CN109254153A - 肌红蛋白的抗氧化剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种肌红蛋白的抗氧化剂及其应用。一种肌红蛋白的抗氧化剂，包括咪唑类化合物。上述抗氧化剂，能够使肌红蛋白的颜色鲜艳且其活性不受影响，是一种温和的抗氧化剂。

Description

肌红蛋白的抗氧化剂及其应用

技术领域

本发明涉及一种肌红蛋白的抗氧化剂及其应用。

背景技术

肌红蛋白是一种含血色素的蛋白质，心肌及横纹肌中含量较高。在心肌梗死、肌肉损伤、药物中毒的情况下，肌细胞损坏而释放出肌红蛋白，由于肌红蛋白分子量较小(17KDa)且不与血浆蛋白质中珠蛋白结合，所以肌红蛋白一旦进入血液就容易从尿中排除，引起肌红蛋白尿，所以测定尿中或血中肌红蛋白含量是心肌梗死的一种早期诊断指标。

测定肌红蛋白并区别血红蛋白及血液中其他蛋白质的方法有很多，其中用肌红蛋白特异性抗体测定肌红蛋白的免疫学方法灵敏度高、特异性强。因此，需要纯的肌红蛋白来制备标准品。但是，肌红蛋白在体外很容易因氧化而变色，传统方法是在肌红蛋白提取过程中加入还原剂或抗氧化剂、亚硝酸盐等方法来防止肌红蛋白氧化，从而保持肌红蛋白鲜艳的颜色。但按照此方法制备的肌红蛋白的存在活性不佳的问题。

发明内容

基于此，有必要提供一种能够使肌红蛋白的颜色鲜艳且能保持其活性的抗氧化剂。

此外，还提供一种上述抗氧化剂在制备肌红蛋白检测试剂或制备肌红蛋白检测试剂盒中的应用。

还提供一种肌红蛋白检测试剂及一种肌红蛋白检测试剂盒。

一种肌红蛋白的抗氧化剂，包括咪唑类化合物。

经证实，上述抗氧化剂，能够使肌红蛋白的颜色鲜艳且其活性不受影响，是一种温和的抗氧化剂。

在其中一个实施例中，所述咪唑类化合物选自咪唑、甲硝唑、替硝唑及5-硝基咪唑中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述咪唑类化合物为咪唑。

上述抗氧化剂在制备肌红蛋白检测试剂中的应用。

一种肌红蛋白检测试剂，上述抗氧化剂。

在其中一个实施例中，还包括肌红蛋白特异性抗体。

上述肌红蛋白检测试剂在制备肌红蛋白检测试剂盒中的应用。

一种肌红蛋白检测试剂盒，包括上肌红蛋白检测试剂。

在其中一个实施例中，还包括标准品，所述标准品为添加所述抗氧化剂的肌红蛋白。

在其中一个实施例中，所述抗氧化剂与所述肌红蛋白的质量比例为1.5～2.5：1。

附图说明

图1为实施例1的肌红蛋白浓度与反应度关系的标准曲线图；

图2为实施例4的SDS-PAGE电泳图；

图3为实施例5的HPLC色谱图；

图4为实施例7的咪唑和HEPES对肌红蛋白增色效果对比图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的部分实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

一实施方式的肌红蛋白的抗氧化剂，包括咪唑类化合物。

在其中一个实施例中，咪唑类化合物选自咪唑、甲硝唑、替硝唑及5-硝基咪唑中的至少一种。进一步地，咪唑类化合物为咪唑、甲硝唑、替硝唑及5-硝基咪唑。进一步优选地，咪唑类化合物为咪唑。具体地，咪唑的结构式为：

在其中一个实施例中，抗氧化剂为粉末状或水剂。

经证实，上述抗氧化剂在保持肌红蛋白的颜色稳定的同时不影响肌红蛋白的结构、活性及稳定性，是一种温和的肌红蛋白抗氧化剂。

上述抗氧化剂在制备肌红蛋白检测试剂中的应用。

一种肌红蛋白检测试剂，包括上述抗氧化剂。

在其中一个实施例中，还包括肌红蛋白特异性抗体。

上述肌红蛋白检测试剂中，上述抗氧化剂能够保持待测样品中的肌红蛋白的颜色鲜艳的同时不影响其结构、稳定性及活性，从而待测样品中的肌红蛋白与肌红蛋白特异性抗体结合能力不受影响，避免待测样品中的肌红蛋白被氧化而影响检测结果。因此，上述肌红蛋白检测试剂的检测结果的准确性、灵敏度提高，待检样品用量需求减少。

上述肌红蛋白检测试剂在制备肌红蛋白检测试剂盒中的应用。

一种肌红蛋白检测试剂盒，包括上述肌红蛋白检测试剂。

在其中一个实施例中，肌红蛋白检测试剂盒包括标准品。标准品为添加上述抗氧化剂的肌红蛋白。当然，标准品中肌红蛋白的浓度已知。进一步地，抗氧化剂与肌红蛋白的质量比例为1.5～2.5:1。再进一步地，咪唑类化合物与肌红蛋白的质量比例为1.5～2.5:1。

在其中一个实施例中，肌红蛋白检测试剂盒还包括肌红蛋白特异性抗体。肌红蛋白特异性抗体能够与待测样品中的肌红蛋白结合以检测待测样品中肌红蛋白的含量。

进一步地，肌红蛋白检测试剂盒还包括磁珠结合物。磁珠结合物为肌红蛋白包被抗体偶联的羧基磁珠。

上述肌红蛋白检测试剂盒，包括上述肌红蛋白检测试剂，能够快速、准确地检测待样品中肌红蛋白的含量。

以下为具体实施例

以下实施例如无特殊说明，则不含有除不可避免的杂质以外的其它未明确指出的组分。

实施例1～实施例8的原料特质如下：

咪唑，Sigma公司的Imidazole。

肌红蛋白检测试剂盒：新健康城公司。

连二亚硫酸钠，广州化学试剂厂公司。

4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，AMRESCO LIFE SCIENCE公司0117C444批号。

实施例1

胶乳比浊法检测肌红蛋白的反应性

(1)将样品一和样品二分别按照1:3000、1:6000及1:12000梯度稀释。其中，样品一为含有咪唑(Sigma公司的Imidazole)的肌红蛋白溶液，咪唑的浓度为60mM，肌红蛋白为FAPON公司未经过脱盐处理的肌红蛋白，肌红蛋白的浓度为3.33mg/mL。样品二为不含咪唑的肌红蛋白溶液，肌红蛋白为FAPON公司经过脱盐处理的肌红蛋白，肌红蛋白的浓度为3.28mg/mL。

(2)采用新健康城肌红蛋白检测试剂盒，分别检测样品一及样品二经梯度稀释后的样品中肌红蛋白的反应性。其中检测参数为：S：R1：R2＝6：180：60，主波长570nm，副波长800nm，定标方式为Spline，分析方法为终点法，肌红蛋白浓度与反应度关系的标准曲线如图1所示。具体操作按照试剂盒的说明书进行。经梯度稀释的样品一和样品二中肌红蛋白的反应性的结果如表1所示。

表1

由表1可知，有咪唑组和无咪唑组的肌红蛋白的活性浓度均为其肌红蛋白浓度的70％左右，咪唑对肌红蛋白的反应性的影响小。

实施例2

酶联免疫法检测肌红蛋白的反应性

分别将样品三、样品四及样品五的FAPON抗原(批号20170228)从浓度5μg/mL开始以3倍梯度稀释包被，同时设置复孔。其中，样品三为样品含咪唑的肌红蛋白溶液，肌红蛋白为FAPON公司未经过脱盐处理的肌红蛋白，肌红蛋白的浓度为3.33mg/mL。样品四为含咪唑的肌红蛋白溶液，样品四的肌红蛋白为FAPON公司经过脱盐处理的肌红蛋白，肌红蛋白的浓度为2.11mg/mL，咪唑的浓度为60mM。样品五为不含咪唑的肌红蛋白溶液，样品五的肌红蛋白为FAPON公司经过脱盐处理的肌红蛋白，肌红蛋白的浓度为2.11mg/mL。

然后检测反应度。结果如表2所示。

表2

由表2可知，咪唑对肌红蛋白的反应性的影响小。

实施例3

咪唑对肌红蛋白的稳定性影响

将本申请人公司经过脱盐处理后的浓度均为2.11mg/mL的肌红蛋白溶液分为四份。其中一份加入咪唑，咪唑的终浓度为60mM，4℃放置7天，然后采用酶联免疫检测其反应性。其中一份加入咪唑，咪唑的终浓度为60mM，37℃放置7天，然后采用酶联免疫检测其反应性。其中一份在4℃放置7天，采用酶联免疫检测其反应性。其中一份在37℃放置7天，然后采用酶联免疫检测其反应性。本实施例酶联免疫采用的是Proteintech公司的羊抗兔-HRP，货号：SA00001-2，1:4K稀释。检测结果如表3所示。

表3

由表3可以看出，无论是在37℃放置7天，还是4℃放置7天，无咪唑和有咪唑的肌红蛋白的活性差异较小，肌红蛋白的稳定性较好。

实施例4

SDS-PAGE法检测咪唑对肌红蛋白的结构的影响

将肌红蛋白含量均为2.11mg/mL的脱盐前肌红蛋白(含有60mM咪唑)、脱盐后肌红蛋白(含有10mM咪唑)和脱盐后肌红蛋白(无咪唑)三个样品进行SDS-PAGE电泳检测。上样量为5μL。检测结果如图2所示。图2中，1泳道～3泳道加β-ME、并加热，4泳道～6泳道不加β-ME、不加热。1泳道和4泳道的上样样品均是脱盐前肌红蛋白(含有60mM咪唑)，2泳道和5泳道的上样样品均是脱盐后肌红蛋白(含有10mM咪唑)，3泳道和6泳道的上样样品均是肌红蛋白(无咪唑)。

由图2可以看出，咪唑对肌红蛋白的结构没有影响。

实施例5

HPLC法检测咪唑对肌红蛋白的结构的影响

将脱盐前肌红蛋白(含有60mM咪唑)、脱盐后肌红蛋白(含有10mM咪唑)、脱盐后肌红蛋白(无咪唑)三个样品均稀释至2.11mg/ml，然后进行HPLC验证。实际进样量5.0μL，色谱图如图3所示。图中蓝色实线表示咪唑的浓度为10mM的肌红蛋白样品，红色虚线表示无咪唑的肌红蛋白样品。

由图3可知，两个样品出峰时间基本一致，结构均为单体结构，说明咪唑对肌红蛋白的结构无影响。

实施例6

实施例6的步骤大致与实施例1相同，其不同在于，实施例6是将实施例1中的咪唑替换为连二亚硫酸钠(Na₂S₂O₄)，并同时设置复孔。连二亚硫酸钠(Na₂S₂O₄)的终浓度为12.2mg/ml，肌红蛋白的浓度为2.11mg/mL。然后采用酶联免疫检测其反应性。本实施例酶联免疫采用的是Proteintech公司的羊抗兔-HRP，货号：SA00001-2，1:4K稀释。检测结果如表4所示。

表4

由表4可知，在抗原浓度为0.0617μg/mL时，加入Na₂S₂O₄的实验组的肌红蛋白的活性可以达到0.572，而不加Na₂S₂O₄的实验组的肌红蛋白的活性只能达到0.397，说明Na₂S₂O₄对肌红蛋白的活性有影响。

实施例7

对比其它含氮杂环试剂对肌红蛋白的增色效果

将本申请人公司脱盐处理的浓度为2.11mg/mL的肌红蛋白溶液分为三组，分别记作有咪唑组、无咪唑组及HEPES组。其中，有咪唑组中加入60mM的咪唑。HEPES组中加入60mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，HEPES的结构式为：无咪唑组既不添加咪唑也不添加HEPES的2.11mg/mL的肌红蛋白溶液，此组作为对照组。将三组肌红蛋白溶液常温处理，添加咪唑后颜色立即变鲜红色，不加咪唑和添加HEPES的样品无颜色变化，三组肌红蛋白溶液的颜色如图4所示。在图中，从左到右分别为有咪唑组、无咪唑组及HEPES组。

由图4可知，HEPES对肌红蛋白增色效果不明显，咪唑肌红蛋白有明显的增色效果。

实施例8

酶联免疫法检测肌红蛋白的反应性

将本申请人公司脱盐处理的浓度为2.11mg/mL的肌红蛋白溶液分为三组，分别记作有咪唑组、无咪唑组及HEPES组。其中，有咪唑组中加入60mM的咪唑。HEPES组中加入60mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，HEPES的结构式为：无咪唑组是既不添加咪唑也不添加HEPES的2.11mg/mL的肌红蛋白溶液，此组作为对照组。将三组肌红蛋白溶液采用酶联免疫检测其反应性。本实施例酶联免疫采用的是Proteintech公司的羊抗兔-HRP，货号：SA00001-2，1:4K稀释。检测结果如表5所示

表5

由表5可知，咪唑对肌红蛋白的活性没有影响，而HEPES对肌红蛋白的活性有影响。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种肌红蛋白的抗氧化剂，其特征在于，包括咪唑类化合物。

2.根据权利要求1所述的抗氧化剂，其特征在于，所述咪唑类化合物选自咪唑、甲硝唑、替硝唑及5-硝基咪唑中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的抗氧化剂，其特征在于，所述咪唑类化合物为咪唑。

4.根据权利要求1～3任一项所述的抗氧化剂在制备肌红蛋白检测试剂中的应用。

5.一种肌红蛋白检测试剂，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述的抗氧化剂。

6.根据权利要求5所述的肌红蛋白检测试剂，其特征在于，还包括肌红蛋白特异性抗体。

7.根据权利要求5或6所述的肌红蛋白检测试剂在制备肌红蛋白检测试剂盒中的应用。

8.一种肌红蛋白检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求5或6所述的肌红蛋白检测试剂。

9.根据权利要求8所述的肌红蛋白检测试剂盒，其特征在于，还包括标准品，所述标准品为添加所述抗氧化剂的肌红蛋白。

10.根据权利要求9所述的肌红蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述抗氧化剂与所述肌红蛋白的质量比例为1.5～2.5:1 。