CN107098965A

CN107098965A - Beclin1突变蛋白及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN107098965A
Application number: CN201710245346.1A
Authority: CN
Inventors: 李小花; 张佳霄; 杨文超
Original assignee: Shenzhen Ren Ren Biological Medicine Technology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Sinang Yiyun Technology Co ltd
Priority date: 2017-04-14
Filing date: 2017-04-14
Publication date: 2017-08-29
Anticipated expiration: 2037-04-14
Also published as: CN107098965B

Abstract

本发明属于生物医学工程技术领域，具体涉及一种Beclin1突变蛋白及其制备方法和应用。该Beclin1突变蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经缺失、插入或替换所获得的具有相同功能的氨基酸序列。其制备方法包括：获得编码Beclin1突变蛋白的核苷酸序列；将该核苷酸序列插入pET载体中得重组质粒；将该重组质粒转化大肠杆菌BL21，并进行异源表达培养；提取该大肠杆菌BL21异源表达的Beclin1突变蛋白。该Beclin1突变蛋白在细胞内高效表达后，导致表型上的自噬抑制，因此，其具有在治疗自噬相关疾病的相关药物开发价值。

Description

Beclin1突变蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医学工程技术领域，具体涉及一种Beclin1突变蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

细胞自噬(Autophagy)是多细胞生物的一种“自食”现象，细胞通过包裹胞浆内容物将其运送到溶酶体系降解以循环使用降解产物供正常活动之需，该现象具有进化保守性。自噬是机体重要的防御和保护机制，在许多生理和病理过程中扮演着复杂而多效的角色。在细胞生存受到威胁时，如缺氧或营养缺失，自噬可通过溶酶体降解生存非紧急的蛋白和细胞器等，循环使用新陈代谢营养原料以促进细胞存活；自噬还可以降解和消除有毒性倾向的陈旧蛋白以及蛋白聚集体，形成保护机制以抵抗神经退行性病变；此外，自噬亦能吞噬入侵的细菌和病毒，将其锁定在自噬体内，最终运送到溶酶体消除以起到免疫防御的作用。自噬作用的紊乱会引起许多病理反应，如肿瘤及神经退行性疾病等。

自噬需要多个信号通路和酶复合物的协同作用，Beclin1(Bcl2-binding myosin-like protein 1)为自噬分子机制的核心成分，是Beclin1-VPS34复合体中的骨架蛋白。VPS34是哺乳动物III型磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)，它特异性地磷酸酯化肌糖环三位的磷脂酸肌醇并将其转化为磷脂酸肌醇3磷酸酯(PI3Ps)。VPS34胞质激酶活性的激活是自噬启动机制中的关键步骤，因为自噬过程的-用来包裹胞浆内容物的双膜自噬体-的形成需要大量由VPS34产生的PI3Ps。Beclin1与VPS34紧密结合，为自噬调节因子提供相互作用的平台，因此它在自噬调控中扮演着独特的角色。Beclin1包含多个独立的功能域，其卷曲螺旋域(Coiled Coil)是募集众多自噬调节因子的蛋白作用平台，就目前所知，多个自噬调节因子均通过与Beclin1相互作用而形成功能独特的Beclin1-VPS34次级复合体以调节VPS34的活性，从而发挥各自对自噬过程的调节作用。例如，Atg14L(Atg14-like protein)和UVRAG(UVradiation associated gene)作为两个关键的自噬激活因子，它们分别与Beclin1相互作用，形成Atg14L-Beclin1-VPS34复合体或UVRAG-Beclin1-VPS34复合体，前者在自噬早期促进自噬体的形成；后者在自噬晚期促进自噬体的成熟，并协助内吞转运(endocytictrafficking)。另外，细胞凋亡中的重要蛋白Bcl-2也可以与Beclin1直接作用，降低VPS34活性和自噬通量。Beclin1-VPS34复合体活性的调节除了通过与自噬调控因子的结合来实现以外，还可以通过Beclin1磷酸化实现，从而改变自噬强度。Beclin1可在某些部位被磷酸化，从而影响Beclin1-VPS34复合体的形成，继而敏锐而准确地针对细胞内诸多影响因素产生应答。

目前，临床上与肿瘤及神经退行性疾病相关的自噬抑制剂药物选择有限。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种Beclin1突变蛋白及其制备方法和应用，旨在解决现有细胞自噬抑制剂选择有限的技术问题。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种Beclin1突变蛋白，所述Beclin1突变蛋白具有如SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列；或如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经缺失、插入或替换所获得的具有相同功能的氨基酸序列。

另一方面，本发明还提供一种编码序列，所述编码序列含有编码上述Beclin1突变蛋白的核苷酸序列。

还一方面，本发明还提供一种上述Beclin1突变蛋白的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

获得编码上述Beclin1突变蛋白的核苷酸序列；

将所述核苷酸序列插入pET载体中得重组质粒；

将所述重组质粒转化大肠杆菌BL21，并进行异源表达培养；

提取所述大肠杆菌BL21异源表达的Beclin1突变蛋白。

最后，发明还提供一种上述Beclin1突变蛋白的应用，所述Beclin1突变蛋白用于制备自噬抑制剂。

本发明提供的Beclin1突变蛋白(简称Beclin1_227E231E)，具有鼠源Beclin1的部分氨基酸序列(编号为174-266的氨基酸序列，简称Beclin1_WT)，即CCD区(coiled-coildomain，卷曲螺旋区)序列中的两个酪氨酸(氨基酸编号分别227和231)同时突变为谷氨酸形成的突变体的氨基酸序列。该Beclin1突变蛋白能够与Atg14L竞争性结合Beclin1_WT，形成二聚界面结合力更强的Beclin1_WT-Beclin1_227E231E二聚体，导致Beclin1_WT-Atg14L的解离；如其在细胞内高效表达，导致表型上的自噬抑制。因此，其具有在治疗自噬相关疾病的相关药物开发价值。

本发明提供的Beclin1突变蛋白的编码序列，可翻译成上述Beclin1突变蛋白。因此，其可以用于制备表达上述Beclin1突变蛋白的表达载体、宿主细胞等。

本发明提供的上述Beclin1突变蛋白的制备方法，应用基因技术，先将Beclin1_227E231E的编码序列的具体核苷酸序列人工合成，再将其在大肠杆菌Bl21中异源表达、分离纯化，得到高纯度Beclin1突变蛋白；其方法简单易行，效率高、成本低。

本发明提供的上述Beclin1突变蛋白的应用，利用该Beclin1突变蛋白的自噬抑制作用特点，将其用于制备自噬抑制剂，可用于治疗自噬相关疾病。

附图说明

图1为本发明实施例1中Beclin1_227E231E的结构图；

图2为本发明实施例1中Beclin1_227E231E的质谱图；

图3为本发明实施例2中免疫荧光结果图；

图4为本发明实施例2中免疫印迹结果图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一方面，本发明实施例提供了一种Beclin1突变蛋白，该Beclin1突变蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经缺失、插入或替换所获得的具有相同功能的氨基酸序列。SEQ ID NO:1：GPGSDSEQLQRELKELALEEERLIQELEDVEKNRKVVAENLEKVQAEAERLDQEEAQEQREESEFKRQQLELDDELKSVENQMRYAQMQLDKLKKTN。

因自噬的启动需要经历三个步骤：第一步，Beclin1_WT-Beclin1_WT同源二聚体解离，变为Belcin1_WT单体；第二步，Beclin1_WT单体与Atg14L形成Beclin1_WT-Atg14L异源二聚体；第三步，Beclin1_WT-Atg14L异源二聚体作为结合平台，募集相应活化因子，启动自噬。基于这种蛋白相互作用的分子机制，在已解析的Beclin1_WT-Beclin1_WT同源二聚体三维结构的基础上，通过基因突变手段，将鼠源野生型Beclin1蛋白中的两个酪氨酸(氨基酸编号分别227和231)同时突变为谷氨酸形成CCD区突变体，即该CCD区突变体长度为起始氨基酸编号174，终止氨基酸编号266，一共93个氨基酸，再引入连接表达载体的4个氨基酸(即最开始的4个氨基酸“GPGS”)，因此一共97个氨基酸组成本发明的Beclin1突变蛋白的氨基酸序列。

该Beclin1突变蛋白的结构如图1所示，且以分子对接方法计算二聚体二聚界面结合力，Beclin1_227E231E所选取的突变位点为227、231，这两个位点野生型占位残基为酪氨酸，该两个位置的酪氨酸可以被相应激酶进行磷酸化修饰，从而产生功能抑制作用，因此，本发明是利用227、231两个位点酪氨酸磷酸化的模拟(E为谷氨酸，Glutamic acid，三字母简写为Glu，单字母简写为E，谷氨酸酸性氨基酸，可从电荷上模拟磷酸化后的原子微环境)。

相关的二聚体二聚界面结合力的强弱如表1所示，具体排序如下：Beclin1_WT-Beclin1_227E231E>Beclin1_WT-Atg14L>Beclin1_WT-Beclin1_WT。因此，该Beclin1突变蛋白能够与Atg14L竞争性结合Beclin1_WT，形成二聚界面结合力更强的Beclin1_WT-Beclin1_227E231E二聚体，导致Beclin1_WT-Atg14L的解离；如其在细胞内高效表达，导致表型上的自噬抑制。因此，其具有在治疗自噬相关疾病的相关药物开发价值。

表1

另一方面，本发明实施例还提供了上述Beclin1突变蛋白的编码序列。该编码序列可翻译成本实施例的Beclin1突变蛋白。因此，其可以用于制备表达上述Beclin1突变蛋白的表达载体、宿主细胞等。

具体地，在本发明一实施例中，Beclin1突变蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1时，该编码序列的核苷酸序列为SEQ ID NO:2：GGG CCC GGA TCC GAC AGT GAA CAG CTA CAGAGG GAG CTG AAG GAG TTG GCC TTG GAG GAG GAG AGG CTG ATC CAG GAG CTG GAA GATGTG GAA AAA AAC CGA AAG GTG GTG GCA GAA AAC CTG GAG AAG GTC CAG GCT GAG GCGGAG AGA CTG GAC CAG GAG GAA GCT CAG GAA CAG CGA GAA GAA AGT GAA TTT AAA AGGCAG CAG CTG GAG CTG GAT GAT GAG CTC AAG AGT GTA GAG AAC CAG ATG CGC TAT GCCCAG ATG CAG CTG GAC AAG CTC AAG AAA ACC AAT TGA。

还一方面，本发明实施例还提供一种上述Beclin1突变蛋白的制备方法。该制备方法包括如下步骤：

S01：获得编码上述Beclin1突变蛋白的核苷酸序列；

S02：将上述核苷酸序列插入pET载体中得重组质粒；

S03：将上述重组质粒转化大肠杆菌BL21，并进行异源表达培养；

S04：提取上述大肠杆菌BL21异源表达的Beclin1突变蛋白。

优选地，上述步骤S01中，当Beclin1突变蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1时，该编码序列的核苷酸序列为SEQ ID NO:2；该SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列可以人工合成。

优选地，上述步骤S02中，转化大肠杆菌BL21的重组质粒质量为：10ng-30ng。在该质量范围内，重组质粒转化大肠杆菌BL21的效果达到最佳。

优选地，上述步骤S03中，异源表达培养的条件为：在大肠杆菌BL21的培养基中添加0.2mM-0.5mM的IPTG诱导剂，并在28℃-30℃下摇瓶培养6h-8h。该培养条件下，Beclin1突变蛋白表达量达到最佳。

优选地，上述步骤S04中，Beclin1突变蛋白的提取过程为：用超声破碎大肠杆菌BL21，并离心处理得上清液；将上清液依次经过亲和层析和分子筛层析得所述Beclin1突变蛋白。该提取条件可获得高纯度Beclin1突变蛋白。

进一步优选的，亲和层析为Ni柱亲和层析，分子筛层析为Superdex 200柱分子筛层析。这样层析效果最佳。

进一步优选的，离心处理的离心力为：18000g-20000g(g为重力加速度)。在该离心力形成的离心条件下获得的上清液所含的Beclin1突变蛋白的量达到最佳。

最后，本发明实施例还提供一种上述Beclin1突变蛋白的应用，即Beclin1突变蛋白用于制备自噬抑制剂。利用该Beclin1突变蛋白的自噬抑制作用特点，将其用于制备自噬抑制剂，可用于治疗自噬相关疾病，如肿瘤以及神经系统疾病。本发明实施例中，自噬抑制剂可以作为抗成纤维瘤药物。

本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。

实施例1

一种Beclin1突变蛋白，该Beclin1突变蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1：GPGSDSEQLQRELKELALEEERLIQELEDVEKNRKVVAENLEKVQAEAERLDQEEAQEQREESEFKRQQLELDDELKSVENQMRYAQMQLDKLKKTN。

该Beclin1突变蛋白的理论等电点pI为4.50，分子量为11529.6，其制备方法如下。

S11：人工合成SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

S12：将上述核苷酸序列插入pET载体(其携带6个组氨酸标签用于后续纯化)中得重组质粒。

S13：用上述重组质粒10ng-30ng转化大肠杆菌BL21，并进行异源表达培养；异源表达培养的条件为：在大肠杆菌BL21的培养基中添加0.2mM-0.5mM的IPTG诱导剂，并在28℃-30℃下摇瓶培养6h-8h。

S14：提取上述大肠杆菌BL21异源表达的Beclin1突变蛋白。提取过程为：用超声仪超声破碎大肠杆菌BL21，并在离心力为18000g-20000g的条件下离心处理得上清液；将该上清液依次经过Ni柱亲和层析(GE，HiTrap)和分子筛层析(GE，Superdex200)，纯化得Beclin1突变蛋白。

对提取的Beclin1突变蛋白进行质谱分析，其结果如图2所示，可确认单体分子量与理论值相同。同时，用光散射仪测定Beclin1突变蛋白聚合状态，结果显示Beclin1_227E231E-Beclin1_227E231E为同源二聚体(先前研究显示野生型Beclin1_WT-Beclin1_WT为同源二聚体)，表示Beclin1突变蛋白的聚合状态与野生型一样，二聚体同源界面的结合未因突变而改变。

另外，用恒温量热滴定仪测定体外蛋白相互作用，将Beclin1_WT溶液滴入Atg14L溶液、将Beclin1_227E231E溶液滴入Beclin1_WT溶液、将Beclin1_227E231E溶液滴入Atg14L溶液，测定结合常数，并进行定量计算，发现Beclin1_227E231E能够干扰Atg14L与Beclin1_WT之间的作用，使Beclin1_WT-Atg14L复合物解离，导致自噬下调。

实施例2

用上述实施例1获得的重组质粒转染肿瘤细胞系(人成纤维瘤细胞)，通过免疫荧光法和免疫印记法表征本实施例1中Beclin1突变蛋白的生物学功效。

免疫荧光

本实施例选用人成纤维瘤HT1080细胞系，在补充10％FBS和1％的NEAA的MEM中培养。将细胞系传代至6孔板中，过夜培养，第二天细胞贴壁后，分为两组：一组转染携带绿色荧光蛋白(GFP)的Beclin1_WT和携带红色荧光蛋白(AsRed)的Atg14L，另一组转染携带绿色荧光蛋白(GFP)的Beclin1_227E231E和携带红色荧光蛋白(AsRed)的Atg14L，37℃培养箱中孵育24小时，将细胞用PBS清洗后，用甲醛溶液室温固定细胞15分钟，最后PBS润洗，立即在显微镜下观察。

结果如图3所示，Beclin1野生型和Atg14L在人纤维瘤HT1080细胞胞浆中有明显的共定位，表明两者已形成复合物(图3A)；而Beclin1_227E231E和Atg14L无显微镜可观测的共定位特征，即两者没有形成复合物(图3B)。

免疫印记

本实施例选用人成纤维瘤HT1080细胞系，在补充10％FBS和1％的NEAA的MEM中培养。将细胞传代至6孔板中，过夜培养，第二天细胞贴壁后，转染Beclin1_WT及Beclin1_227E231E，37℃培养箱中孵育24小时，将细胞用PBS清洗后，lysis buffer裂解细胞，提取细胞蛋白。将提取的细胞蛋白经过煮沸变性后，利用免疫印迹实验进行目标蛋白表征，检测Beclin1_WT及Beclin1_227E231E过表达对细胞自噬活性标志物L3-I/II转化及p62蛋白降解水平的影响，即对自噬水平的影响。

结果如图4所示：通过WB(Western Blot蛋白质印迹)重复试验证实，转染处理24小时后，与野生型(图4中WT)相比，Beclin1_227E231E(图4中227E231E)的过表达能使内源性LC3-II转化率降低，同时p62蛋白降解速率下降，即表明Beclin1_227E231E具有抑制自噬的作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳人仁生物医药科技有限公司

<120> Beclin1突变蛋白及其制备方法和应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 97

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gly Pro Gly Ser Asp Ser Glu Gln Leu Gln Arg Glu Leu Lys Glu Leu

1 5 10 15

Ala Leu Glu Glu Glu Arg Leu Ile Gln Glu Leu Glu Asp Val Glu Lys

20 25 30

Asn Arg Lys Val Val Ala Glu Asn Leu Glu Lys Val Gln Ala Glu Ala

35 40 45

Glu Arg Leu Asp Gln Glu Glu Ala Gln Glu Gln Arg Glu Glu Ser Glu

50 55 60

Phe Lys Arg Gln Gln Leu Glu Leu Asp Asp Glu Leu Lys Ser Val Glu

65 70 75 80

Asn Gln Met Arg Tyr Ala Gln Met Gln Leu Asp Lys Leu Lys Lys Thr

85 90 95

Asn

<210> 2

<211> 294

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gggcccggat ccgacagtga acagctacag agggagctga aggagttggc cttggaggag 60

gagaggctga tccaggagct ggaagatgtg gaaaaaaacc gaaaggtggt ggcagaaaac 120

ctggagaagg tccaggctga ggcggagaga ctggaccagg aggaagctca ggaacagcga 180

gaagaaagtg aatttaaaag gcagcagctg gagctggatg atgagctcaa gagtgtagag 240

aaccagatgc gctatgccca gatgcagctg gacaagctca agaaaaccaa ttga 294

Claims

1.一种Beclin1突变蛋白，其特征在于，所述Beclin1突变蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经缺失、插入或替换所获得的具有相同功能的氨基酸序列。

2.一种编码序列，其特征在于，所述编码序列含有编码如权利要求1所述的Beclin1突变蛋白的核苷酸序列。

3.一种Beclin1突变蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

获得编码如权利要求1所述的Beclin1突变蛋白的核苷酸序列；

将所述核苷酸序列插入pET载体中得重组质粒；

将所述重组质粒转化大肠杆菌BL21，并进行异源表达培养；

提取所述大肠杆菌BL21异源表达的Beclin1突变蛋白。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，转化所述大肠杆菌BL21的所述重组质粒质量为：10ng-30ng。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述异源表达培养的条件为：在所述大肠杆菌BL21的培养基中添加0.2mM-0.5mM的IPTG诱导剂，并在28℃-30℃下摇瓶培养6h-8h。

6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述Beclin1突变蛋白的提取过程为：超声破碎所述大肠杆菌BL21，并离心处理得上清液；将所述上清液依次经过亲和层析和分子筛层析得所述Beclin1突变蛋白。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述亲和层析为Ni柱亲和层析，所述分子筛层析为Superdex 200柱分子筛层析。

8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述离心处理的离心力为：18000g-20000g。

9.一种如权利要求1所述的Beclin1突变蛋白的应用，其特征在于，所述Beclin1突变蛋白用于制备自噬抑制剂。

10.如权利要求9所述的Beclin1突变蛋白的应用，其特征在于，所述自噬抑制剂为抗成纤维瘤药物。