CN109266665A - 一种耐热柠檬酸合酶的基因、含有该基因的工程菌及其表达方法 - Google Patents

一种耐热柠檬酸合酶的基因、含有该基因的工程菌及其表达方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109266665A
CN109266665A CN201811208513.6A CN201811208513A CN109266665A CN 109266665 A CN109266665 A CN 109266665A CN 201811208513 A CN201811208513 A CN 201811208513A CN 109266665 A CN109266665 A CN 109266665A
Authority
CN
China
Prior art keywords
heat
resisting
citrate synthase
gene
genetic engineering
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811208513.6A
Other languages
English (en)
Inventor
葛亚东
蒋璐璐
侯少林
苏凤智
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Anhui Normal University
Original Assignee
Anhui Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Anhui Normal University filed Critical Anhui Normal University
Priority to CN201811208513.6A priority Critical patent/CN109266665A/zh
Publication of CN109266665A publication Critical patent/CN109266665A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/03—Oxo-acid-lyases (4.1.3)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种耐热柠檬酸合酶的基因、含有该基因的工程菌及其表达方法，属于基因工程技术领域，本发明耐热柠檬酸合酶的基因以鱼腥藻PCC 7120基因组为模板，运用PCR扩增技术克降得到，基因工程菌由含柠檬酸合酶基因的重组表达质粒经在大肠杆菌宿主菌中转化而得，并经过卡那霉素抗性筛选和测序验证，制备的柠檬酸合酶的基因工程菌，具有耐热且酶活高的特性，为其更好的应用于柠檬酸的工业生产提供了一定的基础，耐热且酶活高的特性使其可以更好的节约生产成本。

Description

一种耐热柠檬酸合酶的基因、含有该基因的工程菌及其表达 方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种耐热柠檬酸合酶的基因、含有该基因的工程菌及其表达方法。
背景技术
柠檬酸合酶(citrate synthase,CS,EC 4.1.3.7)几乎存在于所有的生物体中，是细胞内多种重要代谢途径的关键限速酶及代谢变化的标志酶。在TCA循环中，柠檬酸合酶可催化草酰乙酸和乙酰辅酶A之间的缩合反应生成柠檬酸和辅酶A。柠檬酸是一种非常重要的有机酸，被誉为第一大有机酸，被普遍应用于食品、环保、化工、纺织和制药以及畜牧业等行业中，需求量也逐年增加。我国是世界最大的柠檬酸生产国，产能占世界的70％以上，产量占世界的65％左右。TCA循环是柠檬酸合成的主要途径，因为TCA循环对于柠檬酸合成来说非常重要，而柠檬酸合酶是TCA循环入口的关键酶。
柠檬酸生成的柠檬酸合酶最适发酵温度较高，发酵过程中需要大量冷却水对发酵罐进行降温来维持正常的发酵温度，不仅耗能大，并且目前采用的柠檬酸合酶耐温性能也难以达到，造成制造成本高、产量低、安全性差，不利于大规模的工业生产。
发明内容
根据以上现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提出一种耐热柠檬酸合酶的基因、含有该基因的工程菌及其表达方法，以解决背景技术中部分或全部不足。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种耐热柠檬酸合酶的基因，该耐热柠檬酸合酶的基因具有SEQ ID NO.1的碱基序列。
一种耐热柠檬酸合酶的基因工程菌，该工程菌构建方法包括引物设计、构建重组表达质粒和宿主菌转化，具体步骤如下：
1)引物设计：根据鱼腥藻PCC7120柠檬酸合酶基因(gltA)的基因序列设计出引物；
2)构建重组表达质粒：以鱼腥藻PCC 7120全基因组为模板，利用PCR扩增技术，得到含Nde I和Xho I酶切位点的目的基因片段，将目的基因片段与载体pET-28b同时双酶切后通过T4 DNA连接酶连接，得到重组表达质粒pET-28b-gltA。
3)宿主菌转化：将重组质粒pET-28b-gltA转化到宿主菌感受态细胞中，经过抗性筛选后，获得表达耐热型柠檬酸合酶的基因工程菌。
优选的，所述引物为包含一个Nde I位点的正向引物gltAF和包含一个Xho I位点的反向引物gltAR，其中，正向引物的序列gltAF:5′-AAATGTGCATATGATGGTGTGCGAATACAAGCCTG-3′，反向引物gltAR：5′-AGCCGCTCGAGTTATTCCCCAGCTTTTAACGTTGGTCAA-3′。
优选的，所述宿主菌为大肠杆菌(E.coli Rosetta(DE3))。
优选的，所述抗性筛选的试剂为卡那霉素和氯霉素。
一种表达耐热柠檬酸合酶的基因工程菌的方法，具体步骤如下：将基因工程菌先进行过夜培养，取培养菌液进行二次培养，然后再进行诱导培养，离心分离，得到菌体，向菌体中加入缓冲液，超声破碎，离心，上清液即为粗酶液，并采用亲和层析法纯化粗酶液，得纯化目标蛋白。
优选的，所述过夜培养和二次培养的培养基均为含卡那霉素30μg/mL和氯霉素30μg/mL的LB液体培养基，培养条件均为转速200-225rpm，温度33-39℃。
优选的，所述诱导培养的诱导剂为浓度0.5mM的IPTG诱导剂，培养条件为转速170-190rpm，温度18-22℃且诱导剂在二次培养的菌浓度OD6oo达到0.4时加入。
优选的，所述缓冲液为pH值为8.0的LEW Buffer缓冲液。
与现有技术相比，本发明有益效果是:
1.本发明提供一种耐热柠檬酸合酶的基因、含有该基因的工程菌及其表达方法，为柠檬酸的工业生产提供更节约的生产条件。
2.本发明构建的柠檬酸合酶的基因工程菌，具有耐热且酶活高的特性，为其更好的应用于柠檬酸的工业生产提供了一定的基础，耐热且酶活高的特性使其可以更好的节约生产成本。
附图明说
1.图1为gltA基因的PCR扩增图；
M：DL-2000DNA marker；1：gltA基因的PCR扩增产物；
2.图2为耐热型柠檬酸合酶纯化的SDS-PAGE电泳图；
M：Prestained Protein Ladder；1：菌体破碎上清液；2：目的蛋白纯化产物；
3.图3为耐热型柠檬酸合酶在不同pH反应体系下的酶活力变化图；
4.图4为耐热型柠檬酸合酶在60℃下不同时间的酶残余活力变化图；
5.图5为耐热型柠檬酸合酶在不同温度下的酶残余活力变化图；
6.图6为耐热型柠檬酸合酶二聚体多肽蛋白质相对分子质量分析图谱。
具体实施方式
下面通过对实施例的描述，本发明通过具体实施方式作进一步详细的说明，以帮助本领域技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。
实施例1
一种耐热柠檬酸合酶的基因，该耐热柠檬酸合酶的基因具有SEQ ID NO.1的碱基序列。
一种耐热柠檬酸合酶的基因工程菌，该工程菌构建方法包括引物设计、构建重组表达质粒和宿主菌转化，具体步骤如下：
1)引物设计：根据已知的鱼腥藻PCC7120(Anabaena sp.PCC7120)柠檬酸合酶基因(NC_003272.1)设计一对包含一个Nde I位点的正向引物gltAF和包含一个Xho I位点的反向引物gltAR的引物，其中，正向引物的序列gltAF:5′-AAATGTGCATATGATGGTGTGCGAATACAAGCCTG-3′，反向引物gltAR：5′-AGCCGCTCGAGTTATTCCCCAGCTTTTAACGTTGGTCAA-3′；
2)构建重组表达质粒：以鱼腥藻PCC 7120全基因组DNA为模板，利用PCR扩增技术，得到含Nde I和Xho I酶切位点的目的基因片段如图1，其中PCR扩增条件：94℃预变性3min；94℃，30s；58℃，30s；72℃，2min；循环30次；72℃延伸5min，将目的基因片段与载体pET-28b，通过Nde I、Xho I双酶切，在16℃连接22h，转化到E.coli DH5α通过T4 DNA连接酶连接，筛选出阳性转化子，获得重组质粒pET-28b-gltA，重组质粒进行DNA测序鉴定；
3)宿主菌转化：将E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞从-80℃冰箱中取出来置于冰上复苏10min；取5μL pET-28b-gltA重组质粒，加入到感受态细胞中并轻轻混匀，冰浴30min，为防止菌体沉淀需要不时地摇晃几次；42℃水浴热激90s，迅速放置到冰上2min，使其冷却；加入500μL没有抗性的LB培养基并混匀，然后于37℃下振荡培养1h；将吸取的100μL转化的菌体涂布于含有卡那霉素(Kan)抗性的LB平板上，正置培养1h，再于37℃温箱中倒置培养过夜。
一种表达耐热柠檬酸合酶的基因工程菌的方法，具体步骤如下：挑单菌落接种到含卡那霉素30μg/mL和氯霉素30μg/mL的5mL LB液体培养基中置于恒温摇床于37℃，225rpm振荡过夜培养；第二天吸取1mL过夜培养液转入装有200mL的含卡那霉素30μg/mL和氯霉素30μg/mL的LB培养基的锥形瓶中，置于恒温摇床于37℃，225rpm振荡培养到菌体浓度OD600达0.4，加入100μL IPTG至终浓度0.5mM诱导表达，然后置于恒温摇床于20℃，180rpm继续诱导培养20h；于4℃，5000rpm离心5min，重复4次，收集菌体。
取收集的菌体，加入20mL，pH值为8.0细胞破碎LEW Buffer缓冲液(LEW buffer(1L)含有NaH2PO4 7.8g，NaCl 17.54g)，涡旋振荡重悬；再置于超声波破碎仪中进行破碎细胞，破碎：1s，间歇：2s，共45min，破碎后于4℃，12000rpm离心30min，分离上清，用Co2+离子亲和柱纯化目的蛋白，用SDS-PAGE检测纯化的目的蛋白，结果如图2，在43kDa处有单一特异性很高的条带，说明纯化后的蛋白的纯度较高(95﹪以上)。
实施例2
1、耐热柠檬酸合酶(CS)的测定：柠檬酸合酶可催化乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合生成柠檬酸和辅酶A，其活性测定方法参照Srere等的DTNB法。DTNB(5，5’-二硫代-2-硝基苯甲酸)为Ellman试剂，在硫基化合物的存在下，无色的DTNB将被转变为黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸。由于5-巯基-2-硝基苯甲酸在412nm处具有最大吸收峰，因此通过监测A412nm的变化即可测定酶的活性。测定方法如下：
反应体系：Tris-HCL(pH 8.0)、草酰乙酸、乙酰辅酶A、DTNB。
按上述反应体系(1mL)，995μL反应液加入5μL纯化后的酶液，颠倒混匀；用Cary300Bio UV-Visible分光光度计，412nm下测定。
2、pH对耐热CS的影响
配制不同pH的Glu-NaOH缓冲液(pH 8.0～10.5)；在标准的反应体系中，用不同pH的Glu-NaOH缓冲液(pH 8.0～10.5)检测酶的活力(每个实验独立重复3-4次)，做出折线图，见图3，确定最适pH，经测量耐热CS在pH为9反应活性100％，具有耐弱碱性。
3、温度对耐热CS的影响
a.将酶溶液放在60℃的水浴中孵育，每隔一段时间取出一份放冰上冷却5min。在标准的反应体系下检测酶的残余活力(每个实验独立重复3-4次)；分析酶在60℃下的热稳定性见图4，耐热CS的在60℃下经过6h的孵育后，酶活性仍维持在80％，具有耐热且酶活高的特性，为其更好的应用于柠檬酸的工业生产提供了一定的基础，耐热且酶活高的特性有利于降低工业生产柠檬酸的制造成本。
b.在标准的反应体系中，用pH 8.0的Tris-HCL缓冲液，将酶溶液分别放在10-70℃水浴中孵育20min，取出后立即放在冰上冷却5min。在标准的反应体系下检测酶的残余活力(每个实验独立重复3-4次)；做出折线图，见图5，耐热CS在63℃之前酶活性一直保持在95％以上，具有较高的酶活性，有利于工业生产的应用，提高工业生产效率，缩短生产时间，降低生产成本。
上面对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 安徽师范大学
<120> 一种耐热柠檬酸合酶的基因、含有该基因的工程菌及其表达方法
<130> 2018.10.9
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1137
<212> DNA
<213> 鱼腥藻(Anabaena sp）
<400> 1
atgatggtgt gcgaatacaa gcctggttta gaaggcattc ccgccgccca atcgagtatc 60
agttatgtag atgggcaaaa gggaatacta gaatatcgtg gcatccggat tgaggattta 120
gcccagcaaa gtacttttct ggagactgct tatcttttaa tctggggtga gttgccaaca 180
aaagaagaat tgcaagtatt tgaggaggaa gtccgtcttc atcggcggat taaataccgg 240
attcgggata tgatgaagtg ctttcccgaa tctggtcatc caatggatgc actccaagcc 300
tctgcggcgg ctttaggctt gttttactcc cgtcgagatt tgcacaatcc tgcctatatt 360
cgggatgctg tagtgcggct aatagctact attccgacga tggtagctgc attccagttg 420
atgcggaaag gtaatgaccc cgttaagccc cgtgatgatt tagattattc cgccaatttt 480
ctctacatgc tcaacgagaa agaaccggat gctttggcgg caaaaatctt tgatatctgc 540
ttgattctcc atgtcgagca tacgatgaat gcttccacct ttagtgctag ggtaacagct 600
tccaccttga ctgacccgta tgcggtggtt gctagcgctg tggggacttt aggagggcct 660
ttacacggtg gagccaatga agaagtaatc cagatgttgg aagagattgg ttccgtggag 720
aatgtgcgtt cttatgtcga ggagaggttg caacgtaaag acaagctcat gggctttgga 780
catcgtgtct acaaagttaa agacccacgg gcgacaattt tgcaaggcct cgcagaacag 840
ttgtttgcca agttcggcgc agataagtat tacgacatcg cccaagaaat ggaacgggta 900
gtcgaagaga aacttggtca taaagggatt tatcccaatg ttgacttcta ctctggttta 960
gtgtatcgga agatgggtat tcctacagac ttgtttacac caatctttgc gatcgctcgt 1020
gttgctggtt ggttagccca ctggaaagaa caactcgaag agaaccgcat tttccgtcct 1080
acccaggttt acaacggcaa acacagtgtt acctacaccc ccattgacca acgttaa 1137

Claims (9)

1.一种耐热柠檬酸合酶的基因，其特征在于，该耐热柠檬酸合酶的基因具有SEQ IDNO.1的碱基序列。
2.一种耐热柠檬酸合酶的基因工程菌，其特征在于，该工程菌构建方法包括引物设计、构建重组表达质粒和宿主菌转化，具体步骤如下：
1)引物设计：根据鱼腥藻PCC7120柠檬酸合酶基因(gltA)的基因序列设计出引物；
2)构建重组表达质粒：以鱼腥藻PCC 7120全基因组为模板，利用PCR扩增技术，得到含Nde I和Xho I酶切位点的目的基因片段，将目的基因片段与载体pET-28b同时双酶切后通过T4DNA连接酶连接，得到重组表达质粒pET-28b-gltA。
3)宿主菌转化：将重组质粒pET-28b-gltA转化到宿主菌感受态细胞中，经过抗性筛选后，获得表达耐热型柠檬酸合酶的基因工程菌。
3.根据权利要求2所述的耐热柠檬酸合酶的基因工程菌，其特征在于，所述引物为包含一个Nde I位点的正向引物gltAF和包含一个Xho I位点的反向引物gltAR，其中，正向引物的序列gltAF:5′-AAATGTGCATATGATGGTGTGCGAATACAAGCCTG-3′，反向引物gltAR：5′-AGCCGCTCGAGTTATTCCCCAGCTTTTAACGTTGGTCAA-3′。
4.根据权利要求2所述的耐热柠檬酸合酶的基因工程菌，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌(E.coli Rosetta(DE3))。
5.根据权利要求2所述的耐热柠檬酸合酶的基因工程菌，其特征在于，所述抗性筛选的试剂为卡那霉素和氯霉素。
6.一种表达权利2-5任一所述的耐热柠檬酸合酶的基因工程菌的方法，其特征在于，具体步骤如下：将基因工程菌先进行过夜培养，取培养菌液进行二次培养，然后再进行诱导培养，离心分离，得到菌体，向菌体中加入缓冲液，超声破碎，离心，上清液即为粗酶液，并采用用亲和层析法纯化粗酶液，得纯化目标蛋白。
7.根据权利要求6所述的表达耐热柠檬酸合酶的基因工程菌的方法，其特征在于，所述过夜培养和二次培养的培养基均为含卡那霉素30μg/mL和氯霉素30μg/mL的LB液体培养基，培养条件均为转速200-225rpm，温度33-39℃。
8.根据权利要求6所述的表达耐热柠檬酸合酶的基因工程菌的方法，其特征在于，所述诱导培养的诱导剂为浓度0.5mM的IPTG诱导剂，培养条件为转速170-190rpm，温度18-22℃且诱导剂在二次培养的菌浓度OD6oo达到0.4时加入。
9.根据权利要求6所述的表达耐热柠檬酸合酶的基因工程菌的方法，其特征在于，所述缓冲液为pH值为8.0的LEW Buffer缓冲液。
CN201811208513.6A 2018-10-17 2018-10-17 一种耐热柠檬酸合酶的基因、含有该基因的工程菌及其表达方法 Pending CN109266665A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811208513.6A CN109266665A (zh) 2018-10-17 2018-10-17 一种耐热柠檬酸合酶的基因、含有该基因的工程菌及其表达方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811208513.6A CN109266665A (zh) 2018-10-17 2018-10-17 一种耐热柠檬酸合酶的基因、含有该基因的工程菌及其表达方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109266665A true CN109266665A (zh) 2019-01-25

Family

ID=65192816

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811208513.6A Pending CN109266665A (zh) 2018-10-17 2018-10-17 一种耐热柠檬酸合酶的基因、含有该基因的工程菌及其表达方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109266665A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113774072A (zh) * 2021-07-15 2021-12-10 湖南省农业科学院 柠檬酸合酶基因、柠檬酸合酶、作为靶标的应用及除草剂

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102061300A (zh) * 2010-11-27 2011-05-18 安徽师范大学 一种链霉菌柠檬酸合酶基因及其编码蛋白
CN108315289A (zh) * 2018-02-02 2018-07-24 江南大学 一种提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102061300A (zh) * 2010-11-27 2011-05-18 安徽师范大学 一种链霉菌柠檬酸合酶基因及其编码蛋白
CN108315289A (zh) * 2018-02-02 2018-07-24 江南大学 一种提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KANEKO,T.等: "ACCESSION NUMBER:BA000019.2", 《GENBANK》 *
SCHIEFER,W.等: "ACCESSION NUMBER: AJ242867.1", 《GENBANK》 *
童晋等: "油菜柠檬酸合酶基因的克隆及在逆境下的表达", 《作物学报》 *
萨姆布鲁克等著: "《分子克隆实验指南》", 31 August 2002 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113774072A (zh) * 2021-07-15 2021-12-10 湖南省农业科学院 柠檬酸合酶基因、柠檬酸合酶、作为靶标的应用及除草剂

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7098005B2 (en) Natural promoters for gene expression in C1 metabolizing bacteria
CN104673810B (zh) 一种苹果酸脱氢酶基因mimdh1及其重组表达载体
CN105331642B (zh) 一种利用L-谷氨酸氧化酶催化生产α-酮戊二酸的方法
CN104774825B (zh) 腈水解酶突变体及其应用
CN104611396B (zh) 一种生产谷胱甘肽的方法
CN104673809B (zh) 一种苹果酸脱氢酶基因及其重组表达载体
CN105838729B (zh) 一种新型高活力蒜氨酸酶及其制备方法
CN105296509B (zh) 一种苹果酸脱氢酶基因rkmdh2及其重组表达载体
CN109266665A (zh) 一种耐热柠檬酸合酶的基因、含有该基因的工程菌及其表达方法
CN103205391A (zh) 一种基因工程菌及其应用
CN104774829B (zh) 一种比酶活和稳定性提高的融合型腈水合酶
CN105838724B (zh) 一种苹果酸脱氢酶基因rgmdh1及其重组表达载体
CN104651388B (zh) 一种高效合成乙烯的构建体及其构建方法和应用
US20170088850A1 (en) Constructs and systems and methods for engineering a co2 fixing photorespiratory by-pass pathway
CN104560917B (zh) 一种β-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶突变体及应用
CN103773783B (zh) 利用重组表达核糖磷酸转移酶生产5’-肌苷酸的方法
CN105886517B (zh) 一种苹果酸脱氢酶基因rkmdh1及其重组表达载体
CN101979589A (zh) 类单胺氧化酶C类脱水酶MaoC基因克隆及蛋白的制备方法及其应用
CN108753802B (zh) 一个苹果酸脱氢酶基因cimdh1及其重组表达载体
CN103966185A (zh) 高效合成s-腺苷同型半胱氨酸的双酶体系及其应用方法
CN110760533B (zh) 一种编码谷氨酸脱羧酶的基因、重组工程菌及其应用
CN103740684B (zh) 一种定点突变的Lambda噬菌体Int重组蛋白及其制备方法
CN106085993B (zh) 一种来源于葡萄藤伯克氏菌的酰胺酶、基因、菌株及其应用
CN114958894B (zh) 一种基于CcmK2纤维状蛋白的亚精胺合成多酶复合体的构建方法及其应用
CN106191019B (zh) 一种截短型尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶，其核苷酸序列及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190125

RJ01 Rejection of invention patent application after publication