CN109234418A - 一种鉴别猪肺炎支原体野毒株和疫苗株的引物、试剂盒和方法 - Google Patents

一种鉴别猪肺炎支原体野毒株和疫苗株的引物、试剂盒和方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于动物病原分子诊断技术领域，具体是涉及到一种鉴别猪肺炎支原体野毒株和疫苗株的引物、试剂盒和方法，包括检测猪肺炎支原体野毒株和疫苗株的引物对，检测猪肺炎支原体野毒株的引物对序列为：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，检测猪肺炎支原体疫苗株的引物对序列为：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，其引物针对的目标核苷酸小，灵敏度高，特异性强，可以有效降低出现假阳假阴的几率，排除其他物质的干扰。

Description

一种鉴别猪肺炎支原体野毒株和疫苗株的引物、试剂盒和 方法
技术领域
本发明属于动物病原分子诊断技术领域，具体是涉及到一种鉴别猪肺炎支原体野毒株和疫苗株的引物、试剂盒和方法。
背景技术
猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是引起猪支原体肺炎的主要病原体，也是猪呼吸道病综合征的主要原发性病原之一。猪场中Mhp的感染率在30％-80％，主要能引起猪的生长受阻，发育迟缓和饲料转化率大幅度下降，生产性能显著降低，是对我国养猪业造成严重经济损失的最常发生、流行最广、最难净化的重要疫病之一。
目前Mhp病毒传统的检测方法有病原的分离培养、微粒凝聚试验、血清学方法、免疫学诊断方法、核酸探针法技术等，但这些方法存在无法区分Mhp野毒株及疫苗株的局限性。
1、病原分离培养
关于猪肺炎支原体的分离和培养，国内不少单位正在展开研究。上海市畜牧兽医研究所(1973年)用病肺埋块分离猪肺炎支原体获得肯定结果。江苏省农业科学研究所畜牧兽医研究室采用“病肺块浸泡法”做分离培养，也获得了初步的结果。
2、血清学诊断方法
目前应用的血清学诊断方法有免疫荧光技术、免疫酶技术、放射免疫酶技术、补体结合试验、间接血凝试验以及ELISA。其中以间接血凝试验、补体结合试验、ELISA和放射免疫酶试验更为常用。
3、分子生物学方法，分子生物学方法一般用做病原检测。
(1)聚合酶链式反应检测技术(PCR)。许多实验室已经广泛应用PCR方法来检测猪肺炎支原体，该方法灵敏度高，特异性好，重复性好，并且能对疾病作出早起诊断。常规PCR存在着一些不足，容易出现假阳性或者假阴性，为最后结果的判断带来影响，并且与实时荧光定量PCR相比，PCR方法灵敏性相对不足，操作过程中也相对易污染。
(2)实时荧光定量PCR技术。1995年美国Perkin Elmer公司研制出新的实时荧光定量PCR(QPCR)从而一举解决了常规PCR的诸多不足之外使技术得到更新和发展从而广泛地应用于临床以及其它相关核酸的研究。在诊断猪肺炎支原体时，一般根据实验室检测结果，结合该禽类养殖场的疫病流行病学、临床症状、病理剖解变化，对该病进行系统的诊断。
在目前的这些检测方法中，存在以下不足:
1、病原分离培养难度大、耗时长。
2、血清学检测技术：易出现假阳性或假阴性结果。
3、常规PCR：(1)所需仪器设备较多；(2)操作复杂操作时间长；(3)非常容易污染；(4)技术操作要求高，较难在基层推广；(5)质量控制不到位，难以标准化。
4、普通PCR和单重荧光PCR均无法区分Mhp野毒株及疫苗株。
存在这些问题，可能的原因为：
1、血清学检测方法是抗原和抗体反应，仅检测1次无法准确判断群体的感染状况和排毒状况。
2、血清学检测抗体，检测的抗体水平高低无法定量检测分析，血清学仅能评价机体体液免疫产生的水平。
3、血清学评估群体健康度、对无症状带毒和免疫耐受的群体评估存在技术上的瓶颈。
4、普通PCR本身操作较复杂操作时间较长。
5、普通PCR所用试剂相对成本较低所导致。
6、其他病原学检测方法(如qPCR等)实验室应用较多，临床应用较少，难以排除其他物质的干扰，导致结果不准确。
目前市场上并没有能够直接准确鉴别猪肺炎支原体野毒株和疫苗株的试剂盒。一般在设计引物序列时，是根据野毒株和疫苗株各自的特异性目标核苷酸设计引物，比如：猪流行性腹泻病毒疫苗株与野毒株RT-PCR检测方法的建立与应用，朱海侠等，福建畜牧兽医，第38卷第3期，2016年，其设计了鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗株与野毒株RT-PCR检测的原理和引物，为了加大特异性，其设计引物所针对的目标核苷酸非常长，疫苗株的目标核苷酸为278bp，野毒株的目标核苷酸为327bp，中国专利号为：CN201310097627，名称为：鉴别小反刍兽疫病毒野生毒株与疫苗株的引物组及其应用，其野毒株和疫苗株的目标核苷酸的大小分布为477bp和324bp。上述病原野毒株和疫苗株鉴别均是通过常规PCR实现，通过扩增条带的大小进行电泳区分，然而缺点是一方面长的扩增片段会导致整体PCR效率偏低，另一方面通过电泳区分亦容易造成扩增产物的污染，从而影响精确性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种鉴别猪肺炎支原体野毒株和疫苗株的引物、试剂盒和方法，其引物针对的目标核苷酸小，灵敏度高，特异性强，可以有效降低出现假阳假阴的几率，排除其他物质的干扰。
本发明的内容包括一对用于检测猪肺炎支原体的引物与Taqman探针，扩增产物长度70bp，引物与探针序列信息如下：
(1)上游引物(Mhp-F1)：5’-CATTTGTTGCAGCAGGTTG-3’(SEQ ID NO.1)；
(2)下游引物(Mhp-R1)：5’-GTCTCGGCTTGTGGTTTAGA-3’(SEQ ID NO.2)；
(3)探针(Mhp-U-P)：5’-TGGACAGACAGAATCAGGTTCGACT-3’(SEQ ID NO.5)，5’标记有FAM，为报告荧光基团，3’端标记有BHQ1，为淬灭荧光基团；
(4)上述引物目的基因为猪肺炎支原体的p46基因，扩增产物长度为70bp，目标核苷酸序列为：
CATTTGTTGCAGCAGGTTGTGGACAGACAGAATCAGGTTCGACTTCAGATTCTAAACCACAAGCCGAGAC(SEQ ID NO.7)。
本技术方案中的一种鉴别猪肺炎支原体野毒株和疫苗株的实时荧光定量PCR方法，还包括一对用于检测猪肺炎支原体168L疫苗株的引物与Taqman探针，扩增产物长度90bp，引物与探针序列信息如下：
(1)168L上游引物(Mhp-F2)：5’-CAGGTTATGTTGGAACTAATG-3’(SEQ ID NO.3)；
(2)168L下游引物(Mhp-R2)：5’-TTAATGAACAACCTCTTTCAG-3’(SEQ ID NO.4)；
(3)168L探针(Mhp-V-P)：5’-ATGCATCAACTGGAACTGGTTA-3’(SEQ ID NO.6)，5’端标记有HEX，为报告荧光基团，3’端标记有BHQ1，为淬灭荧光基团；
(4)上述引物目的基因为猪肺炎支原体168L株的NADH oxidase基因，扩增产物长度为90bp，目标核苷酸序列为：
CAGGTTATGTTGGAACTAATGCAATTTCCGTCTTCGGATTTAATTATGCATCAACTGGAACTGGTTATTCTGAAAGAGGTTGTTCATTAA(SEQ ID NO.8)。
根据上述两端扩增产物目标核苷酸序列，合成带有该两段核苷酸的重组克隆质粒，编号为pUC-mhp。使用蛋白核酸测定仪对两个重组质粒浓度进行定量，并使用TE溶液对重组质粒稀释。根据实际浓度测定值，将pUC-mhp稀释至1.0×104～5.0×104copies/μL，作为阳性对照。
本发明的试剂盒包括：MHP-反应液、DNA酶混合液、MHP-阳性对照、MHP-阴性对照、核酸释放剂。各组分制备方法如下：
(1)MHP-反应液中包括PCR-Buffer、dNTP、上述MHP引物探针、上述MHP疫苗株引物探针。其中MHP引物Mhp-F1与Mhp-R1在反应液中的终浓度范围是200～300nM，MHP探针Mhp-U-P在反应液中的浓度范围是100～200nM；疫苗株引物Mhp-F2与Mhp-R2在反应液中的终浓度范围是200～300nM，疫苗株探针Mhp-V-P在反应液中的终浓度范围是100～200nM；dNTP包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷，其中使用dUTP代替了一般常用的dTTP，这样扩增条带为带有U碱基的DNA。这种双链结构在UNG酶存在时会被水解，因此可以减少扩增产物(PCR的主要污染源)残留的污染。特别的，该反应液中PCR-Buffer不同于常见Buffer，其中Tris-HCl浓度为125～200mM，高于常用的10mM的浓度，使得PCR反应不受碱性核酸释放剂的影响，从而实现本试剂盒直检。
(2)DNA酶混合液中包括酶稀释液、热启动Taq酶与UNG酶。其中热启动Taq酶在DNA酶混合液中的终浓度为1～2U/μL，该酶需在月95℃活化才能行使扩增活性；UNG酶全称尿嘧啶-N-糖基化酶，能选择性水解断裂含有U碱基的DNA中的尿嘧啶糖苷键，进而消除扩增产物残留、气溶胶污染等，该酶最佳活性温度为50℃，95℃失活，同热启动Taq酶共同实现抑制假阳性的效果。
(3)使用蛋白核酸测定仪对重组质粒pUC-mhp浓度进行定量，并使用TE溶液对重组质粒稀释。根据实际浓度测定值，将pUC-mhp稀释至1.0×104～5.0×104copies/μL，作为阳性对照。
(4)MHP-阴性对照为用depc H2O配制的TE溶液。
(5)核酸释放剂为一种碱性裂解液。具体包括25～100mM的NaOH、1～5％PEG6000、0.5～1mM EDTA。该核酸释放剂中NaOH可以有效的裂解细胞或病毒，释放出内容物并使之变性失活，非离子型去垢剂PEG6000进一步分散蛋白与核酸，EDTA能有效的抑制核酸酶对DNA的水解。
上述方法制备的核酸释放剂能直接用于血清、血浆、组织匀浆液的裂解处理，并且无需常见裂解液需要高温加热处理的步骤，在室温下作用10～15min即可。样品经裂解后直接可用于后续荧光PCR扩增，相比较核酸提取纯化过程，在保证一致的扩增结果前提下，更省时省事，非常适合临床一线的快速检测。
(6)试剂盒(以50T计)中上述各组分装量如下：
本技术方案中的一种鉴别猪肺炎支原体野毒株和疫苗株的实时荧光定量PCR试剂盒，特异性强、灵敏度高、抗污染，可用于临床对于MHP隐性感染、低载量感染等早期快速准确检测，同时可对野毒株和疫苗株进行初步鉴别。本试剂盒用法包括以下步骤：
(1)样品采集：活体采集咽拭子、鼻试子等；剖杀病猪，采集肺部组织。
(2)样品预处理：鼻咽拭子使用生理盐水进行浸泡处理，浸出液用于后续检测；取约50mg组织病料，于研磨器具中研磨，加入1mL生理盐水研磨至匀浆，转移至1.5mL离心管，8000g离心5分钟，取上清用于检测。
(3)扩增试剂配制：取出包装盒中除DNA酶混合液外的各组分，室温放置，待其彻底溶解后，震荡混匀备用；按比例(MHP-反应液38μL/头份+DNA酶混合液2μL/头份)取相应量的试剂，充分混匀成PCR-Mix，瞬时离心。
(4)核酸释放与加样：向每个反应管中加入5μL核酸释放剂，再取5μL阴性对照/阳性对照/待测样本分别加入对应PCR反应孔，反复吹打3～5次，静置10min；向每个反应管中分别加入40μL PCR-Mix，盖上管盖，短暂离心，转移至扩增区。
(5)上机扩增：将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置阴性对照、阳性对照以及待测样本名称；选择FAM通道检测MHP核酸；选择HEX通道检测168L疫苗株核酸；设置反应体系为50μL；循环参数设定如下：
设置完毕，保存文件，运行反应程序。
(6)结果分析与判定：待反应程序完成后，记录样品Ct值与扩增曲线。待反应程序完成后，记录样品Ct值与扩增曲线。Mhp-阴性对照FAM通道无报告Ct值，Mhp-阳性对照FAM通道Ct值≤30，HEX通道Ct值≤30；
被检样品检测结果：测定FAM通道Ct值≤35且扩增曲线呈S型，HEX通道无Ct值，报告为Mhp野毒株阳性；
测定FAM和HEX通道Ct值≤35且扩增曲线呈S型，报告为168L疫苗株检测阳性；
测定FAM、HEX通道35＜Ct值≤40且扩增曲线为S型，判定可疑。
建议对该样品进行重复检测，如无Ct值，则报告阴性，低于试剂盒检测下限，否则报告阳性；
测定FAM、HEX通道无Ct值显示，报告为Mhp阴性，低于试剂盒检测下限。
本发明结合目前防控形势与临床情况，可以实现以下用途：
(1)用于疑似发病猪的实验室确诊检测；
(2)发病前或发病初期(无明显症状)的早期诊断；
(3)健康猪群的“体检”，查看是否有Mhp野毒的存在；
(4)引种过程中的猪Mhp病原检测，特别是从国外疫区引种的精准检测；
(5)进口肉制品的Mhp病原检测，特别是从国外疫区进口肉制品的精准检测；
(6)一步法技术方便用于现场的即时检测，结合小型化设备实现POCT。
本申请主要用于区分猪肺炎野毒株和疫苗株。
现有技术中已有报道检测猪肺炎支原体的引物和试剂盒，如中国专利申请号为201611225518.0的专利申请公开了一种猪肺炎支原体的实时荧光pcr检测试剂盒及其用途，其上游引物为：5’-TTCGCTTGCATCAATTATTG-3’,下游引物为：5’-CGGATTGTGGTTTAGAATC-3’；上述专利针对的也是猪肺炎支原体的P46基因，但是本申请的目标基因的具体片段和上述专利不同，其长度也不同，上述专利的目标基因的的大小为86，本申请为70。本申请做出改变的主要原因是，上述引物和探针在用于鉴别株肺炎支原体野毒株和疫苗株方面时，其特异性还达不到要求，导致出现假阳假阴现象。目前，已知的猪肺炎支原体的长度为1104bp，每个技术人员所针对的保守核苷酸片段的认定都不太一样，即使是同一段目标核苷酸，每个人设计的引物也不太一样，一般技术人员在设计引物时，只需要考虑目标核苷酸和引物设计的原则，但是本申请还需要考虑到其和疫苗株的区分，在目标核苷酸的选择和引物的匹配设计上，会存在一定的难度，大大加大了选择特异性和灵敏度达标的引物的难度。本发明通过实验发现，采用本发明的引物和试剂盒，能够满足生产要求的灵敏度和特异性要求。
本发明的有益效果是，
1.首个从荧光PCR方法学学上实现区分Mhp野毒和168L疫苗株。
2.UNG酶体系可减少假阳性：PCR扩增实验室最为常见的污染是扩增产物污染，且清除较为麻烦，形成气溶胶或者表面残留后对高灵敏度常的PCR检测影响很大。为防止和减少此种情况，UNG酶的作用不可少。
3.一步法直检重复性更好，污染几率更小：一步法直检技术代替传统的核酸提取纯化过程，样品只需一次裂解操作即可作为模板扩增，无需传统提纯过程中反复离心、吸取等操作，特别是在多样品同时处理时，越少操作过程就越少污染。另外直检重复性更好。
4.检测过程更加简单与便捷：使用核酸释放剂直检，样品经裂解后直接可用于后续荧光PCR扩增，相比较核酸提取纯化过程，在保证一致的扩增结果前提下，更省时省事，非常适合临床一线的快速检测。
目前临床上多采用疫苗注射的方法预防肺炎支原体，但因机体个体差异，自身存在免疫抑制，从而导致疫苗接种失败的现象，同时还存在自然野毒株混合感染的情况。因此采用有效的方法鉴别肺炎支原体野毒株和疫苗株在临床上显得尤为重要，成为当前研究的重点工作之一。
随着分子生物学检测技术的发展，荧光定量PCR技术灵敏度高、快速便捷、抗污染能力强、安全系数好、结果可视化等优点在病毒检测方面应用越来越广。
本技术方案发明目的在于利用双重实时荧光定量PCR方法，来检测疑似感染猪是否存在猪肺炎支原体感染，同时进一步鉴别是野毒株还是疫苗株，猪场可以对猪肺炎支原体进行早期快速地检测诊断，为及时鉴定疫苗的免疫效果提供准确的检测方法。
本发明的方法首次通过荧光探针PCR对猪肺炎支原体野毒和疫苗进行区分，扩增产物片段小，扩增效率高，整个使用过程无需开盖电泳，污染风险下，精确性得到提高。而本发明的方法是首次通过荧光探针PCR对猪肺炎支原体野毒和疫苗进行区分，扩增产物片段小，扩增效率高，整个使用过程无需开盖电泳，污染风险下，精确性得到提高。
附图说明
图1为本发明的试剂盒FAM通道的荧光扩增曲线图。
图2为本发明的试剂盒FAM通道的线性范围扩增图。
图3为本发明的试剂盒HEX通道的荧光扩增曲线图。
图4为本发明的试剂盒HEX通道的线性范围扩增图。
具体实施方式
实施例1
1.引物探设计
根据Mhp野毒株和168L株的基因序列进行分析比较，在野毒株和疫苗株共同的保守区域p46基因上设计引物Mhp-F1、Mhp-R1及探针Mhp-U-P(此探针用FAM荧光基团标记)。根据野毒株与疫苗株基因差异，设计168L株特异性引物Mhp-F2、Mhp-R2、Mhp-V-P(此探针用HEX荧光基团标记)。引物及探针序列如下：
表1引物与探针序列信息
2.核酸释放剂测试
一种碱性核酸释放剂，其中NaOH可以有效的裂解细胞或病毒，释放出内容物并使之变性失活，非离子型去垢剂PEG6000进一步分散蛋白与核酸，EDTA能有效的抑制核酸酶对DNA的水解。具体成分浓度通过试验进行确定。
(1)NaOH对荧光PCR的影响
NaOH在释放剂中的主要功能是裂解细胞结构，分离核酸与蛋白质。NaOH是碱性裂解液，对核酸较稳定。通过实验验证，2×bufferⅠ对NaOH的最高耐受浓度为0.25N。
浓度N 背景荧光值 平台荧光值 Ct值 曲线形态
1N 1290 1290 NoCt 无
0.5 265 265 NoCt 无
0.25 240 1533 16.93 正常
0.125 227 1500 16.31 正常
0.06 223 1436 16.20 正常
0.03 230 1547 16.08 正常
0.015 228 1601 16.04 正常
0.008 235 1626 16.00 正常
0 279 1858 15.80 正常
(2)peg6000对荧光PCR的影响
PEG6000是一种温和的非离子型去垢剂，并且有利于保护核酸的稳定。通过实验验证，高至10％浓度的PEG6000基本不对荧光PCR造成影响。
(3)释放剂裂解能力的初步验证
按照上述实验结果，配制释放剂(50mM NaOH,2.5％PEG6000,EDTA)，验证对PRVK61疫苗的裂解能力，同时以Axygen提取纯化试剂盒为比较。结果表明：释放剂对病毒样本的裂解能力基本与Axygen提取纯化试剂盒效果一致。
3.试剂盒组分与配制
此发明设计的一种鉴别猪肺炎支原体野毒株和疫苗株的实时荧光定量PCR试剂盒，其组分包括：MHP-反应液、DNA酶混合液、MHP-阳性对照、MHP-阴性对照、核酸释放剂。各组分制备方法如下：
(1)MHP-反应液中包括PCR-Buffer、dNTP、上述MHP通用型引物探针、上述MHP疫苗株引物探针。其中MHP通用型引物Mhp-F1与Mhp-R1在反应液中的终浓度范围是200～300nM，MHP通用型Mhp-W-P在反应液中的浓度范围是100～200nM；疫苗株引物Mhp-F2与Mhp-R2在反应液中的终浓度范围是200～300nM，疫苗株探针Mhp-W-P在反应液中的终浓度范围是100～200nM；dNTP包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷，其中使用dUTP代替了一般常用的dTTP，这样扩增条带为带有U碱基的DNA。这种双链结构在UNG酶存在时会被水解，因此可以减少扩增产物(PCR的主要污染源)残留的污染。特别的，该反应液中PCR-Buffer不同于常见Buffer，其中Tris-HCl浓度为125～200mM，高于常用的10mM的浓度，这样PCR反应才不受碱性核酸释放剂的影响，这也是该试剂盒直检得以实现的核心内容。
(2)DNA酶混合液中包括酶稀释液、热启动Taq酶与UNG酶。其中热启动Taq酶在DNA酶混合液中的终浓度为1～2U/μL，该酶需在月95℃活化才能行使扩增活性；UNG酶全称尿嘧啶-N-糖基化酶，能选择性水解断裂含有U碱基的DNA中的尿嘧啶糖苷键，进而消除扩增产物残留、气溶胶污染等，该酶最佳活性温度为50摄氏度，95摄氏度失活，同热启动Taq酶共同实现抑制假阳性的效果。
(3)使用蛋白核酸测定仪对重组质粒pUC-mhp浓度进行定量，并使用TE溶液对重组质粒稀释。根据实际浓度测定值，将pUC-mhp稀释至1.0×104～5.0×104copies/μL，作为阳性对照。
(4)MHP-阴性对照为用depcH2O配制的TE溶液。
(5)此技术方案中的核酸释放剂为一种碱性裂解液。具体包括25～100mM的NaOH、1～5％PEG6000、0.5～1mM EDTA。该核酸释放剂中NaOH可以有效的裂解细胞或病毒，释放出内容物并使之变性失活，非离子型去垢剂PEG6000进一步分散蛋白与核酸，EDTA能有效的抑制核酸酶对DNA的水解。
(6)试剂盒(以50T计)中上述各组分装量如下：
4.线性范围与扩增效率测定
对重组质粒pUC-mhp进行10倍梯度连续稀释，使其拷贝数范围为：108～1copies/μl，对每个梯度作为模板进行实时荧光PCR，根据扩增结果制作标准曲线。
如图1-2所示。FAM通道对108～1copies/μl的梯度模板扩增正常，呈线性扩增，相关系数R2＝0.99；在此线性扩增范围内，该试剂盒的扩增效率为97％。如图3-4所示。HEX通道对108～1copies/μl的梯度模板扩增正常，呈线性扩增，相关系数R2＝0.99；在此线性扩增范围内，该试剂盒的扩增效率为111％。
5.精密度测定
调整重组质粒pUC-mhp浓度至10copies/μl，作为精密度测定的扩增模板。对此浓度模板重复扩增8个重复，计算Ct值的变异系数(CV)，一般来讲，荧光PCR精密度CV应＜10％，且越低重复性就越好。
精密度测试结果表明(表2)，该双重试剂盒对低浓度模板扩增精密度分别为0.79％、2.23％，重复性很好。
表2试剂盒的精密度测试结果
6.特异性测定
为了检测本发明试剂盒的特异性，利用本发明的试剂盒检测猪肺炎支原体临床样本、活疫苗168L株，及常见猪病病原(非洲猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒、猪链球菌、副猪嗜血杆菌)进行特异性试验。
检测结果表明(表3)：本发明的试剂盒对猪肺炎支原体检测的特异性良好，不与其它病原发生交叉反应。另外能针对野毒株和疫苗株进行准确区分。
表3试剂盒特异性测试结果
7.试剂盒使用方法
根据上述技术研究资料，结合猪肺炎支原体感染的临床特征。确定本试剂盒用法包括以下步骤：
(1)样品采集：活体采集咽拭子、鼻试子等；剖杀病猪，采集肺部组织。
(2)样品预处理：鼻咽拭子使用生理盐水进行浸泡处理，浸出液用于后续检测；取约50mg组织病料，于研磨器具中研磨，加入1mL生理盐水研磨至匀浆，转移至1.5mL离心管，8000g离心5分钟，取上清用于检测。
(3)扩增试剂配制：取出包装盒中除DNA酶混合液外的各组分，室温放置，待其彻底溶解后，震荡混匀备用；按比例(MHP-反应液38μL/头份+DNA酶混合液2μL/头份)取相应量的试剂，充分混匀成PCR-Mix，瞬时离心。
(4)核酸释放与加样：向每个反应管中加入5μL核酸释放剂，再取5μL阴性对照/阳性对照/待测样本分别加入对应PCR反应孔，反复吹打3～5次，静置10min；向每个反应管中分别加入40μL PCR-Mix，盖上管盖，短暂离心，转移至扩增区。
(5)上机扩增：将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置阴性对照、阳性对照以及待测样本名称；选择FAM通道检测MHP核酸；选择HEX通道检测168L疫苗株核酸；设置反应体系为50μL；循环参数设定如下：
设置完毕，保存文件，运行反应程序。
(6)结果分析与判定：待反应程序完成后，记录样品Ct值与扩增曲线。待反应程序完成后，记录样品Ct值与扩增曲线。Mhp-阴性对照FAM通道无报告Ct值，Mhp-阳性对照FAM通道Ct值≤30，HEX通道Ct值≤30；被检样品检测结果：测定FAM通道Ct值≤35且扩增曲线呈S型，HEX通道无Ct值，报告为Mhp野毒株阳性；测定FAM和HEX通道Ct值≤35且扩增曲线呈S型，报告为168L疫苗株检测阳性；测定FAM、HEX通道35＜Ct值≤40且扩增曲线为S型，判定可疑。建议对该样品进行重复检测，如无Ct值，则报告阴性，低于试剂盒检测下限，否则报告阳性；测定FAM、HEX通道无Ct值显示，报告为Mhp阴性，低于试剂盒检测下限。
8.试剂盒临床样本测试
采用本试剂盒方法和普通RT-PCR检测方法对36份肺部样品进行检测以及5份健康的肺部样品进行了检测，结果见表4。
表4采用本发明试剂盒以及普通RT-PCR对临床样品进行检测结果的比较
从表4中可以看出：本试剂盒双重实时荧光RT-PCR方法检测阳性样品与普通RT-PCR方法检测阳性样品的结果100％符合；对于临床样品的检测，本试剂盒双重实时荧光RT-PCR方法检测阳性5/36，普通RT-PCR方法检测阳性3/36，且后者检测的3份样品使用前者检测均为阳性，本发明试剂盒双重实时荧光RT-PCR检测比普通RT-PCR检测更敏感，且检测结果和临床症状表现是一致的。
9.试剂盒临床样本测试
采用本试剂盒方法为实施例1，对比例1为：现有的检测猪肺炎支原体野毒株的引物(采用中国专利申请号为201611225518.0的试剂盒)+本发明的检测猪肺炎支原体疫苗株的引物，其他内容同中国专利申请号为201611225518.0的试剂盒、方法。对50份肺部样品(其中有4份疫苗株样品，后来根据临床症状显示有33份无患病样品，13份感染有猪肺炎支原体)进行检测以及7份健康的肺部样品进行了检测，结果见表5。
表5不同试剂盒对临床样品进行检测结果的比较
从表5中可以看出：本试剂盒双重实时荧光RT-PCR方法检测野毒株阳性、疫苗株阳性和阴性结果，和临床症状一致，本检测试剂盒和方法具有高度可靠性。对比例1漏检2份野毒株样品，其可能的原因是对比例1的野毒株引物的特异性不够或扩增效率偏低，或者是检测过程当中扩增产物的影响，影响了结果的敏感性和可靠性。
<110> 湖南新南方养殖服务有限公司
<120> 一种鉴别猪肺炎支原体野毒株和疫苗株的引物、试剂盒和方法
<160>8
<210>1
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<212>DNA
<213>人工序列
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Claims (10)

1.一种鉴别猪肺炎支原体野毒株和疫苗株的引物，其特征是，包括检测猪肺炎支原体野毒株和疫苗株的引物对，检测猪肺炎支原体野毒株的引物对序列为：SEQ ID NO.1和SEQID NO.2，检测猪肺炎支原体疫苗株的引物对序列为：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
2.一种鉴别猪肺炎支原体野毒株和疫苗株的试剂盒，其特征是，包括如权利要求1所述的鉴别猪肺炎支原体野毒株和疫苗株的引物，还包括检测猪肺炎支原体野毒株的探针，序列为：SEQ ID NO.5，标记有FAM；还包括检测猪肺炎支原体疫苗株的探针，序列为：SEQ IDNO.6，标记有HEX。
3.如权利要求2所述的鉴别猪肺炎支原体野毒株和疫苗株的试剂盒，其特征是，还包括MHP反应液、DNA酶混合液、MHP阳性对照、MHP阴性对照和核酸释放剂。
4.如权利要求3所述的鉴别猪肺炎支原体野毒株和疫苗株的试剂盒，其特征是，所述MHP反应液包括PCR-Buffer、dNTP以及SEQ ID NO.1-6的引物和探针，所述PCR-Buffer包括Tris-HCl，所述Tris-HC在MHP反应液中的浓度为125-200mM。
5.如权利要求4所述的鉴别猪肺炎支原体野毒株和疫苗株的试剂盒，其特征是，所述dNTP包括dATP、dUTP、dGTP和dCTP四种脱氧核糖核苷。
6.如权利要求3-5任一项所述的鉴别猪肺炎支原体野毒株和疫苗株的试剂盒，其特征是，所述DNA酶混合液包括酶稀释液、热启动Taq酶与UNG酶，所述热启动Taq酶在DNA酶混合液中的浓度为1～2U/μL。
7.如权利要求3-5任一项所述的鉴别猪肺炎支原体野毒株和疫苗株的试剂盒，其特征是，所述核酸释放剂包括25～100mM的NaOH、1～5％PEG6000和0.5～1mM的EDTA。
8.如权利要求3-5任一项所述的鉴别猪肺炎支原体野毒株和疫苗株的试剂盒，其特征是，所述MHP阳性对照为带有猪肺炎支原体野毒株和疫苗株目标核苷酸的质粒，质粒载体为pUC，质粒浓度为1.0×104～5.0×104copies/μL。
9.如权利要求3-5任一项所述的鉴别猪肺炎支原体野毒株和疫苗株的试剂盒，其特征是，所述MHP反应液、DNA酶混合液、MHP阳性对照、MHP阴性对照和核酸释放剂的含量分别为：950μL、100μL、50μL、500μL和250μL。
10.一种非疾病诊断目的使用如权利要求2-9所述试剂盒的鉴别猪肺炎支原体野毒株和疫苗株的方法，其特征是，包括如下步骤：
(1)样品采集；
(2)样品预处理：样品用生理盐水浸泡，浸出液用于后续检测；
(3)扩增试剂配制：将MHP反应液和DNA酶混合液混合，制备得到PCR-Mix；
(4)核酸释放与加样：向每个反应管中加入核酸释放剂，再取MHP阴性对照、MHP阳性对照和待测样本分别加入对应PCR反应孔，反复吹打，静置；向每个反应管中分别加入PCR-Mix，离心，转移至扩增区；
(5)扩增：将PCR反应管放入扩增仪样品槽，循环参数设定如下：
(6)结果分析与判定：反应完成后，记录样品Ct值与扩增曲线；Mhp阴性对照的FAM通道无报告Ct值，Mhp阳性对照FAM通道Ct值≤30，HEX通道Ct值≤30；
待测样本检测结果：测定FAM通道Ct值≤35且扩增曲线呈S型，HEX通道无Ct值，报告为Mhp野毒株阳性；
测定FAM和HEX通道Ct值≤35且扩增曲线呈S型，报告为疫苗株检测阳性；
测定FAM、HEX通道35＜Ct值≤40且扩增曲线为S型，判定可疑，对可疑样品进行重复检测，如无Ct值，则报告阴性，否则报告阳性；
测定FAM、HEX通道无Ct值显示，报告为Mhp阴性。
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