CN109251743B - 一种过氧化氢响应的比率计纳米探针及其应用 - Google Patents
一种过氧化氢响应的比率计纳米探针及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109251743B CN109251743B CN201810267720.2A CN201810267720A CN109251743B CN 109251743 B CN109251743 B CN 109251743B CN 201810267720 A CN201810267720 A CN 201810267720A CN 109251743 B CN109251743 B CN 109251743B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hydrogen peroxide
- ratiometric
- nanoprobe
- cancer
- response
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 112
- 230000004044 response Effects 0.000 title claims abstract description 20
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 claims abstract description 24
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims abstract description 15
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 16
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 15
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical group [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229940043267 rhodamine b Drugs 0.000 claims description 6
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 5
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 206010023825 Laryngeal cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010031096 Oropharyngeal cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010057444 Oropharyngeal neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 claims description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010023841 laryngeal neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 201000006958 oropharynx cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims description 2
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 35
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 18
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 abstract description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 abstract description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 abstract description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 102100033420 Keratin, type I cytoskeletal 19 Human genes 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 6
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical group O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- BMIBJCFFZPYJHF-UHFFFAOYSA-N 2-methoxy-5-methyl-3-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)pyridine Chemical compound COC1=NC=C(C)C=C1B1OC(C)(C)C(C)(C)O1 BMIBJCFFZPYJHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101000998011 Homo sapiens Keratin, type I cytoskeletal 19 Proteins 0.000 description 4
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- KKLCYBZPQDOFQK-UHFFFAOYSA-N 4,4,5,5-tetramethyl-2-phenyl-1,3,2-dioxaborolane Chemical compound O1C(C)(C)C(C)(C)OB1C1=CC=CC=C1 KKLCYBZPQDOFQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710183399 Keratin, type I cytoskeletal 19 Proteins 0.000 description 3
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 3
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical compound O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GOLORTLGFDVFDW-UHFFFAOYSA-N 3-(1h-benzimidazol-2-yl)-7-(diethylamino)chromen-2-one Chemical compound C1=CC=C2NC(C3=CC4=CC=C(C=C4OC3=O)N(CC)CC)=NC2=C1 GOLORTLGFDVFDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000020584 Polyploidy Diseases 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- -1 isothiocyanate-activated rhodamine B Chemical class 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
- C09K11/02—Use of particular materials as binders, particle coatings or suspension media therefor
- C09K11/025—Use of particular materials as binders, particle coatings or suspension media therefor non-luminescent particle coatings or suspension media
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
- C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
- C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
- C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
- C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
- C09K2211/1088—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing oxygen as the only heteroatom
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
- C09K2211/14—Macromolecular compounds
- C09K2211/1441—Heterocyclic
- C09K2211/1491—Heterocyclic containing other combinations of heteroatoms
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明公开一种过氧化氢响应的比率计纳米探针及其应用，所述探针包括过氧化氢响应的荧光分子，过氧化氢惰性的荧光分子和生物相容性良好的聚合物。本发明还公开过氧化氢响应的比率计纳米探针在制备恶性实体瘤外周血循环肿瘤细胞检测剂中的应用。本发明提供的比率计纳米探针具有良好的水溶性，易被细胞摄取且细胞毒性低，用于循环肿瘤细胞中的过氧化氢的定量成像。该比率计纳米探针具有优异的荧光性能，对过氧化氢具有很好的灵敏性和特异性，可以检测不同恶性实体瘤细胞中过氧化氢水平的差异和细胞内摄量的不同。
Description
技术领域
本发明属于生物领域，更具体地讲，涉及一种过氧化氢响应的比率计纳米探针及其在检测外周血循环肿瘤细胞中的应用。
背景技术
循环肿瘤细胞(CTC)是从原发肿瘤脱落下来进入外周血循环的具有特殊性质的肿瘤细胞。在临床上癌症的诊断和治疗中，CTC被认为是一种具有肿瘤诊断特性的生物标志物。因而，对CTC的捕获和分析在对癌症病人的生物学分类，采取具体的治疗方法，监测疗效等方面有着很大的应用前景。然而，由于CTC在外周血中的数量极少，对CTC的计数和鉴定存在很大的挑战。
目前检测人外周血中的“循环肿瘤细胞”方法很多，有根据肿瘤细胞大小、弹性等物理特性检测的方法；也有根据肿瘤细胞表面特异性抗原来检测的；或检测肿瘤细胞内多倍染色体的方法。由于肿瘤细胞的异源性，其在大小、弹性等物理特性上可不一致；同样的原因，其表达的特异性抗原也可丢失或减少表达。因此，现有的检测方法在灵敏度或特异性上有一定程度的不足。
相比于正常细胞，肿瘤细胞通常代谢旺盛且具有高的细胞内过氧化氢(H2O2)水平。而CTC作为一种特殊的肿瘤细胞具有此相同的特征。因此，我们把高的细胞内过氧化氢水平作为CTC的另一个特点用于CTC的鉴定，从而克服上述提到的方法的缺点。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种适用于循环肿瘤细胞鉴定的过氧化氢响应的比率计纳米探针。
本发明的第二个目的在于提供一种过氧化氢响应的比率计纳米探针的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供一种过氧化氢响应的比率计纳米探针在制备恶性实体瘤外周血循环肿瘤细胞检测剂中的应用。
为实现本发明第一个目的，本发明公开以下技术方案：一种过氧化氢响应的比率计纳米探针，其特征在于，所述探针包括过氧化氢响应的荧光分子，过氧化氢惰性的荧光分子和生物相容性良好的聚合物。
作为一个优选方案，所述过氧化氢响应的荧光分子包括香豆素-苯硼酸频哪醇酯。
作为一个优选方案，所述过氧化氢惰性的荧光分子是指以发红光为代表的发射波长在580-680nm的小分子荧光分子。
作为一个优选方案，所述过氧化氢惰性的荧光分子包括罗丹明B、PE、Cy系列染料及水溶性碳点。
作为一个优选方案，所述生物相容性良好的聚合物包括含氨基或羧基的聚合物。
作为一个优选方案，所述含氨基或羧基的聚合物包括氨基修饰的壳聚糖和羧酸修饰的聚乙烯醇。
为实现本发明第二个目的，本发明公开以下技术方案：一种过氧化氢响应的比率计纳米探针的制备方法，其特征在于，将过氧化氢响应的荧光分子和过氧化氢惰性的荧光分子接枝到生物相容性良好的聚合物上，得到具有两亲性特征的聚合物，在水中自组装形成过氧化氢响应的比率计纳米探针。
为实现本发明第三个目的，本发明公开以下技术方案：一种过氧化氢响应的比率计纳米探针在制备恶性实体瘤外周血循环肿瘤细胞检测试剂盒中的应用。
作为一个优选方案，所述恶性实体瘤包括胃癌、肺癌、结肠癌、肝癌、喉癌、食管癌、膀胱癌、口咽癌、乳腺癌、前列腺癌。
本发明的优点在于：本发明提供的比率计纳米探针具有良好的水溶性，易被细胞摄取且细胞毒性低，用于循环肿瘤细胞中的过氧化氢的定量成像。该比率计纳米探针具有优异的荧光性能，对过氧化氢具有很好的灵敏性和特异性，可以检测不同恶性实体瘤细胞中过氧化氢水平的差异和细胞内摄量的不同。
附图说明
图1为比率计过氧化氢纳米探针。
图2为核磁共振谱仪测定的比率计纳米探针的化学结构表征。图2(a)1HNMR谱图所示，6.5-8.0ppm处出现了两个荧光分子苯环的特征峰，且1.3ppm处出现了苯硼酸频哪醇酯上甲基的特征峰，表明Cou-Bpin和RhB成功地接枝到GC上，制备得到共价聚合物GC-Cou-Bpin-RhB。图2(b)DLS测得GC-Cou-Bpin-RhB纳米探针的平均粒径为200nm左右，TEM测得其粒径约为150nm左右。图2(c)GC-Cou-Bpin-RhB比率计纳米探针未和H2O2反应时，Cou的最大紫外吸收峰在350ppm,和H2O2反应后红移到了400nm,而RhB的最大紫外吸收峰在和H2O2反应后都在560nm，不受影响。图2(d)在0-200μM的浓度范围内，比率计纳米探针Cou对H2O2具有很好的响应性，随着H2O2浓度的增加，荧光强度逐渐增强，且在反应30min内具有很好的线性关系，而内标探针RhB的荧光强度在不同的H2O2浓度和不同的反应时间都基本保持不变。
图3为比率计过氧化氢纳米探针测定的正常细胞株(HEK 293[(a),(b)],NIH-3T3[(c),(d))和结肠癌细胞株(HCT 116[(e),(f)],HT 29[(g),(h)],SW620[(i),(j))的流式细胞仪测定结果。在正常细胞株(3(a),3(c))内过氧化氢纳米探针的Cou-Bpin在30min内即和细胞内完成过氧化氢反应，其浓度随时间变化不大，而在结肠癌细胞株内(3(e),3(g),3(i))Cou-Bpin浓度随时间增加；在正常细胞株3(b),3(d)和结肠癌细胞株(3(e),3(g),3(i))内过氧化氢纳米探针的RhB浓度随时间增加，表明随探针进入细胞的量随时间增加。
图4为比率计过氧化氢纳米探针测定正常细胞株HEK 293,NIH-3T3和结肠癌肿瘤细胞株HCT 116,HT 29及SW620细胞内Cou-Bpin(蓝光)和RhB(红光)的荧光强度变化。
图5为不同时间点内(i)0h,(ii)30min,(iii)60min,and(iv)120min.比率计过氧化氢纳米探针测定正常细胞株(HEK 293,NIH-3T3)和结肠癌细胞株(HCT116,HT 29，SW620)细胞内过氧化氢的激光共聚焦图。
图6为结直肠癌病人外周血中的循环肿瘤细胞的激光共聚焦图，比率计过氧化氢纳米探针检测出循环肿瘤细胞，蓝色荧光为探针内Cou-Bpin与过氧化氢反应后产生的；红光为探针中的过氧化氢惰性的荧光分子内标(RhB)；绿色荧光为FITC标记CK19抗体。Merge为同一细胞中蓝光、红光和绿光重叠后的图像，荧光的完全重叠表明这些不同颜色的荧光来自同一细胞；Brightfield为显微镜白光下观察的细胞图像。
图7为胃癌病人外周血中的循环肿瘤细胞的激光共聚焦图。比率计过氧化氢纳米探针检测出循环肿瘤细胞。绿色荧光为FITC标记CK19抗体。
图8为肺癌病人外周血中的循环肿瘤细胞的激光共聚焦图。比率计过氧化氢纳米探针检测出循环肿瘤细胞。绿色荧光为FITC标记CK19抗体。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1.比率计纳米探针的合成、组装及表征
将琥珀酰亚胺活化的-香豆素-苯硼酸频哪醇酯(62.6mg,0.125mmol)和异硫氰酸酯活化的罗丹明B(6.65mg,0.0125mmol)分别溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，逐滴加入到乙二醇壳聚糖(160mg,0.75mmol)的水溶液中，最后加入20μL的三乙胺，室温反应24h。反应结束后先在DMSO/H2O(1/4,V/V)中透析48h，再在超纯水中透析48h，组装得到比率计纳米探针(GC-Cou-Bpin-RhBnanoprobe)，图1。
用核磁共振谱仪表征了比率计纳米探针的化学结构，如图2(a)的1H NMR谱图所示，6.5-8.0ppm处出现了两个荧光分子苯环的特征峰，且1.3ppm处出现了苯硼酸频哪醇酯上甲基的特征峰，表明Cou-Bpin和RhB成功地接枝到GC上，制备得到共价聚合物GC-Cou-Bpin-RhB。由于Cou-Bpin和RhB两种荧光分子具有疏水性，而GC具有亲水性，赋予了GC-Cou-Bpin-RhB两亲性，在水中可自组装形成比率计纳米探针。我们用动态光散色(DLS)和透射电镜表征了比率计纳米探针的结构，如图2(b)所示，DLS测得GC-Cou-Bpin-RhB纳米探针的平均粒径为200nm左右，TEM测得其粒径约为150nm左右。
肿瘤细胞内高浓度的过氧化氢使比率计纳米探针上的苯硼酸频哪醇酯去保护，从而使香豆素的蓝色荧光恢复，与此同时，内标罗丹明B的荧光不受过氧化氢的影响，这可以帮助我们很方便地通过荧光成像对CTC进行鉴定。
实施例2.结肠癌细胞株的实验
我们选取了两种正常细胞(HEK 293和NIH-3T3)和三种结肠癌肿瘤细胞(HCT 116，HT 29和SW620)，通过流式细胞术和激光共聚焦表征了GC-Cou-Bpin-RhB比率计纳米探针的细胞内摄能力并检测细胞中的H2O2含量。分析不同细胞系的流式结果，如图3所示，根据内标RhB的荧光强度，我们发现无论是正常细胞还是肿瘤细胞比率计纳米探针都能不同程度地进入。结肠癌细胞HCT 116进细胞能力和正常细胞HEK 293的进细胞能力差不多，但是HCT116细胞内的H2O2浓度却要比HEK 293的高很多。而对于结肠癌细胞HT29来说，其进细胞能力很强，比其它两种结肠癌细胞HCT 116和SW 620都要强，但它的H2O2浓度却要比它们低很多，仅比正常细胞HEK 293和NIH-3T3略高(图4)。流式细胞术结果表明，探针进不同细胞的能力和不同细胞内H2O2浓度都不一样。不能简单地通过一种荧光强度来评价细胞内H2O2水平。激光共聚焦结果(图5)和流式结果(图4)一致。
比率计纳米探针辅助结肠癌病人CTC检测
我们用负筛选的方法富集了结肠癌病人外周血中的CTC，用GC-Cou-RhB比率计纳米探针和标记了异硫氰酸荧光素的肿瘤细胞表面特异性抗体细胞角蛋白(CK19-FITC)共同对富集到的细胞进行染色，用激光共聚焦观察，其中蓝色为H2O2探针香豆素-苯硼酸频哪醇酯与H2O2反应后发出的荧光，红色荧光为内标探针罗丹明B，绿色荧光为CK19-FITC。如图6所示，我们发现即使是同一个肿瘤病人，其CTC中对比率计纳米探针的摄取量、细胞里的H2O2水平和细胞表面的CK19都不一样。仅仅通过蓝色荧光的强弱无法准确地描述细胞内H2O2含量，在相同的H2O2浓度下，比率计纳米探针被细胞摄取的量越多，则蓝色荧光越强，对应地红色荧光也越强；若比率计纳米探针进入细胞的量较少，红色荧光较弱，如图6(3)所示，相同蓝色荧光强度的细胞之间，与红色荧光较强的细胞相比，红色荧光较弱的细胞其H2O2水平要高出许多，如图6(2)所示。因此，比率计纳米荧光探针综合细胞内摄量的不同，更加准确地描述循环肿瘤细胞内的H2O2水平。图6列举了结肠癌病人外周血由比率计纳米探针检测到的几个CTC。
实施例3.比率计纳米探针辅助胃癌病人CTC检测
我们用负筛选的方法富集了胃癌病人外周血中的CTC，用GC-Cou-RhB比率计纳米探针和标记了异硫氰酸荧光素的肿瘤细胞表面特异性抗体细胞角蛋白(CK19-FITC)共同对富集到的细胞进行染色，用激光共聚焦观察，其中蓝色为H2O2探针香豆素-苯硼酸频哪醇酯与H2O2反应后发出的荧光，红色荧光为内标探针罗丹明B，绿色荧光为CK19-FITC，如图7所示。图7(27)、(28)、(29)显示，尽管探针进入细胞的量不多(内标荧光弱)，但细胞内的过氧化氢浓度很高(蓝色荧光强)，其中图7(29)的CTC细胞表面有相对强的CK-19表达。图7(30)则显示探针进入该CTC的量多(红光强)、细胞内过氧化氢浓度也高(蓝光强)，细胞CK-19强表达(绿光)。
实施例4.比率计纳米探针辅助肺癌病人CTC检测
我们用负筛选的方法富集了肺癌病人外周血中的CTC，用GC-Cou-RhB比率计纳米探针和标记了异硫氰酸荧光素的肿瘤细胞表面特异性抗体细胞角蛋白(CK19-FITC)共同对富集到的细胞进行染色，用激光共聚焦观察，其中蓝色为H2O2探针香豆素-苯硼酸频哪醇酯与H2O2反应后发出的荧光，红色荧光为内标探针罗丹明B，绿色荧光为CK19-FITC，如图8所示，3个CTC均见明显的探针进入(红光)及明显的细胞内过氧化氢浓度(蓝光)，细胞表面有CK-19表达。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种过氧化氢响应的比率计纳米探针，其特征在于，所述探针包括过氧化氢响应的荧光分子，过氧化氢惰性的荧光分子和生物相容性良好的聚合物，所述过氧化氢响应的荧光分子为香豆素-苯硼酸频哪醇酯，所述过氧化氢惰性的荧光分子为罗丹明B，所述生物相容性良好的聚合物包括氨基修饰的壳聚糖和羧酸修饰的聚乙烯醇。
2.权利要求1所述的一种过氧化氢响应的比率计纳米探针的制备方法，其特征在于，将过氧化氢响应的荧光分子和过氧化氢惰性的荧光分子接枝到生物相容性良好的聚合物上，得到具有两亲性特征的聚合物，在水中自组装形成过氧化氢响应的比率计纳米探针。
3.权利要求1所述的一种过氧化氢响应的比率计纳米探针在制备恶性实体瘤外周血循环肿瘤细胞检测试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述恶性实体瘤包括胃癌、肺癌、结肠癌、肝癌、喉癌、食管癌、膀胱癌、口咽癌、乳腺癌、前列腺癌。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2017105644085 | 2017-07-12 | ||
| CN201710564408.5A CN107543808A (zh) | 2017-07-12 | 2017-07-12 | 一种过氧化氢响应的比率计纳米探针及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109251743A CN109251743A (zh) | 2019-01-22 |
| CN109251743B true CN109251743B (zh) | 2021-09-07 |
Family
ID=60971185
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710564408.5A Pending CN107543808A (zh) | 2017-07-12 | 2017-07-12 | 一种过氧化氢响应的比率计纳米探针及其应用 |
| CN201810265678.0A Active CN109253990B (zh) | 2017-07-12 | 2018-03-28 | 一种靶向胰腺癌循环肿瘤细胞的纳米荧光探针 |
| CN201810267720.2A Active CN109251743B (zh) | 2017-07-12 | 2018-03-28 | 一种过氧化氢响应的比率计纳米探针及其应用 |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710564408.5A Pending CN107543808A (zh) | 2017-07-12 | 2017-07-12 | 一种过氧化氢响应的比率计纳米探针及其应用 |
| CN201810265678.0A Active CN109253990B (zh) | 2017-07-12 | 2018-03-28 | 一种靶向胰腺癌循环肿瘤细胞的纳米荧光探针 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (3) | CN107543808A (zh) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108844935B (zh) * | 2018-07-06 | 2020-07-24 | 山西大同大学 | 一种硼氮共掺杂碳点的制备方法及应用 |
| CN110044861A (zh) * | 2019-05-09 | 2019-07-23 | 南宁师范大学 | 过氧化氢浓度的检测方法 |
| CN111892668B (zh) * | 2020-07-03 | 2022-07-12 | 广东工业大学 | 一种化合物及其制备方法、荧光探针和抗肿瘤药物 |
| CN111704682B (zh) * | 2020-07-03 | 2021-11-26 | 广东工业大学 | 一种化合物和纳米胶束 |
| CN112924610A (zh) * | 2021-02-01 | 2021-06-08 | 上海交通大学 | 一种基于质谱的活细胞内ros绝对定量方法及其应用 |
| CN113624727B (zh) * | 2021-07-02 | 2024-06-18 | 湖北文理学院 | 一种检测肼浓度的方法 |
| CN113984729B (zh) * | 2021-10-29 | 2022-10-28 | 中国科学院自动化研究所 | 乏氧响应型比率探针合成方法及其应用 |
| CN115684103A (zh) * | 2022-09-15 | 2023-02-03 | 济南大学 | 一种利用比率式荧光探针定量检测水泥pH值的方法 |
| CN115791727B (zh) * | 2022-11-26 | 2024-08-06 | 吉林大学 | 脂溶性荧光探针在神经元死亡检测中的应用和检测方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105367805A (zh) * | 2015-11-23 | 2016-03-02 | 上海交通大学 | H2o2响应的荧光单分子共轭聚合物及胶束、制备方法和应用 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101942502B (zh) * | 2009-12-24 | 2014-09-17 | 北京命码生科科技有限公司 | 胰腺癌标记物及其检测方法、试剂盒和生物芯片 |
| CN104312577B (zh) * | 2014-09-17 | 2016-05-25 | 广西师范大学 | 靶向性聚集诱导发光的荧光复合物及其制备方法与应用 |
| CN106668881B (zh) * | 2017-02-28 | 2019-11-19 | 苏州杰纳生物科技有限公司 | 一种过氧化氢响应的脂质体纳米探针及其制备方法和应用 |
| CN107325062B (zh) * | 2017-08-02 | 2020-05-12 | 浙江大学 | 一种检测过氧化氢活性的荧光探针及制备和应用 |
-
2017
- 2017-07-12 CN CN201710564408.5A patent/CN107543808A/zh active Pending
-
2018
- 2018-03-28 CN CN201810265678.0A patent/CN109253990B/zh active Active
- 2018-03-28 CN CN201810267720.2A patent/CN109251743B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105367805A (zh) * | 2015-11-23 | 2016-03-02 | 上海交通大学 | H2o2响应的荧光单分子共轭聚合物及胶束、制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Hydrogen Peroxide-Responsive Nanoprobe Assists Circulating Tumor Cell Identification and Colorectal Cancer Diagnosis;Chunting Li等;《Anal. Chem. 》;20170422;5966-5975 * |
| pH敏感型荧光探针的合成及其在细胞内pH监测中的应用;崔朋;《中国优秀硕士学位论文全文数据库，工程科技Ⅰ辑》;20140315;B014-583 * |
| 碳量子点的合成及其金属离子分析应用;任悦;《中国优秀硕士学位论文全文数据库，工程科技Ⅰ辑》;20160515;B014-17 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109253990B (zh) | 2021-10-15 |
| CN109251743A (zh) | 2019-01-22 |
| CN107543808A (zh) | 2018-01-05 |
| CN109253990A (zh) | 2019-01-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109251743B (zh) | 一种过氧化氢响应的比率计纳米探针及其应用 | |
| Wu et al. | Ultrasmall near-infrared gold nanoclusters for tumor fluorescence imaging in vivo | |
| Hu et al. | Folate receptor-targeting gold nanoclusters as fluorescence enzyme mimetic nanoprobes for tumor molecular colocalization diagnosis | |
| CN105928914B (zh) | 硫化氢检测传感器及其制备方法、硫化氢的定量检测方法和细胞内硫化氢的定性检测方法 | |
| Romano et al. | Water-soluble silicon nanocrystals as NIR luminescent probes for time-gated biomedical imaging | |
| Jin et al. | Enhancement of aqueous stability and fluorescence brightness of indocyanine green using small calix [4] arene micelles for near-infrared fluorescence imaging | |
| Ke et al. | Multiplexed intracellular detection based on dual-excitation/dual-emission upconversion nanoprobes | |
| CN103339510A (zh) | 含有酪氨酸氧化物偶联的生物材料的用于检测蛋白质的组合物 | |
| CN103865537A (zh) | 一种稀土上转换纳米荧光探针及其制备和应用 | |
| Biffi et al. | Multiple dye-doped NIR-emitting silica nanoparticles for both flow cytometry and in vivo imaging | |
| Song et al. | A dual-modal nanoprobe based on Eu (III) complex–MnO 2 nanosheet nanocomposites for time-gated luminescence–magnetic resonance imaging of glutathione in vitro and in vivo | |
| Li et al. | Near-infrared-II ratiometric fluorescence probes for non-invasive detection and precise navigation surgery of metastatic sentinel lymph nodes | |
| CN109504363A (zh) | 一种近红外二区成像造影剂的制备方法和用途 | |
| CN106568757A (zh) | 一种检测结肠癌肿瘤的量子点靶向探针试剂盒 | |
| CN109529059A (zh) | 一种荧光-磁共振双模态量子点及其制备和应用方法 | |
| CN108066777A (zh) | 肿瘤靶向核磁共振-荧光超分子成像造影剂及制备和应用 | |
| CN102940893B (zh) | 具有上转换发光和磁共振成像双功能的造影剂及其制备方法 | |
| CN106398681B (zh) | 基于二氧化硅的pH敏感的荧光纳米材料、其制备方法及其应用 | |
| CN108524953A (zh) | 一种食源性益生菌的特异性荧光标记方法及其体内应用 | |
| CN109364246B (zh) | 磁共振/激活型荧光双模态成像靶向光热诊疗纳米探针及其合成方法与应用 | |
| Zhang et al. | A hypochlorite-activatable persistent luminescence nanoprobe for assisted tumor resection | |
| CN114652858B (zh) | 一种用于无创评估乳腺癌前哨淋巴结转移的靶向分子探针 | |
| CN114410293B (zh) | 一种高灵敏度硫化氢响应型纳米探针及其制备方法和应用 | |
| DE102011054396B4 (de) | Verwendung von breitbandig absorbierenden und emittierenden NIR-Fluorophoren mit großem Stokes-Shift als Farbstoffe in core-shell-Nanopartikeln für die Biomarkeranalytik und als Komponenten von FRET-Systemen sowie darauf beruhendes Verfahren | |
| Ritschel et al. | Monitoring nanoparticle dissolution via fluorescence-colour shift |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |