CN113774072A

CN113774072A - 柠檬酸合酶基因、柠檬酸合酶、作为靶标的应用及除草剂

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Publication number: CN113774072A
Application number: CN202111132749.8A
Authority: CN
Inventors: 柏连阳; 李祖任; 柏浩东
Original assignee: Hunan academy of agricultural sciences
Current assignee: Hunan academy of agricultural sciences
Priority date: 2021-07-15
Filing date: 2021-09-27
Publication date: 2021-12-10
Anticipated expiration: 2041-09-27
Also published as: CN113774072B

Abstract

本发明属于新农药开发技术领域，具体涉及柠檬酸合酶基因、柠檬酸合酶、作为靶标的应用及除草剂。本发明将被异戊酸处理后的稗草样本，采用TMT定量蛋白质组学技术、非靶向GC/MS代谢组学技术和蛋白质组学和代谢组学联合分析，发现柠檬酸合酶及其檬酸合成酶基因是异戊酸抑制稗草生长的靶标酶和基因。此外，克隆和定位了柠檬酸合酶基因，并进行柠檬酸合酶体内体外活性、荧光半定量PCR和异源过表达水稻验证，柠檬酸合酶及其柠檬酸合酶基因是异戊酸抑制稗草生长的靶标酶和基因。本发明中的柠檬酸合酶和柠檬酸合酶基因是新型除草剂作用靶标，为抗性治理提供新产品和新方案，实现抗药性杂草高效精准可持续防控。

Description

柠檬酸合酶基因、柠檬酸合酶、作为靶标的应用及除草剂

技术领域

本发明属于新农药开发技术领域，具体涉及柠檬酸合酶基因、柠檬酸合酶、作为靶标的应用及除草剂。

背景技术

化学控草是现代农业的必要措施和重要标志，杂草在除草剂选择压力下进化出抗药性是必然规律和现实危害，全球已有1581例杂草生物型对167种除草剂产生抗药性且呈愈演愈烈之势，任其发展将面临“无药可用”、草害猖獗的困境。

挖掘新的作用靶标酶已是新农药创制的热点研究领域。对羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)是20世纪90年代发现的一类新型除草剂靶标酶，针对该酶的除草剂具有活性高、杀草谱广、芽前芽后均可用、残留低、环境相容性好、使用安全，无交互抗性，应用前景广大。先正达公司开发的甲基黄草酮就是以HPPD为靶标为靶标开发的除草剂，防除大多数阔叶杂草及少数禾本科杂草，尤其是所有抗三氮苯与ALS的杂草，一经上市便成为玉米田最受欢迎的除草剂品种之一。国内公司开发的小麦田除草剂双唑草酮和喹草酮均是以HPPD为靶标设计的新型除草剂，杀草谱广、活性高、安全性高。丙酮酸脱氢酶系(PDHc)是生物体内重要的氧化还原酶之一，广泛存在于高等植物、微生物及哺乳动物中，为一个复杂的多酶体系。丙酮酸氧化脱羧转化成为乙酰辅酶A是生物体内的关键代谢过程，它连接糖的有氧氧化与三羧酸循环和氧化磷酸化，其必须在丙酮酸脱氢酶系(PDHc)的催化下才能进行。华中师范大学杨光富团队采用生物合理设计合成的方法，发现HW-02化合物在较大剂量范围内对禾本科作物安全，可用于茎叶处理和杂草萌发前土壤处理，可作为小麦田、水稻、玉米等多种作物除草剂应用开发。

针对农田抗药性杂草种类多、分布广、危害重、损失大、防控技术匮乏等生产问题，研创具有自主知识产权的新型除草剂，是解决杂草危害最直接最有效的途径，特别是以作用靶标酶为研究蛋白模型开发新型高效除草剂，为抗性治理提供新产品和新方案，实现抗药性杂草高效精准可持续防控。然而，近年来新型除草剂作用靶标鲜有报道。

发明内容

为了解决农田杂草交互抗性蔓延、药剂缺乏、靶标陈旧的技术问题，本发明选择将柠檬酸合酶基因或柠檬酸合酶作为除草剂的靶标来开发型高效除草剂。

本发明的技术方案如下：

一种柠檬酸合酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

克隆所述柠檬酸合酶基因的引物对包括CA-JBF和CA-R，所述CA-JBF的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述CA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

柠檬酸合酶基因作为除草剂的靶标的应用，柠檬酸合酶基因的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。

柠檬酸合酶作为除草剂的靶标的应用。

所述柠檬酸合酶的基因核苷酸序列全长为SEQ ID NO:1所示。

所述除草剂包含抑制柠檬酸合酶的活性或/和降低柠檬酸合酶基因转录水平的异戊酸。

所述异戊酸的质量浓度为8.3358mg/mL。

一种提高农作物的除草剂抗性的方法，方法为在农作物中过表达柠檬酸合酶基因。

本发明将被异戊酸处理后的稗草样本，采用TMT定量蛋白质组学技术、非靶向GC/MS代谢组学技术和蛋白质组学与代谢组学联合分析，发现柠檬酸合酶及其柠檬酸合酶基因是异戊酸抑制稗草生长的靶标酶和基因。此外，克隆和定位了柠檬酸合酶基因，进行柠檬酸合酶体内体外活性、荧光半定量PCR、分子对接和异源过表达水稻抗性验证，柠檬酸合酶及其柠檬酸合酶基因是异戊酸抑制稗草生长的靶标酶和基因。本发明中的柠檬酸合酶和柠檬酸合酶基因是新型除草剂作用靶标，为抗性治理提供新产品和新方案，实现抗药性杂草高效精准可持续防控。此外异戊酸对杂草的抑制效果为得到一种新型除草剂提供一种新途径。

附图说明

图1不同浓度异戊酸对稗草的室内生物活性。

图2不同浓度异戊酸对不同杂草的室内生物活性的影响。

图3稗草具有可分蘖特性。

图4 TMT定量蛋白质组学生物信息分析基本流程图。

图5蛋白定量标准曲线。

图6异戊酸处理稗草叶片SDS-PAGE电泳图。

图7异戊酸处理稗草0h-0.5h后各处理组与对照组间显著差异通路的KEGG富集分析图。

图8异戊酸处理稗草0h-1h后各处理组与对照组间显著差异通路的KEGG富集分析图。

图9异戊酸处理稗草0h-2h后各处理组与对照组间显著差异通路的KEGG富集分析图。

图10异戊酸处理稗草0h-4h后各处理组与对照组间显著差异通路的KEGG富集分析图。

图11异戊酸处理稗草0h-8h后各处理组与对照组间显著差异通路的KEGG富集分析图。

图12代谢组数据生物信息学分析流程。

图13异戊酸处理稗草后各处理组与对照组的PCA得分图。

图14异戊酸处理稗草0.5h后与对照组间多元统计得分图及响应排序检验图。

图15异戊酸处理稗草1h后与对照组间多元统计得分图及响应排序检验图。

图16异戊酸处理稗草2h后与对照组间多元统计得分图及响应排序检验图。

图17异戊酸处理稗草4h后与对照组间多元统计得分图及响应排序检验图。

图18异戊酸处理稗草8h后与对照组间多元统计得分图及响应排序检验图。

图19异戊酸处理稗草后0h-0.5h后各组与对照组间显著差异代谢通路富集图。

图20异戊酸处理稗草后0h-01h后各组与对照组间显著差异代谢通路富集图。

图21异戊酸处理稗草后0h-2h后各组与对照组间显著差异代谢通路富集图。

图22异戊酸处理稗草后0h-4h后各组与对照组间显著差异代谢通路富集图。

图23异戊酸处理稗草后0h-8h后各组与对照组间显著差异代谢通路富集图。

图24异戊酸处理稗草后0.5h组与对照组间差异代谢物相关酶和差异蛋白通路分析。

图25异戊酸处理稗草后0.5h组与对照组间代谢通路KEGG top20富集气泡图。

图26异戊酸处理稗草后0.5h组与对照组间代谢途径基于omicsbean云平台的整合网络图。

图27基于KEGG数据库的蛋白代谢整合碳代谢通路图。

图28基于KEGG数据库的蛋白代谢整合通路图。

图29柠檬酸合酶定量标准曲线。

图30异戊酸处理稗草后处理组与对照组的柠檬酸合酶活性。

图31稗草柠檬酸合酶基因表达量对异戊酸的响应。

图32异戊酸处理对稗草叶绿体超微结构的影响。

图33稗草柠檬酸合酶基因CS同源扩增电泳结果。

图34稗草柠檬酸合酶基因CS亚细胞定位。

图35异戊酸与柠檬酸合酶分子对接结果。

图36稗草柠檬酸合酶体外表达纯化SDS-PAGE分析。

图37不同浓度异戊酸对稗草柠檬酸合酶体外活性的影响。

图38重组载体质粒测序比对图。

图39不同浓度异戊酸处理异源过表达水稻(OE)和野生型水稻(WT)结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清晰、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

试验例

1.材料与方法

1.1试验试剂

N,N,N,N-四甲基二乙胺(TEMED)均购自美国卡迈舒公司；蛋白酶抑制剂(PMSF)，TEAB缓冲液，考马斯亮蓝G-250购自德国西格玛公司；胰蛋白酶(trypsin)购自美国普洛麦格公司；质谱级乙腈和水购自赛默飞世尔公司；Tris-HCl、溴酚蓝(Bromophenol blue)、BCA蛋白浓度测定试剂盒，SDS样品裂解液购自碧云天公司；异戊酸(化学分析，99％)吡啶、正己烷、O-甲基羟胺盐酸盐(97％)、BSTFA+1％TMCS均购自CNW公司；柠檬酸合酶活性测定试剂盒购自上海茁彩生物科技有限公司；氯仿、丙酮、甲醇等购自国药集团化学试剂有限公司；L-2-氯苯丙氨酸购自上海恒创生物科技有限公司。所有化学药品和溶剂均为分析纯或色谱级。

1.2仪器设备

2.电泳仪Mini PROTEAN tetra Cell(美国Bio-Rad公司)；全自动样品快速研磨仪：FSTPRP，拓赫机电科技(上海)有限公司；超声波清洗机：YD-1036，常州市佑达超声波设备有限公司；漩涡振荡器：Vortex-G2，杭州聚同电子有限公司；台式高速冷冻离心机：H1850R，湖南湘仪离心机仪器有限公司；冷冻浓缩离心干燥器：TC-LNG-T98，北京同德创业科技有限公司；气浴恒温振荡器：VS-QDH，无锡沃信仪器制造有限公司；真空干燥箱：ZKGT-6053，深圳市澳德玛电子科技有限公司。

1.3异戊酸室内杀草谱测定

供试杂草靶标：稗草(Echinochloa crusgalli)小白菜(Brassica campestris)、蒲公英(Taraxacum mongolicum)、通泉草(Mazus japonicus)。将上述杂草种子分别播于内径为8cm的一次性塑料杯中，播后覆土0.5cm，镇压、淋水后置于温室培养(16h光照100-120μmol.m^-2.s^-1，保持22/18℃)。待杂草长至6叶期时，进行异戊酸处理。0.1、0.2、0.5、1、2g异戊酸分别加入丙酮溶解，加入吐温80，用水稀释成浓度梯度为0.1、0.2、0.5、1、2mg/L的溶液(稀释后丙酮浓度不高于2％，吐温80浓度为0.8％)，观察不同浓度对稗草等靶标杂草幼苗的生长状况，记录测量稗草等杂草地上部分重量。数据采用SPSS、DPS软件进行单因素显著性分析，结果为平均值±标准差。数据DPS软件进行分析计算抑制中浓度EC₅₀的95％置信限及相关系数。

异戊酸抑草效果：结果如图1-2和表1所示，室内杀草谱试验结果发现，异戊酸对稗草、小白菜、蒲公英、通泉草表现出较高的除草活性。其中，通泉草(EC₅₀＝9.16mg/mL)、小白菜(EC₅₀＝5.20mg/mL)、蒲公英(EC₅₀＝7.44mg/mL)，EC₅₀值均小于稗草(EC₅₀＝8.34mg/mL)，抑制活性较高。异戊酸表现出一种灭生性、快速杀草、杀草谱广的特性。

表1异戊酸室内杀草谱活性测定

Tab1 The determination of isovaleric acid herbicidal activity toweeds

注：Y,杂草鲜重(g)；x,化合物重量(g).

Note:Y,weed fresh biomass(g),x,compounds weight(g).

2.异戊酸抑制稗草叶片的多组学分析

2.1试验材料

稗草于湖南省长沙县高桥镇田间收集种子保存，将一粒种子用赤霉素催芽，放置于内径为5cm的小盆内，于16h光照、光强100-120μmol.m^-2.s^-1、温度18-20℃条件下培养。利用稗草可以分蘖的特征，在稗草产生分蘖时，便将其剥离至另一盆子内。当移栽到15盆稗草时，统一将其剪掉上半部分茎叶，待再生幼苗长至8叶期时进行处理(图3)。

2.2稗草叶片样品收集

施药前收集稗草叶片15份，每份0.1g，剪取后立刻用锡箔纸包好放入液氮中。用喷雾塔均匀喷施8.3358mg/mL异戊酸水溶液，于施药后0.5h、1h、2h、4h、8h收集样品，各剪取15份，每份0.1g，剪取后立刻用锡箔纸包好放入液氮中。

2.3 TMT定量蛋白质组学技术

将收集到的0h、0.5h、1h、2h、4h和8h的稗草叶片各3份，即每个处理3个重复，用于蛋白质组学分析。提取样品中总蛋白，一部分用于蛋白浓度测定及SDS-PAGE检测，另一部分进行胰蛋白酶酶解及标记，然后取等量的各标记样品混合后进行色谱分离，最后对样品进行LC-MS/MS分析及数据分析。

色谱条件：样品以3μL/min的流速上样到C18预柱上，维持流速冲洗脱盐10min。分析柱是C18反相色谱柱。流动相A相：乙腈-水-氨水(体积比2：98：0.1)；流动相B相：乙腈-水-氨水(体积比95：5：0.1)；流速：300nL/min(朱燕芳,2018)。

梯度洗脱条件：0-0.5min，94％-93％A；1-45min，91％-72％A；49-60min，75％-61％A；61-61.1min，60％-14％A；62-65min，15％A；67-67.1，15％-95％A；68-69min，95％A(朱元元,2018)。

质谱条件：喷雾电压为2.4Kv，气帘气压为35PSI，雾化气压为12PSI，加热器温度为150℃，扫描方式为信息可靠的采集工作模式，一级全扫扫描范围为m/z 400-1500，扫描时间为250ms，每次采集工作循环可达40个电荷为+2到+4且单秒计数大于260的二级图谱，扫描范围为m/z 100-1500，扫描时间为80ms，碰撞室能量设定适用于所有前体离子碰撞诱导解离(CID)，设定动态排除16s。

明确可信蛋白数量和种类及差异显著性，进一步解析存在差别的蛋白功能，主要解析差异蛋白的基因本体富集、通路、蛋白互作，面对多个比较组数据的情况，进一步分析表达模式聚类热图和韦恩分组。实验原始数据采用Proteome Discoverer(v.2.2)软件(美国赛默飞世尔公司)分析，所用数据库为蛋白质库(Uniprot)的禾本科数据库(孙鹤,2018)。具体流程见图4所示。

以标准蛋白浓度为横坐标，OD₅₆₂为纵坐标制作标准曲线图，求出回归方程。OD₅₆₂值对BSA浓度的标准曲线见图5。

取5μL待测样品稀释5倍，测定稀释后样品的吸光度，求取吸光度平均值，代入图5中方程中，求得样品稀释后的浓度，样品稀释的浓度乘以5便是样品的实际浓度，结果见表2。

表2待测样品吸光度及浓度

Table 2 Absorbancy and concentration of sample

SDS-PAGE测定结果如图6所示，分子量由上到下分别为：116，66.2，45，35，25，18.4(KDa)。

样品经LC-MS/MS检测、搜库后，FDR<1％的蛋白数目，异戊酸处理稗草叶片定性蛋白1含蛋白4019个，定量蛋白1含蛋白3784，定性蛋白2含蛋白3956个，定量蛋白2含蛋白3385，定性蛋白3含蛋白3873个，定量蛋白3含蛋白3511，

首先采用LC-MS手段解析酶解标记后的样品，然后比对图谱功能数据库。研究对象为稗草，由于该对象为非模式物种，故映射水稻功能数据库进行分析。

我们以Score Sequest HT>0且unique peptide≥1为定量遴选指标，将映射功能数据库的结果去掉空白值，从而确定可信蛋白种类、差异倍数等信息。筛选结果为：三组可信蛋白1、2、3中分别遴选出3507、3159、3196个可信蛋白；三者均鉴定到的可信蛋白有2112个。

基于上一步结果，获取的可信蛋白及其差异倍数FC值和差异显著性p-value值作为评价差异蛋白的定量指标。我们将FC>1.2或FC<5/6且p<0.05作为衡量值遴选差异蛋白。依据此可知，0h-0.5h差异蛋白数目725个，上调170个，下调555个；0h-1h差异蛋白数目884个，上调110个，下调774个；0h-2h差异蛋白数目451，上调253个，下调198个；0h-4h差异蛋白数目667个，上调481个，下调186个；0h-8h差异蛋白数目788个，上调621个，下调167个。异戊酸处理稗草后p-value值最小的前10位差异蛋白见表3。

表3异戊酸处理稗草后各组与对照组间显著差异蛋白动态变化

Table 3 Dynamic changes of significance difference protein onbarnyard grass with isovaleric acid

从图7-11的KEGG通路分析结果可知：0h-0.5h组差异蛋白参与的前五个KEGG通路是碳代谢(Carbon metabolism)、蛋白酶体(Proteasome)、TCA循环(Citrate cycleTCAcycle)、光合作用(Photosynthesis)、氨基酸生物合成途径(Biosynthesis of aminoacids)；0h-1h组差异蛋白参与的前五个KEGG通路是碳代谢、核糖体(Ribosome)、蛋白酶体、TCA循环、光合作用；0h-2h组差异蛋白参与的前五个KEGG通路是光合作用、代谢途径(Metabolic pathways)、碳固定(Carbon fixation in photosynthetic organisms)、次生代谢物生物合成途径(Biosynthesis of secondary metabolism)、碳代谢；0h-4h组差异蛋白参与的前五个KEGG通路是光合作用、代谢途径、碳固定、次生代谢物生物合成途径、碳代谢；0h-8h组差异蛋白参与的前五个KEGG通路是代谢途径、碳代谢、光合作用、丙酮酸代谢(Pyruvate metabolism)、次生代谢物生物合成途径。

2.4非靶向GC/MS代谢组学技术

将收集到的0h、0.5h、1h、2h、4h和8h的稗草叶片各8份，即每个处理8个重复，用于代谢组学分析。

称取50μg样本，置于离心管(规格为1.5mL)；按顺序添加两颗小钢珠，355μL冷甲醇和39μL的甲醇为溶剂的0.3mg/mL的L-2-氯-苯丙氨酸，在-80℃冰箱中放置2min。从冰箱中取出后研磨2min，然后再超声30min。分步加入200min的氯仿和400μL的水，均匀混合，超声提取30min。4℃低温离心10min(12000rpm)，吸300μL的上清液，放入玻璃衍生瓶中，制备成一个待测样本提取液。质控样本是吸取全部样本的提取液等量组合而成，每个质控样本的体积与待测样本相同。将玻璃衍生瓶中的样品置于冷冻浓缩离心干燥器中干燥液体。

移入70μL的15mg/mL甲氧胺盐酸盐吡啶溶液至玻璃衍生瓶中，涡旋震荡2min，在温度设置37℃的震荡培养箱中肟化90min。向玻璃衍生瓶再加入70μL的BSTFA(含1％TMCS)衍生试剂和20μL的正己烷，涡旋震荡2min，在温度设置37℃的震荡培养箱中肟化60min。取出玻璃衍生瓶，置于室内30min后，送样入气质色谱联用仪中测定。

色谱条件：DB-5MS毛细管柱，载气为为He，纯度高于99.99％，进样速度为1.0mL/min，进样口温度设置为260℃。进样量1μL，不分流进样，溶剂滞后5min。升温程序：柱温箱的初始温度为60℃，以8℃/min的速度升高到125℃，4℃/min升高到210℃；5℃/min升高到270℃，10℃/min升高到305℃，最后维持3min。质谱条件：EI离子源，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，电子能量70eV。以全扫描模式的方式，从扫描m/z 60至m/z 450。

在获得原始GC/MS数据后，紧接着可视化检查全部样本的TIC。利用ChemStation软件将经检查后D格式的气质原始数据转变成CDF通用格式数据，把转换后的数据导入ChromaTOF软件中预处理，包括峰提取、去噪音、反卷积等，然后比对Fiehn数据库，定性分析代谢物，将峰谱对齐，从软件中备份CSV格式的三维数据矩阵，并以此作为下一步处理的原始数据矩阵。

将原始数据矩阵中的数值计算为log2值(当原始矩阵中的0则用0.000001替代，再计算)后，导入SIMCA软件包，各样本间的总体分布和整个分析过程的稳定性通过采用无监督的主成分分析(PCA)来衡量，各组间代谢轮廓的总体差异则用有监督的(正交)偏最小二乘法分析(OPLS-DA)来评判，从而明确各组间代谢差异。为防止模型过拟合，采用七次循环交互验证和200次响应排序检验(response permutation testing，RPT)的方法来考察模型的质量。

各样本间的差异代谢物是通过多维和单维联合分析来遴选，衡量的标准为OPLS-DA模型第一主成分的VIP值大于1，t检验返回的p值小于0.05。计算差异代谢物在两组样本中的平均含量，并以两者的比值来衡量差异代谢物的变化倍数FC(Fold change)。把差异代谢物映射到KEGG数据库，从而获得该代谢物ID，利用MBROLE软件分析通路功能，富集差异代谢物的KEGG pathway，具体的代谢组数据生物信息学分析流程图如图12所示。

所有处理样本的TIC经可视检查后，可知从信号、峰容量且保留时间等指标来看全部样本的质谱检测都具有较好的可重复性、结果可靠。所有样品处理后经质谱检测，总共有1336个物质峰，348个代谢物。GC/MS原始数据经预处理后，比对Fiehn数据库，导出了CSV格式的三维数据矩阵，去掉假阳性峰后，再进行归一化处理得到可用于后续分析的数据矩阵。数据矩阵转换后导入SIMCA软件，进行PCA分析。所有处理组和对照组整体PCA分析，R2X值为0.546(大于0.5)，加之从图中看出质控样本(QC)聚集在一起，可知该PCA模型可靠，用于解释两组样本之间的代谢差异可信(图13)。分别对0.5h/0h、1h/0h、2h/0h、4h/0h、8h/0h两两进行PCA、PLS-DA、OPLS-DA及RPT分析，各组间的模型参数见表4，各组间的得分图(Scoresplot)和OPLS-DA模型的200次响应排序检验图见(图14-18)。从表4，可知各组间的R2Y和Q2Y直线的斜率接近水平直线，Q2均小于零，PLS-DA和OPLS-DA模型可很好地解释和预测两组样本之间的差异。

我们将处理组和对照组间差异代谢物衡量指标值定为OPLS-DA模型第一主成分的VIP值大于1，t检验返回的p值小于0.05，p<0.05表示显著，p<0.01表示非常显著；差异代谢物在两组中的变化倍数大于1表示表达量上调，变化倍数小于1表示表达量下调。可知，0.5/0h两组显著差异代谢物有60种，其中上调33种和下调27种；1/0h两组间显著差异代谢物有68种，其中上调36种和下调32种；2/0h两组间显著差异代谢物有117种，其中上调68种和下调49种；4/0h两组间显著差异代谢物有142种，其中上调73种和下调69种；8/0h两组间显著差异代谢物有144种，其中上调70种和下调74种。我们依据p值的大小，从每组中选取10种p值最小的显著差异代谢物构成极显著差异代谢物见表5。

我们将处理组和对照组的显著差异代谢通路中p<0.05的部分，以代谢通路名称为横坐标，以-log(p-value)为纵坐标绘制通路富集图(图19-23)。从图19可知：0h-0.5h组差异代谢物参与的前五个KEGG通路是β-丙胺酸代谢(beta-Alanine metabolism)、苯基丙氨酸代谢(Phenylalanine metabolism)、精氨酸脯氨酸代谢(Arginine and prolinemetabolism)、丙氨酸天冬氨酸谷氨酸代谢(Alanine,aspartate and glutamatemetabolism)、戊糖磷酸化途径(Pentose phosphate pathway)；从图20可知：0h-1h组差异代谢物参与的前五个KEGG通路是谷光甘肽代谢(Glutathione metabolism)、甘氨酸丝氨酸苏氨酸代谢(Glycine,serine and threonine metabolism)、缬氨酸亮氨酸异亮氨酸代谢(Valine,leucine and isoleucine biosynthesis)、戊糖磷酸化途径、硫胺代谢(Thiaminemetabolism)；从图21可知：0h-2h组差异代谢物参与的前五个KEGG通路是甘氨酸丝氨酸苏氨酸代谢(Glycine,serine and threonine metabolism)、精氨酸脯氨酸代谢、谷光甘肽代谢(Glutathione metabolism)、缬氨酸亮氨酸异亮氨酸代谢(Valine,leucine andisoleucine biosynthesis)、乙醛酸代谢(Glyoxylate and dicarboxylate metabolism)；从图22可知：0h-4h组差异代谢物参与的前五个KEGG通路是甘氨酸丝氨酸苏氨酸代谢、缬氨酸亮氨酸异亮氨酸代谢、精氨酸脯氨酸代谢、半胱氨酸蛋氨酸代谢(Cysteine andmethionine metabolism)、β-丙胺酸代谢；从图23可知：0h-8h组差异代谢物参与的前五个KEGG通路是甘氨酸丝氨酸苏氨酸代谢、缬氨酸亮氨酸异亮氨酸代谢、精氨酸脯氨酸代谢、丙氨酸天冬氨酸谷氨酸代谢、碳5分支二元酸代谢(C5-Branched dibasic acidmetabolism)。

表4异戊酸处理稗草后各处理组与对照组间多元统计分析模型参数

Table 4 Multivariate analytical model parameter in barnyard grassbetween isovaleric acid treatment and untreat

注：0h,对照；0.5h,异戊酸处理0.5h后；1h,异戊酸处理1h后；2h,异戊酸处理2h后；4h,异戊酸处理4h后；8h,异戊酸处理8h后

Note:0h,Control；0.5h,isovaleric acid treatment after 0.5h；1h,isovaleric acid treatment after 1h；2h,isovaleric acid treatment after2h；4h,isovaleric acid treatment after 4h；8h,isovaleric acid treatment after 8

表5异戊酸处理稗草后各组与对照组间显著差异代谢物动态变化

Table 5 Dynamic change of significant different metabolites inbarnyard grass between isovaleric acid treatment and untreat

2.5蛋白质组学和代谢组学联合分析

蛋白组和代谢组数据整合分析，最主要的是其pathway的整合分析。一方面我们根据差异代谢物的pathway分析结果以及差异蛋白的pathway分析结果，寻找其共同参与的pathway，进行后续综合分析。另一方面，我们通过ID转换，将蛋白和代谢物ID统一转换为KEGG格式，然后映射到KEGG数据库，获取其整合的pathway图形，直观的展现整合分析结果。后续进一步分析代谢物相关酶以及差异蛋白质之间的pathway，和通过omicsbean云平台，构建差异代谢物，差异蛋白质以及相关酶互作网络。

依据农药传播速度和异戊酸作用特点，我们选取了0-0.5h这两组的差异蛋白质和差异代谢物数据来整合分析。将差异代谢物相关酶和差异蛋白，同时基于KEGG数据库，得到他们参与的通路信息。如图24所示，p<0.01和p<0.05的通路主要有：代谢途径、氨基酸生物合成、碳代谢、TCA循环、次生代谢物生物合成、丙氨酸天冬胺酸谷胺酸代谢、乙醛酸代谢(Glyoxylate and dicarboxylate metabolism)、蛋白酶体、半胱胺酸蛋胺酸代谢、丙酮酸代谢。将差异代谢物相关酶和差异蛋白所对应的通路中所含的差异基因富集，选取前20个通路作成富集气泡图(图25)。从图25可知，差异基因最多的前四个途径是代谢途径、次生代谢物生物合成、碳代谢、氨基酸生物合成途径；差异基因显著程度最大的前两个途径是光合作用和黄酮生物合成(Flavonoid biosynthesis)。

将差异代谢物，代谢物直接相关的调控酶和差异蛋白及相关代谢通路通过omicsbean云平台，构建代谢物，代谢物相关酶、差异蛋白及代谢通路的互作网路图(图26)。从图26可知，差异比较显著的3个代谢途径为氨基酸生物合成途径(Biosynthesis ofamino acids)、碳代谢和TCA循环；差异倍数比较大的蛋白或者基因为：pet、Os03g0337900、Os03g0778100、OS06g0107700、Os03g0267300；差异倍数比较大的转录因子为L-glutamicacid(L-Glutamate)和glycine(Glycine)。从图27和图28来分析，乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)是碳代谢和TCA循环途径中的关键化合物，TCA循环中柠檬酸合酶显著下调。柠檬酸合酶及其柠檬酸合酶基因是异戊酸抑制稗草生长的靶标酶和基因。

2.6柠檬酸合酶体内活性和荧光半定量PCR验证

2.6.1柠檬酸合酶体内活性测定

将收集到的0h、0.5h、1h、2h、4h和8h的稗草叶片各3份，即每个处理3个重复，用于柠檬酸合酶活性测定，操作步骤按照试剂盒说明书进行，具体如下：

(1)将稗草样品在液氮中充分研磨；

(2)加入1mL的80％甲醇提取液，置于-20℃过夜；

(3)于4℃，8000rpm，离心20min，取上清液；

(4)上清液过C-18固相萃取柱。80％甲醇(1mL)平衡柱--上样--收集样品--移开样品后用100％甲醇(5mL)洗柱--100％乙醚洗柱--100％甲醇洗柱--循环。过柱后的样品真空干燥，保存备用；

(5)上样前加入pH7.4 PB缓冲液，混匀后室温放置30min，4℃，8000rpm，离心15min，取上清液；

(6)从室温平衡20min后的铝锡箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃冰箱；

(7)设置标准品空和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

样品孔中加入待测样本50μL，空白孔不加；

(8)除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP酶标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅温育60min；

(9)弃去液体，吸水纸拍干，每孔加满洗涤液(350μL)，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；

(10)每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min；

(11)每孔加入终止液50μL，15min，在450nm波长处测定各孔OD值；

(12)计算，各标准品及样品OD值扣除空白孔OD值后，作标准曲线，再根据样品OD值，查出相应的浓度，乘以稀释倍数(20倍)，即为样品实际浓度，单位以U/L计。

以标准CS活性为横坐标，OD450为纵坐标制作标准曲线图，求出回归方程。OD₄₅₉值对CS活性的标准曲线见图29。

稗草叶片经8.3358mg/mL异戊酸水溶液处理0h、0.5h、1h、2h、4h和8h后的柠檬酸合酶活性测定结果见图30。与0h(对照组，2.77U/L)相比，异戊酸处理后稗草叶片中的柠檬酸合酶浓度呈现下降趋势，在4h-8h趋于平稳。可知，稗草叶片受异戊酸的影响柠檬酸合酶呈现下降趋势，从体内生理学的角度验证了柠檬酸合酶是异戊酸抑制稗草生长的靶标酶。

2.6.2 qPCR柠檬酸合酶基因测定

用异戊酸(625μM)喷雾处理稗草叶片后0h、0.5h、1h、2h、4h、8h后，收集鲜叶立即置于液氮。参照Trizol改良法提取稗草叶片总RNA，反转录合成第一链cDNA。qPCR反应体系20μL:SYBR Premix ExTaqTM 10μL、引物(R和F)0.5μL、cDNA 5μL、ddH2O 4μL。反应程序:95℃30s，58℃20s，循环40次。所用引物为目的基因特异性引物qR-CS(CA-F：ATGGCGTTCTTCMGGGGCC和CA-R:TCARGCMGCVDYSTTHTTGC)和内参基因b-ACTIN引物(b-F:CACACTGGTGTCATGGTAGG和b-R:AGAAAGTGTGATGCCAGAT)。数据处理运用^2-△△CT法，比较目的基因的表达水平。利用SPSS软件中Duncan氏新复极差法进行差异显著性分析。

稗草叶片经8.3358mg/mL异戊酸水溶液处理0h、0.5h、1h、2h、4h和8h后的柠檬酸合酶基因表达量的测定结果见图31。与0h(对照组)相比，异戊酸处理后稗草叶片中的柠檬酸合酶基因表达量呈现先上升后下降趋势。从体内基因表达的角度验证了柠檬酸合酶基因是异戊酸抑制稗草生长的靶标基因。

2.7异戊酸对稗草叶片细胞器超微结构的影响

用喷雾塔均匀喷施8.3358mg/mL异戊酸水溶液于5叶期稗草叶片，于施药后0.5h、1h、2h、4h、8h收集样品。样品先用3％戊二醛固定，再经1％饿酸固定，接着系列酒精脱水，无水丙酮置换，环氧树脂浸透与包埋，放入60℃烘箱聚合48h。修样后用超薄切片机切片，用醋酸铀、柠檬酸铅双重染色，在日立H-7500型透射电镜下观察叶片细胞器超微结构并拍照，结果见图32。A：CK。B：异戊酸处理0.5小时后的叶片。C：异戊酸处理1小时后的叶片。D：异戊酸处理2小时后的叶片。E：异戊酸处理4小时后的叶片。F：异戊酸处理8小时后的叶片。G，H：异戊酸处理24小时后的叶片。CW：Cell Wall，细胞壁；G：Granum，基粒；SL：Stromal Lamellae，基质片层。Bar＝1μm。

对照组中，叶绿体形态结构正常，多呈梭形，其内基粒类囊体排列紧密，基质片层清晰可见，排列致密整齐(A)。经羊脂酸处理0.5h后，叶绿体膨胀成椭圆形，膜结构模糊，基质片层排列紊乱，部分发生弯曲并膨胀现象，少数基质片层结构模糊不清、无法辨认，但基粒类囊体排列仍较为紧凑(B)。随着异戊酸处理时间增加，叶绿体内部基质片层和基粒类囊体排列的紊乱程度逐渐加剧，基粒严重变形，体积变小，基质片层含量减少，呈线状分布(C-G)。其中，经异戊酸处理24h后的叶片，叶绿体内部囊泡化(G)，并且有少数叶绿体膜和类囊体膜溶解，内部基粒和基质降解成为絮状物质，结构完全破毁(H)。由此可见，异戊酸严重破坏了叶绿体的超微结构。

2.8稗草柠檬酸合酶基因全长克隆和亚细胞定位

多个近缘物种中单子叶植物同源基因的cDNA序列，通过软件比对分析ORF 5’端和3’端序列的保守性。其中5’端包含起始密码子区域保守性较强，可直接设计简并引物，而3’端终止密码子区域保守性弱，只能往上游区间设计简并引物。

表6基因克隆所用引物

将稗草新鲜叶片用液氮研磨后，采用TRIZOL法提取总RNA，并使用Vazyme公司HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录成cDNA。用简并引物扩增目的基因，使用Vazyme公司phanta maxfidelity DNA polymerase及其PCR程序。其中CA-JBF和CA-JBR2引物对扩增产物经电泳获得特异性单一条带，切胶回收后以CA-JBR2引物测序，经与水稻同源基因参考序列比对，确认为目的基因(图33)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所述；

同源扩增结果获得目的基因包括5’端起始密码子ATG在内的主要ORF序列，但缺少3’端终止密码子序列，因此根据已经获得的核心序列设计引物，采用TAKARA公司3’FullRace Core Kit进行3’RACE。首先按照说明书利用Kit组分对稗草RNA进行反转录，产物作为模板用CA-3RACE-1和Outer Primer(Kit中组分)引物对扩增，再以该扩增产物为模板用CA-3RACE-2和Inner Primer(Kit中引物)引物对扩增，产物电泳后获得的特异性单一条带切胶回收测序。所得序列与水稻同源基因ORF比对，确认3’端终止密码子所在位置和序列。根据3’RACE结果重新设计3’下游引物CA-R，与上游引物CA-JBF配合，以稗草cDNA为模板进行扩增，扩增产物构建到T载体(pMD19-T)上，转化大肠杆菌DH5α，在Amp抗性平板上进行蓝白斑筛选，挑取抗性菌落送测序(采用T载体通用引物M13-47和M13-48双向测序)。共测序4个T克隆，其中3号与4号克隆序列一致，即以其做为目的基因全长，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

目标蛋白基因CS与荧光蛋白GFP的N端或C端融合，通过瞬时转染技术，使得该融合蛋白在受体细胞内表达，目标蛋白会牵引荧光蛋白一起定位到目标细胞器中，通过观察荧光蛋白在细胞内显示的位置，确定目标蛋白的位置。激光共聚焦结果显示目标蛋白CS蛋白定位于线粒体和细胞膜中，结果见图34。

2.9异戊酸与柠檬酸合酶分子对接

以异戊酸为配体，柠檬酸合酶作为受体进行分子对接，对接采用AutoDock VINA软件。配体和受体分子分别经过加氢预处理后,分别采用Gasteiger方法拉马克遗传算(Lamarckian GA 4.2)来计算电荷场和配体受体结合的可能构象，依据参数配体与受体的结合能bind energy)和配体的结合效率(ligand efficiency)来筛选构象,结合能越大说明结合力越强,配体效率越高表示对接结果越好。

以拟南芥CSY4蛋白(PDB:6K5V)为同源模型，经分子柔性对接发现：异戊酸与柠檬酸合酶具有较高亲合力。与Asp-361位形成氢键，距离为

并与Pro-406位形成氢键，距离为

结果见图35所示。

3.0异戊酸对稗草柠檬酸合酶体外酶活性的影响

通过构建稗草柠檬酸合酶体外表达载体pET28a-CS，转化至大肠杆菌BL21体外诱导表达。稗草柠檬酸合酶体外表达纯化SDS-PAGE分析如图36所示，经不同浓度梯度(0、0.02、0.06、0.1、0.14ug/mL)异戊酸水溶液处理4h后的柠檬酸合酶活性测定结果见图37。与0ug/mL(对照组，2.5U/L)相比，异戊酸处理后稗草叶片中的柠檬酸合酶浓度呈现下降趋势，在0.1、0.14ug/mL趋于平稳。可知，稗草叶片受异戊酸的影响柠檬酸合酶呈现下降趋势，从体外生理学的角度验证了柠檬酸合酶及其柠檬酸合酶基因是异戊酸抑制稗草生长的靶标酶和基因。

3.1异戊酸对异源过表达柠檬酸合酶基因水稻的影响

载体构建，用XbaI/BamHI双酶切载体pCambia1301-KY和2.8获得的目的基因片段，回收后连接，转化大肠杆菌DH5α。对转化子进行菌落PCR，挑取PCR阳性的转化子摇菌培养提取质粒。选取测序序列正确的质粒(测序引物：35S-F:5’GACGCACAATCCCACTATCC3’,ZT-JR:5’GAACGA GTACTGCT AGCCTG3’)。

水稻转化，将测序正确质粒转化于农杆菌EHa105，采用农杆菌介导侵染水稻愈伤，获得转基因水稻植株。对转基因植株进行PCR鉴定(引物为35S-F:GACGCACAATCCCACTATCCCA-BamHI-R:CGGGATCCTCAAGCAGCCTTGTTCTTG)，获取阳性植株。

异戊酸处理，阳性植株培养获得T₁代种子，将T₁代种子催芽，培养至二叶一心期。用不同浓度异戊酸(0，0.01，0.03，0.05，0.07，0.1g/mL)处理异源过表达水稻和野生型水稻，7d后称鲜重。

重组载体质粒测序比对结果显示：目的基因已插入载体，表达载体构建准确(图38)。经不同浓度异戊酸处理7d后，异源过表达水稻的IC₅₀值为0.0172g/mL(y＝2.0994x+8.7036,R＝0.9624)，而野生型水稻的IC₅₀值为0.0107g/mL(y＝1.0059x+6.9831,R＝0.9383)。

异源过表达水稻对异戊酸的抗性高于野生型(图39)。从遗传学的角度验证了柠檬酸合酶及其柠檬酸合酶基因是异戊酸抑制稗草生长的靶标酶和基因。

序列表

<110> 湖南省农业科学院

<120> 柠檬酸合酶基因、柠檬酸合酶、作为靶标的应用及除草剂

<141> 2021-07-15

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1419

<212> DNA

<213> Echinochloa crusgalli (L.) Beauv

<400> 1

atggcgttct tcaggggcct caccgcggtc tcgaggctgc gatcccgcgt ggcgcaggag 60

gccaccacgc tgggtggtgt gagatggctg cagatgcaga gcgcttccga tctcgatctt 120

aggtcccagt tgcaggaact gattcccgaa caacaggatc gcttaaagaa gcttaagtca 180

gagcatggaa aggtccagct tggaaacata acagtggata tggtccttgg tggaatgaga 240

gggatgactg gaatgctttg ggaaacatca ctacttgacc cagaggaggg cattcgtttt 300

aggggccttt caattccaga gtgccagcaa gtgctgccga cagcagttaa gggtggtgaa 360

cctttgcctg agggtctcct ttggcttctt ttgacgggaa aggttccaac caaagagcaa 420

gttgatgccc tatcaaagga attgctggcc cgttcaagtg tcccagctca tgtctacaag 480

gcgatagatg ctctccctgt taccgcacat cctatgacac agtttaccac tggagtaatg 540

gctcttcagg ttgagagcga atttcaaaaa gcttatgaca atggaatgcc aaaaacaaag 600

ttctgggagc ctacttatga agatgtatta aatttgattg ctcggcttcc gccagtggct 660

tcttatgttt accggaggat tttcaagaat gggaaatcaa tagaagctga caatgctctg 720

gattacgctg cgaatttttc acacatgctt ggttttgatg atcccaaaat gctggagttg 780

atgcggctct atgtaacaat tcacactgat catgaaggcg ggaatgtcag tgcgcacact 840

ggtcatctgg ttggaagtgc cctgtcagac ccttatcttt ctttcgcagc ggctctgaat 900

ggtttagctg ggccactgca tggcctggct aatcaggaag tgcttctatg gatcaaatct 960

gtaattgagg aaactgggag tgatgttaca accgatcaac tcaaagacta tgtctggaag 1020

acactaaaga gtggaaaggt tgttcctggc tttggtcatg gagttctgcg taagacggac 1080

ccacgatact catgtcaaag ggagtttgcc ctgaagcatt tgcccgaaga tccacttttc 1140

caattggtat ccaagttgta tgaagtcgtg cctcccatcc tcactgagct tggcaaggtt 1200

aagaacccat ggccgaatgt tgatgctcac agtggagttt tgctgaacca ctttggatta 1260

tctgaagccc ggtattacac tgtcttgttt ggtgtctcaa ggagcatcgg gataggatct 1320

cagctcatct gggtccgtgc ccttggctta ccactggaga ggccaaagag tgtcaccatg 1380

gagtggctgg aaaattactg caagaacaag gctgcttga 1419

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcgttct tcmggggcc 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcaagcagcc ttgttcttgc 20

<210> 4

<211> 1357

<212> DNA

<213> Echinochloa crusgalli (L.) Beauv

<400> 4

ttctttcttc tctcagtgtt agcacggcac ggacccagat gagctgagat cctatcccta 60

tgctccttga gacaccaaac aagacagtgt aataccgggc ttcagataat ccaaagtggt 120

tcagcaaaac tccactgtga gcatcaacat tcggccatgg gttcttgacc ttgccaagct 180

cagtgaggat gggaggcacg acttcataca acttggatac caattggaaa agtggatcct 240

cgggcaaatg cttcagggca aactcccttt gacatgagta tcgtgggtcc gtcttacgca 300

aaactccatg accaaagcca ggaacaacct ttccactctt tagtgtcttc cagacatagt 360

ctttgagttg atctgttgta acatcactcc cagtttcctc aattacagat ttgatccata 420

gaagcacttc ctgattagcc aggccatgca gtggcccagc taaaccattc agagccgctg 480

cgaaagaaag ataaggatcc gacagggcac ttccaaccag atgaccagtg tgcgcactga 540

cattcccgcc ttcatgatca gtgtgaattg ttacatacag ccgcatcaac tccagcattt 600

tgggatcatc aaaaccaagc atgtgtgaaa aattcgcagc gtaatccaga gcattgtcag 660

cttctattga tttcccatcc ttgaaaatcc tccggtaaac ataagaagcc actggcggaa 720

gccgagcaat caaatttaat acatcttcat aagtaggctc ccagaacttt gtttttggca 780

ttcctttgtc ataagctttt tgaaattcac tctcaacctg aagagtcatt actccagagg 840

taaactgtgt cataggatgt gcggtaacag ggagagcatc tatggccttg tagacatgag 900

ctgggacact tgaacgggcc agcactcctt tgatagggca tcaacttgct ctttggatgg 960

accttcccgt caaagaagcc aaagagaccc tcagcaaagg tcaccaccct taactgctgt 1020

cggcagcact gctgcaatcc ggaaaaaaaa ggccctaaac gaatgccctc ctctgggtca 1080

aaaagtgatg tattcccaaa gcaatccaat catccctctc attccaccaa ggaccatatc 1140

cactgatatg tttccaagct ggacctttcc atgctctgac ttaagcttct ttaagcgatc 1200

ctgttgttcg ggaatcagtt cctgcaactg ggacctaaga tcgagatcgg aagcgctctg 1260

catctgcagc catctcacac cacccagcgt ggtggcctcc tgcgccacgc gggatcgcag 1320

cctcgagacc gcggtgaggc ccctgaagaa cgccata 1357

Claims

1.一种柠檬酸合酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.扩增如权利要求1所述的柠檬酸合酶基因的引物对，其特征在于，所述引物对包括CA-JBF和CA-R；所述CA-JBF的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述CA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

3.一种柠檬酸合酶，其特征在于，所述柠檬酸合酶由权利要求1所述的柠檬酸合酶基因编码得到。

4.如权利要求1所述的柠檬酸合酶基因或权利要求3所述的柠檬酸合酶作为除草剂的靶标的应用。

5.一种除草剂，其特征在于，所述除草剂包括抑制权利要求1所述柠檬酸合酶基因的表达或降低权利要求3所述柠檬酸合酶的活性的异戊酸。

6.根据权利要求5所述的除草剂，其特征在于，所述异戊酸的质量浓度为8.3358mg/mL。

7.一种提高农作物的除草剂抗性的方法，其特征在于，所述方法为在农作物中过表达如权利要求1所述的柠檬酸合酶基因。