CN109259889A - 复合工艺制备仿生血管支架的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复合工艺制备仿生血管支架的方法，用于在生物制造领域采用同轴电纺丝技术和同轴挤出空心纤维技术复合制备具有三层结构的血管支架，此血管支架三层结构间每层都可以接种不同类型的细胞，具有真正意义上的仿生人体血管结构的支架；内外两层可以进行载药，中间层可以给细胞提供氧气，营养物质及排除代谢物；有助于血管的生长，缩短血管生长周期，具有旷阔的临床应用前景。

Description

复合工艺制备仿生血管支架的方法

技术领域

本发明涉及一种仿生血管支架的制备方法，特别是涉及一种仿生的三层复合的血管支架的制备方法，应用于生物制造技术领域。

背景技术

随着近些年的发展，心血管疾病成为危机人们生命健康的一大危害疾病之一。比如动脉硬化引起的冠心病，动脉闭塞性疾病，血管破损等。而目前主要治疗血管疾病的主要方法是血管移植，一般最佳的血管来源是自体的血管移植，但是自体血管来源有限。解决这一大难题的主要办法就是使用人工血管作为替代物，因此在临床应用上大量的人工血管作为移植代替物。

由于血管支架被广发的应用，越来越多的研究制备血管支架的工艺方法被提出来，在血管支架方面也取得了很大的进步。现有技术中，莫秀梅等发明了一种静电纺与编织技术结合制备人工血管(CN101264349，公开日2008.09.17.),马梦佳等发明了一种静电纺丝复合血管制备的方法(CN102764171A,公开日2012.11.07),以及宋春丽等发明了一种复合血管支架(CN204050425U,公开日2014.12.31),这些方法仅仅制备出了具有两层结构的血管支架；刘媛媛等发明了复合工艺制备血管支架的方法(CN104984405A,公开日2015.10.21)，虽制备出三层血管结构，其内层结构细胞粘附性差，而且细胞活性低；赵勇等发明了一种仿自然血管的三层人造血管支架及其制备方法(CN106540327A,公开日2017.03.29)和一种三层复合小口径血管支架及其制备方法(CN106668944A,公开日2017.05.17)，以及胡庆夕等发明了人工载药同轴再生血管支架及其复合工艺制备方法(CN107898533A,公开日2018.04.13)，这些方法虽然制备出复合结构的三层血管支架，但中间层都没法接种细胞。仅仅实现了三层结构的形式。

对于人体血管结构来说，其具有三层不同的结构，每一层由不同的材料和细胞组成，对于内层，其由IV型胶原蛋白和层粘连蛋白组成，内表面由内皮细胞形成内皮层；中间层是由I型和III型胶原，以及平滑肌细胞(SMCs)组成，胶原纤维和SMCs沿着血管轴呈螺旋状排列；对于外层，其由植根于疏松胶原基质的成纤维细胞组成。由此可以看出，对于不同的血管层具有不同的细胞粘附，上述制备的三层结构的血管支架，基本都不可以在中间层接种细胞进去，难以制备仿生血管结构。

基于上述背景，考虑到人体血管的结构，制备一种具有复合结构的血管支架，既能满足血管的三层结构又可以接种不同的细胞，而且满足生物活性及力学性能，从而使得到的血管支架更符合临床需求。

发明内容

为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种复合工艺制备仿生血管支架的方法，采用多种工艺复合的方法制备血管支架，不仅可以实现仿生血管的三层结构，而且可以接种不同的细胞到不同的血管层，而且结构可以有效的给细胞提供营养物质和氧气，此外其结构具有良好的生物相容性和力学性能，使得制备的血管支架更加符合临床需求。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种复合工艺制备仿生血管支架的方法，采用同轴静电纺丝方法和同轴制备中空纤维方法，进行复合制备具有三层结构的血管支架，通过静电纺丝制备复合血管支架的内层结构，采用同轴挤出方法制备空心纤维形成复合血管支架的中间层结构，采用静电纺丝制备复合血管支架的外层结构，使复合血管支架的中间层也能接种细胞，形成仿生血管结构。

作为本发明优选的技术方案，采用三层血管结构形成仿生血管结构，每一层血管结构均能接种不同的细胞；具有仿生人体真实血管的结构。

作为本发明优选的技术方案，在作为复合血管支架的中间层结构的空心纤维层中能接种平滑肌细胞进行黏附和生长，在作为复合血管支架的外层结构的静电纺丝层上能接种成纤维细胞进行黏附和生长，作为复合血管支架的内层结构的静电纺丝层上能接种内皮细胞进行黏附和生长。

作为本发明优选的技术方案，作为复合血管支架的中间层结构的空心纤维层能为空心纤维层中接种细胞进行生长提供营养液和氧气，排泄代谢物，形成营养液和氧气输运通道和代谢物排出通道。

作为本发明优选的技术方案，采用海藻酸钠溶液和壳聚糖溶液中至少一种液体材料作为同轴挤出的外层材料，采用氯化钙溶液、京尼平、戊二醛或者三聚磷酸钠溶液中至少一种液体材料作为同轴挤出的芯层材料并作为交联剂，利用同轴挤出方法，在复合血管支架的内层结构外表面包裹制备空心纤维缠绕层。

作为本发明优选的技术方案，所述复合血管支架的内层结构和外层结构采用载药同轴电纺丝制成，或者以PCL为外层并以PLA为芯层的复合材料进行同轴电纺丝制成，将药物包裹在电纺丝中制成的载药同轴电纺丝能进行药物的缓释，采用同轴结构将药物包裹在电纺丝芯部。

作为本发明优选的技术方案，所述复合血管支架的内层结构采用PLA材料载药同轴电纺丝制成，所述复合血管支架的外层结构采用PCL材料载药同轴电纺丝制成。

作为本发明优选的技术方案，所述复合血管支架的内层结构和外层结构采用载药同轴电纺丝制成；其中，采用同轴电纺丝PLA和药物复合材料，药物包括血管生长因子和抗凝血药物中的至少一种药物；其中，采用同轴电纺丝PCL和药物复合材料，药物包括抗感染药物和抗炎症药物中的至少一种药物。

作为本发明优选的技术方案，电纺丝的直径不高于200nm。

作为本发明优选的技术方案，一种复合工艺制备仿生血管支架的方法，采用同轴静电纺丝技术和同轴制备中空纤维技术复合制备具有三层结构的血管支架。它包括以下步骤：

a.称取0.8g的PLA将其置于烧杯中，再量取8ml的二氯甲烷和2ml的二甲基甲酰胺，将其全部加入到烧杯中，用锡箔纸盖住烧杯，放置两小时让其PLA全部溶解，再用玻璃棒进行搅拌，使得PLA完全溶解，然后再将溶液加入到医用注射器中，通过塑料细管连接在同轴静电纺丝喷头外通道上面，同轴喷头的内通道端通过塑料细管连接到另一个注射器，其注射器中可以添加相应的药物，如抗生素，阿司匹林以及生长因子等药物，将两个注射器安装在微量泵上面，将其同轴静电纺丝喷头安装在打印平台上面，准备静电纺丝；

b.选用不同直径的芯轴作为静电纺丝的接收装置，由于芯轴上面直接进行电纺丝后，其难以从上面取下来，因此，在芯轴的外表面缠绕一层0.2mm的铜丝，铜丝两端用胶带粘住，防止铜丝松动。将其芯轴安装在打印平台上面。即可进行静电纺丝复合血管支架的内层结构。

c.将海藻酸钠溶解在去离子水中，配成质量浓度为4％的溶液，将其注入到医用注射器中；再将氯化钙粉末溶解在去离子水中，配成质量浓度为4％的溶液，也将其加入到医用注射器中；通过塑料细管将其海藻酸钠接在同轴喷头的外层通道，将氯化钙溶液通过同样的方式接在同轴喷头的内层通道上面。然后将前面静电纺丝PLA的芯轴继续进行同轴空心纤维的接收，芯轴转动，将海藻酸钠和氯化钙成形的中空纤维紧密的螺旋缠绕在PLA层的外表面，缠满整个芯轴之后，将其取下，浸入到氯化钙溶液中，将其缠绕在外表的中空纤维进一步充分的交联，使得血管支架强度加大，保证了血管支架的强度。

d.取2g的PCL，将其加入到7ml的二氯甲烷和3ml的二甲基甲酰胺的混合溶液中，用锡箔纸盖住烧杯，防止挥发，使其溶解两个小时，然后再用玻璃棒进行搅拌，让其全部溶解然后装在医用注射器中，通过塑料细管将其连接在同轴静电纺丝喷头的外层通道上，注射器安装在微量泵上面；同理，同轴静电纺丝喷头的内通道端通过细管连接在另一个注射器，其注射器中加入一些需要抗炎症的药物或者生长因子，进行同轴电纺；将上述已经充分交联的海藻酸钠空心纤维层的芯轴继续安装在打印平台上面，然后在其外表面进行PCL的同轴载药的静电纺丝，从而成形复合血管支架的外层结构。然后将其从打印平台拿下里，将芯轴抽出来，然后再将铜丝拿掉，就可以得到具有三层结构的复合血管支架，内外两层为同轴载药的电纺丝层，中间层是同轴成形的完全交联的中空纤维层。

e.然后将其结构进行消毒，用体积浓度为75％的医用酒精浸泡12小时，并且照紫外灯，用医用注射器针头伸进中空纤维层中，进行注射清洗消毒；然后再用PBS将其血管支架进行清洗3次，同样用医用注射器伸进中空纤维层中进行清洗，避免酒精残留在其中；再将其浸泡在培养液中在紫外灯下面浸泡24小时；然后将其支架换在新的培养皿中，准备好内皮细胞悬浮液，平滑肌细胞(SMCs)悬液和成纤维细胞悬液，然后将其内皮细胞接种在内层PLA的电纺丝层，使其粘附在内表面进行生长；将平滑肌细胞悬液通过医用注射器接种进入到中空纤维层的中空通道中，使其生长成血管的中间层；将成纤维细胞接种在血管支架的外层的PCL电纺丝层，使其生长成血管的外层。然后将其放入培养箱中4小时，然后加培养液进行培养液。其中内层和外层都有载药或者生长因子，有助于细胞的生长和防止炎症的突发及凝血。其中PLA作为内层血管支架的材料，由于其载药时其药物释放速度相对较快，而且讲解速度相对较快，有助于血管内皮层的成形；用全交联的中空纤维作为芯层，有助于加强血管支架的强度，放置血管支架的坍塌或者移植时被压扁；在外层采用PCL作为材料进行同轴载药静电纺丝，由于PCL电访的结构其强度相对较高，而且PCL的药物释放速度相对来说较慢，可以进行长期的载药，有助于血管支架的移植和生长。

本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：

1.本发明方法结合了同轴电纺技术和同轴空心纤维技术制备复合的三层人工血管，本方法制备结构简单，结构层次分明；

2.本发明方法采用三层血管结构，每层上都可以进行接种不同的细胞；而且每层结构上都有助于细胞的黏附和生长；

3.本发明方法采用内外层同轴电纺工艺，可进行载药，而且电纺结构强度高，有助于细胞的黏附生长，中间层采用同轴中空纤维，不仅可以在其中接种细胞进去，而且同时可以给中间的细胞提供营养液和氧气，排泄代谢物。

附图说明

图1是本发明实施例一方法制备复合人工血管的流程图。

图2是本发明实施例一方法制备的复合血管结构的剖面图。

图3是本发明实施例一方法制备的复合血管的端面图。

具体实施方式

以下结合具体的实施例子对上述方案做进一步说明，本发明的优选实施例详述如下：

实施例一

在本实施例中，参见图1-图3所示，一种复合工艺制备仿生血管支架的方法，采用同轴电纺和同轴空心纤维技术制备复合的三层人工血管；包括如下步骤：

a.如图1所示，首先准备一根转轴，用于成形血管结构的模型，作为接收装置；也可以通过选用不同的转轴来控制制备的血管直径，如图1中(1)；

b.在转轴上面缠绕一层0.2mm的细铜丝，两段用胶带粘住，防止松动；有助于后面取下血管支架，如图1中的(2)；

c.进行血管内层结构的制备：称取0.8g的PLA将其置于烧杯中，再量取8ml的二氯甲烷和2ml的二甲基甲酰胺，将其全部加入到烧杯中，用锡箔纸盖住烧杯，放置两小时让其PLA全部溶解，再用玻璃棒进行搅拌，使得PLA完全溶解，加入到的用注射器中，安装在注射泵上，供给到同轴电纺丝喷头的外层；在其同轴电纺丝喷头的芯层用于包裹药物，如血管生长因子或者抗炎症的药物等等；材料准备好之后，安装在打印平台上面，进行电纺，其电纺丝的直径不得超过200nm，其同轴电纺丝喷头可以上下移动，接收装置可以进行左右运动；电纺一段时间，成形一层载药的电纺丝膜，其厚度可根据电纺的时间进行控制，如图1中(3)；

d.完成c步骤之后，进行制备血管中间层：将海藻酸钠溶解在去离子水中，配成质量浓度为4％的溶液，将其注入到医用注射器中；再将氯化钙粉末溶解在去离子水中，配成质量浓度为4％的溶液，也将其加入到医用注射器中；将氯化钙溶液接到同轴喷头的芯层，海藻酸钠接在同轴喷头的外层；然后将其接收平台运动到喷头下方，然后同轴喷头开始挤出成形空心纤维，转轴开始旋转并且向右运动，使得空心纤维紧密的缠绕在之前电纺的内层电纺丝层上面，如图1中的(4)所示；等整个轴都缠绕满了之后，停止平台，取下转轴，将其浸入到氯化钙溶液中，使得缠绕在转轴上的空心纤维之间能够进一步交联图1中第(5)步，增强支架的强度；

e.进行完d步骤之后，将其转轴继续安装在运动平台上面，进行制备血管的外层：取2g的PCL，将其加入到7ml的二氯甲烷和3ml的二甲基甲酰胺的混合溶液中，用锡箔纸盖住烧杯，防止挥发，使其溶解两个小时，然后再用玻璃棒进行搅拌，让其全部溶解然后装在医用注射器中，连接在同轴电纺丝喷头的外层；对于芯层，则可以继续进行载药，对于血管的外层，可以在一些抗感染药物等等，然后进行同轴电纺，使得药物包裹在电纺丝中，可以进行药物的缓释等，电纺丝的直径不得超过200nm；接收在之前的转轴上面，接收平台左右运动，均匀的电纺在转轴上面，包裹住中间层，进而成形血管外层，如图1中的(6)所示；

f.然后将转轴取下来，去掉粘铜丝的胶带，慢慢将其转轴从里面抽出来，然后再将铜丝拉出来，就可以得到具有三层结构的人工血管，如图2和图3所示；

g.然后将其血管结构进行消毒，用体体积浓度为75％的医用酒精浸泡12小时，并且照紫外灯，用医用注射器针头伸进中空纤维层中，进行注射清洗消毒；然后再用PBS将其血管支架进行清洗3次，同样用医用注射器伸进中空纤维层中进行清洗，避免酒精残留在其中；再将其浸泡在培养液中在紫外灯下面浸泡24小时；然后将其支架换在新的培养皿中，准备好内皮细胞悬浮液，平滑肌细胞(SMCs)悬液和成纤维细胞悬液，然后将其内皮细胞接种在内层PLA的电纺丝层，使其粘附在内表面进行生长；将平滑肌细胞悬液通过医用注射器接种进入到中空纤维层的中空通道中，使其生长成血管的中间层；将成纤维细胞接种在血管支架的外层的PCL电纺丝层，使其生长成血管的外层；然后将其放入培养箱中4小时，然后加培养液进行培养液；中间层空心纤微通道也可以为中间的细胞提供营养液，氧气和排掉代谢物；有助于血管的生长和移植，解决血管紧缺的临床问题。本实施例具有复合的三层血管结构，采用同轴电纺PLA与药物作为血管支架的内层，采用海藻酸钠和氯化钙溶液的同轴挤出成形空心纤维层作为血管支架的中间层，采用同轴电纺PCL与药物作为血管支架的外层。采用三层血管结构，每一层血管上面均可接种不同的细胞；具有仿生人体真实血管的结构。采用同轴电纺的PLA的内表面可以接种内皮细胞进行生长；在采用海藻酸钠和氯化钙成形的同轴挤出的空心纤维中接种平滑肌细胞；在同轴电纺的PCL的血管外层可以接种成纤维细胞；仿生人体血管的结构，有助于加快临床应用。同轴挤出的空心纤维成形的中间层不仅可以接种进行细胞，而且在培养时可以给中间的细胞提供氧气，培养液及排除细胞的代谢物，有助于细胞的生长和成形血管。本实施例血管支架内层采用同轴电纺丝PLA和药物，药物包括血管生长因子或抗凝血药物，从而将药物包裹在电纺丝中，可以进行药物的缓释，有助于血管的生长和降低凝血的几率，其中电纺丝的直径不高于200nm。血管支架外层采用同轴电纺丝PCL和药物，其药物包括抗感染药物或者抗炎症的药物，采用同轴将药物包裹在中间，也对药物起到保护作用，电纺丝的直径不高于200nm。

实施例二

本实施例与实施例一基本相同，特别之处在于：

在本实施例中，一种复合工艺制备仿生血管支架的方法，制备混合材料同轴电纺制备内层的复合血管，包括如下步骤：

a.本步骤与实施例一相同；

b.本步骤与实施例一相同；

c.进行血管内层结构的制备：采用同轴电纺混合材料制备，即称取0.8g的PLA将其置于烧杯中，再量取8ml的二氯甲烷和2ml的二甲基甲酰胺，将其全部加入到烧杯中，用锡箔纸盖住烧杯，放置两小时让其PLA全部溶解，再用玻璃棒进行搅拌，使得PLA完全溶解，加入到的用注射器中，安装在注射泵上，供给到同轴电纺丝喷头的芯层；取2g的PCL，将其加入到7ml的二氯甲烷和3ml的二甲基甲酰胺的混合溶液中，用锡箔纸盖住烧杯，防止挥发，使其溶解两个小时，然后再用玻璃棒进行搅拌，让其全部溶解然后装在医用注射器中，连接在同轴电纺丝喷头的外层；两种材料一起进行电纺，PLA降解比较快，但是强度比较底，而PCL的强度比较高，这样混合进行电纺，可以成形更加有利的血管的内层血管结构；

d.本步骤与实施例一相同；

e.本步骤与实施例一相同；

f.本步骤与实施例一相同；

g.本步骤与实施例一相同。

本实施例制备内层血管结构，以PCL为外层并以PLA为芯层的复合材料进行同轴电纺丝制成，将药物包裹在电纺丝中制成的载药同轴电纺丝能进行药物的缓释，采用同轴结构将药物包裹在电纺丝芯部。本实施例采用海藻酸钠和氯化钙溶液的同轴挤出成形空心纤维层作为血管支架的中间层，采用同轴电纺PCL与药物作为血管支架的外层。采用三层血管结构，每一层血管上面均可接种不同的细胞；具有仿生人体真实血管的结构。

实施例二

本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：

在本实施例中，一种复合工艺制备仿生血管支架的方法，包括如下步骤：

a.本步骤与实施例一相同；

b.本步骤与实施例一相同；

c.本步骤与实施例一相同；

d.完成c步骤之后，进行制备血管中间层：同样的道理，依旧使用同轴挤出空心纤微的方法制备，其喷头的外层选用壳聚糖溶液，然后在喷头的芯层选用京尼平、戊二醛或者三聚磷酸钠溶液中的一种作为交联剂，同时从同轴喷头中挤出，即可成形空心纤微；然后将其接收平台运动到喷头下方，转轴开始旋转并且向右运动，使得空心纤维紧密的缠绕在之前电纺的血管内层电纺丝层上面，等整个轴都缠绕满了之后，停止平台，取下转轴，将其浸入到对应的交联剂溶液中，使得缠绕在转轴上的空心纤维之间能够进一步交联，增强支架的强度；

e.本步骤与实施例一相同；

f.本步骤与实施例一相同；

g.本步骤与实施例一相同。

本实施例采用壳聚糖溶液作为同轴电纺丝的外层材料，采用京尼平、戊二醛或者三聚磷酸钠溶液中至少一种液体材料作为同轴电纺丝的芯层材料并作为交联剂，利用同轴挤出方法，在复合血管支架的内层结构外表面包裹制备空心纤维缠绕层。本实施例采用壳聚糖溶液和交联剂的同轴挤出成形空心纤维层作为血管支架的中间层，采用同轴电纺PCL与药物作为血管支架的外层。采用三层血管结构，每一层血管上面均可接种不同的细胞；具有仿生人体真实血管的结构。

综上所述，本发明上述实施例一种复合工艺制备仿生血管支架的方法，用于在生物制造领域采用同轴电纺丝技术和同轴挤出空心纤维技术复合制备具有三层结构的血管支架，此血管支架三层结构间每层都可以接种不同类型的细胞，具有真正意义上的仿生人体血管结构的支架；内外两层可以进行载药，中间层可以给细胞提供氧气，营养物质及排除代谢物；有助于血管的生长，缩短血管生长周期，具有旷阔的临床应用前景。

上面对本发明实施例结合附图进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明复合工艺制备仿生血管支架的方法的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种复合工艺制备仿生血管支架的方法，其特征在于：采用同轴静电纺丝方法和同轴制备中空纤维方法，进行复合制备具有三层结构的血管支架，通过静电纺丝制备复合血管支架的内层结构，采用同轴挤出方法制备空心纤维形成复合血管支架的中间层结构，采用静电纺丝制备复合血管支架的外层结构，使复合血管支架的中间层也能接种细胞，形成仿生血管结构。

2.根据权利要求1所述复合工艺制备仿生血管支架的方法，其特征在于：采用三层血管结构形成仿生血管结构，每一层血管结构均能接种不同的细胞；具有仿生人体真实血管的结构。

3.根据权利要求2所述复合工艺制备仿生血管支架的方法，其特征在于：在作为复合血管支架的中间层结构的空心纤维层中能接种平滑肌细胞进行黏附和生长，在作为复合血管支架的外层结构的静电纺丝层上能接种成纤维细胞进行黏附和生长，作为复合血管支架的内层结构的静电纺丝层上能接种内皮细胞进行黏附和生长。

4.根据权利要求2所述复合工艺制备仿生血管支架的方法，其特征在于：作为复合血管支架的中间层结构的空心纤维层能为空心纤维层中接种细胞进行生长提供营养液和氧气，排泄代谢物，形成营养液和氧气输运通道和代谢物排出通道。

5.根据权利要求1所述复合工艺制备仿生血管支架的方法，其特征在于：采用海藻酸钠溶液和壳聚糖溶液中至少一种液体材料作为同轴挤出的外层材料，采用氯化钙溶液、京尼平、戊二醛或者三聚磷酸钠溶液中至少一种与外层材料能够交联的液体材料作为同轴挤出的芯层材料并作为交联剂，利用同轴挤出方法，在复合血管支架的内层结构外表面包裹制备空心纤维缠绕层。

6.根据权利要求1所述复合工艺制备仿生血管支架的方法，其特征在于：所述复合血管支架的内层结构和外层结构采用载药同轴电纺丝制成，或者以PCL为外层并以PLA为芯层的复合材料进行同轴电纺丝制成，将药物包裹在电纺丝中制成的载药同轴电纺丝能进行药物的缓释，采用同轴结构将药物包裹在电纺丝芯部。

7.根据权利要求6所述复合工艺制备仿生血管支架的方法，其特征在于：所述复合血管支架的内层结构采用PLA材料载药同轴电纺丝制成，所述复合血管支架的外层结构采用PCL材料载药同轴电纺丝制成。

8.根据权利要求6所述复合工艺制备仿生血管支架的方法，其特征在于：所述复合血管支架的内层结构和外层结构采用载药同轴电纺丝制成；其中，采用同轴电纺丝PLA和药物复合材料，药物包括血管生长因子和抗凝血药物中的至少一种药物；其中，采用同轴电纺丝PCL和药物复合材料，药物包括抗感染药物和抗炎症药物中的至少一种药物。

9.根据权利要求1所述复合工艺制备仿生血管支架的方法，其特征在于：电纺丝的直径不高于200nm。