CN109219605A - 水溶性的基于三氮杂吡啶环蕃的络合剂及相应的荧光镧系元素络合物 - Google Patents

水溶性的基于三氮杂吡啶环蕃的络合剂及相应的荧光镧系元素络合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及式(I)的络合剂其中，A1、A2、A3和R1如说明书中所定义。本发明还涉及从所述络合剂获得的镧系元素络合物。本发明可用于标记生物分子。

Description

水溶性的基于三氮杂吡啶环蕃的络合剂及相应的荧光镧系元 素络合物
技术领域
本发明涉及基于三氮杂吡啶环蕃类型的大环化合物的新的水溶性络合剂、从这些络合剂获得的荧光镧系元素络合物以及这些荧光镧系元素络合物在用于对分子进行标记并通过时间分辨荧光技术进行检测方面的用途。
背景技术
当前，铕络合物和铽络合物被整个科学界接纳为选择荧光探针(InorganicChemistry 2014，53，1854；Chemical Review 2010，110，2729)。事实上，由于其非常特殊的光物理性质，这些分子已经广泛地在工业中使用并且在生命科学领域的高校实验室中进行研究。这些荧光化合物特别适合于与相容的荧光团缀合使用以进行FRET(荧光共振能量转移)测量，其在研究生物分子间的相互作用方面的应用已由数家公司进行商业化开发(包括Cisbio Bioassays及其产品系列)。镧系元素络合物的相对长的发射寿命同样使得进行时间分辨荧光测量成为可能(即，在荧光团激发之后具有延时，使得对由测量介质引起的荧光干扰进行限制成为可能)。当测量介质接近包含多种蛋白质的生物介质(该蛋白质的荧光可干扰所研究的化合物的荧光)时，后一特征更加有用。
许多镧系元素络合物已经被公开并且部分被商业化开发：具体可提及的是镧系元素的大的多环穴状化合物(EP 0180492、EP 0321353、EP 0601113、WO 2001/96877、WO2008/063721)；包含与二乙撑三胺五酸单元结合的衍生自香豆素的单元的镧系元素络合物(US 5,622,821)；以及包含吡啶衍生物(US 4,920,195、US 4,761,481)、联吡啶衍生物(US5,216,134)或三联吡啶衍生物(US 4,859,777、US 5,202,423、US 5,324,825)的那些镧系元素络合物。
专利US 5,385,893描述了三氮杂吡啶环蕃的衍生物(其三个氮被(羧酸或膦酸)酸基团取代)以及这些化合物与钆、锰或铁原子的络合物。所述络合物不是荧光的并且可用作造影剂。由于大环笼(macrocyclic cage)的尺寸能够使得水分子的交换相对容易，对制备荧光络合物而言，根据US 5,385,893的三氮杂吡啶环蕃并不是非常适合。以2％的产率进行该三氮杂吡啶环蕃大环的合成。该化合物不是直接获得的而是不可避免地通过中间体的使用，由此属于大环的三个氮原子被甲苯磺酰基保护。在极端条件下，后者在合成结束时被清除。
较近的时候，Lee等人(Journal of Organic Chemistry 1996，61，8304)报道了对该合成的改进，其获得了更好的产率。所述大环化合物根据汇聚式合成法(convergentsynthesis)而获得，所述合成法包括8个步骤，其中最后一步在于也是在高酸性介质中将甲苯磺酰基脱保护。这些大环化合物不作为络合配体使用。
2008年，Nolan等人尝试重复Lee所述的合成方法，但失败了，使得他们开发了新的汇聚式合成策略(Tetrahedron Letters 2008，49，1993)。甲苯磺酰基脱保护的最后一步同样在极酸性介质中进行。
近来，Castro等人对三氮杂吡啶环蕃类型的大环系统的研究(InorganicChemistry 2015，54，1671和Inorganic Chemistry 2013，52，6062)使得通过X-射线衍射表征相应的镧系元素络合物成为可能。然而，所使用的合成方法与Lee等人先前描述的相同。
对FRET生物测定的用途而言，现有技术中的三氮杂吡啶环蕃大环是不适合的：
·前述与铕原子或铽原子络合的三氮杂吡啶环蕃大环在267nm处具有最佳吸收波长，这对于用作FRET测量的供体荧光化合物是不可接受的。具体而言，一方面，在生物测定中用于激发供体荧光团的激光源在各种波长下发射：337nm(氮激光)、355nm(Nd:YAG激光)、349nm(Nd:YLF)；而另一方面，闪光灯允许在310nm和350nm之间的激发：现有技术中的在267nm处吸收最佳的化合物不能被这些装置激发。
·现有技术中的三氮杂吡啶环蕃大环是相对疏水的，这对其在水性介质中的生物测定方面的用途而言是有问题的并且可能在FRET测量中产生相当多的非特异性信号。此外，并非易溶于水性介质中的络合物不能非常简单地进行使用。
·合成这些大环的方法包括多个步骤，其最后一步需要非常极端的实验条件来释放被甲苯磺酰基保护的仲胺官能团(即，在120℃下于浓硫酸中反应数小时)。这对更复杂的分子(该分子可被用作FRET类型的生物测定中的荧光团)的合成而言是真正的障碍，因为这些条件与添加对这些条件敏感的官能团并不相容。
·另外值得注意的是，为了获得适合于用作FRET生物测定中的荧光团的化合物，文献中描述的合成三氮杂吡啶环蕃的方法仅使获得C3对称的化合物成为可能，而因此不能区分由三个吡啶环携带的取代基。
最后，由于其光谱性质和其疏水性，现有技术中的三氮杂吡啶环蕃大环不仅不适于用作FRET类型的生物测定中的荧光团，而且另外为其合成所描述的方法使得这些分子不可能对此应用有任何适应性(C3对称的分子、对胺的脱保护而言的过于极端的条件)。
因此，需要可用于FRET类型的生物测定中的三氮杂吡啶环蕃大环和相应的镧系元素络合物。
本发明旨在克服现有技术中的化合物的缺点并且提供荧光镧系元素络合物，所述荧光镧系元素络合物在310nm和350nm之间被激发时具有比现有技术中的化合物更好的亮度；如果可能的话，在水性介质中具有良好的溶解性；具有适合其在FRET实验中的用途的发射光谱；以及对标记生物分子而言也是非常便利的。
发明内容
本发明人已经摆脱了技术偏见，根据该技术偏见，由于大环笼的尺寸能够使得水分子的交换相对容易，三氮杂吡啶环蕃并不非常适合于制备荧光络合物。上述问题因开发出了使制备由三氮杂吡啶环蕃大环构成的络合剂成为可能的合成方案而得以解决，所述三氮杂吡啶环蕃大环的吡啶由对-甲氧基苯基乙炔基团或2,4,6-三甲氧基苯基基团取代，这些基团本身携带能够增加该大环的水溶性的基团以及任选地能够使该大环与其它分子(特别是期望用荧光化合物进行标记的生物分子)缀合的基团。
因此，本发明涉及基于三氮杂吡啶环蕃大环的络合剂、由与根据本发明的络合剂络合的镧系元素原子组成的荧光镧系元素络合物以及通过根据本发明的络合物标记的感兴趣的有机分子。
络合剂
根据本发明的络合剂为式(I)的化合物
其中：
R1基团相同并且选自-CO2H、-PO(OH)R；R选自以下基团：苯基，由-SO3H基团取代的苯基、优选在邻位或对位由-SO3H基团取代的苯基，苄基，甲基，乙基，丙基，正丁基，仲丁基，异丁基，叔丁基；
A1、A2基团相同或不同，并且选自式-L1-E的基团、式(II)的基团或式(II’)的基团；
A3基团选自式-O-L3-G的基团、式(II)的基团、式(II’)的基团、式(III)的基团或式(III’)的基团；
L1、L2和L3相同或不同，并且代表二价连接基团；
E是使络合剂成为水溶性的基团，选自-SO3H、-PO(OH)2、-CO2H、-N+Alk1Alk2Alk3、碳水化合物残基、磺基甜菜碱、PEG基团；
G是反应基团；
Alk1、Alk2、Alk3可相同或不同，代表(C1-C6)烷基。
碳水化合物被理解为是指：环状形式或线性形式的葡萄糖残基；或者是式-(CHOH)k-CH2OH的基团，k为3-12的整数，优选等于4。
磺基甜菜碱被理解为是指选自以下的基团：
R2代表具有1-6个碳原子的烷基基团，并且优选甲基或乙基；以及q等于1、2、3、4、5或6，优选等于1或2；优选式-(CH3)2N+-(CH2)3-SO3 -的磺基甜菜碱。
取决于pH，-SO3H、-CO2H和-PO(OH)2基团任选地处于去质子化形式。因此在本文的其余部分，这些基团也表示-SO3 -、-CO2 -和-PO(OH)O-基团，反之亦然。
PEG基团被理解为是指式-CH2-(CH2OCH2)y-CH2OCH3的聚乙二醇基团；y为1至5的整数。
(II)、(II’)、(III)以及(III’)基团有助于形成天线(antennae)，所述天线有助于荧光团的光谱性质。-L1-E、(II)和(II’)基团携带有使络合剂成为水溶性的E基团；而-O-L3-G、(III)和(III’)基团携带有反应基团G，所述反应基团G使得根据本发明的荧光络合物能够缀合至期望进行标记的感兴趣的分子。
根据本发明，天线包含2,4,6-甲氧基苯基(II’)、(III’)基团或者对甲氧基苯基乙炔(II)、(III)基团，优选后者。此外，根据本发明的化合物可包含1个、2个或3个天线，并且根据本发明的络合剂因此可基于对甲氧基苯基乙炔天线细分为以下优选的亚族：
·具有3个天线的络合剂，包含2个增溶基团和1个反应基团；所述络合剂对应于式(I)的化合物，其中A1和A2相同且为式(II)的基团，并且A3为式(III)的基团。
·具有2个天线的络合剂，包含2个增溶基团和1个反应基团；所述络合剂对应于式(I)的化合物，其中A1为式(II)的基团，A2为-L1-E基团，并且A3为式(III)的基团。
·具有2个天线的络合剂，包含2个增溶基团和1个反应基团；所述络合剂对应于式(I)的化合物，其中A1和A2相同且为式(II)的基团，并且A3为式-O-L3-G的基团。
·具有1个天线的络合剂，包含2个增溶基团和1个反应基团；所述络合剂对应于式(I)的化合物，其中A1和A2相同且为式-L1-E的基团，并且A3为式(III)的基团。
基于对甲氧基苯基天线的相同的亚族分别通过用式(II’)和式(III’)的基团取代式(II)和式(III)的基团来区分，即：
·具有3个天线的络合剂，包含2个增溶基团和1个反应基团；所述络合剂对应于式(I)的化合物，其中A1和A2相同且为式(II’)的基团，并且A3为式(III’)的基团。
·具有2个天线的络合剂，包含2个增溶基团和1个反应基团；所述络合剂对应于式(I)的化合物，其中A1为式(II’)的基团，A2为-L1-E基团，并且A3为式(III’)的基团。
·具有2个天线的络合剂，包含2个增溶基团和1个反应基团；所述络合剂对应于式(I)的化合物，其中A1和A2相同且为式(II’)的基团，并且A3为式-O-L3-G的基团。
·具有1个天线的络合剂，包含2个增溶基团和1个反应基团；所述络合剂对应于式(I)的化合物，其中A1和A2相同且为式-L1-E的基团，并且A3为式(III’)的基团。
对这些亚族中的每一个而言，参与镧系元素的络合的R1基团可为如上定义的羧酸基-CO2H或亚膦酸酯-PO(OH)R(并且在后一种情况中优选甲基亚膦酸酯)。
对这些亚家族中的每一个而言，其中E基团为-SO3 -基团或葡萄糖残基或铵-N+(CH3)3或下式的磺基甜菜碱的化合物是优选的
其中E基团为-SO3 -基团或葡萄糖残基、或上式的磺基甜菜碱的化合物是特别优选的。
由间隔臂L3携带的反应基团G使得将根据本发明的化合物与期望呈现荧光的物质(例如有机分子、肽或蛋白质)进行偶合成为可能。用于缀合两种有机分子的技术基于反应基团的使用，并且属于本领域技术人员的常识。这些常规技术描述于例如BioconjugateTechniques，G.T.Hermanson，Academic Press，2008年，第二版，第169-211页。
通常而言，反应基团为当将其分别置于合适的亲核基团、亲电基团、亲二烯基团或二烯基团存在的情况下时可形成共价键的亲电基团、亲核基团、二烯基团或亲二烯基团。包含反应基团的根据本发明的化合物与携带官能团的有机分子、肽或蛋白质之间的缀合反应引起共价键的形成，所述共价键包含反应基团的一个或多个原子。
优选地，反应基团G为衍生自以下化合物中的一种的基团：丙烯酰胺、活化胺(例如尸胺或乙二胺)、活化酯、醛、卤代烷、酸酐、苯胺、叠氮化物、氮杂环丙烷、羧酸、重氮烷、卤乙酰胺、卤代三嗪(例如一氯三嗪或二氯三嗪)、肼(包括酰肼)、酰亚胺酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、磺酰卤、硫醇、酮、胺、酸性卤化物、琥珀酰亚胺酯、羟基琥珀酰亚胺酯、羟基磺基琥珀酰亚胺酯、叠氮基硝基苯基、叠氮基苯基、乙二醛、三嗪、乙炔基以及下式的基团：
其中w从0至8变化并且v等于0或1；以及Ar是饱和或不饱和的5元或6元杂环，其含有1-3个杂原子，任选地由卤原子取代。
优选地，反应基团G为羧酸、胺(优选脂肪族胺(任选地以-NHBoc的形式进行保护))、琥珀酰亚胺酯、卤代乙酰胺、肼、异硫氰酸酯、马来酰亚胺基团或羧酸(任选地以-CO2Me或-CO2tBu基团的形式进行保护)。在此情形下，为了能够与亲核物质反应，必须以酯的形式将所述酸活化。
因此，能够由根据本发明的化合物标记的有机分子、肽或蛋白质将包含与镧系元素络合物的反应基团或络合剂的反应基团进行反应的官能团。例如，所述有机分子、蛋白质或肽包含以下基团中的一种：胺、酰胺、硫醇、醇、醛、酮、肼、羟胺、仲胺、卤化物、环氧化物、酯(烷基羧酸酯)、羧酸、包含双键的基团或这些官能团的组合。天然存在于蛋白质上的胺基或硫醇基通常用于进行对这些分子的标记。
反应基团和增溶基团E通过间隔臂(L1、L2、L3)结合至络合剂，所述间隔臂有利地由二价有机自由基形成，所述二价有机自由基选自：
-任选地含有一个或多个双键或三键的直链或支链C1-C20亚烷基基团；
-C5-C8环亚烷基基团或C6-C14亚芳基基团；
所述亚烷基、环亚烷基或亚芳基基团任选地含有一个或多个杂原子(例如氧、氮、硫、磷)或者一个或多个氨基甲酰基或甲酰胺基团，并且所述亚烷基、环亚烷基或亚芳基基团任选地由C1-C8烷基、C6-C14芳基、磺酸酯或氧基取代；
-选自下式的二价基团的基团：
其中n、m、p、q为1至16的整数，优选1至5。
优选地，-L3-G基团由反应基团G和间隔臂L3组成，所述反应基团G选自羧酸(任选地以-CO2Me或-CO2tBu基团的形式进行保护)、胺(优选脂肪族胺(任选地以-NHBoc的形式进行保护))、琥珀酰亚胺酯、卤代乙酰胺、肼、异硫氰酸酯、马来酰亚胺基团；所述间隔臂L3由包含1-5个碳原子的亚烷基链组成。还更优选地，-L3-G基团为由包含1-5个碳原子的亚烷基链携带的胺。
关于L1，以下的二价基团是优选的：
其中n是1至16的整数，优选1至5。
关于L2，以下的二价基团是优选的：
其中n和m是1至16的整数，优选1至5。
关于L3，以下的二价基团是优选的：
-(CH2)n-
其中n是1至16的整数，优选1至5。
如下的亚家族也是优选的，其中，同时地
L1是式的二价基团；并且
L2是式的二价基团；并且
L3是式-(CH2)n-的二价基团。
络合物
本发明还涉及由与上述络合剂络合的镧系元素原子组成的荧光镧系元素络合物。优选地所述镧系元素是Tb3+、Eu3+或Sm3+，并且还更优选地是Eu3+。
这些络合物通过使根据本发明的络合剂与镧系元素盐进行接触来制备。因此，在pH 6的水性介质中，在室温下反应数小时或甚至数天后，1当量的络合剂与1至5当量的镧系元素盐(例如处于氯化物形式的铕、铽或钐)之间的反应产生相应的络合物。
如之前所述，所获得的荧光络合物具有优异的光物理性质，特别是关于它们的量子效率、它们的发光寿命以及它们的激发光谱，非常适合于在约337nm处的激光激发。此外，其发射光谱的谱带分布以约620nm为中心，因此给予了络合物杰出的性质：当与青色素或别藻蓝蛋白类型的受体(例如由Cisbio Bioassays出售的XL665)一起使用FRET时是非常有利的。
优选地，本发明涉及以下络合物：
其中：
Ln3+选自Eu3+、Tb3+、Sm3+；
R3选自以下基团：OH、
缀合物
包含反应基团的根据本发明的络合剂和络合物特别适合于对包含官能团的有机分子或生物分子进行标记，所述官能团能够与反应基团反应以形成共价键。因此，本发明还涉及络合物用于标记生物分子(蛋白质、抗体、酶、激素等)的用途。
本发明还涉及用根据本发明的络合物标记的分子。如果它们具有能够与反应基团反应的官能团，则所有的有机分子或生物分子可与根据本发明的络合物进行缀合。特别是，根据本发明的缀合物包含根据本发明的络合物和选自以下的分子：氨基酸、肽、蛋白质、抗体、糖、糖链、核苷、核苷酸、寡核苷酸、酶底物(特别是自杀酶底物，例如苄基鸟嘌呤或苄基胞嘧啶(以和的名称出售的酶的底物))、氯代烷烃(以Halo-tag的名称出售的酶的底物)、辅酶A(以ACP-tag或MCP-tag的名称出售的酶的底物)。本发明的缀合物是通过使包含反应基团G的根据本发明的镧系元素络合物与感兴趣的分子进行接触而获得。
合成
以下对根据本发明的镧系元素络合物和络合剂的制备进行示意性地描述，并且在实验部分中进行更加详细地描述。
三天线(吡啶基-乙炔-4-O-苯基)系统的合成
包含3个天线、2个增溶基团以及1个反应基团的络合物的合成在方案1-方案4中描述并且是基于汇聚式合成法。包含其它增溶基团/反应基团的化合物能够以类似的方式从中间体24制备。
通过对4-碘苯酚进行烷基化反应引入酯官能团，该官能团随后使得磺酸根、磺基甜菜碱、铵或糖衍生物类型的增溶官能团能够附着。衍生物2和三甲基硅烷基乙炔之间的Sonogashira型偶合反应使得能够获得化合物3。在碳酸钾的存在下，使用甲醇-二氯甲烷溶剂的混合物去除(三甲基硅烷基)保护基团。这些条件使得可省掉对水解而言相对敏感的甲酯官能团。二醇8以3个步骤从白屈氨酸获得，如文献中所述(Tetrahedron2005，61，1755；Tetrahedron 2008，64，399；European Journal of Organic Chemistry 2002，21，3680)。在银盐的存在下进行单甲苯磺酰化反应。这些条件针对非卤化类似物而开发(Tetrahedron2004，49，11117；和Angewandte Chemie，国际版2014，53，5872)。缩合反应使得可获得二吡啶基部分10，在其上进行双Sonogashira反应从而产生第一关键合成子的骨架。在与单甲苯磺酰化的条件十分相似的条件下，通过引入甲苯磺酰基基团来活化二醇官能团。
第二关键合成子23的合成在方案2中描述。该合成子将携带掩蔽的(Boc保护基团)胺官能团，该胺官能团使得能够进行例如与抗体或生物分子的生物缀合反应。根据文献(WO2014/111661)中描述的步骤制备化合物17。将二醇8以二甲苯磺酸酯形式进行活化，然后与化合物19缩合产生化合物21，具有良好的产率。Sonogashira反应之后的硝基苯磺酰基(nosyl)基团的脱保护使得可获得合成子23。
最棘手的步骤表示在方案3中。其为大环化步骤，在优化之后以非常合理的产率得到配体24。该中间体形成平台，用于生产一系列携带不同的增溶基团的镧系元素(铕、铽和钐)的络合物，如方案4中所述。
通过使用类似的策略，可以制备单天线和二天线吡啶环蕃络合物。合成方案如下所述。
单天线(吡啶基-乙炔-4-O-苯基)系统的合成
这些系统的合成在方案5-方案7中描述。
在氧化条件下处理异烟酸甲酯得到二醇28，产率为28％。虽然该产率是中等的，但是该反应使得可在单个步骤中在吡啶环的2位和6位同时引入两个羟基亚甲基基团。二醇的一氯化作用使得可获得化合物29，然后与化合物18反应，得到二吡啶骨架30。醇官能团以甲苯磺酸酯的形式被活化，然后在三天线系统上如前所述进行大环化步骤，并得到关键的中间体32。
两个甲基酯官能团的水解得到二酸化合物34，其上接枝有两个水增溶性官能团(具有阴离子35a、两性离子35b、中性35c、或阳离子35d的性质)。在纯的三氟乙酸的存在下，进行丁基酯的脱保护和Boc保护基团的脱保护。在氯化铕或氯化钐的水性溶液的存在下，当将配体在HEPES缓冲液中处理时，镧系元素原子在配体的空穴中进行络合。
二天线(吡啶基-乙炔-4-O-苯基)系统的合成
这些系统的合成在方案8-方案10中描述。
关于二天线系统，其合成开始于在可商购获得的白屈氨酸36上进行酯化反应(在Inorganic Chemistry 2000，39，4678中描述的程序)。使用Mitsunobu反应在该合成水平引入作为络合物和生物分子之间的接头的臂(在Organic Biomolecular Chemistry 2012，10，9183中描述的程序)。通过在乙醇中使用硼氢化钠进行双还原反应获得二醇39，然后后者随后以二甲苯磺酸酯化的形式被活化(在Organic&Biomolecular Chemistry 2012，10，9183中描述的程序)。如上述(三天线系统)，通过将19与40进行缩合(根据Organic&Biomolecular Chemistry 2012，10，9183中描述的程序制备)然后通过将硝基苯磺酰基保护基团进行脱保护来制备合成子42。将化合物12和化合物42二者用于制备构成二天线系统的基础的关键中间体43(方案9和方案10)。
如上所示，水解酯官能团并且引入水增溶性官能团(但这一次直接在天线上进行)。合成的剩余部分与三天线系统和单天线系统所述的相同。
这些荧光探针可通过引入以下的常规官能团来进行活化：NHS酯、叠氮基、马来酰亚胺或异硫氰酸酯。一个实例描述了马来酰亚胺形式的活化使得与蛋白质或cAMP类型的第二信使的生物缀合成为可能。方案11和方案12描述了这些分子的两个实例。
三天线(吡啶基-2,4,5-O-苯基)系统的合成
吡啶基三甲氧基苯基系统同样是与FRET技术相容的发色团。方案13-方案15表示了根据其来获得相应的络合物(C8-C10系列)的方法。该程序与上述程序相同或者可在文献中获得。细节在实验部分中给出。
具体实施方式
实验部分
总体信息
使用的缩略语
Boc：叔丁氧基羰基
Boc-Osu：N-(叔丁氧基羰基氧基)琥珀酰亚胺
cAMP：环磷酸腺苷
m-CPBA：间氯过氧苯甲酸
d：天
DBU：1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯
DCC：二环己基脲
DCM：二氯甲烷
δ：化学位移
DIAD：偶氮二甲酸二异丙酯
DIPEA：二异丙基乙胺
DMF：二甲基甲酰胺
DMSO：二甲基亚砜
EtOH：乙醇
ESI：电喷射离子化
h：小时
HATU：1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧化物六氟磷酸盐
HEPES：4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸
HPLC：高效液相色谱
HRMS：高分辨率质谱
HTRF：均相时间分辨荧光
Hz：赫兹
MeCN：乙腈
MeOH：甲醇
min：分钟
Mops：3-(N-吗啉代)丙磺酸
MP：熔点
MS：质谱
Ms：甲磺酰基
NBS：N-溴代琥珀酰亚胺
NHS：N-羟基琥珀酰亚胺
NIS：N-碘代琥珀酰亚胺
NMR：核磁共振
Ns：硝基苯磺酰基
PE：石油醚
PEG：聚乙二醇
Ph：苯基
ppm：百万分之一
RT：室温
SMPH：琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺基丙酰氨基)己酸酯
Sphos：2-二环己基膦基-2’,6’-二甲氧基联苯
TEA或Et3N：三乙胺
TFA：三氟乙酸
THF：四氢呋喃
TLC：薄层色谱
TMS：三甲基硅烷基
TsCl：甲苯磺酰氯
TSTU：O-(N-琥珀酰亚胺)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯
色谱
在处于铝片上的Merck 60F254硅胶板上或在处于铝片上的Merck 60F254中性氧化铝板(E型)上进行薄层色谱技术。
在两台机器上进行分析型和制备型高效液相色谱(HPLC)技术：
分析型HPLC：ThermoScientific，P4000四元泵，具有氘灯(190-350nm)的UV1000检测器，Waters XBridge C18，3.5μm，4.6×100mm分析柱。
制备型HPLC：Shimadzu，2个LC-8A泵，VarianProStar UV二极管阵列检测器，Waters XBridge Prep.C18，5μm，19×100mm或50×150mm制备柱。
硅胶柱上的色谱技术在Merck 60硅胶(0.040mm-0.063mm)上进行。氧化铝柱上的色谱技术在Brochmann I活化的中性Sigma-Aldrich氧化铝上进行。
梯度A：
Waters Xbridge C18，3.5μm，4.6×100mm柱；A/水0.1％甲酸-B/乙腈0.1％甲酸，t＝0min，5％B-t＝15min，100％B-1mL.min-1。
梯度B：
Waters Xbridge C18，5μm，19×100mm柱；A/水0.1％甲酸，B/乙腈，t＝0min，50％B-t＝17min，100％B-20mL.min-1。
梯度C：
Waters Xbridge C18，5μm，50×150mm柱；A/水0.1％甲酸，B/乙腈，t＝0min，15％B-t＝2min，15％B-t＝20min，100％B-100mL.min-1。
梯度D：
Waters Xbridge C18，5μm，19×100mm柱；A/水0.1％甲酸，B/乙腈，t＝0min，15％B-t＝2min，15％B-t＝20min，100％B-20mL.min-1。
梯度E：
Waters Xbridge C18，3.5μm，4.6×100mm柱；A/H2O 5mM乙酸铵pH 6.5-B/乙腈-t＝0min，2％B-t＝15min，40％B.1mL.min-1。
梯度F：
Waters Xbridge C18，5μm，50×150mm柱；A/水25mM三乙基乙酸铵，B/乙腈t＝0min，2％B-B-t＝17min，40％B-100mL.min-1。
梯度G：
Waters Xbridge C18，5μm，19×100mm柱；A/水25mM三乙基乙酸铵，B/乙腈t＝0min，5％B-B-t＝17min，40％B-20mL.min-1。
梯度H：
Waters Xbridge C18，5μm，10×100mm柱-水25mM三乙基乙酸铵，B/乙腈t＝0min，2％B-B-t＝19min，40％B-5mL.min-1。
梯度I：
Waters Acquity C18，1.7μm，2.1×50mm柱-A/水0.1％甲酸，B/乙腈0.1％甲酸，t＝0min，5％B-t＝0.2min，5％B-t＝5min，100％B-0.6mL.min-1。
梯度J：
Waters Xbridge C18，5μm，50×150mm柱-A/水25mM TEAAc pH 7，B/乙腈，t＝0min，50％B-t＝20min，100％B-100mL.min-1。
梯度K：
Waters Xbridge C18，5μm，50×150mm柱-A/水25mM TEAAc pH 7，B/乙腈，t＝0min，15％B-t＝19min，80％B-80mL.min-1。
梯度L：
Waters Xbridge C18，5μm，19×100mm柱-A/水25mM TEAAcpH 7，B/乙腈，t＝0min，20％B-t＝19min，80％B-100mL.min-1。
梯度M：
Waters Xbridge C18，5μm，50×150mm柱-A/水25mM TEAAc pH 7，B/乙腈，t＝0min，2％B-t＝18min，40％B-80mL.min-1。
梯度N：
Waters Acquity C18，1.7μm，2.1×50mm柱-A/水5mM乙酸铵pH 5，B/乙腈，t＝0min，2％B-t＝0.2min，2％B-t＝5min，40％B-0.6mL.min-1。
梯度O：
Waters Xbridge C18，5μm，50×150mm柱-A/水0.1％甲酸，B/乙腈，t＝0min，40％B-t＝20min，100％B-100mL.min-1。
光谱：
a.核磁共振
使用配备有2H锁场和梯度Z的多核BBFO测量探头(直径为5mm)的Bruker Avance400MHz NanoBay光谱仪(9.4特斯拉磁体)获得NMR光谱(1H、13C和31P)。化学位移(δ)以百万分之一(ppm)表示。使用以下缩略词：
s：单峰；bs：宽单峰；d：二重峰；t：三重峰；q：四重峰；m：多重峰；dd：双二重峰；dt：双三重峰；dq：双四重峰；ddd：双二倍二重峰。
b.质谱
使用配备有Waters XBridge C18,3.5μm,4.6×100mm柱的具有ESI/APCI多模源的单个四极Waters ZQ 2000光谱仪获得(LC-MS)质谱。
c.高分辨率质谱
使用配备有气动辅助大气压电离源(API)的QStar Elite质谱仪(AppliedBiosystems SCIEX)进行分析。在以下条件下以正电喷雾模式对样品进行电离：电喷雾电压(ISV)：5500V；孔电压(orifice voltage)(OR)：20V；喷雾气体(空气)压力：20psi。用飞行时间(TOF)分析仪获得高分辨率质谱(MS)。以具有内部双重校准的三重复进行精确质量的测量。
其它
熔点仪：使用B-540BUCHI熔点仪获取熔点。
化合物1：可商业化获得。
化合物2：根据WO 2004/094386中描述的程序制备化合物2。
化合物3：根据文章Journal of Medicinal Chemistry 2013，56，4990中描述的程序制备化合物3。
化合物4
在0℃下，依次将无水MeOH(30mL)和无水碳酸钾(15.8g，114mmol)加入至处于无水DCM(20mL)中的化合物3(20g，38.1mmol)的溶液中。将悬液在0℃搅拌15min，然后在室温下搅拌1h，然后过滤并减压浓缩。将残留物用DCM(100mL)稀释，然后加入水(80mL)。分离有机相并用DCM(2×60mL)萃取水相。将有机相合并，用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，从而得到作为略微棕色的固体的化合物4(12g，83％)。在剩余的合成中，化合物4无需额外纯化即加以使用。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ7.45(d,J＝8Hz,2H),6.86(d,J＝8Hz,2H),4.65(s,2H),3.82(s,3H),3.03(s,1H)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δ168.9,158.0,133.6,115.4,114.6,83.3,76.3,65.1,52.3。LRMS(ESI+)：C11H11O3[M+H]+，计算值m/z 191.07，测量值191.70。
化合物5：可商业化获得。
化合物6：根据文章Tetrahedron 2005，61，1755中描述的程序制备化合物6。
化合物7：根据文章Tetrahedron 2008，64，399中描述的程序制备化合物7。
化合物8：根据文章European Journal of Organic Chemistry 2002，21，3680中描述的程序制备化合物8。
化合物9
向冷却至-20℃的处于无水DCM(50mL)中的化合物8(3g，11.3mmol)的悬液中加入氧化银(3.93g，17.0mmol)、碘化钾(0.37g，2.2mmol)，然后以少量分批加入TsCl(2.37g，12.5mmol)。将混合物在室温下搅拌16h，然后用Celite过滤。将滤液减压浓缩，并将残余的油通过硅胶柱色谱法使用DCM作为洗脱剂进行纯化，从而得到对应于化合物9的白色固体(2.1g，44％)。熔点：97℃-98℃。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ7.84(d,J＝8.4Hz,2H),7.64(s,1H),7.62(s,1H),7.38(d,J＝8.4Hz,2H),5.10(s,2H),4.67(s,2H),3.20(bs,1H),2.48(s,3H)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δ160.0,153.4,145.4,132.6,130.0,129.4,129.3,128.0,106.9,70.5,63.4,21.7。HRMS(ESI+)：C14H15NO4IS[M+H]+，计算值m/z 419.9766，测量值419.9759。
化合物10
将无水碳酸钾(1.88g，13.6mmol)加入至处于无水MeCN(76mL)中的甘氨酸叔丁酯盐酸盐(0.76g，4.5mmol)的悬液中，并将这一混合物在55℃下加热30min，然后冷却至室温。向这一悬液中加入化合物9(4.0g，9mmol)，然后将混合物在60℃下加热20h。当混合物回至室温时，过滤混合物，并减压浓缩滤液，且通过硅胶柱色谱法使用AcOEt-MeOH溶剂梯度(以1％的增量从97/3直至90/10)纯化残留物，从而得到泡沫形式的化合物10(2.5g，90％)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.79(s,2H),7.53(s,2H),4.70(s,4H),3.96(s,4H),3.86(bs,2H),3.40(s,2H),1.53(s,9H)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δ170.1,159.6,158.8,131.0,128.3,106.8,81.6,63.6,59.2,56.7,38.2。HRMS(ESI+)：C20H26N3O4I[M+H]+，计算值m/z 626.0013，测量值626.0015。
化合物11
将处于THF(7.5mL)和TEA(7.5mL)的混合物中的化合物10(1.64g，2.62mmol)的溶液和化合物4(1.5g，7.87mmol)的溶液通过氩气流脱气15min。然后，向该混合物中加入[1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)(0.64g，0.78mmol)和碘化亚铜(0.3g，1.57mmol)。将该混合物在微波(100W)下辐射30min，然后冷却至室温，并且最后用Celite床过滤。减压浓缩滤液，并通过硅胶柱色谱法使用DCM/AcOEt/MeOH溶剂梯度(以5％的增量从1/0/0、5/5/0、0/1/0直至0/9/1)纯化残留物，从而得到期望的化合物11(1.39g，71％)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.51(s,2H),7.48(d,J＝8.7Hz,4H),7.19(s,2H),6.87(d,J＝8.7Hz,4H),4.75(s,4H),4.68(s,4H),4.16(bs,2H),4.03(s,4H),3.84(s,6H),3.43(s,2H),1.53(s,9H)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δ170.4,168.9,158.5,158.3,158.0,133.6,132.6,123.7,120.5,115.3,114.7,93.6,86.2,81.4,65.1,63.9,59.5,56.4,52.3,28.2。HRMS(ESI+)：C42H44N3O10[M+H]+，计算值m/z 750.3027，测量值750.3022。
化合物12
将碘化钾(22mg，0.14mmol)和氧化银(231mg，1mmol)加入至处于DCM(8mL)中的二醇11(250mg，0.33mmol)的溶液中。向冷却至-5℃的这一混合物中一次性加入TsCl(190mg，1mmol)。然后，在室温下搅拌混合物16h。通过TLC监测反应进程。在这一时间段之后，在压力下去除溶剂，并通过硅胶柱色谱法使用DCM-MeOH洗脱剂梯度(以0.2％的增量从99/1直至98/2)纯化残留物，从而得到米色油(300mg，88％)。1H NMR(CDCl3；300MHz)δ1.46(s,9H)；2.4(s,6H),3.32(s,2H),3.80(s,6H),3.87(s,4H),4.65(s,4H),5.07(s,4H),6.83(d,J＝8.9Hz,4H),7.28(s,2H),7.29(d,J＝8.3Hz,4H),7.44(d,J＝8.9Hz,4H),7.52(s,2H),7.79(d,J＝8.3Hz,4H)。13C NMR(CDCl3；75MHz)δ170.0,168.8,159.0,158.3,153.1,145.0,133.5,133.0,132.6,129.8,128.0,124.2,121.6,115.1,114.7,94.1,85.9,81.2,71.3,65.0,59.5,56.0,52.3,28.1,21.5。HRMS(ESI+)：C56H56N3O14S2[M+H]+，计算值m/z1058.3204，测量值1058.3241。
化合物13：可商业化获得。
化合物14：可商业化获得。
化合物15：根据文章Organic Letters 2006，8，4251中描述的程序制备化合物15。
化合物16：根据文章Organic Letters 2006，8，4251中描述的程序制备化合物16。
化合物17：根据申请WO 2014/111661中描述的程序制备化合物17。
化合物18：可商业化获得。
化合物19：根据文章Organic Letters 2007，9，1635中描述的程序制备化合物19。
化合物20：
在室温下，将氢氧化钠的水溶液(1.36g，34mmol，溶于10mL水中)加入至处于THF(10mL)中的化合物8(3.0g，11.3mmol)的溶液中。向冷却至0℃的这一混合物中加入处于THF(10mL)中的TsCl(6.47g，34mmol)的溶液并在室温下搅拌20h。向这一悬液中加入DCM(100mL)和饱和盐水(50mL)。倾析后，通过DCM(2×100mL)萃取水相。将有机相合并，用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。通过硅胶柱色谱法用环己烷/DCM洗脱剂梯度(从50/50直至0/100)纯化粗产物，从而得到作为白色固体的化合物20(5.41g，84％)。熔点：143.5-144.5℃。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.81(d,J＝8.2Hz,4H),7.64(s,2H),7.36(d,J＝8.2Hz,4H),5.01(s,4H),2.47(s,6H)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δ154.1,145.3,132.6,130.3,130.0,128.0,106.9,70.38,21.72。HRMS(ESI+)：C21H21NO6IS2[M+H]+，计算值m/z 573.9855，测量值573.9854。
化合物21
将碳酸钠(2.77g，26.2mmol)加入至处于无水MeCN(36mL)中的化合物19(1.83g，5.75mmol)的溶液中，然后将这一悬液在80℃下搅拌1h。向冷却至室温的悬液中加入化合物20(1.5g，2.62mmol)，并将混合物在80℃下搅拌72h。在这一时间段之后，将反应混合物冷却至室温，过滤，并将滤液减压浓缩。通过硅胶柱色谱法使用AcOEt/MeOH洗脱剂梯度(以0.5％的增量从98/2直至95/5)纯化残留物，从而得到作为淡黄色油的化合物21(2.0g，89％)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.08(dd,J＝7.6Hz,1.6Hz,2H),7.75-7.66(m,6H),7.60(s,2H),4.63(s,4H),4.15(s,4H),1.39(s,18H)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δ167.3,156.3,147.7,133.7,133.5,131.7,130.8,130.4,124.2,107.3,82.6,52.8,49.2,28.0。HRMS(ESI+)：C31H37N5O12IS2[M+H]+，计算值m/z 862.0925，测量值862.0927。
化合物22
在氩气流下，将处于TEA(42mL)和无水THF(42mL)的混合物中的化合物17(2.58g，9.4mmol)的溶液和化合物21(8.2g，8.54mmol)的溶液脱气15min。然后，向这一混合物中加入[1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)(1.39g，1.70mmol)和碘化亚铜(0.49g，1.57mmol)，并在60℃下搅拌加热20h。将这一混合物冷却至室温，并用Celite床过滤。减压浓缩滤液，并通过硅胶柱色谱法使用环己烷/DCM/AcOEt洗脱剂梯度(从5/2/3直至2/5/3)纯化粗产物，从而得到作为黄色泡沫的化合物22(4.9g，57％)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.10(dd,J＝7.6Hz,1.7Hz,2H),7.75-7-65(m,6H),7.49(d,J＝8.7Hz,2H),7.32(s,2H),6.92(d,J＝8.7Hz,2H),4.76(bs,1H),4.68(s,4H),4.17(s,4H),4.08(t,J＝6.0Hz,2H),3.36(m,2H),2.03(m,2H),1.47(s,9H),1.38(s,18H)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δ167.4,159.7,156.0,155.8,147.9,133.8,133.6,133.6,131.8,130.8,124.2,122.7,114.7,113.8,95.3,85.5,82.4,79.3,65.9,53.0,49.2,37.8,29.5,28.4,27.9。HRMS(ESI+)：C47H57N6O15S2[M+H]+，计算值m/z 1009.3323，测量值1009.3322。
化合物23
随着搅拌，将2-巯基乙醇(76μL，1.09mmol)和1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(67μL，0.445mol)加入至处于MeCN(4.3mL)中的化合物22(0.1g，0.099mmol)的溶液中。在室温下搅拌反应45min。通过TLC监测反应进程。在这一时间段之后，反应完成。在减压下去除溶剂，通过硅胶柱色谱法使用AcOEt/MeOH混合物作为洗脱剂(98/02然后96/04)纯化粗产物，从而得到作为米色油的化合物23(35mg，55％)。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ1.46(s,9H),1.49(s,18H),2.01(m,2H),3.33(m,2H),3.40(s,4H),3.94(s,4H),4.06(m,2H),6.89(d,J＝8.8Hz,2H)；7.32(s,2H)；7.48(d,J＝8.8Hz,2H)。13C NMR(CDCl3,75MHz)δ,171.3,159.4,159.0,156.0,133.4,132.6,122.0,114.6,114.3,93.7,86.1,81.2,79.2,65.8,54.3,51.1,37.8,29.5,28.3,28.1。HRMS(ESI+)：C35H51N4O7[M+H]+，计算值m/z 639.3758，测量值639.3784。
化合物24
将碳酸钠(312mg，2.95mmol)和碘化钠(4.4mg，0.0295mmol)加入至处于无水MeCN(140mL)中的二甲苯磺酰化的衍生物12(312mg，0.295mmol)及衍生物23(188mg，0.295mmol)的溶液中。将悬液在回流下搅拌40h。通过TLC监测反应进程。在这一时间段之后，反应完成。将反应混合物冷却至室温，过滤，并减压浓缩滤液。通过氧化铝柱色谱法使用DCM/MeOH混合物作为洗脱剂(98/02然后97/03)纯化残留物，从而得到作为米色油的化合物24(297mg，74％)。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ1.47(s,9H),1.52(s,27H),2.02(m,2H),3.37(m,2H),3.43(s,4H),3.45(s,2H),3.84(s,6H),3.90(m,12H),4.02(m,2H),4.62(s,4H),6.69(m,6H),7.22(m,4H),7.25(s,2H),7.35(m,6H)。13C NMR(CDCl3,75MHz)δ170.6,168.9,159.1,158.49,158.45,158.4,157.8,156.0,133.43,133.41,132.0,131.7,123.0,122.97,122.8,115.8,114.6,114.4,114.3,92.9,92.4,86.6,86.4,81.1,79.2,65.7,65.0,60.3,60.2,60.1,59.0,58.7,52.3,37.7,29.4,28.4,28.2。HRMS(ESI+)：C77H90N7O15[M+H]+，计算值m/z1352.6495，测量值1352.6521。
化合物25
将1M氢氧化锂的水溶液(156μL，156μmol)加入至处于MeCN(2.11mL)中的化合物24(21.1mg，15.6μmol)的溶液中。在室温下搅拌溶液1h。通过LC-MS(梯度A)监测反应进程。在这一时间段之后，反应完成。通过制备型HPLC(梯度B)直接纯化溶液并得到化合物25(9.4mg，45％)，经鉴定为期望化合物。HRMS(ESI+)：C75H86N7O15[M+H]+，计算值m/z1324.6182，测量值1324.6185。HPLC(梯度A)Rt＝13.95min。
化合物26a
向处于无水DMSO(1275μL)中的化合物25(34mg，25.7μmol)的溶液中加入牛磺酸(12.85mg，102.7μmol)、DIPEA(26.4μL，19.9mg，154μmol)，最后加入HATU(39mg，102.7μmol)。在室温下搅拌溶液40min。通过LC-MS(梯度A)监测反应进程。在这一时间段之后，反应完成。通过制备型HPLC(梯度C)直接纯化溶液，并且得到化合物26a(30mg，76％)，经鉴定为期望化合物。HRMS(ESI+)：C79H97N9O19S2[M+2H]2+，计算值m/z 769.8171，测量值769.8166。HPLC(梯度A)Tr＝11.33min。
化合物26b
根据WO 2011/146595以及Organic&Biomolecular Chemistry 2012，10，1883中描述的程序制备3-((2-氨基乙基)二甲基胺)丙烷-1-磺酸酯。
向处于无水DMSO(562μL)中的化合物25(15mg，11.3μmol)的溶液中加入3-((2-氨基乙基)二甲基胺)丙烷-1-磺酸酯(15mg，71.58μmol)、DIPEA(11.6μL，8.8mg，67.9μmol)，最后加入HATU(17.2mg，45.3μmol)。在室温下搅拌溶液10min。通过LC-MS(梯度A)监测反应进程。在这一时间段之后，反应完成。通过制备型HPLC(梯度D)直接纯化溶液，并得到化合物26b(11.6mg，60％)，经鉴定为期望化合物。HRMS(ESI+)：C89H119N11O19S2[M+2H]2+，计算值m/z854.9062，测量值854.9054。HPLC(梯度A)Rt＝11.14min。
化合物26c
向处于无水DMSO(562μL)中的化合物25(15mg，11.3μmol)的溶液中加入葡萄糖胺(9.77mg，45.3μmol)、DIPEA(11.6μL，8.8mg，67.9μmol)，最后加入HATU(17.2mg，45.3μmol)。在室温下搅拌溶液10min。通过LC-MS(梯度A)监测反应进程。在这一时间段之后，反应完成。通过制备型HPLC(梯度D)直接纯化溶液，并得到化合物26c(16.3mg，87％)，经鉴定为期望化合物。HRMS(ESI+)：C87H108N9O23[M+H]+，计算值m/z 1646.7558，测量值1646.7558。HPLC(梯度A)Rt＝11.62min。
化合物26d：根据与合成26a-26c所用的相同的程序，通过选择相应的胺制备该化合物。
络合物C1a-C2a-C3a
向化合物26a(30mg，19.5μmol)中加入TFA(500μL)。在室温下搅拌溶液2h。通过LC-MS(梯度A)监测反应进程。在这一时间段之后，反应完成。减压去除溶剂。将残留物分为两部分。一部分用于铕络合物C1a的制备，并且另一部分用于铽络合物C2a的制备。
C1a
将水(6mL)、MeCN(2mL)和3M氢氧化钠的水溶液加入至残留物(22.2mg，18μmol)中，从而获得pH为7的溶液。向该溶液中加入氯化铕(26.4mg，72μmol)和3M氢氧化钠的水溶液，从而获得pH为6的溶液。将溶液在室温下搅拌过夜。通过LC-MS(梯度E)监测反应进程。在这一时间段之后，反应完成。通过制备型HPLC(梯度F)直接纯化溶液，并得到络合物C1a(9.7mg，38％)，经鉴定为期望化合物。HRMS(ESI+)：C62H63N9O17S2Eu[M]3+，计算值m/z473.4322，测量值473.4319.HPLC(梯度E)。
C2a
将水(375μL)、氯化铽(2.24mg，6μmol)和3M氢氧化钠的水溶液加入至第一步中得到的残留物中(1.9mg，1.5μmol)，从而获得pH为6的溶液。将溶液在室温下搅拌过夜。通过LC-MS(梯度E)监测反应进程。在这一时间段之后，反应完成。通过制备型HPLC(梯度G)直接纯化溶液，并得到络合物C2a(107μg，5％)，经鉴定为期望化合物。HRMS(ESI+)：C62H63N9O17S2Tb[M+3H]3+，计算值m/z 476.1012，测量值476.1005。HPLC(梯度E)。
C3a：根据与合成C1a和C2a所用的相同的程序制备该络合物。
络合物C1b-C2b-C3b
将TFA(250μL)加入至化合物26b(11.6mg，7μmol)中。将溶液在室温下搅拌2h。通过LC-MS(梯度A)监测反应进程。在这一时间段之后，反应完成。减压去除溶剂。将残留物分成两部分。一部分用于铕络合物C1b的制备，并且另一部分用于铽络合物C2b的制备。
C1b
将水(3.15mL)、氯化铕(8.1mg，22μmol)和3M氢氧化钠的水溶液加入到此前获得的残留物(7.9mg，5.5μmol)中，获得pH为6的溶液。将溶液在室温下搅拌过夜。通过LC-MS(梯度E)监测反应进程。在这一时间段之后，反应完成。通过制备型HPLC(梯度F)直接纯化溶液，并得到络合物C1b(3.58mg，41％)，经鉴定为期望化合物。HRMS(ESI+)：C72H83N11O17S2Eu[M+H]3+，计算值m/z 530.1540，测量值530.1580。HPLC(梯度E)Rt＝8.56min和8.81min(58％-42％的异构体混合物)。
C2b
将水(857μL)、氯化铽(2.24mg，6μmol)和3M氢氧化钠的水溶液加入至第一步中获得的残留物(2.2mg，1.5μmol)中，从而获得pH为6的溶液。将溶液在室温下搅拌过夜。通过LC-MS(梯度E)监测反应进程。在这一时间段之后，反应完成。通过制备型HPLC(梯度G)直接纯化溶液，并得到络合物C2b(231μg，10％)，经鉴定为期望化合物。HRMS(ESI+)：C72H85N11O17S2Tb[M+3H]3+，计算值m/z 532.8273，测量值532.8268。HPLC(梯度E)Rt＝8.71min和8.94min(35％-65％的异构体混合物)。
C3b：根据与合成C1b和C2b所用的相同的程序制备该络合物。
络合物C1c-C2c
将TFA(250μL)加入至化合物26c(16.3mg，11.8μmol)中。将溶液在室温下搅拌2h。通过LC-MS(梯度A)监测反应进程。在这一时间段之后，反应完成。减压去除溶剂。向残留物中加入水(4mL)和3M氢氧化钠的水溶液，从而获得pH为7的溶液。将溶液分成两部分。一部分用于铕络合物C1c的制备，并且另一部分用于铽络合物C2c的制备。
C1c
将氯化铕(15.1mg，41.2μmol)和3M氢氧化钠的水溶液加入到此前获得的溶液(16.3mg，11.8μmol，3.5mL)中，从而获得pH为6的溶液。将溶液在室温下搅拌过夜。通过LC-MS(梯度E)监测反应进程。在这一时间段之后，反应完成。通过制备型HPLC(梯度F)直接纯化溶液，并得到络合物C1c(3.25mg，18％)，经鉴定为期望化合物。HRMS(ESI+)：C70H72N9O21Eu[M+]2+，计算值m/z 763.7027，测量值763.7093。HPLC(梯度E)Rt＝8.68min。
C2c
将水(508μL)、氯化铽(2.24mg，6μmol)和3M氢氧化钠的水溶液加入到此前获得的溶液(2.1mg，1.5μmol，508μL)中，从而获得pH为6的溶液。将溶液在室温下搅拌过夜。通过LC-MS(梯度E)监测反应进程。在这一时间段之后，反应完成。通过制备型HPLC(梯度G)直接纯化溶液，并得到络合物C2c(184μg，8％)，经鉴定为期望化合物。HRMS(ESI+)：C70H74N9O21Tb[M+2H]2+，计算值m/z 767.7126，测量值767.7141。HPLC(梯度E)Rt＝8.30min和8.78min(25％-75％的异构体混合物)。
C3c：根据与合成C1c和C2c所用的相同的程序制备该络合物。
C1d、C2d、C3d：根据与合成C1c和C2c所用的相同的程序制备这些络合物。
C1a-马来酰亚胺
将处于无水DMF(50μL)中的琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯(0.23mg，600nmol)的溶液和DIPEA(0.2μL，155μg，1.2μmol)加入吡啶环蕃络合物C1a(0.56mg，400nmol)中。将混合物在室温下搅拌2h。通过LC-MS(梯度E)监测反应进程，Rt＝10.64min。在这一时间段之后，反应完成。通过制备型HPLC(梯度H)直接纯化溶液，并得到络合物C1a-马来酰亚胺(353μg，210nmol，52％)，经鉴定为期望化合物。LRMS(ESI+)：C75H77N11O21S2Eu[M+H]+，计算值m/z1684.3933，测量值1684.65。HPLC(梯度E)Rt＝10.64min。
C1a-CAMP
将处于无水DMF(50μL)中的TSTU(0.13mg，440nmol)的溶液和DIPEA(0.1μL，77.5μg，600nmol)加入至CAMP-Glu-酸(0.25mg，400nmol)中。将混合物在室温下搅拌1h。向该溶液中加入处于50mM pH7磷酸盐缓冲液(350μL)中的络合物C1a(0.28mg，200nmol)的溶液。通过LC-MS(梯度E)监测反应进程，Rt＝9.1min。在这一时间段之后，反应完成。通过制备型HPLC(梯度H)直接纯化溶液，并得到络合物C1a-CAMP(303μg，150nmol，75％)，经鉴定为期望化合物。LRMS(ESI+)：C84H92N16O28PS2Eu[M+2H]2+，计算值m/z 1010.2329，测量值1010.89。HPLC(梯度E)Rt＝9.1min。
化合物27：可商业化获得。
化合物28：根据EP-A-533131中描述的程序制备化合物28。
化合物29
将三苯基膦(4.2g，16.1mmol)加入至处于氯仿(265mL)中的化合物28(2.6g，13.4mmol)的悬液中。将混合物在室温下搅拌直至完全溶解(30min)。向该溶液中加入四氯化碳(37mL)，并在室温下搅拌20h。通过TLC监测反应进程。在这一时间段之后，反应完成。减压去除溶剂。通过硅胶柱色谱法使用3/7的环己烷-AcOEt洗脱剂纯化残留物，从而得到期望化合物(0.8g，28％)。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ7.96(s,1H),7.81(s,1H),4.86(s,2H),4.74(s,2H),3.99(s,3H),3.45(sl 1H)。
化合物30
将碳酸钠(1.25g，11.8mmol)和胺18(250μL，1.85mmol)加入至处于无水MeCN(15mL)中的化合物29(0.8g，3.7mmol)的悬液中。将非均相混合物在回流下加热20h，然后冷却至室温。向该混合物中加入饱和的碳酸氢钠的水溶液(20mL)、水(15mL)然后加入DCM(50mL)。分离有机相，并用DCM(2×50mL)萃取水相。将有机相合并，用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。通过硅胶柱色谱法使用DCM-MeOH洗脱剂梯度(以1％的增量从97/3直至90/10)纯化残留物，从而得到化合物30(0.6g，66％)。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ7,97(s,2H),7.67(s,2H),4.82(s,2H),4.81(s,2H),4.12(s,4H),4.02(s,2H),3.98(s,6H),3.43(s,2H),1.53(s,9H)。
化合物31
将碘化钾(7mg，42.5μmol)和氧化银(71mg，306μmol)加入至处于DCM(2mL)中的二醇化合物30(50mg，102μmol)的溶液中。在非活性气氛下，向冷却至-20℃的混合物中加入TsCl(39mg，204μmol)。将溶液再加热至室温，然后在非活性气氛下搅拌20h。在这一时间段之后，通过硅胶柱色谱法使用90/10的DCM-AcOEt洗脱剂混合物直接纯化反应混合物，从而得到处于无色油形式的二甲苯磺酰化的衍生物31(57mg，71％)。1H NMR(CDCl3):δ1.46(s,9H)；2.42(s,6H)；3.33(s,2H)；3.94(s,6H)；3.96(s,4H)；5.13(s,4H)；7.31-7.33(d,4H,J＝8.1Hz)；7.75(s,2H)；7.80-7.83(d,4H,J＝8.4Hz)；7.96(s,2H)。13C NMR(CDCl3):δ＝21.7；28.2；52.8；59.4；56.1；71.3；81.4；119.3；122.1；128.1；129.9；132.7；138.9；145.2；154.4；160.4；165.3；170.1。MS(ES+)：m/z＝798.5[M+H+](100％)。IR(cm-1)ν3444,2958,1732,1368,1177。
化合物32
在氩气下，将化合物23(204mg，0.319mmol)、碳酸钠(338mg，3.19mmol)和碘化钠(4.8mg，0.0319mmol)加入至处于无水MeCN(160mL)中的二甲苯磺酰化的化合物31(255mg，0.319mmol)的溶液中。将悬浮液在回流下搅拌40h。将混合物过滤，真空蒸发，并通过氧化铝柱色谱法纯化(以0.5％的增量从100％的CH2Cl2直至99/1的CH2Cl2/MeOH)残留物。然后，将回收的级分(对应于游离形式和钠络合物形式的化合物的混合物)重新溶解于最少量的DCM中，并且用水洗涤数次。得到黄色粉末形式的期望化合物32(208mg，60％)。Rf＝0.18(氧化铝，CH2Cl2/MeOH 98/2)。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ7.58(s,4H),7.44(d,J＝8.7Hz,2H),7.16(s,2H),6.86(d,J＝8.7Hz,2H),4.77(s,1H),4.03(t,J＝6Hz,2H),3.95(s,4H),3.92(s,4H),3.84(s,4H),3.79(s,6H),3.43(s,2H),3.39(s,4H),3.35-3.28(m,2H),2.02-1.94(m,2H),1.47(s,27H),1.42(s,9H)；13C NMR(CDCl3,75MHz)δ170.4,165.8,159.6,159.3,158.4,155.9,137.6,133.3,131.8,122.8,120.5,120.3,114.6,114.5,92.8,86.3,81.19,81.15,79.2,65.8,60.0,59.9,58.9,58.7,52.3,37.8,29.5,28.3,28.1；HRMS(ESI+)：C59H78N7O13[M+H]+，计算值m/z 1092.5658，测量值1092.5636；IR(cm-1):ν3429,2977,2932,2210,1729,1596,1511,1367,1225,1159。
化合物34
在25mL圆底烧瓶中，将化合物32(50.0mg，46μmol)溶解在MeCN(1mL)中，以得到无色溶液。将处于水(458μL)中的氢氧化锂(11.19mg，458μmol)的溶液一次性加入至反应混合物中。在室温下搅拌溶液30min。通过UPLC-MS(梯度I)监测反应进程。在这一时间段之后，反应完成。通过制备型HPLC(梯度J)直接纯化溶液，并得到化合物34(35mg，71％)，经鉴定为期望化合物。HRMS(ESI+)：C57H74N7O13[M+H]+，计算值m/z 1064.5339，测量值1064.5341。UPLC-MS(梯度I)Rt＝3.82min。
化合物35a
在50mL圆底烧瓶中，将化合物34(35.0mg，33μmol)溶解在DMSO(1mL)和MeCN(4mL)的混合物中，以得到无色溶液。将DIPEA(34μL，197μmol)、牛磺酸(12.47mg，99μmol)和HATU(25.8mg，65.8μmol)一次性加入到反应混合物中。在室温下搅拌溶液2h。通过UPLC-MS(梯度I)监测反应进程。在这一时间段之后，反应完成。通过制备型HPLC(梯度K)直接纯化溶液，并得到化合物35a(31.7mg，75％)，经鉴定为期望化合物。HRMS(ESI+)：C61H85N9O17S2[M+2H]2+，计算值m/z639.7747，测量值639.7747。UPLC-MS(梯度I)Rt＝3.36min。
化合物35b
根据WO 2011/146595和Organic&Biomolecular Chemistry 2012，10，1883中描述的程序制备3-((2-氨基乙基)二甲基胺)丙烷-1-磺酸酯。在5mL圆底烧瓶中，将3-((2-氨基乙基)二甲基胺)丙烷-1-磺酸酯(10.56mg，50.0μmol)和化合物34(10.64mg，10μmol)溶解于DMSO(600μL)中，以得到黄色溶液。将DIPEA(12.06μL，70.0μmol)和HATU(15.21mg，40.0μmol)一次性加入到反应混合物中。在室温下搅拌溶液15min。通过UPLC-MS(梯度I)监测反应进程。在这一时间段之后，反应完成。通过制备型HPLC(梯度L)直接纯化溶液，并得到化合物35b(8.6mg，59％)，经鉴定为期望化合物。HRMS(ESI+)：C71H107N11O17S2[M+2H]2+，计算值m/z724.8638，测量值724.8644。UPLC-MS(梯度I)Rt＝3.24min。
化合物35c：根据与用于合成35a和35b所用的相同的程序制备该化合物。
化合物35d
根据在Analytical Chemistry 2014，86，10006中描述的程序制备2-三甲基铵甲基胺盐酸盐。在5mL圆底烧瓶中，将2-三甲基铵甲基胺盐酸盐(6.98mg，50.0μmol)和化合物34(10.64mg，10μmol)溶解在DMSO(600μL)中，以得到黄色溶液。将DIPEA(16.68μL，100μmol)和HATU(15.21mg，40.0μmol)一次性加入至反应混合物中。在室温下搅拌溶液15min。通过UPLC-MS(梯度I)监测反应进程。在这一时间段之后，反应完成。通过制备型HPLC(梯度L)直接纯化溶液，并得到化合物35d(6.8mg，55％)，经鉴定为期望化合物。HRMS(ESI+)：C67H99N11O11[M+2H]2+，计算值m/z 616.8757，测量值616.8759。UPLC-MS(梯度I)Rt＝2.97min。
络合物C4a
在50mL圆底烧瓶中，将化合物35a(31.7mg，25μmol)溶解在TFA(200μL)中，以得到黄色溶液。在室温下搅拌溶液30min。通过UPLC-MS(梯度I)监测脱保护进程。在这一时间段之后，脱保护完成。减压蒸发TFA。将残留物溶解在水(6mL)和MeCN(1mL)中，用3M氢氧化钠溶液将pH调至7。随着搅拌，将氯化铕(III)六水合物(36.3mg，99μmol)一次性加入至反应混合物中。通过加入3M氢氧化钠将pH调节至7。在室温下搅拌溶液5天。通过UPLC-MS(梯度I)监测反应进程。在这一时间段之后，反应完成。通过制备型HPLC(梯度M)直接纯化溶液，并得到络合物C4a(15.6mg，55％)，经鉴定为期望化合物。HRMS(ESI+)：C44H50N9O15S2Eu[M+2H]2+，计算值m/z 579.6028，测量值579.6026。UPLC-MS(梯度N)，异构体1Rt＝1.32min和异构体2Rt＝1.64min。
络合物C5a：根据与合成C4a所用的相同的程序制备该络合物。
络合物C4b
在25mL圆底烧瓶中，将化合物35b(8.6mg，5.93μmol)溶解在TFA(130μL)中，以得到黄色溶液。在室温下搅拌溶液30min。通过UPLC-MS(梯度I)监测脱保护进程。在这一时间段后，脱保护完成。减压蒸发TFA。将残留物溶解在50mM pH 7.4的HEPES缓冲液(2mL)中。随着搅拌，将氯化铕(III)六水合物(13.03mg，36μmol)一次性加入至反应混合物中。在室温下搅拌溶液40h。通过UPLC-MS(梯度I)监测反应进程。在这一时间段之后，反应完成。通过制备型HPLC(梯度M)直接纯化溶液，并得到络合物C4b(6.5mg，83％)，经鉴定为期望化合物。HRMS(ESI+)：C54H73N11O15S2Eu[M+3H]3+，计算值m/z 444.1310，测量值444.1309。UPLC-MS(梯度I)Rt＝0.34min。
络合物C5b：根据与合成C4b所用的相同的程序制备该络合物。
络合物C4c：根据与合成C4b所用的相同的程序制备该络合物。
络合物C5c：根据与合成C4b所用的相同的程序制备该络合物。
络合物C4d
在25mL圆底烧瓶中，将化合物35d(6.8mg，5.51μmol)溶解在TFA(200μL)中，以得到黄色溶液。在室温下搅拌溶液5h。通过UPLC-MS(梯度I)监测脱保护进程。在这一时间段之后，脱保护完成。减压蒸发TFA。将残留物溶解在50mM pH7.4的HEPES缓冲液(2mL)中。随着搅拌，将氯化铕(III)六水合物(12.09mg，33μmol)一次性加入至反应混合物中。在室温下搅拌溶液18h。通过UPLC-MS(梯度I)监测反应进程。在这一时间段之后，反应完成。通过制备型HPLC(梯度M)直接纯化溶液，并得到络合物C4d(3mg，19％)，经鉴定为期望化合物。HRMS(ESI+)：C50H64N11O9Eu[M+2H]2+，计算值m/z 557.7048，测量值557.7050。UPLC-MS(梯度I)Rt＝0.32min。
络合物C5d：根据与合成C4b所用的相同的程序制备该络合物。
络合物C4e：根据与合成C4b所用的相同的程序制备该络合物。
络合物C5e：根据与合成C4b所用的相同的程序制备该络合物。
化合物37
根据文章Chemistry-A European Journal 2008，14，1726中描述的程序制备化合物37。在97％硫酸(0.6mL)的存在下，在EtOH(60mL)中在回流下加热白屈氨酸一水合物5(3g，15mmol)16h。减压蒸发溶剂，将剩余的白色残留物用饱和的碳酸氢钠的水溶液中和并用DCM萃取。将有机相用硫酸镁干燥，蒸发至干，并得到白色固体形式的二酯37(2.27g，63％)。Rf＝0.10(二氧化硅，CH2Cl2/MeOH 99/1)；1H NMR(CDCl3,300MHz)δ7.31(s,2H),4.46(q,J＝7.1Hz,4H),1.42(t,J＝7.1Hz,6H)；13CNMR(DMSO-d6,62.5MHz)δ166.0,164.3,149.9,115.2,61.4,14.1。
化合物38
根据文章Organic&Biomolecular Chemistry 2012，10，9183中描述的程序制备化合物38。在氩气下，向处于无水THF(50mL)中的白屈氨酸二乙酯(diethyl chelidamate)37(0.5g，2.09mmol)的溶液中加入在无水THF(10mL)中稀释的叔丁基-(3-羟丙基)氨基甲酸酯(0.77g，4.41mmol)和三苯基膦(1.13g，4.31mmol)。然后，在10min内滴加DIAD(0.83mL，4.19mmol)，并在70℃下搅拌反应介质16h。减压蒸发介质，并将获得的黄色粘性残留物通过快速硅胶柱色谱法(AcOEt/EP 50/50)纯化。得到白色粉末形式的化合物38(0.82g，99％)，Rf＝0.23(二氧化硅，AcOEt/EP 50/50)；1H NMR(CDCl3,300MHz)δ7.77(s,2H),4.68(s,1H),4.47(q,J＝7.1Hz,4H),4.19(t,J＝5.9Hz,2H),3.39-3.28(m,2H),2.10-1.99(m,2H),1.45(t,J＝7.1Hz,6H),1.43(s,9H)；13C NMR(CDCl3,75MHz)δ166.8,164.7,156.0,150.2,114.3,79.4,66.6,62.4,37.5,29.4,28.4,14.2。
化合物39
根据文章Organic&Biomolecular Chemistry 2012，10，9183中描述的程序制备化合物39。将硼氢化钠(817mg，21.595mmol)以少量分批加入至处于EtOH(85mL)中的化合物38(1.70g，4.30mmol)的溶液中。将反应介质在回流下加热2h。然后将混合物冷却至室温，并加入70mL水，并且减压去除乙醇。用DCM(4×20mL)萃取水相。将有机相用饱和的氯化铵(20mL)溶液洗涤，然后用水(20mL)洗涤，用硫酸镁干燥并减压蒸发。然后得到白色固体形式的化合物39(1.02g，76％)。Rf＝0.30(二氧化硅，CH2Cl2/MeOH 90/10)；1H NMR(CDCl3,300MHz)δ6.72(s,2H),4.71(s,4H),4.68(s,1H),4.09(t,J＝6.1Hz,2H),3.37-3.23(m,2H),2.77(s,2H),2.07-1.93(m,2H),1.43(s,9H)；13C NMR(CDCl3,75MHz)δ166.5,161.2,156.3,105.6,79.4,65.7,64.4,37.6,29.4,28.5。
化合物40
根据文章Organic&Biomolecular Chemistry 2012，10，9183中描述的程序制备化合物40。在0℃下，随着搅拌将处于THF(23mL)中的TsCl(1.07g，5.64mmol)的溶液和氢氧化钠(338mg，8.45mmol)加入至处于THF/水(1:1.17mL)混合物中的化合物39(440mg，1.41mmol)的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌16h，然后倾析，并用DCM(10mL)洗涤水相。将收集的有机相用5％碳酸氢钠的水溶液(10mL)洗涤，用硫酸镁干燥，过滤并蒸发至干。得到白色粉末形式的化合物40(841mg，96％)。Rf＝0.40(二氧化硅，CH2Cl2/MeOH 98/2)；1HNMR(CDCl3,300MHz)δ7.80(d,J＝8.0Hz,4H),7.33(d,J＝8.0Hz,4H),6.81(s,2H),4.98(s,4H),4.68(s,1H),4.03(t,J＝6.0Hz,2H),3.36-3.23(m,2H),2.44(s,6H),2.06-1.91(m,2H),1.45(s,9H)；13C NMR(CDCl3,75MHz)δ166.7,156.1,153.3,145.3,132.8,130.1,128.2,107.7,79.6,71.3,66.1,37.6,29.4,28.5,21.8。
化合物41
在氩气下，将碳酸铯(1.01g，3.12mmol)和化合物40(844mg，1.36mmol)加入至处于无水DMF(26mL)中的化合物19(943mg，2.98mmol)的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌40h，过滤，蒸发至干，并将所得到的粗产物通过硅胶柱色谱法(100％CH2Cl2然后90/10CH2Cl2/AcOEt)纯化，以得到白色粉末形式的化合物41(980mg，79％)。Rf＝0.58(二氧化硅，CH2Cl2/AcOEt 90/10)；1H NMR(CDCl3,300MHz)δ8.11-8.04(m,2H),7.72-7.60(m,6H),6.76(s,2H),4.70(s,1H),4.60(s,4H),4.12(s,4H),4.02-3.92(m,2H),3.35-3.21(m,2H),2.03-1.87(m,2H),1.45(s,9H),1.35(s,18H)；13C NMR(CDCl3,75MHz)δ167.4,166.6,157.2,155.9,147.9,133.58,133.55,131.8,130.9,124.1,107.6,82.3,79.4,65.7,53.2,49.1,37.5,29.2,28.4,27.8；LRMS(ESI+)：C39H53N6O15S2[M+H]+，计算值m/z 909.30，测量值909.30。
化合物42
随着搅拌，将2-巯基乙醇(949μL，13.574mmol)和1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(828μL，5.55mmol)加入至处于MeCN(54mL)中的二甲苯磺酰化的化合物41(1.12g，1.23mmol)的溶液中。在室温下搅拌混合物30min。减压去除溶剂，然后加入DCM(20mL)，并将混合物用水(2×10mL)洗涤，用硫酸镁干燥，过滤，并减压蒸发。将所得到的粗产物通过硅胶柱色谱法(95/5AcOEt/MeOH然后90/10AcOEt/MeOH)纯化，从而得到黄色固体形式的化合物42(523mg，79％)。Rf＝0.24(二氧化硅，AcOEt/MeOH 90/10)；1H NMR(CDCl3,300MHz)δ6.73(s,2H),4.79-4-75(m,1H),4.04(t,J＝6Hz,2H),3.84(s,4H),3.73(s,2H),3.34(s,4H),3.31-3.25(m,2H),2.00-1.92(m,2H),1.44(s,18H),1.42(s,9H)；13CNMR(CDCl3,75MHz)δ171.4,166.1,160.5,156.0,106.7,81.2,79.3,65.5,54.5,51.2,37.6,29.3,28.4,28.1；MS(ESI+)：C27H47N4O7[M+H]+，计算值m/z 539.3445，测量值539.3445。
化合物43
在氩气下，将化合物42(480mg，0.893mmol)、碳酸钠(947mg，8.93mmol)和碘化钠(13mg，0.0893mmol)加入至处于MeCN(447mL)中的化合物12(945mg，0.893mmol)的溶液中。将悬液在回流下搅拌65h。过滤残留物，减压蒸发，并通过氧化铝柱色谱法(以1％的增量从100％DCM直至95/5DCM/MeOH)纯化。然后将回收的级分(对应于游离形式和钠络合物形式的化合物的混合物)重新溶解于最少量的DCM中，并且用水洗涤数次。得到处于黄色粉末形式的期望的化合物43(690mg，62％)。Rf＝0.33(氧化铝，DCM/MeOH 97/3)；1H NMR(CDCl3,300MHz)δ7.40(d,J＝8.8Hz,4H),7.24(d,J＝1.5Hz,2H),7.20(d,J＝1.5Hz,2H),6.79(d,J＝8.8Hz,4H),6.64(s,2H),4.71(s,1H),4.64(s,4H),4.01-3.96(m,2H),3.86-3.83(m,12H),3.81(s,6H),3.39(s,6H),3.17-3.08(m,2H),1.82-1.70(m,2H),1.48(s,9H),1.46(s,18H),1.41(s,9H)；13CNMR(CDCl3,75MHz)δ170.5,168.9,166.2,158.5,158.1,155.9,133.4,131.7,123.2,122.9,115.6,114.7,107.9,92.6,86.6,81.2,81.1,79.0,65.8,65.1,60.1,59.8,59.6,58.31,58.28,52.3,37.5,29.6,28.4,28.2。MS(ESI+)：m/z 626.8[M+2H]2+,42％,645.8[M+K+H]2+,100％),1252.6([M+H]+,15％)；HRMS(ESI+)：C69H86N7O15[M+H]+，计算值m/z 1252.6182，测量值1252.6194；IR(cm-1)：ν3425,2976,2931,2210,1758,1733,1596,1510,1367,1213,1158。
化合物44
在5mL圆底烧瓶中，将化合物43(27.0mg，22μmol)溶解在MeCN(1mL)中，以得到无色溶液。将处于水(500μL)中的氢氧化锂(2.66mg，109μmol)的溶液一次性加入至反应混合物中。在室温下搅拌溶液30min。通过UPLC-MS(梯度I)监测反应进程。在这一时间段之后，反应完成。通过制备型HPLC(梯度O)直接纯化溶液，并得到化合物44(22.9mg，86％)，经鉴定为期望化合物。HRMS(ESI+)：C67H82N7O15[M+H]+，计算值m/z 1224.5863，测量值1224.5867。UPLC-MS(梯度I)Rt＝3.87min。
化合物45a
在25mL圆底烧瓶中，将化合物44(22.90mg，19μmol)溶解在DMSO(1mL)中，以得到无色溶液。向反应混合物中一次性加入牛磺酸(11.82mg，94μmol)、DIPEA(22μL，131μmol)，然后加入HATU(29.3mg，74.8μmol)。在室温下搅拌溶液2h。通过UPLC-MS(梯度I)监测反应进程。在这一时间段之后，反应完成。通过制备型HPLC(梯度K)直接纯化溶液，并得到化合物26a(27mg，70％)，经鉴定为期望化合物。HRMS(ESI+)：C71H93N9O19S2[M+2H]2+，计算值m/z719.8009，测量值719.8011。UPLC-MS(梯度I)Rt＝3.22min。
化合物45b：根据与合成45a所用的相同的程序，通过选择相应的胺制备该化合物。
化合物45c：根据与合成45a所用的相同的程序，通过选择相应的胺制备该化合物。
化合物45c：根据与合成45a所用的相同的程序，通过选择相应的胺制备该化合物。
化合物45d：根据与合成45a所用的相同的程序，通过选择相应的胺制备该化合物。
络合物C6a：
在10mL圆底烧瓶中，将化合物45a(18.9mg，13μmol)溶解在TFA(200μL)中，以得到黄色溶液。在室温下搅拌溶液30min。通过UPLC-MS(梯度I)监测脱保护进程。在这一时间段之后，脱保护完成。减压去除TFA。将残留物溶解在50mM pH 7.4的HEPES缓冲液(6.2mL)中。随着搅拌，将氯化铕(III)六水合物(27.5mg，75μmol)一次性加入至反应混合物中。在室温下搅拌溶液4天。通过UPLC-MS(梯度I)监测反应进程。在这一时间段之后，反应完成。通过制备型HPLC(梯度M)直接纯化溶液，并得到络合物C6a(0.89mg，5％)，经鉴定为期望化合物。HRMS(ESI+)：C54H58N9O17S2Eu[M+2H]2+，计算值m/z 660.6299，测量值660.6299。UPLC-MS(梯度I)，异构体1Rt＝1.5min和异构体2Rt＝1.55min。
络合物C7a：根据与合成C6a所用的相同的程序制备该络合物。
络合物C7a：根据与合成C6a所用的相同的程序制备该络合物。
络合物C6b：根据与合成C6a所用的相同的程序制备该络合物。
络合物C7b：根据与合成C6a所用的相同的程序制备该络合物。
络合物C6c：根据与合成C6a所用的相同的程序制备该络合物。
络合物C6d：根据与合成C6a所用的相同的程序制备该络合物。
络合物C7d：根据与合成C6a所用的相同的程序制备该络合物。
化合物46：可商业化获得。
化合物47：根据Journal Organic Chemistry 1987，52，2029中所述的程序制备化合物47。
化合物48：根据EP2216330中描述的程序制备化合物48。
化合物49：根据EP2216330中对类似化合物描述的程序制备化合物49。
化合物50：根据EP2216330中对类似化合物描述的程序制备化合物50。
化合物51：根据与合成15所用的相同的程序制备该化合物。
化合物52：根据Organic Letters 2014，16，1290中描述的程序制备化合物52。
化合物53：根据与合成20所用的相同的程序制备该化合物。
化合物54：根据与合成21所用的相同的程序制备该化合物。
化合物55：根据与合成23所用的相同的程序制备该化合物。
化合物56：根据与合成9所用的相同的程序制备该化合物。
化合物57：根据与合成10所用的相同的程序制备该化合物。
化合物58：根据与合成12所用的相同的程序制备该化合物。
化合物59：根据与合成24所用的相同的程序制备该化合物。
化合物60：根据与合成25所用的相同的程序制备该化合物。
化合物61a-61d：根据与合成26a-26d所用的相同的程序制备这些化合物。
络合物C8a-C8d：根据与合成C1a-C1d所用的相同的程序制备这些络合物。
络合物C9a-C9d：根据与合成C2a-C2d所用的相同的程序制备这些络合物。
络合物C10a-C10d：根据与合成C3a-C3d所用的相同的程序制备这些络合物。
光物理测量
在下表中公布了本发明的代表性的络合物的光物理性质。
表1：络合物的光物理性质
a：Chrom＝发色团
基础的吡啶环蕃(现有技术)在水(生物介质和缓冲介质)中是可溶的，但是因为该络合物的最大吸收为267nm，所以发色团(吡啶)不适合于310-350nm之间的激发(通过闪光灯或氮激光器激发)。向这些不含增溶基团的吡啶环蕃系统(化合物62、化合物63)中引入发色团使得这些络合物与激光源或闪光激发源(62和63的吸收为约320-330nm)相容，但这些络合物在水(生物介质和缓冲介质)中是不溶的。溶解性的这一缺乏阻止了62和63在HTRF型免疫测定中的任何应用。另一方面，一旦将增溶基团引入至62和63中(对应于本发明的络合物(实例C1a-c或C4a-b、C4d))，则这些化合物在生物介质和缓冲介质中变得可溶，并且这些络合物可用于HTRF型免疫测定、显微术或其它生命科学应用中。
图1和图2示出了络合物C1a的吸收光谱和发射光谱。吸收光谱在320nm处具有最大值。因此，该络合物系列与激光和闪光灯激发是完全相容的。发射光谱在620nm处具有最大值，这使得能够与相容的受体具有最佳重叠。

Claims (18)

1.一种式(I)的络合剂：
其中，
R1基团相同并且选自-CO2H、-PO(OH)R；R选自以下基团：苯基，由-SO3H基团取代的苯基、优选在邻位或对位由-SO3H基团取代的苯基，苄基，甲基，乙基，丙基，正丁基，仲丁基，异丁基，叔丁基；
A1基团、A2基团相同或不同，并且选自式-L1-E的基团、式(II)的基团或式(II’)的基团；
A3基团选自式-O-L3-G的基团、式(II)的基团、式(II’)的基团、式(III)的基团或式(III’)的基团；
L1、L2和L3相同或不同，并且代表二价连接基团；
E是使所述络合剂成为水溶性的基团，选自-SO3H、-PO(OH)2、-CO2H、-N+Alk1Alk2Alk3、碳水化合物残基、磺基甜菜碱、PEG基团；
G是反应基团；
Alk1、Alk2、Alk3可相同或不同，代表(C1-C6)烷基。
2.如权利要求1所述的络合剂，其特征在于，A1和A2相同且为式(II)的基团，并且A3为式(III)的基团。
3.如权利要求1所述的络合剂，其特征在于，A1为式(II)的基团，A2为-L1-E基团，并且A3为式(III)的基团。
4.如权利要求1所述的络合剂，其特征在于，A1和A2相同且为式(II)的基团，并且A3为式-O-L3-G的基团。
5.如权利要求1所述的络合剂，其特征在于，A1和A2相同且为式-L1-E的基团，并且A3为式(III)的基团。
6.如权利要求1所述的络合剂，其特征在于，A1和A2相同且为式(II’)的基团，并且A3为式(III’)的基团。
7.如权利要求1所述的络合剂，其特征在于，A1为式(II’)的基团，A2为-L1-E基团，并且A3为式(III’)的基团。
8.如权利要求1所述的络合剂，其特征在于，A1和A2相同且为式(II’)的基团，并且A3为式-O-L3-G的基团。
9.如权利要求1所述的络合剂，其特征在于，A1和A2相同且为式-L1-E的基团，并且A3为式(III’)的基团。
10.如前述权利要求中任一项所述的络合剂，其特征在于，所述反应基团G选自丙烯酰胺、活化胺、活化酯、醛、卤代烷、酸酐、苯胺、叠氮化物、氮杂环丙烷、羧酸、重氮烷、卤乙酰胺、卤代三嗪、二氯三嗪、肼、酰亚胺酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、磺酰卤、硫醇、酮、胺、酸性卤化物、琥珀酰亚胺酯、羟基琥珀酰亚胺酯、羟基磺基琥珀酰亚胺酯、叠氮基硝基苯基、叠氮基苯基、乙二醛、三嗪、乙炔基团以及下式的基团：
其中，w从0至8变化并且v等于0或1；以及Ar是饱和或不饱和的5元杂环或6元杂环，所述杂环包含1-3个杂原子，任选地由卤原子取代。
11.如前述权利要求中任一项所述的络合剂，其特征在于，当存在间隔臂L1、L2和L3时，所述间隔臂选自：
-任选地含有一个或多个双键或三键的直链或支链C1-C20亚烷基基团；
-C5-C8环亚烷基基团或C6-C14亚芳基基团；
所述亚烷基、环亚烷基或亚芳基基团任选地含有一个或多个杂原子或者一个或多个氨基甲酰基或甲酰胺基基团，所述杂原子例如氧、氮、硫、磷，并且所述亚烷基、环亚烷基或亚芳基基团任选地由C1-C8烷基、C6-C14芳基、磺酸酯或氧基取代；
-选自下式的二价基团的基团：
其中，n、m、p、q是1-16的整数，优选1-5。
12.如前述权利要求中任一项所述的络合剂，其特征在于，当-L3-G基团存在时，所述-L3-G基团由反应基团G和间隔臂L3组成，所述反应基团G选自羧酸、胺、优选脂族胺、琥珀酰亚胺酯、卤代乙酰胺、肼、异硫氰酸酯、马来酰亚胺基团；所述间隔臂L3由含有1-5个碳原子的亚烷基基团组成。
13.如前述权利要求中任一项所述的络合剂，其特征在于，当L1存在时，L1为下式的二价基团：
其中，n是1-16的整数，优选1-5。
14.如前述权利要求中任一项所述的络合剂，其特征在于，当L2存在时，L2为下式的二价基团：
其中，n和m是1-16的整数，优选1-5。
15.如前述权利要求中任一项所述的络合剂，其特征在于，当L3存在时，L3为下式的二价基团：
-(CH2)n-
其中，n是1-16的整数，优选1-5。
16.包含如前述权利要求中任一项所述的络合剂和镧系元素的荧光镧系元素络合物，所述镧系元素选自Eu3+、Sm3+、Tb3+。
17.一种具有下述的式(IV)、式(V)、式(VI)或式(VII)的荧光镧系元素络合物：
其中，Ln3+选自Eu3+、Tb3+、Sm3+；
R3选自以下基团：OH；
18.通过使权利要求16或17中所述的镧系元素络合物与感兴趣的分子接触而获得的感兴趣的分子的荧光缀合物，所述络合物包含反应基团G。
CN201680081345.1A 2015-12-09 2016-12-09 水溶性的基于三氮杂吡啶环蕃的络合剂及相应的荧光镧系元素络合物 Active CN109219605B (zh)

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