CN109254096A - 济川煎制剂的质量控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药品技术领域，具体涉及一种济川煎制剂的质量控制方法。所述的济川煎制剂的质量控制方法，包括指纹图谱、含量测定和鉴别方法，采用超高效液相色谱建立了济川煎制剂的指纹图谱，包括如下步骤：待测样品的制备；待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算。本发明所提供的济川煎制剂的质量控制方法，科学合理、简单易行，能更加全面、有效的控制药品的质量，缩短了工作时间，提高了工作效率。

Description

济川煎制剂的质量控制方法

技术领域

本发明属于药品技术领域，具体涉及一种济川煎制剂的质量控制方法。

背景技术

济川煎处方来源于《景岳全书》卷51，系临床使用的经典方剂，由肉苁蓉、当归、牛膝、升麻、泽泻、枳壳六味药材经提取制备而成。具有温肾益精，润肠通便的功用，主治肾阳虚衰，精津不足所致的大便秘结，小便清长，腰膝酸软，舌淡苔白，脉沉迟。临床上常用于治疗老年便秘、习惯性便秘，以及妇人产后肾气虚弱，大便秘结等属肾虚津亏肠燥者。

在中医传统用药中，汤剂仍占主导地位，具有吸收迅速、生产快捷、药效强劲的优点，但因其稳定性差，不易保存，患者的服用量大，不易携带等问题限制了其应用。颗粒剂在服用形式上与传统汤剂最为一致，在保持了汤剂优点的基础上，具有携带方便、性质稳定、易于保存、适于工业大生产等优点。由于中药材的质量良莠不齐，加之成分复杂，现有分析方法很难全面反应药材质量，目前市场上的中药复方制剂的质量控制中含量基本上只控制一个或两个指标性成分，鉴别多只鉴定组方中一味或两味药材，难以更好的控制药品质量。

中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。因此建立中药制剂指纹图谱对于提高中药质量，促进中药现代化具有重要意义。

超高效液相色谱(UPLC)的原理与高效液相色谱法基本相同，但固定相为小颗粒、高性能微粒，与传统的高效液相色谱(HPLC)相比，UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍，它缩短了分析时间，对于成分不稳定的样品，分析时间越长，样品的稳定性越差，如果多批次样品同时进行测定的话，中途需重新制备样品，结果偏差比较大，此时若采用UPLC就可以完美的解决这个问题，同时减少了溶剂用量降低了分析成本。此外，对于HPLC难于分离的成分，UPLC提供了一种分离度更高的新方法，其使用是药物分析的发展趋势。

现有技术中CN 201710087201.3和CN 201710087162.7中公开了济川煎指纹图谱的建立方法及指纹图谱，其采用的是高效液相色谱(HPLC)建立了济川煎指纹图谱，共有10个共有峰，共有峰数比较少，能获得的化合物信息比较少；另外每分析一批样品需要80分钟，分析时间过长，不适合稳定性较差的成分；此外，现有技术并未对指纹图谱中的共有峰的化学结构进行指认，单从指纹图谱中不能获得化合物的结构信息，也就不能得知济川煎中的主要化学成分，对于控制药品的质量来说，不够全面。CN 201710087162.7中公开了济川煎中当归、肉苁蓉、枳壳的鉴别方法，并未公开升麻、牛膝及泽泻的鉴别方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种济川煎制剂的质量控制方法，科学合理、简单易行，具有稳定性强、测量准、速度快的特点，能更加全面、有效的控制药品的质量，缩短了工作时间，提高了工作效率。

本发明所述的济川煎制剂的质量控制方法，包括指纹图谱、含量测定和鉴别方法，采用超高效液相色谱建立了济川煎制剂的指纹图谱，包括如下步骤：

1)待测样品的制备：

取济川煎制剂样品，加入提取溶剂，超声溶解，再加入溶剂调整溶液浓度，微孔滤膜滤过，取滤液，注入超高效液相色谱仪，得到色谱图；

2)待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算：

将待测样品的色谱图积分信号导入中国药典委的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”软件，比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度；

其中色谱条件如下：

色谱柱：选择UPLC C18或T3柱；

流动相选自以下流动相中的一种：

溶剂A0.1％甲酸水溶液–溶剂B乙腈；

溶剂A0.1％磷酸水溶液–溶剂B乙腈；

溶剂A0.1％醋酸水溶液–溶剂B乙腈；

溶剂A0.1％三氟乙酸水溶液–溶剂B乙腈梯度洗脱；

采用梯度洗脱进行洗脱，所述梯度洗脱：选自以下四个不同的洗脱方案中的一种：

①0～1.04min，15％B，1.04～5.60min，15％–16％B，5.60～10.42min，16％–25％B，10.42～13.55min，25％–95％B，13.55～13.76min，95-15％B，13.76～17min，15％B；

②0～1.04min，12％B，1.04～5.60min，12％–16％B，5.60～10.42min，16％–24％B，10.42～13.55min，24％–95％B，13.55～13.76min，95-12％B，13.76～17min，12％B；

③0～2min，10-13％B，2～6.25min，13％–18％B，6.25～10.42min，18％–24％B，10.42～13.55min，24％–95％B，13.55～13.76min，95％–10％B，13.76～17min，10％B；

④0～1.17min，16％B，1.17～3.80min，16％–18％B，3.80～10.35min，18％–26％B，10.35～13.85min，26％–95％B，13.85-14.38min，95-16％B，14.38～17.00min，16％B；

柱温：25-35℃；

流速：0.2-0.5ml/min；

进样量为0.2-0.5μl；

紫外检测波长：240-330nm。

所述的济川煎制剂的制备方法为：取当归500份、牛膝200份、肉苁蓉300份、泽泻150份、升麻100份和枳壳100份，加水煎煮浓缩后制成制剂。

所述的指纹图谱包括21个共有峰，各共有峰相对保留时间与参照峰相对保留时间比值分别为：

1号峰相对保留时间RRT为0.34；2号峰相对保留时间RRT为0.51；3号S峰的相对保留时间RRT为1.00；4号峰相对保留时间RRT为1.11；5号峰相对保留时间RRT为1.26；6号峰相对保留时间RRT为1.32；7号峰相对保留时间RRT为1.37；8号峰相对保留时间RRT为1.53；9号峰相对保留时间RRT为1.58；10号峰相对保留时间RRT为1.67；11号峰相对保留时间RRT为1.71；12号峰相对保留时间RRT为1.88；13号峰相对保留时间RRT为1.92；14号峰相对保留时间RRT为1.96；15号峰相对保留时间RRT为2.00；16号峰相对保留时间RRT为2.07；17号峰相对保留时间RRT为2.10；18号峰相对保留时间RRT为2.12；19号峰相对保留时间RRT为2.37；20号峰相对保留时间RRT为2.41；21号峰相对保留时间RRT为2.47；其中：3号S峰是参照物的色谱峰。

所述的共有峰中1号峰为共有峰1是绿原酸，2号峰为共有峰2是咖啡酸，3号峰为共有峰3是松果菊苷，4号峰为共有峰4是阿魏酸，5号峰为共有峰5是异阿魏酸，6号峰为共有峰8是毛蕊花糖苷，7号峰为共有峰11是柚皮苷，8号峰为共有峰12是新橙皮苷。

所述的待测样品的制备中加入提取溶剂是体积浓度为50％的甲醇或乙醇水溶液中的一种。

所述的含量测定为采用高效液相色谱法对济川煎制剂中的松果菊苷、柚皮苷进行测定；色谱条件与系统适用性试验是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.1％甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，洗脱梯度为0～5min，13％B，5～30min，13％–20％B，30～31min，20％–80％B，31～40min，80％B，40～41min，80-13％B，41～50min，13％B，松果菊苷检测波长为330nm，柚皮苷检测波长为283nm；理论板数按松果菊苷峰计算，不低于3000；

对照品的制备方法为：取松果菊苷，加甲醇溶解制成每1ml含松果菊苷200μg的溶液，作为对照品溶液；取柚皮苷，加甲醇溶解制成每1ml含柚皮苷80μg的溶液，作为对照品溶液；

供试品溶液的制备方法为：取济川煎制剂，研细，取约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理后用50％甲醇补足减失的重量，摇匀滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

所述的鉴别方法包括对济川煎制剂中的肉苁蓉、当归、升麻、牛膝、枳壳进行鉴别。

所述的肉苁蓉和枳壳的鉴别方法为：取济川煎制剂1.5g，研细，加甲醇10ml，超声处理10分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次10ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取肉苁蓉对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液；再取柚皮苷对照品、新橙皮苷对照品，分别加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取上述四种溶液，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以正丁醇-无水乙醇-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以质量含量3％的三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热约5分钟，置紫外光灯下检视；所述的正丁醇-无水乙醇-水的体积比为1:2:8；紫外光灯波长为365nm。

所述的当归和升麻的鉴别方法为：取济川煎制剂3g，研细，加甲醇50ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，用乙醚振摇提取3次，每次10ml，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取当归对照药材1.5g、升麻对照药材2g，同法制成对照药材溶液；再取阿魏酸对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取上述四种溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚-三氯甲烷-冰醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％铁氰化钾-1％三氯化铁的混合溶液。

所述的石油醚-三氯甲烷-冰醋酸的体积比为8:5:1；铁氰化钾、三氯化铁质量浓度为1％，且两者以质量比1:1进行混合，组成混合溶液。

所述的牛膝的鉴别方法为：取济川煎制剂15g，研细，加甲醇100ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加在Dl01型大孔吸附树脂柱上，用水l00ml洗脱，弃去水液，再用80％乙醇l00ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水10ml使溶解，用乙醚振摇提取3次，每次10ml，弃去乙醚液，再用水饱和正丁醇振摇提取3次，每次10ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；再取牛膝对照药材4g，加80％甲醇50ml，加热回流3小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水15ml，微热使溶解，加在Dl01型大孔吸附树脂柱上，用水l00ml洗脱，弃去水液，再用20％乙醇l00ml洗脱，弃去洗脱液，继用80％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加80％甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取上述二种溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以质量分数5％的香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。

所述的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液体积比为8:4:3:1。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、缩短了济川煎指纹图谱的分析时间，分析时间由现有技术的80分钟缩减为17分钟，大大提高了效率，节约了成本，保证产品质量的稳定和可靠；

2、现有技术虽建立了济川煎的指纹图谱，但只有10个共有峰，并未对共有峰的化学结构进行指认，本发明提供的指纹图谱方法共有21个共有峰，并指认了其中8个主要成分的化学结构，提供的质量控制方法能更全面的反应药品质量，当药品质量发生问题或出现不良反应时，能更准确的确认是组方中哪味药材出现了问题，对指导工业生产控制药品质量具有重要的意义；

3、指纹图谱建立的基础是药材，现有技术虽建立了济川煎的指纹图谱，但并未说明药材来源及产地，本发明提供的方法中药材均来自全国各主产区，其中道地药材居多，更具有代表性，能更好的反应工业生产中的药材质量；

4、本发明提供的质量控制方法中增加了升麻和牛膝的鉴别方法，相比现有技术，更全面，更详实。

附图说明

图1为17090401-17090408批样品指纹图谱及标准对照指纹图谱；

图2为参照物图谱；

图3为供试品图谱(17090401批)；

图4为肉苁蓉和枳壳的鉴别图谱；

图5为当归和升麻的鉴别图谱；

图6为牛膝的鉴别图谱；

图2中，1-绿原酸；2-咖啡酸；3-松果菊苷；4-阿魏酸；5-异阿魏酸；6-毛蕊花糖苷；7-柚皮苷；8-新橙皮苷。

具体实施方法

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但其并不限制本发明的实施，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

济川煎制剂的制备：

分别从全国主要药材产区及道地产区购买处方药材共8批，产地信息见表1。

表1济川煎药材产地信息

制备方法：取当归500g、牛膝200g、肉苁蓉300g、泽泻150g、升麻100g、枳壳100g，加水煎煮二次，每次1小时，煎液滤过，滤液合并，滤液减压浓缩至相对密度为1.20～1.24(g/cm³，60℃)的清膏，加入适量的糊精，制粒，整粒，即得。

实施例1

济川煎制剂指纹图谱

1.仪器与试药

超高效液相色谱仪(Waters Acquity H-Class)、分析天平(METTLER TOLEDO XS/205DU)、超声清洗机(KQ-5200E)；

色谱柱：C18柱(Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1*50mm，1.8μm)；

试剂：乙腈为色谱纯，水为超纯水；其他试剂均为分析纯，参照物均购自中国食品药品检定研究院；

试药：济川煎颗粒(批号：17090401-17090408)；

2.色谱条件：以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱条件为0～1.04min，15％B，1.04～5.60min，15％–16％B，5.60～10.42min，16％–25％B，10.42～13.55min，25％–95％B，13.55～13.76min，95-15％B，13.76～20min，15％B。流速为每分钟0.2ml/min；柱温25℃；检测波长为330nm。理论板数按松果菊苷峰计算不低于3000。

3.参照物溶液的制备：取绿原酸、咖啡酸、松果菊苷、阿魏酸、异阿魏酸、毛蕊花糖苷、柚皮苷、新橙皮苷对照品适量，加甲醇溶解制成1ml含各对照品20μg的溶液，作为对照品溶液。

4.供试品溶液的制备：取济川煎颗粒，研细，取约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度50％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理后用50％甲醇补足减失的重量，摇匀滤过，取续滤液，即得。

5.测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各0.2μl，注入超高效液相色谱仪中，测定，记录17分钟色谱图。

指纹图谱包括21个共有峰，各峰相对保留时间为：

1号峰2.065min；2号峰3.077min；3号峰6.069min；4号峰6.752min；5号峰7.651min；6号峰7.992min；7号峰8.311min；8号峰9.279；9号峰9.618；10号峰10.154min；11号峰10.361min；12号峰11.398min；13号峰11.676min；14号峰11.912min；15号峰12.135min；16号峰12.589min；17号峰12.762min；18号峰12.879min；19号峰14.371min；20号峰14.624min；21号峰15.018min。

各峰相对保留时间与参照峰相对保留时间比值分别为：

1号峰相对保留时间RRT为0.34；2号峰相对保留时间RRT为0.51；3号S峰的相对保留时间RRT为1.00；4号峰相对保留时间RRT为1.11；5号峰相对保留时间RRT为1.26；6号峰相对保留时间RRT为1.32；7号峰相对保留时间RRT为1.37；8号峰相对保留时间RRT为1.53；9号峰相对保留时间RRT为1.58；10号峰相对保留时间RRT为1.67；11号峰相对保留时间RRT为1.71；12号峰相对保留时间RRT为1.88；13号峰相对保留时间RRT为1.92；14号峰相对保留时间RRT为1.96；15号峰相对保留时间RRT为2.00；16号峰相对保留时间RRT为2.07；17号峰相对保留时间RRT为2.10；18号峰相对保留时间RRT为2.12；19号峰相对保留时间RRT为2.37；20号峰相对保留时间RRT为2.41；21号峰相对保留时间RRT为2.47；其中：3号S峰是参照物的色谱峰，见图1。

参照物图谱中，1号峰为共有峰1为绿原酸，2号峰为共有峰2为咖啡酸，3号峰为共有峰3为松果菊苷，4号峰为共有峰4为阿魏酸，5号峰为共有峰5为异阿魏酸，6号峰为共有峰8为毛蕊花糖苷，7号峰为共有峰11为柚皮苷，8号峰为共有峰12为新橙皮苷，见图2。

将积分信号导入中国药典委的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”软件，以S1为参照谱图，按平均值法计算得相似度结果，并生成标准对照指纹图谱(RFP)，见图1，相似度结果见表2。相似度小于90％为不合格产品，对8批样品进行质量评价。

表2 8批样品指纹图谱与标准对照指纹图谱相似度比较

以上结果表明，17090401-17090408批样品均为合格产品。

实施例2

济川煎制剂指纹图谱

1.仪器与试药

超高效液相色谱仪(Waters Acquity H-Class)、分析天平(METTLER TOLEDO XS/205DU)、超声清洗机(KQ-5200E)；

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1*50mm，1.7μm)；

试剂：乙腈为色谱纯，水为超纯水；其他试剂均为分析纯，参照物均购自中国食品药品检定研究院；

试药：济川煎颗粒(批号：17090401-17090408)；

2.色谱条件：以0.1％磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱条件为0～1.04min，12％B，1.04～5.60min，12％–16％B，5.60～10.42min，16％–24％B，10.42～13.55min，24％–95％B，13.55～13.76min，95-12％B，13.76～17min，12％B。流速为每分钟0.5ml；柱温35℃；检测波长为240nm。理论板数按松果菊苷峰计算不低于3000。

3.参照物溶液的制备：取绿原酸、咖啡酸、松果菊苷、阿魏酸、异阿魏酸、毛蕊花糖苷、柚皮苷、新橙皮苷对照品适量，加甲醇溶解制成1ml含各对照品20μg的溶液，作为对照品溶液。

4.供试品溶液的制备：取济川煎颗粒，研细，取约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇25ml，密塞，称定重量，超声处理后用50％乙醇补足减失的重量，摇匀滤过，取续滤液，即得。

5.测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各0.5μl，注入超高效液相色谱仪中，测定，记录17分钟色谱图。

6.相似度结果：见表3

表3 8批样品指纹图谱与标准对照指纹图谱相似度比较

实施例3

济川煎制剂指纹图谱

1.仪器与试药

超高效液相色谱仪(Waters Acquity H-Class)、分析天平(METTLER TOLEDO XS/205DU)、超声清洗机(KQ-5200E)；

色谱柱：Aglient Poroshell 120EC-C18(3.0*50mm，2.7μm)；

试剂：乙腈为色谱纯，水为超纯水；其他试剂均为分析纯，参照物均购自中国食品药品检定研究院；

试药：济川煎颗粒(批号：17090401-17090408)

2.色谱条件：以0.1％醋酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱条件为0～2min，10-13％B，2～6.25min，13％–18％B，6.25～10.42min，18％–24％B，10.42～13.55min，24％–95％B，13.55～13.76min，95％–10％B，13.76～17min，10％B。流速为每分钟0.3ml；柱温30℃；检测波长为320nm。理论板数按松果菊苷峰计算不低于3000。

3.参照物溶液的制备：取绿原酸、咖啡酸、松果菊苷、阿魏酸、异阿魏酸、毛蕊花糖苷、柚皮苷、新橙皮苷对照品适量，加甲醇溶解制成1ml含各对照品20μg的溶液，作为对照品溶液。

4.供试品溶液的制备：取济川煎颗粒，研细，取约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理后用50％甲醇补足减失的重量，摇匀滤过，取续滤液，即得。

5.测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各0.3μl，注入超高效液相色谱仪中，测定，记录17分钟色谱图。

6.相似度结果：见表4

表4 8批样品指纹图谱与标准对照指纹图谱相似度比较

实施例4

济川煎制剂指纹图谱

1.仪器与试药

超高效液相色谱仪(Waters Acquity H-Class)、分析天平(METTLER TOLEDO XS/205DU)、超声清洗机(KQ-5200E)；

色谱柱：Aglient Poroshell 120 EC-C18(3.0*50mm，2.7μm)；

试剂：乙腈为色谱纯，水为超纯水；其他试剂均为分析纯，参照物均购自中国食品药品检定研究院；

试药：济川煎颗粒(批号：17090401-17090408)

2.色谱条件：以0.1％三氟乙酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱条件为0～1.17min，16％B，1.17～3.80min，16％–18％B，3.80～10.35min，18％–26％B，10.35～13.85min，26％–95％B，13.85-14.38min，95-16％B，14.38～15.00min，16％B。流速为每分钟0.4ml；柱温30℃；检测波长为280nm。理论板数按松果菊苷峰计算不低于3000。

3.参照物溶液的制备：取绿原酸、咖啡酸、松果菊苷、阿魏酸、异阿魏酸、毛蕊花糖苷、柚皮苷、新橙皮苷对照品适量，加甲醇溶解制成1ml含各对照品20μg的溶液，作为对照品溶液；

4.供试品溶液的制备：取济川煎颗粒，研细，取约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理后用50％甲醇补足减失的重量，摇匀滤过，取续滤液，即得；

5.测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各0.5μl，注入超高效液相色谱仪中，测定，记录17分钟色谱图。

6.相似度结果：见表5

表5 8批样品指纹图谱与标准对照指纹图谱相似度比较

济川煎指纹图谱方法学考察：

1.精密度实验

取供试品溶液(批号17090401)，按实施例1中的方法制备供试品溶液并进行检测，连续进样6次，分别对共有峰相对保留时间和相对峰面积进行考察。供试品中共有峰相对保留时间的RSD＜0.3％，相对峰面积的RSD＜3％，表明仪器精密度良好。

2.重现性实验

取供试品溶液(批号为17090401)5份，按实施例1中的方法制备供试品溶液并进行检测，分别对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察；供试品中共有峰的相对保留时间的RSD＜0.3％，相对峰面积的RSD＜3％，表明重复性良好。

3.稳定性试验

取供试品溶液(批号为17090401)，按实施例1中的方法制备供试品溶液并进行检测，分别于0，2，4，8，12，24h进样分析，分别对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察。结果表明，供试品中共有峰相对保留时间的RSD＜0.3％，相对峰面积的RSD＜3％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

济川煎含量测定：

1.仪器与试药

高效液相色谱仪(Agilent 1120 Compact LC)、分析天平(METTLER TOLEDO XS/205DU)、超声清洗机(KQ-5200E)；

试剂：乙腈为色谱纯，水为超纯水；其他试剂均为分析纯，对照品均购自中国食品药品检定研究院；

试药：济川煎颗粒(批号：17090401-17090408)；

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Inertsil ODS-SP，4.6×250mm，5μm)；以0.1％甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，洗脱梯度为0～5min，13％B，5～30min，13％–20％B，30～31min，20％–80％B，31～40min，80％B，40～41min，80-13％B，41～50min，13％B，松果菊苷检测波长为330nm，柚皮苷检测波长为283nm。理论板数按松果菊苷峰计算不低于3000。

2.对照品溶液的制备：取松果菊苷对照品适量，加甲醇溶解制成每1ml含对照品200μg的溶液；取柚皮苷对照品适量，加甲醇溶解制成每1ml含对照品80μg的溶液，作为对照品溶液。

3.供试品溶液的制备：取济川煎颗粒，研细，取约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理后用50％甲醇补足减失的重量，摇匀滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

4.测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

济川煎中肉苁蓉、枳壳、当归、升麻、牛膝鉴别；

1.仪器与试药

分析天平(METTLER TOLEDO XS/205DU)、超声清洗机(KQ-5200E)、电热套、烘箱(FXB101-0型)、三用紫外仪(ZF-7型)。

试剂：试剂均为分析纯，所用对照品均购自中国食品药品检定研究院。

试药：济川煎(批号为17090401-17090403)

2.肉苁蓉、枳壳鉴别

取济川煎制剂1.5g，研细，加甲醇10ml，超声处理10分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次10ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取肉苁蓉对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。再取柚皮苷对照品、新橙皮苷对照品，分别加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取上述四种溶液，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以正丁醇-无水乙醇-水(1:2:8)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3％三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热约5分钟，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

3.当归和升麻鉴别

取济川煎制剂3g，研细，加甲醇50ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，用乙醚振摇提取3次，每次10ml，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取当归对照药材1.5g、升麻对照药材2g，同法制成对照药材溶液。再取阿魏酸对照品，加甲醇制成每lml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取上述四种溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚-三氯甲烷-冰醋酸(8:5:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％铁氰化钾-1％三氯化铁(1:1)的混合溶液(临用配制)。供试品色谱中，在与对照品色谱和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

4.牛膝鉴别

取济川煎制剂15g，研细，加甲醇100ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加在Dl01型大孔吸附树脂柱上，用水l00ml洗脱，弃去水液，再用80％乙醇l00ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水10ml使溶解，用乙醚振摇提取3次，每次10ml，弃去乙醚液，再用水饱和正丁醇振摇提取3次，每次10ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。再取牛膝对照药材4g，加80％甲醇50ml，加热回流3小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水15ml，微热使溶解，加在Dl01型大孔吸附树脂柱上，用水l00ml洗脱，弃去水液，再用20％乙醇l00ml洗脱，弃去洗脱液，继用80％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加80％甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取上述二种溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液(8:4:3:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材品色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种济川煎制剂的质量控制方法，包括指纹图谱、含量测定和鉴别方法，其特征在于：采用超高效液相色谱建立了济川煎制剂的指纹图谱，包括如下步骤：

1)待测样品的制备：

取济川煎制剂样品，加入提取溶剂，超声溶解，再加入溶剂调整溶液浓度，微孔滤膜滤过，取滤液，注入超高效液相色谱仪，得到色谱图；

2)待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算：

将待测样品的色谱图积分信号导入中国药典委的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”软件，比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度；

其中色谱条件如下：

色谱柱：选择UPLC C18或T3柱；

流动相选自以下流动相中的一种：

溶剂A 0.1％甲酸水溶液–溶剂B乙腈；

溶剂A 0.1％磷酸水溶液–溶剂B乙腈；

溶剂A 0.1％醋酸水溶液–溶剂B乙腈；

溶剂A 0.1％三氟乙酸水溶液–溶剂B乙腈梯度洗脱；

采用梯度洗脱进行洗脱，所述梯度洗脱：选自以下四个不同的洗脱方案中的一种：

①0～1.04min，15％B，1.04～5.60min，15％–16％B，5.60～10.42min，16％–25％B，10.42～13.55min，25％–95％B，13.55～13.76min，95-15％B，13.76～17min，15％B；

②0～1.04min，12％B，1.04～5.60min，12％–16％B，5.60～10.42min，16％–24％B，10.42～13.55min，24％–95％B，13.55～13.76min，95-12％B，13.76～17min，12％B；

③0～2min，10-13％B，2～6.25min，13％–18％B，6.25～10.42min，18％–24％B，10.42～13.55min，24％–95％B，13.55～13.76min，95％–10％B，13.76～17min，10％B；

④0～1.17min，16％B，1.17～3.80min，16％–18％B，3.80～10.35min，18％–26％B，10.35～13.85min，26％–95％B，13.85-14.38min，95-16％B，14.38～17.00min，16％B；

柱温：25-35℃；

流速：0.2-0.5ml/min；

进样量为0.2-0.5μl；

紫外检测波长：240-330nm。

2.根据权利要求1所述的济川煎制剂的质量控制方法，其特征在于：济川煎制剂的制备方法为：取当归500份、牛膝200份、肉苁蓉300份、泽泻150份、升麻100份和枳壳100份，加水煎煮浓缩后制成制剂。

3.根据权利要求1所述的济川煎制剂的质量控制方法，其特征在于：指纹图谱包括21个共有峰，各共有峰相对保留时间与参照峰相对保留时间比值分别为：

1号峰相对保留时间RRT为0.34；2号峰相对保留时间RRT为0.51；3号S峰的相对保留时间RRT为1.00；4号峰相对保留时间RRT为1.11；5号峰相对保留时间RRT为1.26；6号峰相对保留时间RRT为1.32；7号峰相对保留时间RRT为1.37；8号峰相对保留时间RRT为1.53；9号峰相对保留时间RRT为1.58；10号峰相对保留时间RRT为1.67；11号峰相对保留时间RRT为1.71；12号峰相对保留时间RRT为1.88；13号峰相对保留时间RRT为1.92；14号峰相对保留时间RRT为1.96；15号峰相对保留时间RRT为2.00；16号峰相对保留时间RRT为2.07；17号峰相对保留时间RRT为2.10；18号峰相对保留时间RRT为2.12；19号峰相对保留时间RRT为2.37；20号峰相对保留时间RRT为2.41；21号峰相对保留时间RRT为2.47；其中：3号S峰是参照物的色谱峰。

4.根据权利要求3所述的济川煎制剂的质量控制方法，其特征在于：共有峰中1号峰为绿原酸，2号峰为咖啡酸，3号峰为松果菊苷，4号峰为阿魏酸，5号峰为异阿魏酸，8号峰为毛蕊花糖苷，11号峰为柚皮苷，12号峰为新橙皮苷。

5.根据权利要求1所述的济川煎制剂的质量控制方法，其特征在于：待测样品的制备中加入提取溶剂是体积浓度为50％的甲醇或乙醇水溶液中的一种。

6.根据权利要求1所述的济川煎制剂的质量控制方法，其特征在于：含量测定为采用高效液相色谱法对济川煎制剂中的松果菊苷、柚皮苷进行测定；色谱条件与系统适用性试验是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.1％甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，洗脱梯度为0～5min，13％B，5～30min，13％–20％B，30～31min，20％–80％B，31～40min，80％B，40～41min，80-13％B，41～50min，13％B，松果菊苷检测波长为330nm，柚皮苷检测波长为283nm；理论板数按松果菊苷峰计算，不低于3000；

对照品的制备方法为：取松果菊苷，加甲醇溶解制成每1ml含松果菊苷200μg的溶液，作为对照品溶液；取柚皮苷，加甲醇溶解制成每1ml含柚皮苷80μg的溶液，作为对照品溶液；

供试品溶液的制备方法为：取济川煎制剂，研细，取约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度50％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理后用体积浓度50％甲醇补足减失的重量，摇匀滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

7.根据权利要求1所述的济川煎制剂的质量控制方法，其特征在于：鉴别方法包括对济川煎制剂中的肉苁蓉、当归、升麻、牛膝和枳壳进行鉴别。

8.根据权利要求7所述的济川煎制剂的质量控制方法，其特征在于：肉苁蓉和枳壳的鉴别方法为：取济川煎制剂1.5g，研细，加甲醇10ml，超声处理10分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次10ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取肉苁蓉对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液；再取柚皮苷对照品、新橙皮苷对照品，分别加甲醇制成每1mg含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述四种溶液，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以正丁醇-无水乙醇-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以质量含量3％的三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热约5分钟，置紫外光灯下检视；正丁醇-无水乙醇-水三者的体积比为1:2:8。

9.根据权利要求7所述的济川煎制剂的质量控制方法，其特征在于：当归和升麻的鉴别方法为：取济川煎制剂3g，研细，加甲醇50ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，用乙醚振摇提取3次，每次10ml，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取当归对照药材1.5g、升麻对照药材2g，同法制成对照药材溶液；再取阿魏酸对照品，加甲醇制成每lml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述四种溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚-三氯甲烷-冰醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以质量浓度为1％铁氰化钾-1％三氯化铁的混合溶液；石油醚-三氯甲烷-冰醋酸三者体积比为8:5:1。

10.根据权利要求7所述的济川煎制剂的质量控制方法，其特征在于：牛膝的鉴别方法为：取济川煎制剂15g，研细，加甲醇100ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加在Dl01型大孔吸附树脂柱上，用水l00ml洗脱，弃去水液，再用80％乙醇l00ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水10ml使溶解，用乙醚振摇提取3次，每次10ml，弃去乙醚液，再用水饱和正丁醇振摇提取3次，每次10ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；再取牛膝对照药材4g，加80％甲醇50ml，加热回流3小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水15ml，微热使溶解，加在Dl01型大孔吸附树脂柱上，用水l00ml洗脱，弃去水液，再用20％乙醇l00ml洗脱，弃去洗脱液，继用80％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加80％甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述二种溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以质量分数5％的香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液四者体积比为8:4:3:1。