂质体的转染方法有着毒性大、效率低、无专一性及靶向效应、不易在体内实施转染等缺点，严重阻碍着miRNA靶向治疗的临床应用。此外，由于纳米银本身就具有一定的抗肿瘤及抑菌作用，加之其特有的对体内肿瘤的特异靶向效应以及EPR效应，使得其在体内、外应用时相比于传统载体具有更优异的药物传送、保护及靶向等优势。因而，选用纳米银作为载体来搭载miR-181a-5p有望同时发挥纳米治疗及基因治疗的共同优势，产生联合治疗的疗效。
发明内容
本发明的目的是提供了一种治疗口腔癌的miR-181a-5p纳米复合物及制备方法、应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明涉及一种治疗口腔癌的miR-181a-5p纳米复合物，由银纳米颗粒和双链核苷酸制备而成。
第二方面，本发明还涉及前述的治疗口腔癌的miR-181a-5p纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)在小烧杯中加入8ml超纯水后再加入2ml 5umol/L的枝化聚乙烯亚胺(PEI25K)，在室温条件下，于IKA的big-squid磁力搅拌器上，选用中档转速搅拌至均匀；
(2)向小烧杯中逐滴加入50ul 0.1mol/L的AgNO3后(使得AgNO3和PEI二者的摩尔比为AgNO3:PEI＝1:2)，用新鲜的保鲜膜封口；
(3)在避光条件下室温、中档转速搅拌2h后，使用由超纯水1:2稀释以后的冰乙酸调节上述体系pH至4，体系的pH值由雷磁的PHS-3E型pH计来测定，检测时严格按照仪器所附带的检测步骤进行；
(4)继续在中档转速搅拌的条件下，逐滴加入9ml 0.01mol/L的抗坏血酸(AA)，使得AgNO3和AA的摩尔比为：AgNO3:AA＝1:18；
(5)根据各原料的用量，补充超纯水，使体系总体积为20ml；
(6)继续使用新鲜保鲜膜封口后，在365nm的紫外光照射下，继续于室温下在IKA的big-squid磁力搅拌器上于中档转速下，持续搅拌6h；
(7)将整个合成后的体系转入10cm2的玻璃培养皿中，随后将其置于101-1S型的电热恒温鼓风干燥箱中，打开鼓风功能，并调节温度至45-55℃，烘干8-16h；
(8)使用移液枪准确加20ml超纯水于上述玻璃培养皿中，缓慢吹打混匀至无肉眼可见的颗粒物后，于超声仪上超声20-30分钟，得到纯净的纳米银溶液；
(9)将所得纯净的纳米银溶液用超纯水稀释20倍后，备用；
(10)将装有miR-181a-5p mimics粉末的离心管在sigma的3-18K型离心机上4℃，3600rpm离心15分钟后小心取出，按照每1OD双链mimics加入125μL DEPC水的比例进行配置，使用移液枪向离心管中加入适量的DEPC水后，轻轻吹打混匀20–30次，将miR-181a-5pmimics粉末配置成20μM的溶液后，备用；
(11)将稀释后的纳米银溶液、miR-181a-5p mimics溶液按照摩尔比例为(1-10):(1-8)量取，备用；
(12)先将纳米银溶液加入到离心管中，再加入miR-181a-5p溶液，随后，用移液枪反复轻轻吹打混匀40-50次；
(13)室温静置20-30分钟，静置后，即得治疗口腔癌的miR-181a-5p纳米复合物。
第三方面，本发明还涉及前述miR-181a-5p纳米复合物的应用，该miR-181a-5p纳米复合物用于制备治疗口腔癌药物的应用。
将治疗口腔癌的miR-181a-5p纳米复合物转染多种细胞系以检测转染效率，通过检测miR-181a-5p的靶基因的表达、对口腔癌细胞增殖、集落、迁移、侵袭等细胞行为学功能验证该复合物对抑制口腔鳞癌发生发展所起到的关键作用和调控机制，从非编码RNA的基因表达调控和纳米药物治疗方面为抑制及治疗口腔癌的形成和发展，提供分子作用机制等方面的基础资料。
该纳米载体中的聚乙烯亚胺具有一定的pH响应性，能够显著提高纳米药物对肿瘤部位靶向及药物释放效率，可用于体外抗肿瘤机制实验等。利用该纳米载体递送具有口腔癌抑制功能的miR-181a-5p(miR-181a-5p mimics)模拟物，能够显著提高miR-181a-5pmimics的血清稳定性和RNA酶稳定性，可以有效抑制癌细胞的增殖、迁移及侵袭等，能够显著抑制口腔癌细胞的生长。本发明成本低，方法简单，条件温和，易于操作，能充分利用纳米药物的EPR效应，具有显著口腔肿瘤细胞杀伤效果，具有良好的应用前景。
本发明具有以下优点：本发明选用聚乙烯亚胺修饰的银纳米颗粒(AgNC-PEI)，作为载体来递送具有口腔癌抑制功能的miR-181a-5p(miR-181a-5p mimics)模拟物，能显著提高体外细胞内机制研究的便捷性和可靠性，由于细胞转染时一般需要使用无双抗培养基，而纳米银本身就具有一定的抑菌作用，在转染时也可有效的降低细胞被污染的风险，因而在使用该纳米载体时操作更加简洁方便，安全有效，可提升实验效率。而且，聚乙烯亚胺修饰的纳米银复合物具有一定的pH响应性，能够显著提高纳米药物对肿瘤部位的靶向及基因序列的释放效率，更便于体外抗肿瘤机制的研究。同时，由于纳米药物所特有的高靶向性、专一性及滞留效应等，使得纳米银作为纳米载体时相较于传统的脂质体具有独特的优势，在实施体内治疗时利用其特有的性质，可以将负载的药物顺利的载入肿瘤部位。此外，由于纳米银本身就具有一定的抗肿瘤及抑菌作用，加之其特有的对体内肿瘤的特异靶向效应以及EPR效应，使得其在体内、外应用时相比于传统载体具有更优异的药物传送、保护及靶向等优势。因而，选用纳米银作为载体来搭载miR-181a-5p有望同时发挥纳米治疗及基因治疗的共同优势，产生联合治疗的疗效。
本发明中的miR-181a-5p纳米复合物具有良好的药物学特性，该复合物无需外源转染试剂的帮助就能顺利进入细胞，并显著提高miR-181a-5p的血清稳定性和RNA酶稳定性，同时还能够显著提高口腔癌中miR-181a-5p基因的表达量，可通过上调miR-181a-5p的表达，来抑制癌细胞的增殖，迁移，侵袭以及集落形成等，有效地抑制口腔癌的恶性行为。本发明所制备的miR-181a-5p纳米复合物在口腔癌的治疗应用和分子调控机制研究等方面有显著有益效果。本发明成本低，方法简单，条件温和，易于操作，能充分利用纳米药物的EPR效应，具有显著口腔肿瘤细胞杀伤效果，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是最佳合成条件下纳米银的吸光度曲线图；
图2是在自然光条件下各种原料分装于1.5ml的离心管的光照图；
图3是365nm的紫外灯下照射下各原料分装于1.5ml的离心管的照片图；
图4是合成后小烧杯中于采集365nm的紫外光下，采集照片图；
图5是各原料在曝光仪中的明场条件下的照片图；
图6是是各原料在曝光仪的曝光条件下的照片图；
图7是透射电子显微镜观察纳米银结构分布图；
图8是Zeta电位及纳米粒度分析(DLS)表征图；
图9是X射线衍射-XRD表征图；
图10是琼脂糖凝胶电泳测试搭载效果图；
图11是纳米银簇与miR-181a-5p复合物(AgNCs/miR-181a-5p)的RNA酶稳定性表征效果图；
图12是纳米银簇与miR-181a-5p复合物(AgNCs/miR-181a-5p)各组在血清(FBS)中孵育2h结果图；
图13是纳米银簇与miR-181a-5p复合物(AgNCs/miR-181a-5p)各组在血清(FBS)中孵育4h结果图；
图14是纳米银簇与miR-181a-5p复合物(AgNCs/miR-181a-5p)各组在血清(FBS)中孵育6h结果图；
图15是纳米银簇与miR-181a-5p复合物(AgNCs/miR-181a-5p)各组在血清(FBS)中孵育8h结果图；
图16是纳米银簇与miR-181a-5p复合物(AgNCs/miR-181a-5p)各组在血清(FBS)中孵育12h结果图；
图17是纳米银簇与miR-181a-5p复合物(AgNCs/miR-181a-5p)各组在血清(FBS)中孵育24h结果图；
图18是miRNA定量反应程序图；
图19是细胞HN6转染效率分布图；
图20是细胞SCC-25转染效率分布图；
图21是细胞CAL-27转染效率分布图；
图22是细胞SCC-9转染效率分布图；
图23是细胞CHO转染效率分布图；
图24是SCC-25细胞系中靶基因(BCL2)的变化图；
图25是SCC-25细胞系中靶基因(KRAS)的变化图；
图26是CAL-27细胞系中靶基因(BCL2)的变化图；
图27是CAL-27细胞系中靶基因(KRAS)的变化图；
图28是纳米银簇与miR-181a-5p复合物(AgNCs/miR-181a-5p)口腔癌细胞系SCC-25的增殖检测结果对比图；
图29是纳米银簇与miR-181a-5p复合物(AgNCs/miR-181a-5p)抑制口腔癌细胞系的集落形成对比图；
图30是纳米银簇与miR-181a-5p复合物(AgNCs/miR-181a-5p)抑制口腔癌细胞系的侵袭对比图；
图31是纳米银簇与miR-181a-5p复合物(AgNCs/miR-181a-5p)抑制口腔癌细胞系的迁移对比图；
图32是不同pH梯度下的纳米银吸光度曲线图；
图33是合成纳米银时所需各原料的吸光度曲线图；
图34是不同AgNO3:PEI比例下的吸光度曲线图；
图35是不同AgNO3:AA比例下的吸光度曲线图；
图36是不同搅拌时间下的吸光度曲线图；
图37是最佳合成条件下所合成纳米银的吸光度曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。应当指出的是，以下的实施实例只是对本发明的进一步说明，但本发明的保护范围并不限于以下实施例。
实施例
本实施例涉及一种治疗口腔癌的miR-181a-5p纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)在小烧杯中加入8ml超纯水后再加入2ml 5umol/L的枝化聚乙烯亚胺(PEI25K)，在室温条件下，于IKA的big-squid磁力搅拌器上，选用中档转速搅拌至均匀；
(2)向小烧杯中逐滴加入50ul 0.1mol/L的AgNO3后(使得AgNO3和PEI二者的摩尔比为AgNO3:PEI＝1:2)，用新鲜的保鲜膜封口；
(3)在避光条件下室温、中档转速搅拌2h后，使用由超纯水1:2稀释以后的冰乙酸调节上述体系pH至4，体系的pH值由雷磁的PHS-3E型pH计来测定，检测时严格按照仪器所附带的检测步骤进行；
(4)继续在中档转速搅拌的条件下，逐滴加入9ml 0.01mol/L的抗坏血酸(AA)，使得AgNO3和AA的摩尔比为：AgNO3:AA＝1:18；
(5)根据各原料的用量，补充超纯水，使体系总体积为20ml；
(6)继续使用新鲜保鲜膜封口后，在365nm的紫外光照射下，继续于室温下在IKA的big-squid磁力搅拌器上于中档转速下，持续搅拌6h；
(7)将整个合成后的体系转入10cm2的玻璃培养皿中，随后将其置于101-1S型的电热恒温鼓风干燥箱中，打开鼓风功能，并调节温度至45-55℃，烘干8-16h；
(8)使用移液枪准确加20ml超纯水于上述玻璃培养皿中，缓慢吹打混匀至无肉眼可见的颗粒物后，于超声仪上超声20-30分钟，得到纯净的纳米银溶液；
(9)将所得纯净的纳米银溶液用超纯水稀释20倍后，备用；
(10)将装有miR-181a-5p mimics粉末的离心管在sigma的3-18K型离心机上4℃，3600rpm离心15分钟后小心取出，按照每1OD双链mimics加入125μL DEPC水的比例进行配置，使用移液枪向离心管中加入适量的DEPC水后，轻轻吹打混匀20–30次，将miR-181a-5pmimics粉末配置成20μM的溶液后，备用；
(11)将稀释后的纳米银溶液、miR-181a-5p mimics溶液按照摩尔比例为(1-10):(1-8)量取，备用；
(12)先将纳米银溶液加入到离心管中，再加入miR-181a-5p溶液，随后，用移液枪反复轻轻吹打混匀40-50次；
(13)室温静置20-30分钟，静置后，即得治疗口腔癌的miR-181a-5p纳米复合物。
本发明实施例最佳条件的筛选
1、合成pH条件的筛选
本实验进行合成时，其他合成条件的配比均固定(AgNO3:PEI＝1:1；AgNO3:AA＝1:12；T＝6h)，使用超纯水稀释过的冰醋酸(1:2稀释)来调节反应体系的pH值，体系的pH值由雷磁的PHS-3E型pH计来测定，检测时严格按照仪器所附带的检测步骤进行。严格按照无机化学中的各项操作规程对所用试剂进行配置。全部合成完毕后使用UV-8000全波段紫外-可见光分光光度计来进行材料吸光度的测定，见图32。当pH值过高，PEI与银离子结合力太强此时会阻碍还原进行，而pH值过低，银离子还原过快，极易形成大颗粒。在实验中发现pH值太低时溶液较为浑浊颜色也较为昏暗，这也间接证明了大颗粒的形成。因此，虽然当pH为3的时候其吸光度值最高，但是在综合考量之下，我们最后挑选在pH＝4这个相对居中的条件下，银离子能以适当的速度被还原，生成大量的银纳米团簇。
2、排除原料自身吸光度的干扰
为了证明产生的物质是纳米银，而不是其他反应物的络合物。随后检测了各种反应物的本底吸光度曲线，见图33。严格按照上述检测合成产物的步骤，对该合成过程中所用到的所有反应物都进行了相同的吸光度检测，发现所有的反应物在检测的全波段中均没有明显的特征吸收峰。特别是在250～350nm左右几乎没有任何吸收。因此可以初步判断合成反应是生成了新的纳米银产物。因此，可以继续后续合成实验的最佳条件探索。
3、最佳AgNO3:PEI比例的探索
本次实验中是控制了AgNO3与PEI两种原料之间的比例来作为变量；其他因素均与之前保持一致(pH＝4；AgNO3:AA＝1:12；T＝6h)，本实验中严格控制AgNO3加入的总量以及总的反应体系一定，且与之前的实验用量保持一致。通过改变PEI的量来配置AgNO3:PEI的各个梯度比例。根据无机化学实验中的相关配置方案，使用容量瓶和小烧杯以及精密天平等严格按照操作规程来配置合适浓度的硝酸银以及所需浓度和用量的PEI，AA等试剂。使用超纯水稀释过的冰醋酸(1:2稀释)来调节反应体系的pH值，体系的pH值由雷磁的PHS-3E型pH计来测定，检测时严格按照仪器所附带的检测步骤进行。见图34，从吸收曲线可以看出，比例为1：2时曲线的吸光度较高，而且曲线没有明显的多峰和峰肩，曲线比较均一且光滑；峰宽也比较窄。说明这个比例下的产物是比较一致的，没有太大或太小的颗粒更没有杂质产生。同时这个比例下的吸光度值也较高，超过这个比例时也未有更加明显的升高。同时，结合合成后产物的外观以及颜色的比对，该比例下的纳米银呈比较透亮的状态，无明显的大颗粒和沉淀产生。当比例再升高时，虽然吸光度值还会再略有提高，但是此时的产物容易凝集成大颗粒导致溶液较为浑浊且不透亮；此外，结合节约原材料以及节省物料的原则，我们选择1:2这个比例来作为接下来合成的条件。
4、最佳AgNO3:AA梯度的探索
本次实验中是控制了AgNO3和PEI这两种原料之间的不同配比来作为变量，其他因素均与之前保持一致(pH＝4；AgNO3:PEI＝1:2；T＝6h)。在本实验中严格控制AgNO3加入的总量以及总的反应体系一定，且与之前的实验用量保持一致；通过改变AA的量，来配置AgNO3:AA的各个梯度比例。根据无机化学实验中的相关配置方案，使用容量瓶和小烧杯以及精密天平等严格按照操作规程来配置合适浓度的硝酸银，以及所需浓度和用量的PEI，AA等试剂。使用超纯水稀释过的冰醋酸(1:2稀释)来调节反应体系的pH值。体系的pH值由雷磁的PHS-3E型pH计来测定，检测时严格按照仪器所附带的检测步骤进行。见图35，由本次实验结果可以看出，在1:18的比例下曲线的吸光度值较高，而且该曲线没有明显的多峰和峰肩，曲线比较均一且光滑；同时这个比例下的峰宽也比较窄。说明这个比例下的产物是比较一致的，没有太大或太小的颗粒更没有杂质产生。结合外观以及颜色的比对，该比例下的纳米银溶液呈比较透亮的状态，无明显的大颗粒和沉淀产生。故而我们选择这个比例作为接下来合成的条件。而且在超过这个比例时，虽然总体产物的吸光度值还会略有升高，但是由于太多还原剂的存在，也会使得还原反应进行的过快，从而导致较大颗粒的产生。同时，即使在超过这个比例的时候，其吸光度值也没有更明显的升高趋势，从节约原材料以及节省物料的角度出发，选择该比例进行后续的合成实验也是比较合理的。
5、最佳时间梯度的筛选
在本次实验中通过改变加入还原剂后在365nm的紫外光照射下的搅拌时间，来筛选最佳的搅拌时间。实验时，其他因素均与之前保持一致(pH＝4；AgNO3:AA＝1:18；AgNO3:PEI＝1:2)，本实验中严格控制AgNO3加入的总量以及总的反应体系一定，且各反应物与之前的实验用量保持一致；根据无机化学实验中的相关配置方案，使用容量瓶和小烧杯以及精密天平等严格按照操作规程来配置合适浓度的硝酸银，以及所需浓度和用量的PEI，AA等试剂。使用超纯水稀释过的冰醋酸(1:2稀释)来调节反应体系的pH值，体系的pH值由雷磁的PHS-3E型pH计来测定，检测时严格按照仪器所附带的检测步骤进行。
由本次实验结果见图36可以看出，在混合并调节好pH加入还原剂以后，在365nm的紫外光线照射下的磁力搅拌时间在6h时的紫外吸光度较高，而且曲线没有明显的多峰和峰肩，曲线比较均一且光滑；同时这个时间点下的峰宽也比较窄。说明这个时间点下的合成产物是比较一致的，没有太大或太小的颗粒更没有杂质产生。结合合成后整个体系的外观以及颜色的比对，最终决定选取在365nm的紫外照射下搅拌6h的条件来进行纳米银的合成与制备。因为2h下的体系，其溶液由于搅拌的不完全和不充分，有部分反应物还没有充分反应完全，其整个体系的溶液比较浑浊。
6、最佳合成条件总结
基于以上筛选结果，选定以下条件作为最佳合成条件来进行后续的合成与制备：选取pH＝4；AgNO3:PEI＝1:2；AgNO3:AA＝1:18；T＝6h，见图37。
最后的合成条件及各原料的用量为：在小烧杯中先加入8ml超纯水，然后再加入2ml 5umol/L的PEI 25K，随后于室温条件下，在IKA的big-squid磁力搅拌器上选用中档转速开始搅拌以后，逐滴缓慢滴加入50ul 0.1mol/L的AgNO3，随后将小烧杯用新鲜的保鲜膜封口。在避光条件下搅拌2h以后使用由超纯水1:2稀释以后的冰乙酸调节上述体系pH至4，体系的pH值由雷磁的PHS-3E型pH计来测定，检测时严格按照仪器所附带的检测步骤进行。随后，继续在中档转速搅拌的条件下，缓慢的逐滴加入9ml0.01mol/L的抗坏血酸(AA)，随后根据各原料的用量，补充剩余体积的超纯水，使得该体系总体积达到20ml后，继续使用新鲜保鲜膜封口，在365nm的紫外光照射下继续于室温下，在磁力搅拌器上于中档转速下，持续搅拌6h。将整个合成后的体系转入10cm2的玻璃培养皿中，随后将其置于101-1S型的电热恒温鼓风干燥箱中，打开鼓风功能，并调节温度至45-55℃，烘干8-16h。最后，使用移液枪准确加20ml超纯水于上述玻璃培养皿中，缓慢吹打混匀至无肉眼可见的颗粒物后，于超声仪上超声20-30分钟，得到纯净的纳米银溶液。
一、纳米银的合成及表征
1、使用全波段紫外分光光度计对纳米银进行表征：
检测前先使用三蒸水(溶剂)作为参比溶液来校准仪器。检测时，将提前收集于离心管中的样品按比例稀释9倍后，使用移液器将样品稀释液加入到石英比色皿中，随后按照糙面对着柱子，光面对着光路的方式依次将盛有样品稀释液的石英比色皿放入全波段的紫外分光光度计中进行检测。
如图1所示，检测结果可知，该产物的吸光度值较高且吸光度曲线较为光滑，而且曲线没有明显的多峰和峰肩，曲线比较均一且峰宽也比较窄。说明该产物是比较一致的，没有太大或太小的颗粒更没有杂质产生。
2、紫外光照射下纳米银的荧光表征
为了更好的对合成产物的应该特性进行表征，首先将纳米银和合成过程中所用到的各种原料小心分装于1.5ml的离心管中。随后在暗室中将各离心管置于365nm的紫外灯下照射，并收集照片，分别在自然光、365nm的紫外灯下照射进行，见图2、图3所示。
结果显示，合成的纳米银在365nm的紫外光线照射下，能够发出较为明显的绿色荧光。而合成过程中所用到的其他组分只是简单的被紫色光线所照亮，并没有被激发出明显的荧光。从图4中刚合成完成后，纳米银溶液在小烧杯中的荧光图可以更清楚的看到，纳米银溶液在365nm的紫外光激发下显示出了明显的黄绿色荧光。
3、曝光仪下纳米银的荧光表征
与上一步的表征方法类似，首先将纳米银和合成过程中所用到的各种原料小心分装于1.5ml的离心管中。随后按顺序依次将各离心管置于曝光仪中，依次在明场条件和曝光的条件下进行曝光并采集照片，见图5和图6所示，结果显示合成制备得到的纳米银簇在曝光仪中进行曝光时能够在曝光条件下显现出明显的轮廓，而其他组分则未能显示出较为明显的图像，这也说明了该纳米银确实可以产生一定强度的荧光。
4、电子显微镜对纳米银的表征
按照前述条件将所述纳米银合成并纯化好后，将纳米银溶液滴到碳膜铜网上，随后放入干燥器中，室温过夜，得到载有样品的铜网。纳米银形态通过JEOL JEM-2100透射电子显微镜(TEM)在加速电压为200kV的条件下观察得到，结果见图7所示。利用电子显微镜对合成的纳米银进行检测后发现，合成的纳米银呈小球状的球形结构，而且纳米颗粒的散布和粒径都较为均一，说明其分散稳定性良好。由图7透射电子显微镜观察纳米银结构分布图，左边为100000倍条件下观察的结果，右边为200000倍条件下观察的结果，其粒径大多分布在40-80nm的范围内。
5、合成材料的能谱扫描-ICP表征
为了进一步确定本实施例合成的纳米银的成分是否较为纯净，材料是否为纳米银。对材料进行了能谱扫描的表征见表1所示，在收集好合成并纯化的纳米银后送样进行上机检测。
表1(单位：mg/L)
样品编号 取样体积/ml 定容体积/ml 稀释系数 所测元素 仪器读数 换算含量
样本1 1 25 1 Ag 0.9766 24.4145
样本2 1 25 1 Ag 0.9206 23.0146
平均 1 25 1 Ag 0.9486 23.7146
由表1数据结果可知，合成的纳米颗粒中确实含有一定量的Ag元素，从元素定性和定量的角度更加说明了本发明合成的确实是含有银元素的纳米银颗粒。
6、Zeta电位及纳米粒度分析(DLS)表征
为了进一步对材料进行表征，进行了Zeta电位及纳米粒度分析的表征。在收集好合成并纯化的纳米银后送样进行上机检测，结果如图8所示。
由Zeta电位及纳米粒度分析的结果可知，合成的纳米颗粒粒径分散较为均一，其分散性良好，且其粒径大多分布在40nm左右，没有大的杂质颗粒产生，这也和上述图7电镜的表征结果较为一致。
7、X射线衍射-XRD表征
对了更好的研究纳米材料光学衍射特性，在收集好合成并纯化的纳米银后，送样进行XRD检测，结果如图9所示。
由XRD的结果可知，本发明合成的纳米颗粒粒径分散较为均一，其中确实有Ag元素的特征峰，且产物确实为较小粒径的纳米银。
二、负载miR-181a-5p的聚乙烯亚胺修饰的纳米银复合物的制备
1、纳米银搭载miR-181a-5p
搭载时，需要按照所需比例的用量将纳米银载体先加入到预先准备好的合适容量的离心管中，随后缓慢加入与之对应比例的miRNA来配置各个比例(载体：核酸不同梯度的摩尔比)梯度的溶液。加入适量的对应miRNA后，用移液枪反复吹打混匀40-50次，随后室温静置20-30分钟。静置完毕后于预先浸泡于TAE电泳缓冲液中的2％琼脂糖凝胶上进行上样并跑胶，跑胶条件为：恒压110v，15-20分钟。上样时需按1:9的比例混合miRNA和上样缓冲液(10X)，随后将上样体系加于各孔中进行上样，并保持每孔中的miRNA浓度一致，结果见图10所示。
由纳米银搭载miR-181a-5p核酸序列的结果可知，随着纳米银使用量的逐步增大，残留在溶液中的miR-181a-5p的量在逐渐减少，故而能够在凝胶中跑出来条带的量也逐渐减少，其对应泳道中的亮度也越低。
其中，单独的miRNA孔中由于没有miRNA被搭载于载体上，故而该孔中的全部miRNA都能随电泳而往下运行，因而该孔所对应的条带灰度也是最亮的。同时，该孔中由于没有被载体束缚住的miRNA，其上样孔中显示不出条带亮度。而单独的纳米银组，由于并没有核酸物质，故而该孔对应的泳道位置中不显示条带，同时上样孔中也不显示亮度。
在0.125:1的比例中，由于纳米载体的含量较少，所以只有少部分的miRNA能被载体所束缚在上样孔中而不被电泳到相应的泳道中，因而该组中的上样孔中只有相对较暗的亮度，而泳道中的对应位置有一条较为明显的条带，但该条带的亮度较只有miRNA组暗。
相似的，在0.25:1组中，上样孔中只有相对较暗的亮度但较0.125:1组亮，说明该组中有更多的miRNA被搭载于纳米银载体中；而泳道中的对应位置仍有一条较为明显的条带，但该条带的亮度较0.125:1组暗，说明改组中只有少部分的miRNA未被搭载而随着电泳到了泳道中的相应位置。
在0.5:1组中，绝大多数的miRNA被搭载于纳米载体上，而只有极少部分未被搭载的miRNA随着电泳而到达了泳道中的相应位置。而在1:1组中，可以看出该组几乎没有未被搭载而随着电泳跑出上样孔的miRNA，所有的miRNA均被载体束缚在了上样孔中。同样的，在2:1及3:1组中所有的miRNA也均被完全搭载于纳米载体上，从而束缚在了上样孔中，未被电泳至泳道中。
由于纳米药物在实体瘤的治疗中具有高通透性和滞留效应(enhancedpermeability and retention effect，EPR)，因而一般在制备纳米药物来针对肿瘤进行治疗时，首先要考虑的就是纳米体系的负载效率以及其纳米尺寸。因此，根据琼脂糖凝胶电泳结果，选择纳米银簇与miR-181a-5p的摩尔比例为1:1，作为制备纳米银簇复合载药体系的最终比例。
2、纳米银簇与miR-181a-5p复合物(AgNCs/miR-181a-5p)的RNA酶稳定性表征
为了更好的表明合成的纳米银对要搭载的miRNA有很好的保护作用，进行了miR-181a-5p/AgNCs复合物RNA酶稳定性的表征，结果见图11。
本实验miR-181a-5p/AgNCs的制备过程与前述步骤相同。实验开始时，miR-181a-5p与miR-181a-5p/AgNCs均与等体积的0.05mg/ml的RNA酶(RNase)溶液混合，在二氧化碳恒温(37℃)培养箱中孵育1h。孵育完毕后取一半体积的miR-181a-5p+RNase混合液与10mg/ml的肝素溶液混合15min，分为miR-181a-5p+RNase组和miR-181a-5p+RNase+肝素组；取一半体积的miR-181a-5p/AgNCs+RNase混合液与10mg/ml的肝素溶液混合15min，分为miR-181a-5p/AgNCs+RNase组和miR-181a-5p/AgNCs+RNase+肝素组。各组分均配制并孵育好以后，在浸泡于TAE电泳缓冲液中的2％琼脂糖凝胶上进行上样并跑胶。跑胶条件为：恒压110V，15-20分钟。上样时需按1:9的比例与上样缓冲液(10X)混合。
RNase能够快速的在短时间内将RNA片段降解，而当miRNA被搭载于纳米载体上以后由于有载体的保护而不会被RNase降解。同时，肝素也能够和miRNA竞争性的结合纳米银载体，所以当miR-181a-5p/AgNCs和肝素共同孵育以后，载体上的miR-181a-5p会被释放下来而显示出清晰的条带。
在miR-181a-5p组中，由于miR-181a-5p并没有和RNase共同孵育，所以在该组中miR-181a-5p能够显示出清晰的亮带，且miR-181a-5p随着电泳一直往正极移动，故而在电泳槽中显示了清晰的亮带；在miR-181a-5p+RNase组中，由于miR-181a-5p和RNase一起孵育了1h，所以该组中的miR-181a-5p被RNA酶降解，该组不能显示出较为清晰的亮带；在miR-181a-5p/AgNCs+RNase组中，由于miR-181a-5p被载体AgNCs保护的很好，因而既不会随着电泳跑向正极，更不会被RNase所降解，所以在该组中的上样孔中会有较亮的条带；在miR-181a-5p+RNase+肝素组中，由于在之前miR-181a-5p和RNase孵育过程中已经被降解，所以在该组中也不会产生任何较为明显的条带；在miR-181a-5p/AgNCs+RNase+肝素组中，由于在前期和RNase孵育的过程中miR-181a-5p被AgNCs载体保护的很好未被降解掉，在后续和肝素的孵育中由于肝素和miR-181a-5p竞争性的结合AgNCs载体，故而在与肝素孵育结束后miR-181a-5p/AgNCs复合物上的miR-181a-5p会脱落下来并随着电泳的进行向正极移动，因而该组在与单独miR-181a-5p组相同的位置也会显示出较亮的条带。
综上所述，由本实验结果可知，合成的AgNCs载体对miR-181a-5p有很强的保护作用，可以有效保护miR-181a-5p不被RNA酶降解。
3、纳米银簇与miR-181a-5p复合物(AgNCs/miR-181a-5p)的血清稳定性表征
为了进一步验证我们合成的纳米银对要搭载的目的miRNA有很好的保护作用，同时也为了更好的模拟在转染细胞以及在机体内运行时纳米载体和目的核酸序列所处的微环境，我们进行了miR-181a-5p/AgNCs复合物血清稳定性的表征，见图12所示。
本实验中miR-181a-5p/AgNCs的制备过程与前述步骤相同。实验开始时，miR-181a-5p溶液与miR-181a-5p/AgNCs溶液均与等体积的FBS混合后在二氧化碳恒温(37℃)培养箱中分别孵育2,4,6,8,10,12,24h。孵育完毕后取一半体积的miR-181a-5p+FBS混合液与2％的SDS溶液混合15min，分为miR-181a-5p+FBS组和miR-181a-5p+FBS+2％SDS组；同时，取一半体积的miR-181a-5p/AgNCs+FBS混合液与2％的SDS溶液混合15min，分为miR-181a-5p/AgNCs+FBS组和miR-181a-5p/AgNCs+FBS+2％SDS组。各组分均配制并孵育好以后，在浸泡于TAE电泳缓冲液中的2％琼脂糖凝胶上进行上样后跑胶。跑胶条件为：恒压110V，15-20分钟。上样时需按1:9的比例与上样缓冲液(10X)混合。
同样的，SDS也能够和miRNA竞争性的结合纳米银载体，所以当miR-181a-5p/AgNCs复合物和SDS共同孵育以后，载体上的miR-181a-5p会被释放下来而在相应位置显示出清晰的条带。
本实验结果显示，见图13-17所示，纳米载体AgNCs对其所负载的miR-181a-5p在血清中有很好的保护作用。单独的miR-181a-5p序列在50％的血清中孵育4-6h时就已经基本被完全降解，而miR-181a-5p/AgNCs复合物中的miR-181a-5p由于有AgNCs纳米载体的保护，其在50％的血清中孵育长达24小时后仍能被顺利的释放，并随着电泳在泳道的相应位置显示出较亮的条带。血清稳定性结果表明，纳米银载体AgNCs对于其所负载的miR-181a-5p有很好的保护作用，能够较长时间的在血清中保证其稳定性。
4、纳米银簇与miR-181a-5p复合物(AgNCs/miR-181a-5p)在多种细胞系中转染效率的检测
为了验证合成的纳米银载体是否能顺利的将miR-181a-5p的模拟物mimics序列转入目的细胞系中，以及检验该纳米银载体的转染效率，进行AgNCs载体转染多种细胞系的表征。在该实验中使用相应的无关序列做为阴性对照(NC组)。
在各细胞系中，具体的转染步骤如下所示：
1、在转染前24h将预先培养至合适时期的待转染细胞消化后计数，然后在六孔板中接种适量的细胞后，添加新鲜的对应培养基。随后，将六孔板放回二氧化碳培养箱中培养。
2、在转染前1h将六孔板更换新鲜的无血清、无双抗的纯培养基。
3、分别准备两支无菌离心管，来配置转染所需的A液和B液；
A:向无菌离心管中按比例加入所需量的纳米银载体，随后按250ul/孔的量加入无血清无双抗的纯培养基，移液枪轻轻吹打混匀，室温静置5分钟。
B：在离心管中加入适量的miR-181a-5p mimics序列，随后再加入250μl/孔的无血清、无双抗纯培养基。用移液枪将上述溶液轻轻吹打混匀。
4、将上述B液全部加入到A液中与之混合，随后用移液枪轻轻吹打混匀后室温静置孵育30min。随后将A、B混合液按量加入至对应孔中，并根据每孔加入的量，使用无血清、无双抗的培养基补齐至2ml。最后，将处理好的六孔板“八角”摇匀后放入培养箱中。
5、在转染6h后，将转染体系换液成完全培养基继续培养。
在完成转染24h后，吸去各孔中培养基，使用无菌PBS将各孔轻轻洗涤2次，随后加入trizol裂解细胞并提取各组细胞中RNA。
随后，使用Mir-XTM miRNA First Strand Synthesis Kit试剂盒中相关试剂进行逆转录。按表3所示信息加样于200ul无酶离心管中，上机反应程序如表4所示。逆转录反应结束后，加90ul dd H2O于逆转录反应体系对反应产物进行稀释。所有操作均在冰浴进行。
miR-181a-5p mimics和mimics NC的序列如下表2(各组转染物序列信息)、表3(逆转录上样体系表)、表4(逆转录反应程序表)、表5(qPCR反应加样体系表)所示：
表2
表3
逆转录试剂 所需体积
mRQEnzyme 1.25uL
mRQbuffer(4×) 5uL
RNASample Upto10uL
表4
反应温度 持续时间
37℃ 60min
85℃ 5min
4 30min
逆转录顺利完成后，使用逆转录产物及TB Green Premix Ex Taq试剂盒进行实时荧光定量PCR(qPCR)。反应的加样体系如表5所示；反应程序如图18所示；该反应的总体系为25ul；内参为U6。
表5
试剂 体积
TBGreenPremixExTag(2×) 12.5uL
ROXReferenceDye(50×) 0.5uL
cDNA 2uL
mRQ3’Primer 0.5uL
miRNA-sepecificPrimer 0.5uL
ddH2O 9uL
Total 25uL
转染效率验证实验表明，见图19-图23所示，合成的纳米银不仅可以顺利的搭载目的miRNA的模拟物序列，在转染细胞时也能顺利的携带目的序列进入细胞内，同时将所搭载的序列顺利的释放入细胞内。结果充分的说明了，该纳米银载体在多种细胞系中均具有较高的转染效率，可以为后续的机制验证实验奠定基础。
在验证纳米银转染效率的时候发现，载体和序列的摩尔比是1:1,2:1,3:1的时候其转染效率依次降低，所以决定，后续主要选用1:1的这个最佳比例来进行后续的转染实验。
5、纳米银簇与miR-181a-5p复合物(AgNCs/miR-181a-5p)转染后对其靶基因的影响
为了进一步验证AgNCs/miR-181a-5p复合物在转染进入细胞后对其下游基因的影响，我们在转染后对其下游靶基因的表达变化进行了检测。
同样的，在六孔板中种板后进行转染，随后利用trizol法提取各组中的RNA进行检测和鉴定。mRNA的逆转录使用日本takara公司5×Prime Script TM RT Master Mix试剂盒中相关试剂进行。逆转录体系按表6所示信息加样于200ul无酶离心管中，随后在逆转录PCR仪中反应，上机反应程序如表7所示。所有操作均在冰浴进行。
表6
逆转录试剂 所需体积
5×PrimeScriptTMRTMasterMix 2uL
RNASample 根据测得的浓度计算
RNaseFreedH2O Upto10ul
表7
反应温度 所需时间
37℃ 15min
85℃ 5s
4 根据实验所需设定
逆转录反应顺利完成后，对靶基因进行实时荧光定量PCR(qPCR)的检测。qPCR的反应体系如表8所示；反应程序如表9所示，靶基因mRNA的定量过程总体系为20ul；内参为β-actin。
表8
表9
靶基因的引物序列信息如表10(各基因引物信息)所示：
表10
各细胞系中靶基因的变化情况如下所示：其中，SCC-25细胞系中靶基因的变化情况，见图24、图25所示；CAL-27细胞系中靶基因的变化情况：见图26、图27所示。
由靶基因的定量结果可知，在SCC-25和CAL-27这两株口腔癌细胞系中，AgNCs/miR-181a-5p复合物在转染进入细胞后对其下游靶基因有明显的抑制作用。说明该复合物可能通过抑制其靶基因的表达而发挥抑制口腔癌的作用。
6、纳米银簇与miR-181a-5p复合物(AgNCs/miR-181a-5p)抑制口腔癌细胞系的恶性行为
(1)纳米银簇与miR-181a-5p复合物(AgNCs/miR-181a-5p)抑制口腔癌细胞系的增殖
①收取细胞后打散混匀并计数，以每孔1×105个/mL的浓度接种到96孔板中；每个转染浓度做10个副孔。同时，为避免挥发造成误差，在96孔板外围一周加入等量的100ul无菌PBS。
②将96孔板转入培养箱中培养过夜，待细胞贴壁后，根据前述的细胞转染步骤，将各组核酸序列分别转染到相应组别中。待培养至各待测时间点(0h，24h,，48h，72h，96h)时，以cck8试剂：培养基＝1：10的比例，向各孔中加入检测试剂，随后将96孔板再次移入培养箱中孵育。
③孵育达60min后取出培养板，随后使用酶标仪在450nm处读板测定。
由增殖检测结果图28可知，与空白对照组及阴性对照组相比，AgNCs/miR-181a-5p复合物对口腔癌细胞系SCC-25的增殖有显著的抑制作用。
(2)纳米银簇与miR-181a-5p复合物(AgNCs/miR-181a-5p)抑制口腔癌细胞系的集落形成
收集细胞后打散混匀并计数，以每孔1×106个/mL的浓度接种到6孔板中后将6孔板转入培养箱中培养过夜。待细胞贴壁后，根据细胞转染的步骤将miRNA-181a-5p的模拟物以及模拟物阴性对照序列分别在相应的组别中转染48h以后，收集细胞并计数。随后按照每孔2000-5000个细胞的密度，将各处理组接种于6孔板中，然后将6孔板转移至培养箱中培养15天左右，使用无菌PBS洗涤待处理细胞两次。洗涤完毕后，依次，多聚甲醛固定30min，0.1％结晶紫染色30min，然后对各组细胞进行拍照并统计，集落形成的结果如图29所示。
为了检测AgNCs/miR-181a-5p复合物对人类口腔癌细胞系生长发育的影响，进行平板克隆的集落形成实验。该部分实验结果表明，与不作任何处理的空白对照组及阴性对照组相比，AgNCs/miR-181a-5p复合物能够显著抑制SCC-25细胞系的集落形成。
(3)纳米银簇与miR-181a-5p复合物(AgNCs/miR-181a-5p)抑制口腔癌细胞系的侵袭
本实验所需的基质胶、枪头、离心管等均需要提前2小时在4℃冰箱预冷；具体实验步骤如下所示：
①收集细胞后以每孔1×106个/mL的浓度接种到6孔板中，过夜培养待细胞贴壁后，根据细胞转染的步骤将各组核酸序列转染于相应组别中。
②将基质胶稀释40-50倍至200-300ug/mL左右，配置为基质胶使用液。
③加100ul基质胶使用液于Transwell小室的上室中后，将其置于CO2培养箱中孵育1h左右。
④将转染到达最适时间后的各组细胞使用PBS洗涤2次，使用普通胰酶消化，消化完成后1000rpm离心5min，收集细胞后加无血清的纯培养基重悬细胞。
⑤计数后，将细胞密度控制在1×104个/mL左右。取出之前放入CO2培养箱中孵育的基质胶，将小室倒扣，倒掉多余的基质液。
⑥在24孔板中每孔加650ul含15％血清的培养基，24孔板中每孔放入基质胶处理后的Transwell小室，在上室中每孔加入100ul细胞悬液。
⑦将带有Transwell小室的24孔板放回CO2培养箱中培养24小时，达到培养时间后，向Transwell小室中加入4％多聚甲醛固定30min。
⑧吸掉多聚甲醛后，使用PBS清洗两次小室，每孔加入100ul左右的结晶紫染液染色20min。
⑨使用PBS清洗直至在镜下可以清晰的看到着色的细胞为止，显微镜观察、拍照，随后进行各组的计数和统计。
侵袭的结果见图30所示，其中：A：对照组，B：阴性对照组，C：AgNCs/miR-181a-5p复合物组，D：各组统计结果。
本研究利用Matrigel基质胶结合Transwell小室，评估了AgNCs/miR-181a-5p复合物对OSCC细胞系侵袭的影响。Matrigel Transwell侵袭试验表明，与空白对照组和阴性对照组相比，AgNCs/miR-181a-5p复合物能够显著降低OSCC细胞系SCC-25的侵袭能力。
(4)纳米银簇与miR-181a-5p复合物(AgNCs/miR-181a-5p)抑制口腔癌细胞系的迁移
Transwell小室法检测细胞迁移时的方法步骤与侵袭检测基本一致，但是省去了基质胶相关处理的步骤：待转染的各组细胞达到最适处理时间时直接收集细胞计数，然后种于上室中即可，不必对上室进行基质胶的处理。其余步骤均与侵袭检测一致。具体步骤如下：
①收集细胞后以每孔1×106个/mL的浓度接种到6孔板中，过夜培养待细胞贴壁后，根据细胞转染的步骤将各组核酸序列转染于相应组别中。
②将转染到达最适时间后的各组细胞使用PBS洗涤2次，使用普通胰酶消化。消化完成后1000rpm离心5min，收集细胞后加无血清的纯培养基重悬细胞。
③对重悬的细胞进行计数后，将细胞密度控制在1×104个/mL左右。
④在24孔板中每孔加650ul含15％血清的培养基，24孔板中每孔放入相应的Transwell小室，在上室中每孔加入100ul细胞悬液。
⑤将带有Transwell小室的24孔板放回CO2培养箱中培养24小时，达到培养时间后，向Transwell小室中加入4％多聚甲醛固定30min。
⑥吸掉多聚甲醛后，使用PBS清洗两次小室，每孔加入100ul左右的结晶紫染液，染色20min。
⑦使用PBS清洗直至在镜下可以清晰的看到着色的细胞为止，显微镜观察、拍照，随后进行各组的计数和统计。
迁移的结果见图31所示：其中，A：对照组，B：阴性对照组，C：AgNCs/miR-181a-5p复合物组，D：各组统计结果。
通过Transwell法进行了口腔癌细胞系的迁移检测。迁移结果的分析表明，在AgNCs/miR-181a-5p复合物组中的下室中，迁移细胞数明显少于SCC-25正常培养组和阴性对照组。迁移实验说明AgNCs/miR-181a-5p复合物可以显著抑制人口腔癌细胞系SCC-25的迁移；该复合物有望成为临床上治疗口腔癌的潜在备选药物。
综上所述，本发明应用新型的纳米银生物合成技术构建新式纳米银，并对其进行修饰使其能够负载核酸miR-181a-5p，之后再利用纳米银药物自身的独特优势将负载miR-181a-5p后的纳米银转染入口腔癌细胞系。本发明通过对纳米银搭载miR-181a-5p后血清稳定性、RNA酶稳定性以及搭载后在各细胞系中的转染效率表征实验验证miR-181a-5p成功搭载在纳米银上，合成了一种治疗口腔癌的miR-181a-5p纳米复合物。将这种复合物转染到多种细胞系中，通过检测转染效率、miR-181a-5p的靶基因的表达、对口腔癌细胞增殖、集落形成、迁移、侵袭等细胞行为学功能验证实验，研究负载miR-181a-5p的纳米银对抑制口腔鳞癌发生发展所起到的关键作用和调控机制，从非编码RNA的基因表达调控和纳米药物治疗方面为抑制及治疗口腔癌的形成和发展，提供分子作用机制等方面的基础资料。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质。

Claims (2)

1.一种治疗口腔癌的miR-181a-5p纳米复合物，其特征在于：由银纳米颗粒和双链核苷酸制备而成；
该治疗口腔癌的miR-181a-5p纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)在小烧杯中加入8ml超纯水后，加入2ml 5umol/L的枝化聚乙烯亚胺，在室温条件下，于IKA的big-squid磁力搅拌器中档转速搅拌至均匀；
(2)向小烧杯中逐滴加入50ul 0.1mol/L的AgNO3后，使AgNO3与PEI的摩尔比为1:2，用新鲜的保鲜膜封口；
(3)在避光条件下，室温、中档转速搅拌2h后，用由超纯水1:2稀释的冰乙酸调节上述体系pH至4；
(4)继续中档转速搅拌的条件下，逐滴加入9ml 0.01mol/L的抗坏血酸，使得AgNO3和AA的摩尔比为1:18；
(5)根据各原料的用量，补充超纯水，使体系总体积为20ml；
(6)继续使用新鲜保鲜膜封口后，在365nm的紫外光照射下，室温下IKA的big-squid磁力搅拌器中档转速，持续搅拌6h；
(7)将整个合成后的体系转入10cm2的玻璃培养皿中，随后将其置于101-1S型的电热恒温鼓风干燥箱中，打开鼓风功能，并调节温度至45℃-55℃，烘干8-16h；
(8)用移液枪加20ml超纯水于上述玻璃培养皿中，缓慢吹打混匀至肉眼未见的颗粒物，于超声仪上超声20-30分钟，得到纯净的纳米银溶液；
(9)将所得纯净的纳米银溶液用超纯水稀释20倍后，备用；
(10)将装有miR-181a-5p mimics粉末的离心管在sigma的3-18K型离心机上4℃，3600rpm离心15分钟后取出，按照每1OD双链mimics加入125μL DEPC水的比例进行配置，用移液枪向离心管中加入适量的DEPC水后，轻轻吹打混匀20-30次，将miR-181a-5p mimics粉末配置成20μM的溶液后，备用；
(11)将稀释后的纳米银溶液、miR-181a-5p mimics溶液按照摩尔比例为(1-10):(1-8)量取，备用；
(12)先将纳米银溶液加入到离心管中，再加入miR-181a-5p溶液，随后，用移液枪反复轻轻吹打混匀40-50次；
(13)室温静置20-30分钟，静置后，即得治疗口腔癌的miR-181a-5p纳米复合物。
2.如权利要求1所述的治疗口腔癌的miR-181a-5p纳米复合物的应用，其特征在于，用于制备治疗口腔癌药物的应用。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103800917A (zh) * 2014-02-19 2014-05-21 华中科技大学同济医学院附属同济医院 纳米金miR-885-5p偶联物及其制备方法和应用
CN105873613A (zh) * 2013-08-13 2016-08-17 贝勒医学院 用于核酸和药物递送的新型plga-修饰的聚乙烯亚胺自组装纳米技术
CN109276559A (zh) * 2018-11-07 2019-01-29 南京市妇幼保健院 一种生物合成银纳米颗粒的制备方法
CN111529713A (zh) * 2020-05-11 2020-08-14 山东大学 一种AuNPs/miR-140复合物及其制备方法和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105873613A (zh) * 2013-08-13 2016-08-17 贝勒医学院 用于核酸和药物递送的新型plga-修饰的聚乙烯亚胺自组装纳米技术
CN103800917A (zh) * 2014-02-19 2014-05-21 华中科技大学同济医学院附属同济医院 纳米金miR-885-5p偶联物及其制备方法和应用
CN109276559A (zh) * 2018-11-07 2019-01-29 南京市妇幼保健院 一种生物合成银纳米颗粒的制备方法
CN111529713A (zh) * 2020-05-11 2020-08-14 山东大学 一种AuNPs/miR-140复合物及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
整合miRNA 和mRNA 表达分析探索口腔癌的药物靶点;肖兰飞;第十五届中国实验动物科学年会论文;第673-679页 *
槲皮素及miR-181a-5p 对口腔癌细胞体外协同抗肿瘤 作用的研究;肖兰飞;山西医科大学硕士学位论文;全文 *

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