CN104984405A - 复合工艺制备血管支架的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复合工艺制备血管支架的方法，所述血管支架有三层结构，分别采用不同的工艺制备，其中内层材料选用PVA溶液，采用浇铸法，并进行冰冻-解冻物理交联来提高PVA的机械强度；中间层为含有平滑肌细胞的海藻酸钠，并利用氯化钙进行交联，通过挤出成形的方法，挤出的纤维绕着内层PVA膜形成螺旋结构；外层利用电纺细胞工艺，共混电纺PVA和细胞，将支架从芯轴上缓慢取下后，在内壁接种上内皮细胞。本发明利用三种工艺复合制备出的血管支架很好地模拟了天然血管的三层结构，缩短了血管支架体外培养所需的时间，在临床应用中具有广阔前景。

Description

复合工艺制备血管支架的方法

技术领域

本发明涉及一种血管支架的制备方法，应用于生物制造技术领域。

背景技术

心血管疾病，尤其是动脉硬化导致的冠心病，目前已成为人类主要死亡原因之一，其主要的治疗手段为血管移植。由于自体血管来源有限，因此临床上需要大量的人工血管作为移植替代物。

随着血管支架的广泛应用，支架的制造技术有了很大的发展，但支架的加工工艺与血管支架的各种性能有着密切的关系，如对支架的扩张性、支撑力、顺应性和易弯曲性都有很大的影响，因此对血管支架成形方法的选择直接影响着血管支架的使用性能。目前随着基因工程、细胞生物学、临床医学和材料学的飞速发展，很多国内外学者采用多种技术复合的路线构建组织工程人工血管，这也是近年来国内外的研究重点和热点。

目前制作出的血管支架由于在结构上不能很好地模拟天然血管结构，因此需要耗费较长时间对血管支架进行体外培养，使其形成类似于天然血管的结构，因此在血管支架成形工艺的选择上还有待改进。

发明内容

为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种复合工艺制备血管支架的方法，采用多种工艺复合的方法制备血管支架，不仅可以弥补采用单种工艺所带来的局限，而且能够更好地模拟天然血管的结构，缩短血管支架体外培养的时间，使得到的血管支架更符合临床的多种性能要求。

为达到上述发明创造目的，本发明采用下述技术方案：

一种复合工艺制备血管支架的方法，它包括以下步骤：

a．将PVA溶解于去离子水中，在磁力搅拌器上水浴加热并搅拌直至完全溶解，制得质量百分比浓度为10~16wt.%的PVA溶液，然后在PVA溶液还未冷却至室温时，将PVA溶液倒入到制作血管支架内层结构的模具中，此时将芯轴插入到模具中，将芯轴连同模具一起置于-20℃的冰冻箱中冰冻至少8h，然后置于室温20℃条件下解冻至少8h，如此反复3-5次，开模后将芯轴连同PVA内层膜一并取出，即在芯轴上制得管状结构的血管支架PVA内部分；在制作血管支架内层时，优选所述芯轴的直径为5-8mm，所述芯轴的材质优选采用不锈钢；

b．将在所述步骤a中制备的血管支架PVA内层膜连同芯轴在酒精中浸泡至少1h，然后用PBS溶液清洗至少3次后，再去除残余酒精；

c．向海藻酸钠溶液加入平滑肌细胞再经搅拌均匀后装载到同轴喷头的外通道料筒内，将氯化钙溶液装载到同轴喷头的内通道料筒内，然后通过挤出机构从同轴喷头的内外喷孔之间挤出管状中空纤维，同时将带有在所述步骤a中制备的血管支架PVA内层膜的芯轴与电动机连接，并以设定转速驱动芯轴转动，以血管支架PVA内层膜的外表面作为从同轴喷头挤出的管状中空纤维的接收载体，同时控制挤出机构沿芯轴方向平移，使从同轴喷头挤出的管状中空纤维在血管支架PVA内层膜的外表面上绕成螺旋结构，形成具有螺旋结构的血管支架中间层；在制作血管支架中间层时，采用的海藻酸钠溶液的浓度优选为3%(w/v)，采用的氯化钙溶液的浓度优选为3%(w/v)；血管支架中间层制备工艺优选在无菌操作台内进行；在制作血管支架中间层时，所述同轴喷头的内针头内径优选为0.6mm，内针头外径优选为0.8mm，外针头内径优选为1mm，外针头外径优选为1.2mm；

d．向另外的PVA溶液中掺入成纤维细胞并使之混合均匀后，将混合液装载到料筒中进行电纺丝，将带有在所述步骤a中制备的血管支架PVA内层膜连同在所述步骤c中制备的血管支架中间层的芯轴作为电纺丝的接收载体，然后通过电纺丝工艺在血管支架中间层之上包覆血管支架PVA外层膜，制作好由内层、中间层和外层三层结构组成的血管支架，然后将制作好的血管支架缓慢从芯轴上取下，在血管内壁接种上内皮细胞，并置于二氧化碳培养箱中进行培养，得到复合材料血管支架；在制作血管支架外层时，采用的PVA溶液的质量百分比浓度优选为8.8 wt .%；在制作血管支架外层时，喷头内径优选为0.6mm，控制电纺丝的电压优选为15kV，控制喷头出口和作为承接载体的在所述步骤c中制备的血管支架中间层外表面之间的距离优选为100mm，控制喷头的供料速优选为1.2ml/h；血管支架外层制备工艺和处理过程以及接种内皮细胞均优选在无菌操作台内进行。

本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：

1. 本发明制备的血管支架由具有生物相容性并可降解的生物材料制备，具有良好的生物相容性；

2. 本发明制备的血管支架的内层结构的PVA经过冰冻-解冻物理交联具有足够的机械强度，并且没有用到化学交联试剂，更有利于细胞的存活；

3. 本发明制备的血管支架的中间层的螺旋结构很好地模拟了血管中平滑肌细胞的有序周向排列的结构，且管状中空纤维为营养物质的传输和代谢物的排除提供了良好的环境，可缩短支架体外培养形成血管的时间；

4. 本发明制备的血管支架的外层通过静电纺丝工艺制备的纳米级纤维结构具有高的孔隙率及比表面积，为细胞粘附提供了条件；

5. 与传统的纯静电纺丝支架相比较，本发明制备的血管支架的具有更好的机械性能和临床适应性。

附图说明

图1是本发明优选实施例在制备血管支架的内层结构时采用的模具外部轮廓和轴向剖面结构示意图。

图2是本发明优选实施例制备的血管支架的内层结构示意图。

图3是本发明优选实施例制备血管支架的中间层结构采用的装置连接结构示意图。

图4是本发明优选实施例制备血管支架的内层和中间层结构示意图。

图5是本发明优选实施例制备血管支架的外层结构采用的装置连接结构示意图。

图6是本发明优选实施例制备的血管支架结构示意图。

具体实施方式

本发明的优选实施例详述如下：

在本实施例中，参见图1~图6，一种复合工艺制备血管支架的方法，它包括以下步骤：

a．将2.6g PVA溶解于17.4g的去离子水中，在磁力搅拌器上水浴加热并搅拌直至完全溶解，制得质量百分比浓度为13wt.%的PVA溶液，然后在PVA溶液还未冷却至室温时，将PVA溶液倒入到制作血管支架内层结构的模具2中，此时将直径为8mm的不锈钢芯轴1插入到模具中，再将芯轴1连同模具一起置于-20℃的冰冻箱中冰冻8h，然后置于室温20℃条件下解冻8h，如此反复4次，如图1开模后将芯轴1连同PVA内层膜一并取出，即在芯轴1上制得管状结构的血管支架PVA内部分，参见图2；

b．在无菌操作台内，将在所述步骤a中制备的血管支架PVA内层膜连同芯轴1在酒精中浸泡1h，然后用PBS溶液清洗3次后，再去除残余酒精；

c．在无菌操作台内，将0.3g的海藻酸钠溶解于去离子水中得10ml的海藻酸钠溶液，采用第二代的平滑肌细胞用胰酶消化后，以转速为1000r/min的转速离心5min，制得细胞浓度为4×10⁶个/ml的细胞悬浮液，将5ml的细胞悬浮液和10ml的海藻酸钠溶液混合，并搅拌均匀，装载到同轴喷头的外通道料筒内，再配制质量体积比为3%的氯化钙溶液并装载到同轴喷头的内通道料筒5内，参见图3，采用的同轴喷头的内针头内径为0.6mm，内针头外径为0.8mm，外针头内径为1mm，外针头外径为1.2mm，然后通过挤出机构从同轴喷头的内外喷孔之间挤出管状中空纤维，同时将带有在所述步骤a中制备的血管支架PVA内层膜的芯轴1与步进电动机3连接，并由控制器4控制以设定转速驱动芯轴1转动，以血管支架PVA内层膜的外表面作为从同轴喷头挤出的管状中空纤维的接收载体，同时控制挤出机构沿芯轴1方向平移，使从同轴喷头挤出的管状中空纤维在血管支架PVA内层膜的外表面上绕成螺旋结构，形成具有螺旋结构的血管支架中间层，参见图4；

d．在无菌操作台内，配置质量分数浓度为8.8wt.%的PVA溶液，采用第三代的成纤维细胞用胰酶消化后，以转速为1000r/min的转速离心5min，制得细胞浓度为4×10⁶个/ml的细胞悬浮液，将5ml的细胞悬浮液和5ml的PVA溶液混合，并在搅拌均匀后装载到料筒6中进行电纺丝，将带有在所述步骤a中制备的血管支架PVA内层膜连同在所述步骤c中制备的血管支架中间层的芯轴1作为电纺丝的接收载体，参见图5，然后通过电纺丝工艺在血管支架中间层之上包覆血管支架PVA外层膜，制作好由内层、中间层和外层三层结构组成的血管支架，将其缓慢地从芯轴上取下。第二代的内皮细胞用胰酶消化后，用含有10%胎牛血清的DMEM培养基配制成细胞密度为8×10⁶个/ml的细胞悬液，在血管支架内腔接种上300微升的细胞悬液，置于二氧化碳培养箱中进行培养，得到复合材料血管支架，参见图6，在制作血管支架外层时，喷头内径为0.6mm，控制电纺丝的高压电源7的电压为15kV，控制喷头出口和作为承接载体的在所述步骤c中制备的血管支架中间层外表面之间的距离为100mm，控制喷头的供料速率为1.2ml/h，参见图5。

在本实施例中，参见图1~图6，采用复合工艺制备血管支架，所述血管支架有三层结构，分别采用不同的工艺制备，其中内层材料选用PVA溶液，采用浇铸法，并进行冰冻-解冻物理交联来提高PVA膜的机械强度；中间层为含有平滑肌细胞的海藻酸钠，并利用氯化钙进行交联，通过挤出成形的方法，挤出的纤维绕着内层PVA膜形成螺旋结构；外层利用电纺细胞工艺，共混电纺PVA和细胞。本实施例利用三种工艺复合制备出的血管支架很好地模拟了天然血管的三层结构，缩短了血管支架体外培养所需的时间，在临床应用中具有广阔前景。

上面结合附图对本发明实施例进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明复合工艺制备血管支架的方法的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种复合工艺制备血管支架的方法，其特征在于，它包括以下步骤：

a．将PVA溶解于去离子水中，在磁力搅拌器上水浴加热并搅拌直至完全溶解，制得质量百分比浓度为10~16wt.%的PVA溶液，然后在PVA溶液还未冷却至室温时，将PVA溶液倒入到制作血管支架内层结构的模具中，此时将芯轴插入到模具中，将芯轴连同模具一起置于-20℃的冰冻箱中冰冻至少8h，然后置于室温20℃条件下解冻至少8h，如此反复3-5次，开模后将芯轴连同PVA内层膜一并取出，即在芯轴上制得管状结构的血管支架PVA内部分；

b．将在所述步骤a中制备的血管支架PVA内层膜连同芯轴在酒精中浸泡至少1h，然后用PBS溶液清洗至少3次后，再去除残余酒精；

c．向海藻酸钠溶液加入平滑肌细胞再经搅拌均匀后装载到同轴喷头的外通道料筒内，将氯化钙溶液装载到同轴喷头的内通道料筒内，然后通过挤出机构从同轴喷头的内外喷孔之间挤出管状中空纤维，同时将带有在所述步骤a中制备的血管支架PVA内层膜的芯轴与电动机连接，并以设定转速驱动芯轴转动，以血管支架PVA内层膜的外表面作为从同轴喷头挤出的管状中空纤维的接收载体，同时控制挤出机构沿芯轴方向平移，使从同轴喷头挤出的管状中空纤维在血管支架PVA内层膜的外表面上绕成螺旋结构，形成具有螺旋结构的血管支架中间层；

d．向另外的PVA溶液中掺入成纤维细胞并使之混合均匀后，将混合液装载到料筒中进行电纺丝，将带有在所述步骤a中制备的血管支架PVA内层膜连同在所述步骤c中制备的血管支架中间层的芯轴作为电纺丝的接收载体，然后通过电纺丝工艺在血管支架中间层之上包覆血管支架PVA外层膜，制作好由内层、中间层和外层三层结构组成的血管支架，将支架缓慢从芯轴上取下，在支架内壁接种上内皮细胞，置于二氧化碳培养箱中进行培养，得到复合材料血管支架。

2.根据权利要求1所述复合工艺制备血管支架的方法，其特征在于：在所述步骤c中制作血管支架中间层时，采用的海藻酸钠溶液的浓度为3%(w/v)，采用的氯化钙溶液的浓度为3%(w/v)。

3.根据权利要求1或2所述复合工艺制备血管支架的方法，其特征在于：在所述步骤d中制作血管支架外层时，采用的PVA溶液的质量百分比浓度为8.8 wt .%。

4.根据权利要求1或2所述复合工艺制备血管支架的方法，其特征在于：在所述步骤a中制作血管支架内层时，所述芯轴的直径为5-8mm，所述芯轴的材质为不锈钢。

5.根据权利要求1或2所述复合工艺制备血管支架的方法，其特征在于：在所述步骤c中制作血管支架中间层时，所述同轴喷头的内针头内径为0.6mm，内针头外径为0.8mm，外针头内径为1mm，外针头外径为1.2mm。

6.根据权利要求1或2所述复合工艺制备血管支架的方法，其特征在于：在所述步骤d中制作血管支架外层时，喷头内径为0.6mm，控制电纺丝的电压为15kV，控制喷头出口和作为承接载体的在所述步骤c中制备的血管支架中间层外表面之间的距离为100mm，控制喷头的供料速率为1.2ml/h。

7.根据权利要求1或2所述复合工艺制备血管支架的方法，其特征在于：在所述步骤c和步骤d中的血管支架的各层制备工艺和处理过程均在无菌操作台内进行。