CN109197594A - 一种太子参脱毒种苗的组培扩繁方法 - Google Patents

一种太子参脱毒种苗的组培扩繁方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种太子参脱毒种苗的组培扩繁方法，具体步骤如下：(1)获得脱毒种苗；(2)配制培养基：按照以下配比量取培养基的各组分：KNO3为7.07g/L，NH4H2PO3为2.30g/L，KH2PO4为3.4g/L，MgSO4·7H2O为4.95g/L，Ca(NO3)2·4H2O为4.7g/L，Na2·EDTA为37.3mg/L，FeSO4·7H2O为27.8mg/L；向培养基中添加结冷胶形成固体培养基；(3)脱毒种苗组培扩增；(4)脱毒种苗繁育。为太子参生长提供需要的氮磷钾含量及微量元素。在太子参脱毒种苗扩繁培养过程中，整个过程不需更换培养基，且不需添加任何植物激素，简化了培养过程，节省了劳动成本，大大提高了组培扩繁效率。组培扩增操作不需洁净工作台，对操作人员技术要求较低，操作简单快速，微生物污染率低，种苗成活率高，极大地降低了生产成本。

Description

一种太子参脱毒种苗的组培扩繁方法
技术领域
本发明属于太子参的组织培养技术领域，具体涉及一种太子参脱毒种苗的组培扩繁方法。
背景技术
太子参为石竹科多年生草本植物异叶假繁缕的块根，有益气健脾、生津润肺的功效，对小孩盗汗、食欲不振、老人体虚失眠具有显著功效，与人参相比药性更为平缓，适宜于儿童补虚补气之用，因此，又称作孩儿参或童参。太子参是一种可用于保健食品的补益类中药材，可作为人参乃至西洋参的代用品，在中医药界和保健品行业有巨大的发展空间，近年的需求量呈稳定上升趋势。
太子参的种植集中于贵州、福建、安徽、山东和江苏等地，在生产上主要以块根进行繁殖。由于长期的块根无性繁殖，太子参病毒病发生普遍，病害严重，部分种植区的病毒病发病率高达90％以上，是影响太子参产量和质量的主要病害，对农户收入及太子参产业发展造成极大障碍。侵染太子参的病毒种类较多，报道的主要有烟草花叶病毒(TMV)、芜菁花叶病毒(TuMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)等，农艺防治措施收效甚微。
鉴于太子参种植的无性繁殖特性，培育脱毒种苗或种参是克服其带毒生产现状的关键手段，并有技术人员进行了相关尝试，能够获得太子参的脱毒种苗。然而，前期报道的太子参脱毒种苗及脱毒种参培育方法均以MS(Murashige&Skoog)培养基为基本培养基，该方法操作技术复杂，对操作人员技术要求较高，且易发生细菌污染，致使培育成本居高不下；另一方面，太子参的田间种植密度高，每亩近7万株，用种量较大，高成本的脱毒种苗或种参繁育无法满足农业生产实际需求。对克服这一现状而言，开发一种快速高效、操作简单、成本低廉的太子参脱毒种苗组培扩繁方法尤为重要。
发明内容
针对上述客观技术问题，本发明提供了一种太子参脱毒种苗的组培扩繁方法，该方法极大地降低了操作技术难度，操作设施要求简单，接种污染率低，种苗成活率高，极大地降低了生产成本，提高了生产效率，能够满足生产需求的太子参脱毒种苗及种参供给。
本发明采取的技术方案为：
一种太子参脱毒种苗的组培扩繁方法，具体步骤如下：
(1)获得脱毒种苗：
以太子参苗新生茎尖为外植体，消毒处理后，于低倍双筒解剖镜下获取茎尖分生组织，置于MS固体培养基上于人工气候室培养，获得太子参脱毒种苗；本步骤用于获得原始脱毒种苗，以开展下一步的种苗扩增；
(2)配制培养基：
按照以下配比量取培养基的各组分：KNO3为7.07g/L，NH4H2PO3为2.30g/L，KH2PO4为3.4g/L，MgSO4·7H2O为4.95g/L，Ca(NO3)2·4H2O为4.7g/L，Na2·EDTA为37.3mg/L，FeSO4·7H2O为27.8mg/L；以上述配方配制10倍浓度的母液，在使用前用蒸馏水稀释成1倍浓度溶液，分装至培养瓶，向培养基中添加2g/L的结冷胶作为凝固剂；将配制好的培养基放入高压灭菌锅加热，取出，静置放凉，形成固体培养基；本步骤用于配制可在敞开空间进行脱毒种苗扩增的培养基；
(3)脱毒种苗组培扩增：
将太子参脱毒种苗以叶节为单位剪成小段，转入有培养基的组培瓶中，每瓶放置6-8个茎段，盖上瓶盖后置于人工气候室培养，获得太子参扩繁种苗；本步骤进行脱毒种苗的扩增操作，在敞开空间操作，不需洁净工作台；
(4)脱毒种苗繁育：
待太子参扩繁种苗生长至6cm高后，打开培养瓶盖练苗2天，然后，洗净根部培养基，移栽至盛有营养基质的育苗盘上，在人工气候室驯化间培养1个月，随后，将脱毒太子参扩繁种苗移植至进行过消毒处理的土壤中繁育脱毒种参。
进一步的，所述步骤(1)中生苗后，通过透射电镜切片观察，鉴定出无病毒粒子的脱毒种苗。
进一步的，所述步骤(2)中将配制好的培养基放入高压灭菌锅中于120℃左右加热10min。
进一步的，所述步骤(2)中培养基用1M的KOH或HCl溶液调节pH至6.0。
进一步的，所述步骤(2)中培养基所用凝固剂为结冷胶。
进一步的，所述步骤(3)中脱毒种苗组培扩增在开敞的室内空间操作。无需特殊的洁净无菌设施，大大降低了环境要求，提高脱毒种苗组培扩增的适用范围。
进一步的，所述步骤(3)中人工气候室的培养条件为：25℃室温，60％相对湿度，2800lx光照强度，14小时光照/8小时黑暗的光照周期。
进一步的，所述步骤(4)中人工气候室内的温度保持在25℃左右，相对湿度为60％，光照强度为2800lx。
进一步的，所述步骤(4)中脱毒太子参扩繁种苗移植地200m范围内禁止种植带毒太子参、烟草、黄瓜、油菜或蚕豆作物，避免病毒感染。
本发明的有益效果为：
本申请针对太子参脱毒种苗扩繁采用了特殊的培养基配方，该配方中的硝酸钾含量和磷酸氢氨含量增加，保证了太子参生长所需要的氮磷钾含量，同时为其补充了镁、钙、钠和铁等微量元素，保证了太子参快速生长的需求；另外，磷酸氢铵使用安全性较高。
在太子参脱毒种苗扩繁培养过程中，只进行一次组培扩繁操作即可培养到太子参种苗练苗移栽阶段，整个过程不需更换培养基，且不需添加任何植物激素，简化了培养过程，节省了劳动成本，大大提高了组培扩繁效率。
本申请中可在开敞的室内空间操作，对操作人员技术要求较低，操作简单快速，微生物污染率低，种苗成活率高，极大地降低了生产成本，提高了生产效率，为太子参脱毒种苗和种参的规模化生产提供了技术保障。
用本方法扩繁的太子参种苗，未发现有病毒病感染的单株，太子参脱毒种参平均单粒重0.51g，与常规种植的太子参单粒重量相近，可以作为正常生产用种。
附图说明
图1六种培养基在敞开空间移植脱毒太子参种苗后的染菌情况；
图2太子参脱毒种苗在三种培养基上的生长情况比较；
图3为本申请中太子参脱毒种苗田间生长情况；
其中，图2的照片展示为扩繁1个月后的生长情况。Hoagland、#2、#3分别为Hoagland培养基、本申请的培养基、参试培养基的培养基编号。
具体实施方式
下面结合附图进一步说明本发明。
实施例1
一、脱毒种苗培育
1.外植体获取
选取生长健壮、无明显病害症状的太子参幼苗，取其新生茎尖作为外植体材料。然后，将选取的太子参茎尖组织置于烧杯中，在超净工作台内进行表面消毒处理：将材料在烧杯中用配制的消毒液100mL(5mL漂渍液，50μL Tween 20，95mL无菌水)消毒7min，中间轻柔晃动几次，取出后用无菌水洗涤3次。
2.脱毒种苗培育
将消毒处理后的外植体从无菌水中取出，在低倍双筒解剖镜下剥去茎尖外面幼叶，获取新生茎尖的分生组织，置于MS固体培养基上，于25℃、60％相对湿度，2800lx光照强度的组培间培养。待幼苗长至2～3个节时，在无菌环境下按单株编码，并分别扩增培养。
3.脱毒种苗的鉴定
从按单株编码扩增的脱毒种苗中分别取样进行脱毒植株的鉴定，通过透射电镜切片观察进行病毒粒子检测，选取未检测到病毒粒子的脱毒种苗株系，并将其单株移植于营养钵中于温室培养，选取整个生长过程均无病毒检出的脱毒种苗株系。
二、脱毒种苗扩繁
1.脱毒种苗起始群体培育
以上述通过组织培养和病毒检测鉴定出的脱毒种苗株系为材料，在超净工作台种剪取其叶节，移植于常规MS固体培养基上培养，并通过多轮连续扩增培养获得脱毒种苗培育的起始群体(500个培养瓶)。
2.脱毒种苗组培扩繁培养基的配制
所用培养基配方为：KNO3为7.07g/L，NH4H2PO3为2.30g/L，KH2PO4为3.4g/L，MgSO4·7H2O为4.95g/L，Ca(NO3)2·4H2O为4.7g/L，Na2·EDTA为37.3mg/L，FeSO4·7H2O为27.8mg/L；在配制脱毒种苗组培扩繁培养基时，先以上述配方配制10倍浓度的母液，在使用前用蒸馏水稀释成1倍浓度溶液，用1M的KOH或HCl溶液调节pH值至6.0，然后，分装至培养瓶，并加入凝固剂(结冷胶)，凝固剂用量为2g/L。将配制好的培养基放入高压灭菌锅加热，于120℃左右加热10min取出，静置放凉，形成固体培养基。
3.脱毒种苗组培扩增
脱毒种苗组培扩增可在开敞的室内空间操作，把剪刀在酒精灯上加热消毒后，将组培瓶中的太子参脱毒种苗以叶节为单位剪成小段，转入有组培扩繁培养基的组培瓶中，每瓶放置6个茎段，盖上瓶盖置于人工气候室培养。人工气候室的培养条件为：25℃室温，60％相对湿度，2800lx光照强度，14小时光照/8小时黑暗的光照周期。
三、脱毒种参繁育
1.脱毒种苗驯化
待太子参的扩繁脱毒种苗生长至6cm高后，打开培养瓶盖练苗2天，取出组培苗，洗净根部培养基，将种苗移栽盛有基质的育苗盘上培养(如图3所示)。所需基质是由营养土：蛭石按体积比为1：1配制而成，基质厚度为15～20cm，移栽基质配制好后需进行基质消毒。将脱毒种苗在人工气候室驯化间培养1个月，温度保持在25℃左右，相对湿度为60％，光照强度为2800lx。
2.脱毒种参繁育
将脱毒种参繁育地进行土壤消毒处理后，将驯化苗移栽到消毒过的土壤中正常种植。种参繁育地200m范围内禁止种植带毒太子参、烟草、黄瓜、油菜、蚕豆等作物，以避免病毒感染。
采用本申请中上述技术方案培养得到的太子参脱毒种参增产效果如下：
表1.太子参脱毒种参增产效果
实验：
一：根据适宜敞开空间操作的培养基选择：
为筛选适宜敞开空间操作的培养基，我们选取了以下六种培养基配方：MS+琼脂粉、MS+结冷胶、B5+琼脂粉、B5+结冷胶、Hoagland+琼脂粉、Hoagland+结冷胶。其中，MS和B5培养基为组织培养的常用培养基，Hoagland培养基极少用作组织培养的培养基。试验所用MS和B5培养基配方为通用配方，所用Hoagland培养基配方为：KNO3为5.55g/L，NH4NO3为1.6g/L，KH2PO4为3.4g/L，MgSO4·7H2O为4.95g/L，Ca(NO3)2·4H2O为4.7g/L，Na2·EDTA为37.3mg/L，FeSO4·7H2O为27.8mg/L，培养基的凝固剂用量分别为：琼脂粉10g/L，结冷胶2g/L。将上述培养基于120℃加热10min后冷却凝固，分别用于敞开空间的脱毒太子参种苗扩繁，每种培养基各扩繁100瓶，并比较其7天及1个月后的染菌情况。7天后的培养基染菌情况统计发现，MS+琼脂粉、MS+结冷胶、B5+琼脂粉、B5+结冷胶和Hoagland+琼脂粉的染菌率均已达到100％，而Hoagland+结冷胶的染菌率则只有1％；1个月后的培养基染菌情况统计表明，Hoagland+结冷胶的染菌率也只有3％。由于太子参脱毒苗在培养基中的生长周期只有1个月的时间，因此，Hoagland+结冷胶的培养基适合脱毒太子参种苗在敞开空间的组培扩繁。
如图1所示，照片展示为扩繁7天后的代表性染菌情况，培养瓶下标注的百分数表示各培养基在扩繁后1个月的染菌率(％)。A：MS+琼脂粉，B：MS+结冷胶，C：B5+琼脂粉，D：B5+结冷胶，E：Hoagland+琼脂粉，F：Hoagland+结冷胶。
二、培养基优化
虽然上述试验表明Hoagland+结冷胶的培养基适合脱毒太子参种苗在敞开空间的组培扩繁，但太子参在该培养基中的生长情况并不理想，表现在生长速度慢，叶片易变黄，扩繁苗移栽成活率低等问题。为开发适宜太子参脱毒种苗扩繁的培养基，我们进行了配方优化。通过试验筛选，我们最后选用了以下三种配方的培养基：
Hoagland培养基：KNO3为5.55g/L，NH4NO3为1.6g/L，KH2PO4为3.4g/L，MgSO4·7H2O为4.95g/L，Ca(NO3)2·4H2O为4.7g/L，Na2·EDTA为37.3mg/L，FeSO4·7H2O为27.8mg/L；
本申请的培养基：KNO3为7.07g/L，NH4H2PO3为2.30g/L，KH2PO4为3.4g/L，MgSO4·7H2O为4.95g/L，Ca(NO3)2·4H2O为4.7g/L，Na2·EDTA为37.3mg/L，FeSO4·7H2O为27.8mg/L；
参试培养基：KNO3为5.55g/L，NH4NO3为1.6g/L，KH2PO4为6.8g/L，MgSO4·7H2O为4.95g/L，Ca(NO3)2·4H2O为4.7g/L，Na2·EDTA为37.3mg/L，FeSO4·7H2O为27.8mg/L。
将上述培养基于120℃加热10min后冷却凝固，分别用于敞开空间的脱毒太子参种苗扩繁，每种配方的培养基各扩繁100瓶，每周观察太子参种苗的生长情况，连续观察1个月。经过1个月的观察比较发现，脱毒太子参种苗在本申请的培养基上的长势最好(如图2所示)，随后的移栽试验表明以本申请的培养基的脱毒太子参种苗的成活率最高(见表2)。
表2三种培养基的脱毒太子参种苗移栽成活率比较
以上所述并非是对本发明的限制，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实质范围的前提下，还可以做出若干变化、改型、添加或替换，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种太子参脱毒种苗的组培扩繁方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)获得脱毒种苗：
以太子参苗新生茎尖为外植体，消毒处理后，于低倍双筒解剖镜下获取茎尖分生组织，置于MS固体培养基上于人工气候室培养，获得太子参脱毒种苗；
(2)配制培养基：
按照以下配比量取培养基的各组分：KNO3为7.07g/L，NH4H2PO3为2.30g/L，KH2PO4为3.4g/L，MgSO4·7H2O为4.95g/L，Ca(NO3)2·4H2O为4.7g/L，Na2·EDTA为37.3mg/L，FeSO4·7H2O为27.8mg/L；以上述配方配制10倍浓度的母液，在使用前用蒸馏水稀释成1倍浓度溶液，分装至培养瓶，向培养基中添加2g/L凝固剂；将配制好的培养基放入高压灭菌锅加热，取出，静置放凉，形成固体培养基；
(3)脱毒种苗组培扩增：
将太子参脱毒种苗以叶节为单位剪成小段，转入有培养基的组培瓶中，每瓶放置6-8个茎段，盖上瓶盖后置于人工气候室培养，获得太子参扩繁种苗；
(4)脱毒种苗繁育：
待太子参扩繁种苗生长至6cm高后，打开培养瓶盖练苗2天，然后，洗净根部培养基，移栽至盛有营养基质的育苗盘上，在人工气候室驯化间培养1个月，随后，将脱毒太子参扩繁种苗移植至进行过消毒处理的土壤中繁育脱毒种参。
2.根据权利要求1所述一种太子参脱毒种苗的组培扩繁方法，其特征在于，所述步骤(1)中生苗后，通过透射电镜切片观察，鉴定出无病毒粒子的脱毒种苗。
3.根据权利要求1所述一种太子参脱毒种苗的组培扩繁方法，其特征在于，所述步骤(2)中将配制好的培养基放入高压灭菌锅中于120℃左右加热10min。
4.根据权利要求1所述一种太子参脱毒种苗的组培扩繁方法，其特征在于，所述步骤(2)中培养基用1M的KOH或HCl溶液调节pH至6.0。
5.根据权利要求1所述一种太子参脱毒种苗的组培扩繁方法，其特征在于，所述步骤(2)中培养基所用凝固剂为结冷胶。
6.根据权利要求1所述一种太子参脱毒种苗的组培扩繁方法，其特征在于，所述步骤(3)中脱毒种苗组培扩增在开敞的室内空间操作。
7.根据权利要求1所述一种太子参脱毒种苗的组培扩繁方法，其特征在于，所述步骤(3)中人工气候室的培养条件为：25℃室温，60％相对湿度，2800lx光照强度，14小时光照/8小时黑暗的光照周期。
8.根据权利要求1所述一种太子参脱毒种苗的组培扩繁方法，其特征在于，所述步骤(4)中人工气候室内的温度保持在25℃左右，相对湿度为60％，光照强度为2800lx。
9.根据权利要求1所述一种太子参脱毒种苗的组培扩繁方法，其特征在于，所述步骤(4)中脱毒太子参扩繁种苗移植地200m范围内禁止种植带毒太子参、烟草、黄瓜、油菜或蚕豆作物，避免病毒感染。
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