CN109234313A - 共转染载体及其在抗骨肉瘤药物中的应用 - Google Patents

共转染载体及其在抗骨肉瘤药物中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109234313A
CN109234313A CN201811121364.XA CN201811121364A CN109234313A CN 109234313 A CN109234313 A CN 109234313A CN 201811121364 A CN201811121364 A CN 201811121364A CN 109234313 A CN109234313 A CN 109234313A
Authority
CN
China
Prior art keywords
plasmid
seq
cell
bone
application
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811121364.XA
Other languages
English (en)
Inventor
贺超
郝永强
蒋宇航
符静珂
王磊
郭煜
谢凯
赵双
谭嘉
吴钧翔
杨阳子
罗丁豪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Original Assignee
Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine filed Critical Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority to CN201811121364.XA priority Critical patent/CN109234313A/zh
Publication of CN109234313A publication Critical patent/CN109234313A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

一种共转染载体，包括第一质粒和第二质粒，以质粒pLVX‑shRNA1为载体构件。将本发明提供的第一质粒和第二质粒共转染肿瘤细胞，能显著增加化疗药物(顺铂)的敏感性，使得人骨肉瘤细胞得到抑制。

Description

共转染载体及其在抗骨肉瘤药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种增强药物敏感性的方法，尤其涉及一种将至少一种载体转染肿瘤，以增强肿瘤化疗的药物敏感性，以及在制备抗骨肉瘤药物中的应用。
背景技术
骨肉瘤(osteosarcoma)是恶性程度较高的骨的原发性肿瘤，较常见的发生在20岁以下的青少年或儿童，其特点是瘤细胞直接形成骨样组织。在小儿骨恶性肿瘤中最多见，约为小儿肿瘤的5％。该瘤恶性程度甚高，预后极差，可于数月内出现肺部转移，截肢后3～5年存活率仅为5～20％。骨肉瘤经病理确诊后，即开始前期的化学或放射性治疗，切除肿瘤组织是骨肉瘤治疗中重要的步骤。
在骨肉瘤中，化疗耐药性成为导致患者高死亡率的最大障碍之一。然而，耐药机制仍不明确，这限制了治疗效果。
中国发明专利ZL02110990.7公开了一种判断肿瘤细胞对顺铂敏感度的方法，通过检测患者肿瘤细胞中的UBF含量和用顺铂后的细胞IC50值来判断肿瘤细胞对顺铂的敏感程度。通过检测患者肿瘤细胞中UBF含量的不同可提示肿瘤细胞对顺铂的敏感程度，当细胞的顺铂IC50值较小时，说明顺铂对该肿瘤细胞具有较强的抑制作用，提示临床使用顺铂来治疗肿瘤效果较好。反之，当细胞的顺铂IC50值较大时，说明顺铂对该肿瘤细胞抑制作用较弱，应寻找其他更有效的药物，避免盲目用药。
中国发明专利申请201810091212.3公开了一种原薯蓣皂苷在制备抗耐药性骨肿瘤药物中的应用，显著改善U2OS肿瘤细胞对甲氨喋呤、阿霉素和顺铂等化疗剂的耐药性。
中国发明专利201210177462.1公开了一种抑制SKA1基因表达的siRNA，及含有该siRNA的重组载体，该重组载体转染真核细胞，能够有效降解SKA1基因的mRNA，从而特异性抑制SKA1基因的表达，即得到SKA1基因沉默的细胞。siRNA可用于制备与SKA1基因相关疾病包括肿瘤的治疗药物，对肿瘤特别是骨肉瘤、结直肠恶性肿瘤的临床非手术治疗具有重要的意义。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种质粒，将其转染肿瘤细胞，以增强肿瘤化疗的药物敏感性。
本发明的另一个目的在于提供一种质粒在制备抗骨肉瘤药物中的应用，以增强肿瘤化疗的药物敏感性。
本发明提供一种质粒，包括如SEQ ID No 1所示的正义DNA。
本发明提供另一种质粒，包括如SEQ ID No 1所示的正义DNA，以及与之互补的如SEQ ID No 2所示的反义DNA。
本发明提供另一种质粒，包括如SEQ ID No 3所示的正义DNA。
本发明提供另一种质粒，包括如SEQ ID No 3所示的正义DNA，以及与之互补的如SEQ ID No 4所示的反义DNA。
本发明提供的一种质粒组合物，包括：
第一质粒，其包括如SEQ ID No 1所示的正义DNA；
第二质粒，其包括如SEQ ID No 3所示的正义DNA。
本发明提供的另一种质粒组合物，包括：
第一质粒，其包括如SEQ ID No 1所示的正义DNA，以及与之互补的如SEQ ID No 2所示的反义DNA；
第二质粒，其包括如SEQ ID No 3所示的正义DNA，以及与之互补的如SEQ ID No 4所示的反义DNA。
第一质粒和第二质粒的数量之比值为0.5～2，尤其是1。
本实施例的各种质粒，以pLVX-shRNA1为载体。
本发明提供的第一质粒和第二质粒共转染人骨肉瘤细胞，进行细胞活性实验(不同浓度的顺铂作用72小时)，证明本发明提供的质粒组合物显著增加了对化疗药物(顺铂)的敏感性，其作为顺铂的增敏剂，使得人骨肉瘤细胞得到抑制。
本发明制得的质粒组合在制备抗肿瘤药物中的应用，提高化疗药物的敏感性。
附图说明
图1为pLVX-shRNA1质粒的结构示意图。
具体实施方式
以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
实施例1质粒的构建
使用BamHI和EcoRI将载体pLVX-shRNA1(参见图1)进行双酶切，条件：
1μl Fast Digest EcoRI，1μl Fast Digest BamHI，2μg pLVXshRNA1，双蒸水补齐到20μl，37℃，30分钟。
将酶切后的载体与经退火的SEQ ID No 1所示序列和SEQ ID No 2所示序列或SEQID No 3所示序列和SEQ ID No 4所示序列链接，条件：
1μl pLVX-shRNA1，5μl退火后的序列，1.5μl 10×T4连接酶缓冲液，1μl T4连接酶，双蒸水补齐到15μl，22℃，60分钟。
依据以上方法分别得到第一质粒(含有SEQ ID No 1所示序列)和第二质粒(含有SEQ ID No 3所示序列)。
实施例2共转染肿瘤细胞培养
将1.2μg第一质粒和第二质粒等两种重组质粒分别加入52μl DMEM中，再加入3.3μl ofHD，混匀后37℃静置5分钟～10分钟，将上述混合物加入到12孔板的人骨肉瘤细胞中，37℃培养24小时后加入2μg/ml的puromycin继续培养48小时，得到转染第一质粒或第二质粒重组质粒的细胞。
将得到的第一质粒和第二质粒等两种重组载体各0.6μg共同加入52μl DMEM中，再加入3.3μl ofHD，混匀后37℃静置5分钟～10分钟，将上述混合物加入到12孔板的人骨肉瘤细胞中，37℃培养24小时后加入2μg/ml的puromycin继续培养48小时，得到双质粒转染细胞。
质粒转化采用常规氯化钙转化法，取5μl上述连接产物与100μl感受态DH5a大肠杆菌混匀，冰水浴30分钟，42℃水浴热击90s，冰水浴2分钟，加入500μlSOC培养基，摇床37℃，200rpm培养2小时。吸取100μl菌液涂布在含氨苄青霉素的LB细菌培养皿上，倒置培养37℃，16小时。挑选克隆菌落，测序确保构建的质粒载体正确。
将1.2μg pLVX-shRNA1质粒(没有插入任何序列的空质粒)加入52μl DMEM中，再加入3.3μl ofHD，混匀后37℃静置5分钟～10分钟，将上述混合物加入到12孔板的人骨肉瘤细胞中，37℃培养24小时后加入2μg/ml的puromycin继续培养48小时，得到对照组的细胞。
实施例3化疗敏感性测试
在96孔板中每孔分别加入100微升5,000个上述得到的四种细胞，之后加入顺铂到终浓度0μM、1μM和2μM，培养72小时。
然后，每孔加入10微升CCK-8溶液。
接着，在细胞培养箱内继续孵育2小时。
最后在450nm测定吸光度，将所得吸光度值经空白孔的吸光度值校正标准化后列于下表1。
表1
表中，“*”表示P＜0.01。
序列表
<110> 上海交通大学医学院附属第九人民医院
<120> 共转染载体及其在抗骨肉瘤药物中的应用
<141> 2018-09-03
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gatccgctgt tcgctgctat gaatttcaag agaattcata gcagcgaaca gcttttttac 60
gcgtg 65
<210> 2
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
aattcacgcg taaaaaagct gttcgctgct atgaattctc ttgaaattca tagcagcgaa 60
cagcg 65
<210> 3
<211> 68
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gatccggaga aggagagtga ggatgattca agagatcatc ctcactctcc ttctcctttt 60
ttacgcgt 68
<210> 4
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
aattcacgcg taaaaaagga gaaggagagt gaggatgatc tcttgaatca tcctcactct 60
ccttctccg 69

Claims (10)

1.一种质粒组合物，其特征在于包括：
第一质粒，其包括如SEQ ID No 1所示的正义DNA；
第二质粒，其包括如SEQ ID No 3所示的正义DNA。
2.根据权利要求1所述的质粒组合物，其特征在于还包括与所述的SEQ ID No 1互补的SEQ ID No 2。
3.根据权利要求1所述的质粒组合物，其特征在于还包括与所述的SEQ ID No 3互补的SEQ ID No 4。
4.根据权利要求1所述的质粒组合物，其特征在于所述第一质粒和所述第二质粒的数量之比值为0.5～2。
5.根据权利要求1所述的质粒组合物，其特征在于所述第一质粒和所述第二质粒的数量之比值为1。
6.根据权利要求1～5之一所述的质粒组合物，以pLVX-shRNA1为载体。
7.根据权利要求1～5之一所述的质粒组合物在制备抗骨肉瘤药物中的应用。
8.根据权利要求1～5之一所述的质粒组合物在制备用于顺铂增敏剂中的应用。
9.一种增敏剂，其特征在于包括权利要求1～6之一所述的质粒组合物。
10.一种抗肿瘤组合物，其特征在于包括顺铂和权利要求1～6之一所述的质粒组合物。
CN201811121364.XA 2018-09-25 2018-09-25 共转染载体及其在抗骨肉瘤药物中的应用 Pending CN109234313A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811121364.XA CN109234313A (zh) 2018-09-25 2018-09-25 共转染载体及其在抗骨肉瘤药物中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811121364.XA CN109234313A (zh) 2018-09-25 2018-09-25 共转染载体及其在抗骨肉瘤药物中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109234313A true CN109234313A (zh) 2019-01-18

Family

ID=65057531

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811121364.XA Pending CN109234313A (zh) 2018-09-25 2018-09-25 共转染载体及其在抗骨肉瘤药物中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109234313A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104981458A (zh) * 2012-10-02 2015-10-14 Epi生物医疗有限公司 组蛋白去甲基化酶抑制剂
US20170042904A1 (en) * 2015-08-14 2017-02-16 New York University Methods for treating t-cell acute lymphoblastic leukemia
CN108464984A (zh) * 2018-04-09 2018-08-31 徐州维康生物科技有限公司 一种治疗骨肉瘤的表观遗传药物

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104981458A (zh) * 2012-10-02 2015-10-14 Epi生物医疗有限公司 组蛋白去甲基化酶抑制剂
US20170042904A1 (en) * 2015-08-14 2017-02-16 New York University Methods for treating t-cell acute lymphoblastic leukemia
CN108464984A (zh) * 2018-04-09 2018-08-31 徐州维康生物科技有限公司 一种治疗骨肉瘤的表观遗传药物

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHAO HE, ET AL.: ""Elevated H3K27me3 levels sensitize osteosarcoma to cisplatin"", 《CLINICAL EPIGENETICS》 *
EDWARD SAMUEL HOOKWAY: ""The role of the lysine demethylases KDM5 and KDM6 in bone malignancies"", 《牛津大学博士学位论文》 *
HURST CD, ET AL.: ""Homo sapiens lysine demethylase 6A (KDM6A), transcript variant 1, mRNA，NM_001291415.1，5941bp mRNA linear"", 《NCBI GENBANK》 *
张立伟 等: ""KDM5B基因在卵巢癌中的表达及其对卵巢癌耐药能力的影响"", 《现代妇产科进展》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109072240A (zh) 使用piRNA诊断和治疗癌症的组合物和方法
Stępkowski et al. Silver nanoparticles induced changes in the expression of NF-κB related genes are cell type specific and related to the basal activity of NF-κB
Backer et al. Chaperone-targeting cytotoxin and endoplasmic reticulum stress-inducing drug synergize to kill cancer cells
CN100424096C (zh) 含有hiv转导结构域的生存素突变体及制备方法和应用
CN109415731A (zh) 呈递用于特异性敲低白介素17受体mRNA的反义寡核苷酸(ASO)的脂质体球形核酸(SNA)构建体
CN107531768A (zh) 抗衰老化合物及其用途
CN105274110B (zh) 非小细胞肺癌转移及预判其转移风险的miRNA标记物
CN105008535B (zh) 桥粒芯糖蛋白2(dsg2)结合蛋白质及其用途
CN101918035B (zh) 针对抗癌药物抗性癌的具有抗癌药物增强作用的癌细胞死亡诱导剂
Liu et al. Combination gene therapy using VEGF-shRNA and fusion suicide gene yCDglyTK inhibits gastric carcinoma growth
Wu et al. Combination of Compound Kushen Injection and cisplatin shows synergistic antitumor activity in p53-R273H/P309S mutant colorectal cancer cells through inducing apoptosis
JP2010533212A (ja) マイクロｒｎａ分子を含む抗癌組成物
CN105296656A (zh) 一种诊治鼻咽癌的分子标志物
CN106539808B (zh) 特女贞苷在制备治疗新生血管性疾病药物中的应用
Jo et al. A reverse complementary multimodal imaging system to visualize microRNA9-involved neurogenesis using peptide targeting transferrin receptor-conjugated magnetic fluorescence nanoparticles
JP5234846B2 (ja) 改変ヨウ化ナトリウム共輸送体タンパク質及びその使用
CN105112550B (zh) 作为骨质疏松症诊治靶标的mtus1基因
CN109234313A (zh) 共转染载体及其在抗骨肉瘤药物中的应用
CN107446022A (zh) 一种可拮抗parp1蛋白rna结合活性的多肽pip‑14及其应用
KR101775356B1 (ko) Parp 및 탄키라제 동시 저해제에 대한 감수성 결정 방법
CN110072593A (zh) 适用于肾癌治疗的方法和药物组合物
CN104995300B (zh) Rna活性和血管通透性的调节
Toelen et al. Fetal gene transfer with lentiviral vectors: long-term in vivo follow-up evaluation in a rat model
CN103110958B (zh) Tt1基因在制备治疗肿瘤的药物中的应用
CN107098965A (zh) Beclin1突变蛋白及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20190118