CN109196097A - 用于选择高m6p重组蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

描述了用于生产、捕获、和纯化重组人溶酶体蛋白的方法。此类重组人溶酶体蛋白可以具有高含量的甘露糖‑6‑磷酸残基。还描述了包括此类重组人溶酶体蛋白的药物组合物，以及此类重组人溶酶体蛋白的治疗方法和用途。

Description

用于选择高M6P重组蛋白的方法

技术领域

本发明的原理和实施例总体上涉及制造重组蛋白，特别是具有高含量的甘露糖-6-磷酸的溶酶体酶。

背景技术

溶酶体贮积失调是一组常染色体隐性遗传疾病，其特征在于细胞的糖鞘脂、糖原、或黏多糖在细胞内的区室(称为溶酶体)内的积累。患有这些疾病的个体携带编码在催化一种或多种这些物质的水解方面有缺陷的酶的突变基因，这些物质随后在溶酶体中积累。例如，庞贝氏病，又称为酸性麦芽糖酶缺乏症或糖原贮积症II型，是若干种溶酶体贮积失调之一。溶酶体失调的其他实例包括戈谢病、GM1-神经节苷脂贮积症、岩藻糖苷贮积症、粘多糖贮积症、胡尔勒-施埃尔病(Hurler-Scheie disease)、尼曼-皮克A和B病(Niemann-Pick A和B)，以及法布里氏病(Fabry disease)。庞贝氏病还被分类为神经肌肉疾病或代谢性肌病。

庞贝氏病的发病率被估计为在40,000人中约1例，并且是由GAA基因的突变引起的，该GAA基因编码酶溶酶体α-葡糖苷酶(EC:3.2.1.20)，该酶也常被称为酸性α-葡糖苷酶。酸性α-葡糖苷酶通过在溶酶体内将糖原催化水解为葡萄糖来参与糖原(一种分支多糖，是动物中葡萄糖的主要储存形式)的代谢。因为患有庞贝氏病的个体产生无活性的或具有减少的活性的突变的、缺陷的酸性α-葡糖苷酶，糖原分解发生缓慢或根本不发生，并且在不同组织的溶酶体中(特别是在横纹肌中)发生糖原积累，导致了包括进行性肌无力和呼吸功能不全的广谱临床表现。组织(如，心脏和骨骼肌)特别受影响。

庞贝氏病可以在酶的缺乏程度、严重程度和发病年龄方面差别很大，并且已经鉴定了在GAA基因中的超过500种不同的突变，它们中的许多引起不同严重程度的疾病症状。该疾病已经被分类为以下广泛类型：早发型或婴儿型，以及晚发型。早发型疾病和较低酶活性通常与更严重的临床病程相关。婴儿型庞贝氏病是最严重的，是由完全的或接近完全的酸性α-葡糖苷酶缺乏引起，并且出现包括肌肉张力严重缺乏、虚弱、肝脏和心脏增大、和心肌病的症状。舌头可能变得增大和突出，并且吞咽可能变得困难。多数染病的儿童在两岁之前死于呼吸并发症或心脏并发症。晚发型庞贝氏病可以出现在大于12个月的任何年龄，并且其特征在于缺乏心脏损害和更好的短期预后。症状与进行性骨骼肌功能障碍相关，并且涉及全身性肌无力以及在躯干、近端下肢、和隔膜中的呼吸肌的消耗。一些成年患者缺乏主要症状或运动限制。预后通常取决于呼吸肌损害的程度。大多数患有庞贝氏病的受试者最终发展为需要使用轮椅和辅助通气的身体衰弱的状态，其中由于呼吸衰竭而经常发生过早死亡。

针对庞贝氏病的最近的治疗选项包括用重组人酸性α-葡糖苷酶(rhGAA)进行的酶替代疗法(ERT)。常规的rhGAA产品在来自健赞公司(Genzyme,Inc.)的阿葡糖苷酶α(alglucosidase alfa)、或名下是已知的。ERT是贯穿患者一生所必需的慢性治疗，并且涉及通过静脉内输注来给予替代酶。该替代酶随后在循环中转运，并且进入细胞内的溶酶体中，在溶酶体中该替代酶的作用是分解积累的糖原，补偿内源性缺陷突变型酶缺乏的活性，并且从而缓解该疾病症状。在患有婴儿型庞贝氏病的受试者中，相比于历史对照，显示出用阿葡糖苷酶α的治疗显著改进存活率，并且在晚发型庞贝氏病中，与安慰剂相比，阿葡糖苷酶α已经示出对6分钟步行测试(6MWT)和用力肺活量(FVC)具有统计学显著的影响(如果适度的话)。

然而，在经历阿葡糖苷酶α的治疗时，大多数受试者保持稳定或继续恶化。用阿葡糖苷酶α进行的ERT的明显次优效应的原因尚不清楚，但是部分可以归因于潜在肌肉病理的进行性性质，或当前ERT的差的组织靶向。例如，输注的酶在中性pH(包括血浆的pH(约pH7.4))下不稳定，并且会在循环内不可逆地失活。此外，输注的阿葡糖苷酶α在关键的疾病相关肌肉中示出摄取不足，可能归因于甘露糖-6-磷酸(M6P)残基的糖基化不足。这样的残基在细胞表面结合阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体(CIMPR)，允许该酶进入细胞及其中的溶酶体中。因此，高剂量的该酶对于有效的治疗是必需的，这样使得充足量的活性酶可以到达溶酶体，使得此种治疗昂贵并且费时。

在rhGAA上存在七个潜在的N-联糖基化位点。由于每个糖基化位点在存在的N联寡糖(N-聚糖)的类型中是异质的，所以rhGAA由具有N-聚糖的蛋白的复杂混合物组成，这些N-聚糖对M6P受体和其他碳水化合物受体具有不同结合亲和力。包含具有一个M6P基团(单-M6P)的高甘露糖N-聚糖的rhGAA以低(约6,000nM)亲和力结合至CIMPR，而在相同N-聚糖上包含两个M6P基团(双-M6P)的rhGAA以高(约2nM)亲和力结合。非磷酸化的、单-M6P、和双-M6P聚糖的代表性结构如图1A所示。甘露糖-6-P基团如图1B所示。一旦在溶酶体内，rhGAA可以酶促降解积累的糖原。然而，常规rhGAA具有低总水平的带有M6P和双-M6P的聚糖，并且因此靶向肌细胞很差，导致rhGAA至溶酶体的较差递送。rhGAA的生产性药物靶向如图2A所示。这些常规产品中的大多数rhGAA分子不具有磷酸化的N-聚糖，从而缺乏对CIMPR的亲和力。非磷酸化的高甘露糖聚糖还可以被甘露糖受体清除，该甘露糖受体导致ERT的非生产性清除(图2B)。

包含半乳糖和唾液酸的其他类型的N-聚糖、复合碳水化合物，也存在于rhGAA上。由于复合N-聚糖没有被磷酸化，所以它们对CIMPR没有亲和力。然而，具有暴露的半乳糖残基的复合型N-聚糖对肝脏肝细胞上的脱唾液酸糖蛋白受体具有中度至高度亲和力，这导致rhGAA的快速非生产性清除(图2B)。

用于制备常规rhGAA(如 或阿葡糖苷酶α)的现有制造方法没有显著增加M6P或双-M6P的含量，因为细胞碳水化合物加工自然是复杂的且极难操作。因此，仍然需要进一步的改进用于治疗庞贝氏病的酶替代疗法，如针对rhGAA的新的制造、捕获、和纯化方法。

类似地，靶向溶酶体的其他重组蛋白，如其他溶酶体酶，也结合CIMPR。然而，目前用于产生靶向溶酶体的其他常规重组蛋白的制造方法不提供具有高含量的M6P或双-M6P的重组蛋白。因此，还仍然需要进一步改进针对这些其他重组蛋白的制造、捕获、和纯化方法。

发明内容

本发明的一个方面涉及一种用于生产重组人溶酶体蛋白的方法。在此方面的各种实施例中，该方法包括在生物反应器中培养分泌重组人溶酶体蛋白的宿主细胞，从该生物反应器中去除介质，将该介质过滤以提供滤液，将该滤液加载到阴离子交换色谱(AEX)柱上以捕获溶酶体蛋白，并且从该AEX柱上洗脱第一蛋白产物。

在一个或多个实施例中，该重组人溶酶体蛋白是重组人α-葡糖苷酶(rhGAA)。在一个或多个实施例中，该rhGAA包括与SEQ ID NO:2具有至少95％一致性的氨基酸序列。

在一个或多个实施例中，该方法进一步包括将第一蛋白产物加载到色谱柱上，并且从该柱上洗脱第二蛋白产物。在一些实施例中，该柱是固定的金属亲和色谱(IMAC)柱

在一个或多个实施例中，该方法进一步包括将第二蛋白产物加载到色谱柱上，并且从该色谱柱上洗脱第三蛋白产物。在一些实施例中，第三色谱柱选自阳离子交换色谱(CEX)柱，并且是尺寸排阻色谱(SEC)柱。

在一个或多个实施例中，对介质的过滤选自交替切向流过滤(ATF)和切向流过滤(TFF)。

在一个或多个实施例中，该方法进一步包括使第一蛋白产物、第二蛋白产物、和第三蛋白产物的一种或多种中的病毒失活。

在一个或多个实施例中，该方法进一步包括将第二蛋白产物或第三蛋白产物过滤，以提供经过滤的产物，并且用该经过滤的产物填充小瓶。在一个或多个实施例中，该方法进一步包括将该经过滤的产物冻干。

在一个或多个实施例中，这些宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一些实施例中，这些宿主细胞包括CHO细胞系GA-ATB-200、或ATB-200-X5-14、或其次代培养物。

在一个或多个实施例中，(i)至少90％的第一蛋白产物或第二蛋白产物或第三蛋白产物结合至阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体(CIMPR)或(ii)至少90％的第一蛋白产物或第二蛋白产物或第三蛋白产物包含带有单-甘露糖-6-磷酸(单-M6P)或双甘露糖-6-磷酸(双-M6P)的N-聚糖。

在一个或多个实施例中，该重组人溶酶体蛋白是包括七个潜在的N-糖基化位点的rhGAA，至少50％的该rhGAA的分子在第一位点处包括带有两个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元，至少30％的该rhGAA的分子在第二位点处包括带有一个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元，至少30％的该rhGAA的分子在第四位点处包括带有两个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元，并且至少20％的该rhGAA的分子在第四位点处包括带有一个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元。

本发明的另一个方面涉及通过本文所述的任何方法而制得的重组蛋白产物。

本发明的另一方面涉及包括重组蛋白产物和药学上可接受的载体的药物组合物。

本发明的又另一方面涉及用于治疗溶酶体贮积失调的方法，该方法包括将该药物组合物给予至对其有需要的患者。

在一个或多个实施例中，该溶酶体贮积失调是庞贝氏病，并且该重组蛋白是rhGAA。在一个或多个实施例中，在给予该包括rhGAA产物的药物组合物的4小时内将α-葡糖苷酶的药物分子伴侣共同给予至患者。在一些实施例中，该药物分子伴侣选自1-脱氧野尻霉素和N-丁基-脱氧野尻霉素。在一些实施例中，将该药物分子伴侣与rhGAA产物共同配制。

以下列出了不同实施例。应当理解的是，以下列出的实施例不仅如下所列结合，而且可以根据本发明的范围以其他合适的组合而结合。

附图说明

从以下书面描述和附图中，本发明的其他特征将变得明显，其中：

图1A示出非磷酸化高甘露糖聚糖、单-M6P聚糖、和双-M6P聚糖。

图1B示出M6P基团的化学结构。

图2A描述了rhGAA经由带有M6P的聚糖对靶组织(例如，患有庞贝氏病的受试者的肌肉组织)的生产性靶向。

图2B描述了对非靶组织(例如，肝脏和脾)或通过非M6P聚糖与非靶组织的结合的非生产性药物清除。

图3A图示了CIMPR受体(又称IGF2受体)和该受体的结构域。

图3B是一张表，该表示出了带有双-和单-M6P的聚糖对CIMPR的结合亲和力(纳摩尔)、高甘露糖型聚糖与甘露糖受体的结合亲和力、以及脱唾液酸化复合物聚糖对去唾液酸糖蛋白受体的结合亲和力。具有带有M6P和双-M6P的聚糖的RhGAA可以生产性地结合至肌肉上的CIMPR。

图4A和4B分别是示出和的CIMPR亲和色谱的结果的图。虚线是指M6P洗脱梯度。用M6P洗脱替代经由包含M6P的聚糖结合到CIMPR的GAA分子。如在图2A中所示，中78％的GAA活性在添加M6P前被洗脱。图2B示出73％的GAA活性在M6P添加前被洗脱。在或中只有22％或27％的rhGAA，分别用M6P洗脱。这些图示出，在这两种常规rhGAA产品中大多数rhGAA缺乏具有在靶肌肉组织中靶向CIMPR所需M6P的聚糖。

图5示出了用于用编码rhGAA的DNA转化CHO细胞的DNA构建体。用编码rhGAA的DNA构建体转化CHO细胞。

图6是用于制造、捕获、和纯化重组溶酶体蛋白的示例性方法的示意图。

图7A和7B分别是示出和ATB200 rhGAA的CIMPR亲和色谱的结果的图。从图7B可以看出，在ATB200 rhGAA中约70％的rhGAA包含M6P。

图8是示出在阴离子交换(AEX)柱上被捕获和不被捕获的ATB200 rhGAA的CIMPR亲和色谱的结果的图。

图9是示出和ATB200 rhGAA的波利韦克斯(Polywax)洗脱曲线的图。

图10是示出相比鉴定为BP-rhGAA、ATB200-1、和ATB200-2的ATB200rhGAA的三种不同的制剂，的N-聚糖结构的概述的表。

图11A-11H示出了ATB200 rhGAA的位点特异性N-糖基化分析的结果。

图12A是比较ATB200 rhGAA的CIMPR结合亲和力(左轨迹线)与的CIMPR结合亲和力(右轨迹线)的图。

图12B是比较和ATB200 rhGAA的双-M6P含量的表。

图13A是在不同GAA浓度下，比较在正常成纤维细胞内的ATB200 rhGAA活性(左轨迹线)与rhGAA活性(右轨迹线)的图。

图13B是在不同GAA浓度下，比较来自患有庞贝氏病的受试者的成纤维细胞中的ATB200 rhGAA活性(左轨迹线)与rhGAA活性(右轨迹线)的表。

图13C是比较来自正常受试者和患有庞贝氏病的受试者的成纤维细胞的K_摄取的表。

图14A是示出与运载体(阴性对照)，与20mg/ml的阿葡糖苷酶α或与5mg/kg、10mg/kg、或20mg/kg的ATB200接触后，相对于在小鼠心肌中的重组人酸性α-葡糖苷酶的剂量的糖原量的图。

图14B是示出与运载体(阴性对照)，与20mg/ml阿葡糖苷酶α或与5mg/kg、10mg/kg、或20mg/kg ATB200接触后，相对于在小鼠四头肌中的重组人酸性α-葡糖苷酶的剂量的糖原量的图。

图14C是示出与运载体(阴性对照)，与20mg/ml阿葡糖苷酶α或与5mg/kg、10mg/kg、或20mg/kg ATB200接触后，相对于在小鼠三头肌中的重组人酸性α-葡糖苷酶的剂量的糖原量的图。

图15是示出ATB200 rhGAA和分子伴侣麦格司他(miglustat)的组合在GAA基因敲除小鼠中比用不具有麦格司他分子伴侣的或TB200rhGAA的治疗提供显著更好的糖原清除的表。

图16是来自在麦格司他存在和不存在的情况下，用运载体、阿葡糖苷酶α、和ATB200治疗的野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的心脏、隔膜和比目鱼肌的一系列电子显微图，示出溶酶体相关膜蛋白(LAMP-1)水平。

图17是来自在麦格司他存在和不存在的情况下，用运载体、阿葡糖苷酶α、和ATB200治疗的野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的心脏和比目鱼肌的一系列电子显微图，示出用过碘酸-希夫(Schiff)试剂(PAS)染色的糖原水平。

图18是来自在麦格司他存在和不存在的情况下，用运载体、阿葡糖苷酶α、和ATB200治疗的野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的四头肌的一系列电子显微图(1000x)，用亚甲蓝染色来示出囊泡(用箭头指示)。

图19是来自在麦格司他存在和不存在的情况下，用运载体、阿葡糖苷酶α、和ATB200治疗的野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的四头肌的一系列电子显微图(40x)，示出自噬标记物微管相关蛋白质1A/1B-轻链3磷脂酰乙醇胺共轭物(LC3A II)和p62，胰岛素依赖性葡萄糖转运体GLUT4和胰岛素非依赖性葡萄糖转运体GLUT1的水平。

图20A和20B分别地是示出在在阴离子交换(AEX)柱上捕获和纯化之前和之后，重组α-半乳糖苷酶A(rhα-Gal A)酶的CIMPR亲和色谱的结果的图。

图21A和21B是示出在麦格司他存在的情况下，用运载体、阿葡糖苷酶α、和ATB200治疗的野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的线悬挂和握力肌数据的图。

图22A-22G是示出来自在麦格司他存在和不存在的情况下，用运载体、阿葡糖苷酶α、和ATB200治疗的野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的四头肌、三头肌和心脏细胞中的糖原水平的图。

图23是来自在麦格司他存在和不存在的情况下，用运载体、阿葡糖苷酶α、和ATB200治疗的野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的股外侧肌(VL)的肌纤维的一系列显微照片(100x和200x)，示出抗肌萎缩蛋白信号。

图24示出一个开放标记、固定顺序、递增剂量、第一次在人类中研究的、1/2期研究的研究设计，以在患有庞贝氏病的成年人中评估安全性、耐受性、PK、PD、以及ATB200的静脉内输注与口服麦格司他共同给予的效力。

图25A-25B是示出在给药5、10、或20mg/kg ATB200，20mg/kg ATB200和130mg麦格司他，或20mg/kg ATB200和260mg麦格司他后，在人类受试者血浆中的GAA总蛋白的浓度-时间曲线的图。

图25C是示出在给药20mg/kg ATB200，20mg/kg ATB200和130mg麦格司他，或20mg/kg ATB200和260mg麦格司他后，在人类受试者血浆中的GAA总蛋白的AUC的图。

图25D是示出在给药20mg/kg ATB200和260mg麦格司他后，在两名个体人类受试者血浆中的GAA总蛋白的浓度-时间曲线的图。

图26是示出在给药130mg或260mg麦格司他后，在人类受试者血浆中的麦格司他的浓度-时间曲线的图。

图27A-27D是示出在给予递增剂量的ATB200(5、10、和20mg/kg)，随后共同给予ATB200(20mg/kg)和麦格司他(130mg和260mg)后，在人类患者中的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、肌酸磷酸激酶(CPK)和己糖四糖(Hex4)水平的变化的图。

具体实施方式

在描述本发明若干示例性实施例之前，应当理解的是，本发明不限于以下描述中列出的构建或方法步骤的细节。本发明能够有其他的实施例，并且能够以不同的方式被实施或进行。

尽管具体涉及GAA，本领域的具有普通技术的人员将理解到本文所描述的这些方法可以用于生产、捕获、和纯化靶向溶酶体的其他重组蛋白，这些其他重组蛋白包括但不限于溶酶体酶α-半乳糖苷酶A。

本发明的各种方面涉及用于生产、捕获、和纯化重组人溶酶体蛋白，如重组人酸性α-葡糖苷酶(rhGAA)的新方法。本发明的其他方面涉及通过本文所述的方法而产生的重组蛋白，连同此类重组蛋白的药物组合物、治疗方法、以及用途。

定义

在本发明的上下文中以及在每个术语使用的特定上下文中,在本说明书中使用的术语通常具有其在本领域中的一般含义。某些术语在下文或说明书中的其他地方讨论，以向从业者提供描述本发明的组合物和方法以及如何制作和使用它们的另外指导。

在本说明书中，除非上下文需要，否则归因于表达语言或必要的含义，词语“包括(comprises)”，或变化形式如“包括(comprises或comprising)”是以包容性的意义使用，即用于指明所述特征的存在，但是不排除在本发明的不同实施例中存在或添加的其他特征。

如本文中所使用，术语“溶酶体蛋白”是指靶向溶酶体的任何蛋白质，如溶酶体酶。将溶酶体酶和相关疾病的实例提供在下表1中：

表1

如本文中所使用，术语“庞贝氏病”还称为酸性麦芽糖酶缺乏症、糖原贮积症II型(GSDII)、和糖原贮积病II型，旨在是指遗传性的溶酶体贮积失调，其特征在于在编码人酸性α-葡糖苷酶的GAA基因的突变。术语包括但不限于该疾病的早发型和晚发型形式，包括但不限于婴儿型、青年型和成年型庞贝氏病。

如本文中所使用，术语“酸性α-葡糖苷酶”旨在是指水解糖原、麦芽糖和异麦芽糖的D-葡萄糖单元之间的α-1,4键的溶酶体酶。替代名包括但不限于：溶酶体的α-葡糖苷酶(EC:3.2.1.20)；糖化酶；1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶；淀粉葡糖苷酶；γ-淀粉酶和外切-1,4-α-葡糖苷酶。人酸性α-葡糖苷酶是由GAA基因(美国国家生物技术信息中心(NCBI)基因ID2548)编码的，该基因已经被定位至染色体17的长臂上(位置17q25.2-q25.3)。目前已经在人类GAA基因中鉴定了超过500个突变，其中的许多突变与庞贝氏病有关。导致该酸性α-葡糖苷酶的错折叠或错加工的突变包括T1064C(Leu355Pro)和C2104T(Arg702Cys)。另外，影响酶的成熟和加工的GAA突变包括Leu405Pro和Met519Thr。在氨基酸残基516-521处的保守六肽WIDMNE对于酸性α-葡糖苷酶蛋白的活性是必需的。如本文中所使用，缩写“GAA”旨在是指酸性α-葡糖苷酶酶，而斜体缩写“GAA”旨在是指编码人酸性α-葡糖苷酶的人类基因。斜体缩写“Gaa”旨在是指编码非人酸性α-葡糖苷酶的非人类基因，包括但不限于大鼠或小鼠基因，并且缩写“Gaa”旨在是指非人酸性α-葡糖苷酶。因此，缩写“rhGAA”旨在是指重组人酸性α-葡糖苷酶。

如本文中所使用，术语“阿葡糖苷酶α”旨在是指被鉴定为[199-精氨酸,223-组氨酸]前体原-α-葡糖苷酶(人)的重组人酸性α-葡糖苷酶；化学文摘登记号420794-05-0。阿葡糖苷酶α被批准在美国由健赞公司在2016年1月作为产品和进行市场营销。

如本文中所使用，术语“ATB200”旨在是指共同未决的专利申请PCT/US2015/053252中所描述的重组人酸性α-葡糖苷酶，该专利申请的披露内容通过引用并入本文。

如本文中所使用，术语“聚糖”旨在是指共价结合至蛋白质或多肽上的氨基酸残基的多糖链。如本文中所使用，术语“N-聚糖”或“N-联聚糖”旨在是指通过共价结合至氨基酸残基的氮原子而附接至蛋白质或多肽上的氨基酸残基的多糖链。例如，N-聚糖可以共价结合至天冬酰胺残基的侧链氮原子上。聚糖可以包含一个或若干个单糖单元，并且该单糖单元可以共价连接以形成直链或支链。在至少一个实施例中，附接至ATB200的N-聚糖单元可以包括每一独立地选自N-乙酰葡糖胺、甘露糖、半乳糖或唾液酸的一个或多个单糖单元。蛋白质上的该N-聚糖单元可以通过任何适当的分析技术(例如，质谱)来确定。在一些实施例中，N-聚糖单元可以通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)，利用仪器，如赛默科技(ThermoScientific)Orbitrap Velos Pro^TM质谱仪、赛默科技Orbitrap Fusion Lumos Tribid^TM质谱仪或沃特斯(Waters)G2-XS QTof质谱仪来确定。

如本文中所使用，术语“高甘露糖N-聚糖”旨在是指具有一个至六个或更多个甘露糖单元的N-聚糖。在至少一个实施例中，高甘露糖N-聚糖单元可以包含结合至天冬酰胺残基并且进一步结合至分支的聚甘露糖链的一个双(N-乙酰葡糖胺)链。如在本文可互换地使用，术语“M6P”或“甘露糖-6-磷酸盐”旨在是指在位置6处磷酸化的甘露糖单元；即，具有与位置6处的羟基基团结合的磷酸基基团。在至少一个实施例中，一个或多个N-聚糖单元的一个或多个甘露糖单元是在位置6处磷酸化以形成甘露糖-6-磷酸单元。在至少一个实施例中，术语“M6P”或“甘露糖-6-磷酸”是指在磷酸基团上具有作为“帽”的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的甘露糖磷酸二酯，连同具有缺少GlcNAc帽的暴露的磷酸基团的甘露糖单元。在至少一个实施例中，蛋白质的N-聚糖可以具有多种M6P基团，其中至少一个M6P基团具有GlcNAc帽，并且至少另一个M6P基团缺少GlcNAc帽。

如本文中所使用，术语“复合N-聚糖”旨在是指包含一个或多个半乳糖和/或唾液酸单元的N-聚糖。在至少一个实施例中，复合N-聚糖可以是高-甘露糖N-聚糖，其中一个或多个甘露糖单元进一步结合至各自独立地选自N-乙酰葡糖胺、半乳糖和唾液酸的一个或多个单糖单元。

如本文中所使用，化合物麦格司他，也称为N-丁基-1-脱氧野尻霉素NB-DNJ或(2R,3R,4R,5S)-1-丁基-2-(羟甲基)哌啶-3,4,5-三醇，是具有以下化学式的化合物：

麦格司他的一种配制品作为针对1型戈谢病的单一疗法在商品名下进行商业销售。

如下讨论，麦格司他的药学上可接受的盐也可以用于本发明。当使用麦格司他的一种盐时，将调整该盐的剂量，这样使得患者接受的麦格司他的剂量与使用麦格司他游离碱时接受的量是相当的。

如本文中所使用，化合物脱氧野尻霉素(duvoglustat)，又称为1-脱氧野尻霉素或DNJ或(2R,3R,4R,5S)-2-(羟甲基)哌啶-3,4,5-三醇，是具有以下化学式的化合物：

当使用脱氧野尻霉素的一种盐时，调整该盐的剂量，这样使得由患者接受的脱氧野尻霉素的该剂量与使用脱氧野尻霉素游离碱时接受的量是相当的。

如本文中所使用，术语“药物分子伴侣”或有时简称为术语“分子伴侣”旨在是指特异性结合溶酶体蛋白，并且具有以下作用中的一种或多种的分子：

·增强蛋白质的稳定分子构象的形成；

·增强蛋白质从内质网到另一个细胞位置，优选天然的细胞位置的适当运输，以便于防止蛋白质的内质网-相关降解；

·防止构象不稳定或错误折叠的蛋白质的聚集；

·恢复和/或增强蛋白质的至少部分的野生型功能、稳定性，和/或活性；和/或

·改进具有该蛋白质的细胞的表型或功能。

因此，用于酸性α-葡糖苷酶的药物分子伴侣是结合酸性α-葡糖苷酶，导致酸性α-葡糖苷酶的适当的折叠、运输、非聚集，和活性的分子。如本文中所使用，该术语包括但不限于结合在酶、抑制剂或拮抗剂，和激动剂的活性位点的活性位点特异性分子伴侣(ASSC)。在至少一个实施例中，该药物分子伴侣可以是酸性α-葡糖苷酶的抑制剂或拮抗剂。如本文中所使用，术语“拮抗剂”旨在是指结合酸性α-葡糖苷酶，并且部分地抑或完全地阻断、抑制、降低、或中和酸性α-葡糖苷酶活性的任何分子。在至少一个实施例中，该药物分子伴侣是麦格司他。酸性α-葡糖苷酶的药物分子伴侣的另一个非限制性实例是脱氧野尻霉素。

如本文中所使用，术语“活性位点”旨在是指与蛋白质的特定生物活性相关的并且是蛋白质的特定生物活性必需的蛋白质区域。在至少一个实施例中，该活性位点可以是结合底物或其他结合配偶体的，并且有助于直接参与化学键的形成和断裂的氨基酸残基的位点。

如本文中所使用，该“治疗有效剂量”和“有效量”旨在是指足够导致受试者治疗反应的重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)的量、和/或分子伴侣的量、和/或其组合的量。治疗反应可以是使用者(例如，临床医生)将会识别为对治疗的有效响应的任何反应，包括本文所述和本领域已知的任何替代性临床标记物或症状。因此，在至少一个实施例中，治疗反应可以是庞贝氏病的一个或多个症状或标记物(例如本领域已知的那些)的改善或抑制。庞贝氏病的症状或标记物包括但不限于：降低的酸性α-葡糖苷酶组织活性；心肌病；心脏肥大；进行性肌无力(尤其在躯干或下肢)；深度张力减退；巨舌(并且在一些病例中，舌突出)；吞咽、吮吸，和/或摄食困难；呼吸功能不全；肝肿大(中等的)；面肌松弛；无反射；运动不耐受；劳力性呼吸困难；端坐呼吸；睡眠性呼吸暂停；上午头痛；嗜睡；脊柱前凸和/或脊柱侧弯；减少的深腱反射；下腰痛；以及不满足发展性的动作发展指标。应当注意的是，出于本发明的目的，对酸性α-葡糖苷酶具有抑制作用的分子伴侣(例如，麦格司他)的浓度可以构成“有效量”，是因为在体内给予时，分子伴侣的稀释(以及由于平衡变化导致的结合随之转变)、生物利用度和代谢。

如本文中所使用，术语“酶替代疗法”或“ERT”旨在是指将非天然的、经纯化的酶引入具有这种酶缺乏的个体中。给予的蛋白质可以从自然来源或通过重组表达而获得。该术语也指将经纯化的酶引入个体，该个体在其他情况下需要或受益于给予的经纯化的酶。在至少一个实施例中，这样的个体患有酶缺乏症。该引入的酶可以是在体外产生的经纯化的重组酶，或从离体组织或体液例如像胎盘或动物奶，或从植物纯化的蛋白质。

如本文中所使用，术语“联合治疗”旨在是指同时地或连续地给予两个或多个个体化治疗的任何疗法。在至少一个实施例中，与单独进行每种治疗时的效果相比，联合治疗的结果是增强的。增强可以包括，与通过单独进行治疗时所实现的结果相比，可以产生有利的结果的不同治疗的效果的任何改进。增强的效果或结果可以包括协同增强，其中增强的效果大于每种疗法独自进行时的加和效应；加和增强，其中该增强效果基本上等于每种治疗独自进行时的加和效应；或小于协同效应，其中该增强的效果低于每种治疗独自进行时的加和效应，但仍优于每种治疗独自进行时的效果。增强的效果可以通过本领域已知的可以测量的治疗功效或结果的任何手段来测量。

如本文中所使用，术语“药学上可接受的”旨在是指当给予人类时，生理上可耐受的，并且通常不会产生不良反应的分子实体以及组合物。优选地，如本文中所使用，术语“药学上可接受的”意指由联邦或州政府的管理机构批准的或者在美国药典或其他普遍认可的药典中列出的，用于在动物体内并且更具体地在人体内的使用。

如本文中所使用，术语“载体”旨在是指与化合物一起给予的稀释剂、助剂、赋形剂、或运载体。适合的药物载体是本领域已知的，并且在至少一个实施例中，其描述于“雷明顿药物科学”("Remington's Pharmaceutical Sciences")，E.W.马丁(E.W.Martin)著，第18版，或其他版本。

如本文中所使用，术语“受试者”或“患者”旨在是指人类或非人类动物。在至少一个实施例中，受试者是哺乳动物。在至少一个实施例中，受试者是人类。

如本文中所使用，术语“抗药物抗体”旨在是指特异性结合给予至受试者的药物并且作为向受试者给予药物的体液免疫反应的至少一部分由受试者产生的抗体。在至少一个实施例中，该药物是治疗性蛋白质药物产品。抗药物抗体在受试者中的存在可以引起范围从轻微到严重的免疫反应，包括但不限于危机生命的免疫反应，包括但不限于过敏反应、细胞因子释放综合征、以及介导关键功能的内源性蛋白质的交叉反应中和。另外或可替代地，抗药物抗体在受试者中的存在可以降低该药物的功效。

如本文中所使用，术语“中和抗体”旨在是指用于中和药物功能的抗药物抗体。在至少一个实施例中，该治疗性蛋白质药物产品是在受试者中表达减少或缺失的内源性蛋白质的对应物。在至少一个实施例中，该中和抗体可以用于中和内源性蛋白质的功能。

如本文中所使用，术语“约”和“大约”旨在是指对于给定测量的性质或精度的测量的量而言可接受程度的误差。例如，如本领域中所理解的，误差的程度可以由为测量提供的有效数字的数值来指示，并且包括但不限于对于测量所报告的最精确的有效数字中±1的变化。典型的示例性误差程度是在给定值或值范围的20％(％)内，优选在10％内，并且更优选在5％内。可替代地，并且特别是在生物系统中，术语“约”和“大约”可以意指是在给定值的一个数量级内，优选在5倍以内，并且更优选在2倍以内的值。除非另有说明，本文给出的数字量是大约的，意指当没有明确说明时，可以推断出术语“约”或“大约”。

如本领域技术人员将理解的，如本文中使用的术语“同时地”旨在意指同时或在之前或之后的相当短的时间内。例如，如果用彼此同时给予两种治疗，一种治疗可以在另一种治疗之前或之后给予，以允许为两种治疗的后者做准备所需要的时间。因此，两种治疗的“同时给予”包括但不限于一种治疗在另一种治疗之后20分钟或更短，约20分钟、约15分钟、约10分钟、约5分钟、约2分钟、约1分钟或比1分钟更短。

如本文中使用的术语“药学上可接受的盐”旨在意指在合理医学判断的范围内，适合与人类和低等动物的组织接触使用而无不当毒性、刺激、过敏反应等，与合理的效益/风险比相称的，通常是水或油可溶的或可分散的，并且对于它们的预期用途有效的盐。术语包括药学上可接受的酸加成盐以及药学上可接受的碱加成盐。适合的盐的列表发现于，例如，S.M.伯奇(S.M.Birge)等人，药物科学杂志(J.Pharm.Sci.)，1977,66，第1-19页，通过引用并入本文。

如本文中使用的术语“药学上可接受的酸加成盐”旨在意指那些保持生物有效性和游离碱特性的，并且不是生物学或其他方面不希望的盐，这些盐是与以下各项形成的：无机酸，包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、硝酸、磷酸等，以及有机酸，包括但不限于乙酸、三氟乙酸、己二酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、丁酸、樟脑酸、樟脑磺酸、肉桂酸、柠檬酸、二葡萄糖酸、乙磺酸、谷氨酸、乙醇酸、甘油磷酸、半硫酸、己酸、甲酸、富马酸、2-羟乙基磺酸(羟基乙磺酸)、乳酸、羟基马来酸、苹果酸、丙二酸、苯乙醇酸、均三甲苯磺酸、甲磺酸、萘磺酸、烟酸、2-萘磺酸、草酸、扑酸、果胶酯酸、苯乙酸、3-苯丙酸、特戊酸、丙酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、磺胺酸、酒石酸、对甲苯磺酸，十一烷酸等。

如本文中使用的术语“药学上可接受的碱加成盐”旨在意指那些保持生物有效性和游离酸特性的，并且不是生物学或其他方面不希望的盐，这些盐是与以下各项形成的：无机碱，包括但不限于氨或铵或金属阳离子，如钠、钾、锂、钙、镁、铁、锌、铜、锰，铝等的氢氧化物、碳酸盐、或碳酸氢盐。来源于药学上可接受的有机无毒碱的盐包括但不限于以下各项的盐：伯、仲和叔胺，季胺化合物，经取代胺包括天然存在的经取代胺，环胺和碱性离子交换树脂，如甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、二乙胺、三乙胺、异丙胺、三丙胺、三丁胺、乙醇胺、二乙醇胺、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、二环己基胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、海巴明、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、甲葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、四甲基铵化合物、四乙铵化合物、吡啶、N,N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、二环己胺、二苄胺、N,N-二苄基苯乙胺、1-二苯羟甲胺、N,N'-二苄基乙二胺，聚胺树脂等。

ATB200 rhGAA

在至少一个实施例中，该重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达，并且当相比于带有常规重组人溶酶体蛋白(如阿葡糖苷酶α)的一个或多个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元的含量，该重组人溶酶体蛋白包括增加的含量的带有一个或多个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元。在至少一个实施例中，该酸性α-葡糖苷酶是本文称为ATB200的重组人酸性α-葡糖苷酶，如在共同未决的国际专利申请PCT/US 2015/053252中描述。已经示出ATB200以高亲和力(K_D约2-4nM)结合阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体(CIMPR)，并且由庞贝氏成纤维细胞和骼肌成肌细胞有效内化(K_摄取约7-14nM)。ATB200在体内表征，并且示出具有比阿葡糖苷酶α(t_1/2约60min)更短的表观血浆半衰期(t_1/2约45min)。

在至少一个实施例中，该重组人酸性α-葡糖苷酶是具有如在SEQ ID NO:1或SEQID NO:2中所示的氨基酸序列的酶。

在至少一个实施例中，该重组人酸性α-葡糖苷酶具有如在SEQ ID NO:1中所示的野生型GAA氨基酸序列，如在美国专利号8,592,362中所描述的，并且具有基因库登录号AHE24104.1(GI:568760974)。在至少一个实施例中，该重组人酸性α-葡糖苷酶是葡糖苷酶α，这是由最主要的九个观察到的GAA基因的单倍型编码的人酸性α-葡糖苷酶。

在至少一个实施例中，该重组人酸性α-葡糖苷酶初始表达为具有在如SEQ ID NO:1中所示的野生型GAA的全长952氨基酸序列，并且该重组人酸性α-葡糖苷酶经历去除一部分氨基酸，例如，前56个氨基酸的细胞内加工。因此，由宿主细胞分泌的该重组人酸性α-葡糖苷酶可以具有比在细胞内初始表达的重组人酸性α-葡糖苷酶更短的氨基酸序列。在至少一个实施例中，该更短的蛋白质可以具有在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，其与SEQ IDNO:1不同仅在于已经去除了包括信号肽和前体肽的前56个氨基酸，因此产生具有896个氨基酸的蛋白质。氨基酸数目的其他变化也是可能的，如相对由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2描述的氨基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个缺失、取代和/或插入。在一些实施例中，该rhGAA产物包括具有不同氨基酸长度的重组人酸性α-葡糖苷酶分子的混合物。

在至少一个实施例中，该重组人酸性α-葡糖苷酶在蛋白质的一个或多个氨基酸残基处经历翻译后修饰和/或化学修饰。例如，甲硫氨酸和色氨酸残基可以经历氧化反应。作为另一个实例，N-末端谷氨酰胺可以形成焦谷氨酸。作为另一个实例，天冬酰胺残基可以经历脱酰胺作用以形成天冬氨酸。作为又另一个实例，天冬氨酸残基可以经历异构化作用以形成异天冬氨酸。作为又另一个实例，蛋白质中未配对的半胱氨酸残基可以与游离谷胱甘肽和/或半胱氨酸形成二硫键。因此，在一些实施例中，该酶初始表达为具有如在SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且该酶经历一个或多个这些翻译后修饰和/或化学修饰。此类修饰也在本披露的范围内。

还考虑编码GAA和此类变体人GAA的多核苷酸序列，并且可以根据本发明用于重组表达rhGAA。

优选地，不多于70％、65％、60％、55％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、或5％的总重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)分子缺少带有一个或多个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元，或缺少结合阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体(CIMPR)的能力。可替代地，30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、<100％或更多的该重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)分子包括带有一个或多个甘露糖-6-磷酸残基的至少一个N-聚糖单元，或具有结合CIMPR的能力。

该重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)分子可以具有在它们的聚糖上的1、2、3、或4个甘露糖-6-磷酸(M6P)基团。例如，在重组人溶酶体蛋白分子上的唯一一个N-聚糖可以带有M6P(单-磷酸化的)，单个N-聚糖可以带有两个M6P基团(双-磷酸化的)，或在相同重组人溶酶体蛋白分子上的两个不同的N-聚糖可以各自带有单个M6P基团。重组人溶酶体蛋白分子还可以具有不带有M6P基团的N-聚糖。在另一个实施例中，平均来说，N-聚糖包含大于3mol/mol的M6P和大于4mol/mol唾液酸，这样使得该重组人溶酶体蛋白包括平均至少3摩尔的甘露糖-6-磷酸残基/摩尔的重组人溶酶体蛋白，以及至少4摩尔的唾液酸/摩尔的重组人溶酶体蛋白。平均来说，在重组人溶酶体蛋白上的至少约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、或10％的总聚糖可以处于单-M6P聚糖的形式，例如，约6.25％的总聚糖可以携带单个M6P基团，并且平均来说，在重组人溶酶体蛋白上的至少约0.5％、1％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％的总聚糖是处于双-M6P聚糖的形式，并且平均来说，少于25％总重组人溶酶体蛋白不包含结合CIMPR的经磷酸化的聚糖。

该重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)可以具有平均含量的携带M6P的N-聚糖，该平均含量范围是从0.5至7.0mol/mol的溶酶体蛋白，或包括0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、或7.0mol/mol溶酶体蛋白的子范围的任意中间值。可以将该溶酶体蛋白分级以提供具有不同平均数量的带有M6P或带有双M6P的聚糖的溶酶体蛋白制剂，从而通过选择特定级分或通过选择性地组合不同级分来允许进一步定制靶向靶组织中溶酶体的溶酶体蛋白。

在一些实施例中，平均来说，该重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)将带有2.0至8.0摩尔的M6P/摩尔重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)。这一范围包括所有的中间值和子范围，包括2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、和8.0mol M6P/mol重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)。

在重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)上高达60％的N-聚糖可以被完全地唾液酸化，例如，高达10％、20％、30％、40％、50％、或60％的N-聚糖可以完全地唾液酸化。在一些实施例中，从4％至20％的总N-聚糖被完全地唾液酸化。在其他实施例中，在该重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)上不多于5％、10％、20％、或30％的N-聚糖携带唾液酸和末端半乳糖残基(Gal)。这一范围包括所有的中间值和子范围，例如，在该重组人溶酶体蛋白上7％至30％的总N-聚糖可以携带唾液酸和末端半乳糖。在又其他实施例中，在重组人溶酶体蛋白上不多于5％、10％、15％、16％、17％、18％、19％、或20％的N-聚糖仅具有末端半乳糖，并且不包含唾液酸。这一范围包括所有的中间值和子范围，例如，在组合物中重组人溶酶体蛋白上从8％至19％的总N-聚糖可以仅具有末端半乳糖，并且不包含唾液酸。

在本发明的其他实施例中，在该重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)上的40％、45％、50％、55％至60％的总N-聚糖是复合物型N-聚糖；或在该重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)上不多于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％的总N-聚糖是混合型N-聚糖；在该重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)上不多于5％、10％、或15％的高甘露糖型N-聚糖是非磷酸化的；在该重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)上至少5％或10％的高甘露糖型N-聚糖是单-M6P磷酸化的；和/或在重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)上至少1％或2％的高甘露糖型N-聚糖是双-M6P磷酸化的。这些值包括所有的中间值和子范围。重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)可以满足以上所述的一个或多个含量范围。

在一些实施例中，平均来说，该重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)将带有2.0至8.0摩尔的唾液酸残基/摩尔重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)。这一范围包括所有的中间值和子范围，包括2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、和8.0mol残基/mol重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)。不受理论的约束，据信带有唾液酸残基的N-聚糖单元的存在可以通过脱唾液酸蛋白受体来防止重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)的非生产性清除。

在一个或多个实施例中，在该重组人溶酶体蛋白的某些N-糖基化位点处，该重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)具有M6P和/或唾液酸单元。例如，如上所述，在rhGAA上存在七个潜在的N-联糖基化位点。这些潜在的糖基化位点在SEQ ID NO:2的以下位置处：N84、N177、N334、N414、N596、N826和N869。相似地，对于SEQ ID NO:1的全长氨基酸序列，这些潜在的糖基化位点是在以下位置处：N140、N233、N390、N470、N652、N882和N925。取决于天冬酰胺残基的位置，rhGAA的其他变体可以具有相似的糖基化位点。通常，除了X不能是HIS或PRO以外，在蛋白质氨基酸序列中的ASN-X-SER或ASN-X-THR序列指示潜在的糖基化位点。

在不同的实施例中，该rhGAA具有某一N-糖基化图。在一个或多个实施例中，在第一N-糖基化位点处至少20％的该rhGAA是经磷酸化的(例如，SEQ ID NO:2的N84以及SEQ IDNO:1的N140)。例如，在第一N-糖基化位点处，至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的该rhGAA可以被磷酸化。这种磷酸化作用可以是单-M6P和/或双-M6P单元的结果。在一些实施例中，在第一N-糖基化位点处，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的该rhGAA带有单-M6P单元。在一些实施例中，在第一N-糖基化位点处，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的该rhGAA带有双-M6P单元。

在一个或多个实施例中，在第二N-糖基化位点处(例如，SEQ ID NO:2的N177，以及SEQ ID NO:1的N223)，至少20％的该rhGAA是经磷酸化的。例如，在第二N-糖基化位点处，至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的该rhGAA可以被磷酸化。这种磷酸化作用可以是单-M6P和/或双-M6P单元的结果。在一些实施例中，在第二N-糖基化位点处，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的该rhGAA带有单-M6P单元。在一些实施例中，在第二N-糖基化位点处，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的该rhGAA带有双-M6P单元。在一个或多个实施例中，在第三N-糖基化位点处(例如，SEQ ID NO:2的N334，以及SEQ ID NO:1的N390)至少5％的该rhGAA是经磷酸化的。在其他实施例中，在第三N-糖基化位点处，少于5％、10％、15％、20％或25％的该rhGAA是磷酸化的。例如，该第三N-糖基化位点可以具有作为主要种类的非-磷酸化的高甘露糖聚糖、二-、三-、和四-触角复合物聚糖，以及混合聚糖的混合物。在一些实施例中，在第三N-糖基化位点处，至少3％、5％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的该rhGAA是经唾液酸化的。

在一个或多个实施例中，在第四N-糖基化位点处(例如，SEQ ID NO:2的N414，以及SEQ ID NO:1的N470)，至少20％的该rhGAA是经磷酸化的。例如，在第四N-糖基化位点处，至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的该rhGAA可以被磷酸化。这种磷酸化作用可以是单-M6P和/或双-M6P单元的结果。在一些实施例中，在第四N-糖基化位点处，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的该rhGAA带有单-M6P单元。在一些实施例中，在第四N-糖基化位点处，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的该rhGAA带有双-M6P单元。在一些实施例中，在第四N-糖基化位点处，至少3％、5％、8％、10％、15％、20％或25％的该rhGAA是经唾液酸化的。

在一个或多个实施例中，在第五N-糖基化位点处(例如，SEQ ID NO:2的N596，以及SEQ ID NO:1的N692)，至少5％的该rhGAA是经磷酸化的。在其他实施例中，在第五N-糖基化位点处，少于5％、10％、15％、20％或25％的该rhGAA是经磷酸化的。例如，该第五N-糖基化位点可以具有作为主要种类的岩藻糖化的二-触角复合聚糖。在一些实施例中，在第五N-糖基化位点处，至少3％、5％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的该rhGAA是经唾液酸化的。

在一个或多个实施例中，在第六N-糖基化位点处(例如，SEQ ID NO:2的N826，以及SEQ ID NO:1的N882)，至少5％的该rhGAA是经磷酸化的。在其他实施例中，在第六N-糖基化位点处，少于5％、10％、15％、20％或25％的该rhGAA是经磷酸化的。例如，该第六N-糖基化位点可以具有作为主要种类的二-、三-、和四-触角复合聚糖的混合物。在一些实施例中，在第六N-糖基化位点处，至少3％、5％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的该rhGAA是经唾液酸化的。

在一个或多个实施例中，在第七N-糖基化位点处(例如，SEQ ID NO:2的N869，以及SEQ ID NO:1的N925)，至少5％的该rhGAA是经磷酸化的。在其他实施例中，在第七N-糖基化位点处，少于5％、10％、15％、20％或25％的该rhGAA是经磷酸化的。在一些实施例中，在第七N-糖基化位点处，少于40％、45％、50％、55％、60％或65％的该rhGAA具有任何聚糖。在一些实施例中，在第七N-糖基化位点处，至少30％、35％或40％的该rhGAA具有一个聚糖。

在各种实施例中，该rhGAA具有平均0-5mol的海藻糖含量/mol的rhGAA、10-30mol的GlcNAc含量/mol的rhGAA、5-20mol的半乳糖含量/mol的rhGAA、10-40mol的甘露糖含量/mol的rhGAA、2-8mol的M6P含量/mol的rhGAA、以及2-8mol的唾液酸含量/mol的rhGAA。在各种实施例中，该rhGAA具有平均2-3mol的海藻糖含量/mol的rhGAA、20-25mol的GlcNAc含量/mol的rhGAA、8-12mol的半乳糖含量/mol的rhGAA、22-27mol的甘露糖含量/mol的rhGAA、3-5mol的M6P含量/mol的rhGAA、以及4-7mol的唾液酸含量/mol的rhGAA。

该重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)优选地由中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，如CHO细胞系GA-ATB-200或ATB-200-001-X5-14，或由这种CHO细胞培养物的次代培养物或衍生物产生。表达酸性α-葡糖苷酶的等位变体或其他变体酸性α-葡糖苷酶氨基酸序列(如与SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2具有至少90％、95％、98％或99％一致性的那些)的DNA构建体可以在CHO细胞中构建并表达。这些变体酸性α-葡糖苷酶氨基酸序列相对SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2可以包含缺失、取代，和/或插入，如相对由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2描述的氨基酸序列，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个缺失、取代和/或插入。本领域普通技术人员可以选择适合于转化CHO细胞用于产生此类DNA构建体的替代载体。

可以使用不同比对算法和/或程序来计算两个序列之间的一致性，包括可用作GCG序列分析包(威斯康辛大学，麦迪逊市，威斯康辛州)的一部分的FASTA或BLAST，并且并且可以与例如，默认设置一起使用。例如，考虑与本文所述的特定多肽具有至少90％、95％、98％或99％一致性，并且优选地表现出基本相同功能的多肽，连同编码此类多肽的多核苷酸。除非另有说明，相似性分数将基于BLOSUM62的使用。当使用BLASTP时，相似性百分比是基于BLASTP阳性得分，并且序列一致性百分比是基于BLASTP一致性得分。BLASTP“一致性”示出相同的高分序列对中总残基的数量和分数；并且BLASTP“阳性”示出具有正值的比对分数并且彼此相似的残基的数量和分数。本披露考虑和涵盖具有与本文披露的氨基酸序列具有这些程度的一致性或相似性或任何中间程度的一致性或相似性的氨基酸序列。使用遗传密码推导出的相似多肽的多核苷酸序列，并且可以通过常规手段(具体地通过使用遗传密码来逆转录其氨基酸序列)获得。

诸位发明人已经发现，可以使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞生产重组人酸性α-葡糖苷酶，该重组人酸性α-葡糖苷酶具有靶向阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体(CIMPR)和细胞溶酶体的优异能力，连同降低其体内非生产性清除的糖基化模式。可以诱导这些细胞表达比常规重组人酸性α-葡糖苷酶产物(如阿葡糖苷酶α)具有显著更高水平的带有一个或多个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元的重组人酸性α-葡糖苷酶。由这些细胞产生的该重组人酸性α-葡糖苷酶，例如，由ATB200例证的，比常规的酸性α-葡糖苷酶(例如)，具有显著更多的肌细胞靶向的甘露糖-6-磷酸盐(M6P)和双-甘露糖-6-磷酸盐N-聚糖残基。不受理论的约束，据信这种广泛的糖基化允许ATB200酶被更有效地吸收到靶细胞中，并且因此比其他重组人酸性α-葡糖苷酶(例如像，具有远远更低的M6P和双-M6P含量的阿葡糖苷酶α)更有效地从循环中清除。已经示出ATB200有效地结合CIMPR，并且被骨骼肌和心肌有效吸收，并且具有提供有利的药代动力学曲线并且减少体内非生产性清除的糖基化模式。

相比例如阿葡糖苷酶α，还考虑ATB200的大量糖基化可以有助于ATB200免疫原性的降低。如本领域普通技术人员将理解的，用保守的哺乳动物糖对蛋白质的糖基化通常增强产物溶解度，并且减少产物的聚集和免疫原性。糖基化通过最小化蛋白质聚集连同通过从免疫系统中屏蔽免疫原性蛋白质表位来间接改变蛋白质免疫原性(工业指导-治疗性蛋白质产品的免疫原性评估(Guidance for Industry-Immunogenicity Assessment forTherapeutic Protein Products)，美国卫生和人类服务部，食品与药品管理局，药物评估和研究中心，生物制剂评估和研究中心，2014年8月)。因此，在至少一个实施例中，该重组人酸性α-葡糖苷酶的给予不会引起抗药物抗体。在至少一个实施例中，相比通过给予葡糖苷酶α引起的抗药物抗体的水平，该重组人酸性α-葡糖苷酶的给予引起受试者中抗药物抗体的更低发生率。

如在共同未决的国际专利申请PCT/US 2015/053252中所述，可以使用细胞(如，CHO细胞)来产生其中所述的rhGAA，并且该rhGAA可以用于本发明。此类CHO细胞系的实例是产生如其中所述的rhGAA组合物的GA-ATB-200或ATB-200-001-X5-14，或其次代培养物。此类CHO细胞系可以包含编码GAA的多核苷酸的基因的多个拷贝，如5、10、15或20或更多个拷贝。

该高M6P和双-M6P rhGAA(如ATB200 rhGAA)可以通过用编码GAA的DNA构建体转化CHO细胞来产生。尽管CHO细胞之前被用于制备rhGAA，但是没有意识到转化的CHO细胞可以按产生具有高含量的靶向CIMPR的M6P和双-M6P聚糖的rhGAA的方式进行培养和选择。

出人意料地，发现可以转化CHO细胞系，选择产生rhGAA的转化体，该rhGAA包含高含量的带有靶向CIMPR的M6P或双-M6P的聚糖，并稳定表达该高-M6P rhGAA。因此，用于制备这些CHO细胞系的方法还描述在共同未决的国际专利申请PCT/US 2015/053252中。该方法涉及用编码GAA或GAA变体的DNA转化CHO细胞，选择将编码GAA的DNA稳定整合到其染色体中并稳定表达GAA的CHO细胞，并且选择表达具有高含量的带有M6P或双-M6P的聚糖的GAA的CHO细胞，以及任选地选择一种CHO细胞，该CHO细胞具有含高唾液酸含量的N-聚糖，和/或具有含低非磷酸化的高甘露糖含量的N-聚糖。

通过培养该CHO细胞系，并且从CHO细胞培养物中回收所述的组合物，这些CHO细胞系可以用于产生rhGAA和rhGAA组合物。

重组人溶酶体蛋白的生产、捕获、和纯化

本发明的各种实施例涉及用于产生和/或捕获和/或纯化重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)的方法。将用于生产、捕获、和纯化重组人溶酶体蛋白的示例性方法600在图6中示出。

在图6中，箭头表明针对包含该重组人溶酶体蛋白的各种液相的运动方向。生物反应器601包含培养细胞，如CHO细胞，这些细胞表达重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)，并将其分泌至周围的液体培养基中。生物反应器601可以是用于培养细胞的任何合适的生物反应器，如灌注式、分批式、或补料分批式生物反应器。在各种实施例中，该生物反应器具有约1L和约20,000L之间的体积。示例性生物反应器的体积包括约1L、约10L、约20L、约30L、约40L、约50L、约60L、约70L、约80L、约90L、约100L、约150L、约200L、约250L、约300L、约350L、约400L、约500L、约600L、约700L、约800L、约900L、约1,000L、约1,500L、约2,000L、约2,500L、约3,000、约3,500L、约4,000L、约5,000L、约6,000L、约7,000L、约8,000L、约9,000L、约10,000L、约15,000L、和约20,000L。

如图6所示，该介质可以从该生物反应器中去除。此类介质的去除对于灌注式生物反应器可以是连续的，或对于分批式或补料分批式反应器可以是分批的。将该介质通过过滤系统603过滤以去除细胞。在一些实施例中，将从介质中去除的这些细胞再引入至该生物反应器中，并且可以将包括分泌重组人溶酶体蛋白的介质做进一步处理。过滤系统603可以是任何合适的过滤系统，包括交替切向流过滤(ATF)系统、切向流过滤(TFF)系统、离心过滤系统等。在各种实施例中，该过滤系统利用具有孔径大小在约10纳米和约2微米之间的过滤器。示例性过滤器孔径大小包括约10nm、约20nm、约30nm、约40nm、约50nm、约60nm、约70nm、约80nm、约90nm、约100nm、约150nm、约200nm、约250nm、约300nm、约350nm、约400nm、约500nm、约600nm、约700nm、约800nm、约900nm、约1μm、约1.5μm、和约2μm。

在各种实施例中，该介质去除速率在约1L/天和约20,000L/天之间。示例性介质去除速率包括约1L/天、约10L/天、约20L/天、约30L/天、约40L/天、约50L/天、约60L/天、约70L/天、约80L/天、约90L/天、约100L/天、约150L/天、约200L/天、约250L/天、约300L/天、约350L/天、约400L/天、约500L/天、约600L/天、约700L/天、约800L/天、约900L/天、约1,000L/天、约1,500L/天、约2,000L/天、约2,500L/天、约3,000L/天、约3,500L/天、约4,000L/天、约5,000L/天、约6,000L/天、约7,000L/天、约8,000L/天、约9,000L/天、约10,000L/天、约15,000L/天、和约20,000L/天。可替代地，该介质去除速率可以表示为该生物反应器体积的函数，如约0.1至约3个反应器体积/天。示例性介质去除速率包括约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约2、约2.5、和约3个反应器体积/天。

对于连续的或补料分批过程，其中将新鲜介质提供给该生物反应器的速率可以是在约1L/天和约20,000L/天之间。示例性介质引入速率包括约1L/天、约10L/天、约20L/天、约30L/天、约40L/天、约50L/天、约60L/天、约70L/天、约80L/天、约90L/天、约100L/天、约150L/天、约200L/天、约250L/天、约300L/天、约350L/天、约400L/天、约500L/天、约600L/天、约700L/天、约800L/天、约900L/天、约1,000L/天、约1,500L/天、约2,000L/天、约2,500L/天、约3,000L/天、约3,500L/天、约4,000L/天、约5,000L/天、约6,000L/天、约7,000L/天、约8,000L/天、约9,000L/天、约10,000L/天、约15,000L/天、和约20,000L/天。可替代地，该介质引入速率可以表示为该生物反应器体积的函数，如约0.1至约3个反应器体积/天。示例性介质引入速率包括约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约2、约2.5、和约3个反应器体积/天。

过滤后，将该滤液加载到蛋白质捕获系统605上。该蛋白质捕获系统605可以包括一个或多个色谱柱。如果使用多于一个色谱柱，那么这些色谱柱可以串联放置，这样使得下一个色谱柱可以在第一个色谱柱加载后立即开始加载。可替代地，该介质去除过程可以在这些色谱柱转换的期间被中止。

在各种实施例中，该蛋白质捕获系统605包括用于直接产品捕获重组人溶酶体蛋白(特别是具有高M6P含量的溶酶体蛋白)的一个或多个阴离子交换(AEX)柱。虽然不希望受任何具体理论的束缚，据信使用AEX色谱捕获来自经过滤的介质中的该重组人溶酶体蛋白可确保该捕获的重组蛋白产物具有更高的M6P含量，这归因于具有一个或多个M6P基团的重组蛋白的更多的负电荷。其结果是，非磷酸化的重组蛋白和宿主细胞杂质不结合树脂柱连同高度磷酸化的重组蛋白，并且将该非磷酸化的重组蛋白和宿主细胞杂质穿过该柱。因此，该AEX色谱可以用于丰富该蛋白产物(即，选择具有更多M6P的蛋白质)的M6P含量，这归因于包含M6P的蛋白质对于AEX树脂的高亲和力。

此外，虽然不希望受任何具体理论的束缚，还据信通过使用AEX色谱的重组蛋白的直接产物捕获可确保将具有高M6P含量的重组蛋白从包含蛋白酶和其他酶的介质中去除，这些蛋白酶和其他酶可以降解该蛋白质和/或将该蛋白质脱磷酸。其结果是，该高质量的产物被保存。

合适的AEX色谱柱具有结合带负电荷的蛋白质的功能性化学基团。示例性官能团包括，但不限于：伯、仲、叔、和季铵、或胺基团。这些官能团可能结合至膜(例如纤维素膜)或常规的色谱树脂。示例性柱介质包括来自通用医疗生命科学公司(GE HealthcareLifesciences)的SP、CM、Q、和DEAE 快速流动介质。

AEX色谱柱的体积可以是任何合适的体积，如在1L和1,000L之间。示例性柱体积包括约1L、约2L、约3L、约4L、约5L、约6L、约7L、约8L、约9L、约10L、约20L、约30L、约40L、约50L、约60L、约70L、约80L、约90L、约100L、约150L、约200L、约250L、约300L、约350L、约400L、和约500L、约600L、约700L、约800L、约900L、和约1,000L。

将阴离子交换柱的示例性条件提供在以下表2中：

表2

将该重组人溶酶体蛋白加载到蛋白质捕获系统605上后，通过改变该柱中的pH和/或盐含量，将该重组人溶酶体蛋白从该一个或多个柱上进行洗脱。

可以将经洗脱的重组人溶酶体蛋白经受进一步的纯化步骤和/或质量保证步骤。例如，如图6所示，可以将经洗脱的重组人溶酶体蛋白经受病毒杀灭步骤607。此种病毒杀灭607可以包括低pH杀灭、洗涤剂杀灭、或本领域已知的其他技术中的一个或多个。

可以将来自病毒杀灭步骤607的重组蛋白产物引入第二个色谱系统609中以进一步纯化该重组蛋白产物。可替代地，可以将来自蛋白质捕获系统605的经洗脱的重组蛋白直接补料至第二色谱系统609。在各种实施例中，该第二色谱系统609包括用于进一步去除杂质的一个或多个固定的金属亲和色谱(IMAC)柱。示例性金属离子包括钴、镍、铜、铁、锌、或镓。

该第二色谱柱(例如，IMAC柱)的体积可以是任何合适的体积，如在0.1L和100L之间。示例性柱体积包括约0.1L、约0.2L、约0.3L、约0.4L、约0.5L、约0.6L、约0.7L、约0.8L、约0.9L、约1L、约1.5L、约2L、约2.5L、约3L、约3.5L、约4L、约4.5L、约5L、约6L、约7L、约8L、约9L、约10L、约15L、约20L、约25L、约30L、约35L、约40L、和约50L、约60L、约70L、约80L、约90L、和约100L。

将IMAC柱的示例性条件提供在以下表3中：

表3

将该重组蛋白加载到第二色谱系统609上后，将该重组蛋白从柱上进行洗脱。如图6所示，该经洗脱的重组蛋白可以经受病毒杀灭步骤611。如同病毒杀灭607一样，病毒杀灭611可以包括低pH杀灭、洗涤剂杀灭、或本领域已知的其他技术中的一个或多个。在一些实施例中，仅使用病毒杀灭607或611中的一个，或在纯化过程的相同阶段进行病毒杀灭。

如图6所示，可以将来自病毒杀灭步骤611的重组蛋白产物引入第三色谱系统613中以进一步纯化该重组蛋白产物。可替代地，可以将来自第二色谱系统609的经洗脱的重组蛋白直接补料至第三色谱系统613中。在各种实施例中，第三色谱系统613包括用于进一步去除杂质的一个或多个阳离子交换色谱(CEX)柱和/或尺寸排阻色谱(SEC)柱。然后将该重组蛋白产物从第三色谱系统613中洗脱。

该第三色谱柱(例如，CEX或SEC柱)的体积可以是任何合适的体积，如在0.1L和200L之间。示例性柱体积包括约0.1L、约0.2L、约0.3L、约0.4L、约0.5L、约0.6L、约0.7L、约0.8L、约0.9L、约1L、约1.5L、约2L、约2.5L、约3L、约3.5L、约4L、约4.5L、约5L、约6L、约7L、约8L、约9L、约10L、约15L、约20L、约25L、约30L、约35L、约40L、和约50L、约60L、约70L、约80L、约90L、约100L、约150L、和约200L。

将CEX柱的示例性条件提供在以下表4中：

表4

还可以将该重组蛋白产物进行进一步的处理。例如，可以使用另一个过滤系统615去除病毒。在一些实施例中，此种过滤可以利用具有孔径在5和50μm之间的过滤器。其他产物处理可以包括产物调节步骤617，其中该重组蛋白产物可以被灭菌、过滤、浓缩、储存和/或具有用于终产物配制品而添加的另外的组分。例如，可以将该重组蛋白产物浓缩2-10倍，如从约2至约20mg/ml的最初的蛋白质浓度到约4至约200mg/ml最终的蛋白质浓度。可以将该终产物用于填充小瓶，并且可以冻干用于将来使用。

重组蛋白的给予

可以根据常规程序将该重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)，或其药学上可接受的盐配制为适合向人类给予的药物组合物。例如，在优选的实施例中，用于静脉内给予的组合物是在无菌等渗水缓冲液中的溶液。必要时，该组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂以缓解注射部位的疼痛。通常，成分以单位剂量形式分开或混合在一起提供，例如，作为在气密容器中的干燥冻干粉或无水浓缩物，气密容器如指明活性剂的量的安瓿或小药囊。在通过输注给予组合物时，可以用包含无菌药用级的水、盐水或右旋糖/水的输液瓶进行分配。在通过注射给予组合物时，可以提供无菌注射用水或盐水的安瓿，这样使得可以在给予前将这些成分混合。

通过适当的途径给予重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)(或包含重组人溶酶体蛋白的组合物或药物)。在一个实施例中，经静脉内给予该重组人溶酶体蛋白。在其他实施例中，通过直接给予靶组织(如至心脏或骨骼肌(例如，肌内))或神经系统(例如，直接注射到脑中；脑室内；鞘内)来给予重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)。如果需要，可以同时使用多于一个途径。

将该重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)(或包含重组人溶酶体蛋白的组合物或药物)以治疗有效量给予(例如，当以规律间隔给予时，足以治疗疾病的剂量，例如通过减轻与与疾病相关的症状，预防或延迟疾病的发作，和/或减轻疾病的症状的严重性或频率实现的)。在治疗疾病中治疗有效的量将取决于疾病影响的性质和程度，并且可以通过标准临床技术来确定。另外，可以任选地采用体外或体内测定来帮助鉴定最佳剂量范围。待采用的确切剂量还取决于给予途径和疾病的严重程度，并且应根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。可以从源自体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线外推有效剂量。在至少一个实施例中，将该重组人酸性α-葡糖苷酶以约1mg/kg至约100mg/kg，如约5mg/kg至约30mg/kg，典型地约5mg/kg至约20mg/kg的剂量通过静脉内输注给予。在至少一个实施例中，将该重组人酸性α-葡糖苷酶以约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约50mg/kg、约50mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、约80mg/kg、约90mg/kg、或约100mg/kg的剂量通过静脉内输注给予。在至少一个实施例中，将该重组人酸性α-葡糖苷酶以约20mg/kg的剂量通过静脉内输注给予。对具体个体的有效剂量可以是随着时间变化的(例如，增加的或减少的)，这取决于该个体的需要。例如，在生理疾病或躯体应激的时候，或如果抗-酸性α-葡糖苷酶抗体存在或增加，或如果疾病症状恶化，该量可以增加。

以规律的间隔给予的重组人酸性α-葡糖苷酶(或包含重组人酸性α-葡糖苷酶的组合物或药物)的治疗有效量取决于疾病影响的性质和程度，以及持续进行的基础。如本文中所使用，以“规律的间隔”给予表示，将该治疗有效量定期地给予(如区别于一次性剂量)。该间隔可以通过标准临床技术来确定。在优选的实施例中，将重组人酸性α-葡糖苷酶以每月、每两个月；每周；每周两次；或每日给予。单个个体的给予间隔不需要是固定的间隔，但是可以是随时间变化的，其取决于该个体的需要。例如，在生理疾病或躯体应激的时候，如果抗-重组人酸性α-葡糖苷酶抗体存在或增加，或如果疾病症状恶化，可以减小剂量之间的间隔。在一些实施例中，将5、10、20、50、100，或200mg酶/kg体重的治疗有效量以每周两次、每周一次或每隔一周，伴有或不伴有分子伴侣来给予。

该重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)可以制备用于以后使用，如在单位剂量小瓶或注射器中，或在用于静脉内给予的瓶或袋中。包含重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)，连同任选的赋形剂或其他活性成分，如分子伴侣或或其他药物的试剂盒，可以封装在包装材料中，并且附有用于复水、稀释或给药的说明书，用于治疗对其有需要的受试者，如患有庞贝氏病的患者。

rhGAA和药物分子伴侣的联合治疗

在各种实施例中，可以将通过本文所述的过程而产生的该rhGAA(例如，ATB200)与药物分子伴侣(如麦格司他或脱氧野尻霉素)用于联合治疗。

在至少一个实施例中，将该药物分子伴侣(例如麦格司他)口服给予。在至少一个实施例中，将麦格司他以约200mg至约400mg的口服剂量，或以约200mg、约250mg、约300mg、约350mg、或约400mg的口服剂量给予。在至少一个实施例中，将麦格司他以约233mg至约400mg的口服剂量给予。在至少一个实施例中，将麦格司他以约250mg至约270mg的口服剂量，或以约250mg、约255mg、约260mg、约265mg、或约270mg的口服剂量给予。在至少一个实施例中，将麦格司他以约260mg的口服剂量给予。

本领域的普通技术人员将理解，在约200mg至400mg的范围或其中任何更小范围中的麦格司他的口服剂量可以适用于平均体重为约70kg的成年患者。对于体重显著低于约70kg的患者，包括但不限于婴儿、儿童或体重不足的成人，医生可以认为更小的剂量是适合的。因此，在至少一个实施例中，将麦格司他按从约50mg至约200mg的口服剂量给予，或按以下口服剂量给予：约50mg、约75mg、约100mg、125mg、约150mg、约175mg或约200mg。在至少一个实施例中，将麦格司他按从约65mg至约195mg口服剂量给予，或按以下口服剂量给予：约65mg、约130mg或约195mg。

在至少一个实施例中，将该麦格司他以合适口服给予的药学上可接受的剂型给予，并且包括但不限于片剂、胶囊剂、珠粒剂(ovule)、酏剂、溶液或混悬剂、凝胶剂、糖浆剂、漱口剂，或在使用前用水或其他合适的运载体重构的干粉，可任选地具有用于速释、延迟释放、改性释放、持续释放、脉冲释放或控释应用的调味剂和着色剂。还可以使用固体组合物，如片剂、胶囊、锭剂、软锭剂、丸剂、大丸剂、粉剂、糊剂、颗粒剂、子弹剂、糖衣丸或预混制剂。在至少一个实施例中，将麦格司他作为片剂给予。在至少一个实施例中，将麦格司他作为胶囊给予。在至少一个实施例中，该剂型包含从约50mg至约300mg的麦格司他。在至少一个实施例中，该剂型包含约65mg的麦格司他。在至少一个实施例中，该剂型包含约130mg的麦格司他。在至少一个实施例中，该剂型包含约260mg的麦格司他。预期当该剂型包含约65mg的麦格司他时，麦格司他可以按四种剂型给予，或麦格司他总剂量为260mg。然而，对于具有体重显著低于平均成年人体重(70kg)的患者，包括但不限于婴儿、儿童或体重不足的成人，将麦格司他可以按以下剂型的剂量给予：一个剂型(总剂量65mg的麦格司他)、两个剂型(总剂量130mg的麦格司他)，或三个剂型(总剂量195mg的麦格司他)。

可以根据本领域已知的方法来制备用于口服使用的固体和液体组合物。这样的组合物还可以包含一种或多种药学上可接受的，可以是固体或液体形式的载体和赋形剂。片剂或胶囊可以通过常规手段与药学上可接受的赋形剂(包括但不限于粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂或润湿剂)一起来制备。适合的药学上可接受的赋形剂是本领域已知的，并且包括但不限于：预胶化淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基乙基纤维素(HPEC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶、阿拉伯树胶、乳糖、微晶纤维素、磷酸氢钙、硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯、滑石、硅石、玉米、马铃薯或木薯淀粉、淀粉乙醇酸钠、十二烷基硫酸钠、柠檬酸钠、碳酸钙、二碱式磷酸钙、甘氨酸交联羧甲基纤维素钠，以及复合硅酸盐。可以将片剂通过本领域熟知的方法进行包被。在至少一个实施例中，将麦格司他以作为(Actelion Pharmaceuticals公司)可商购的配制品来给予。

在至少一个实施例中，将麦格司他和该重组人酸性α-葡糖苷酶同时给予。在至少一个实施例中，将麦格司他和该重组人酸性α-葡糖苷酶顺序给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前少于三小时给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前约两小时给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前少于两小时给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前约1.5小时给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前约一小时给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前约50分钟至约70分钟给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前约55分钟至约65分钟给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前约30分钟给予在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前约25分钟至约35分钟给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前约27分钟至约33分钟给予。

在至少一个实施例中，将麦格司他的给予与该重组人酸性α-葡糖苷酶的给予同时进行。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前或之后20分钟内给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前或之后15分钟内给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前或之后10分钟内给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前或之后5分钟内给予。

在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之后给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之后长达2小时给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之后约30分钟给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之后约一小时给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之后约1.5小时给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之后约2小时给予。

本发明的另一方面提供了在对其有需要的患者中用于联合治疗庞贝氏病的一种试剂盒。该试剂盒包括以下各项：包括麦格司他的药学上可接受的剂型，包括如本文定义的重组人酸性α-葡糖苷酶的药学上可接受的剂型，以及用于将包括麦格司他的该药学上可接受的剂型和包括重组酸性α-葡糖苷酶的该药学上可接受的剂型给予至对其有需要的患者的说明书。在至少一个实施例中，包括麦格司他的药学上可接受的剂型是如本文所描述的口服剂型，包括但不限于片剂或胶囊。在至少一个实施例中，包括重组人酸性α-葡糖苷酶的药学上可接受的剂型是如本文所述的适合注射的无菌溶液。在至少一个实施例中，用于给予这些剂型的说明包括如本文所述的，在通过静脉内输注包括重组人酸性α-葡糖苷酶的药学上可接受的剂型之前口服给予包括麦格司他的药学上可接受的剂型的说明。

不受理论束缚，据信麦格司他充当该重组人酸性α-葡糖苷酶ATB200的药物分子伴侣，并且结合其活性位点。例如，已发现麦格司他降低了未折叠的ATB200蛋白的百分比，并且稳定了ATB200的活性构象，防止在血浆的中性pH下变性和不可逆失活，并且允许其在循环条件中存活足够长以到达组织，并且被组织吸收。然而，麦格司他与ATB200活性位点的结合，通过防止天然底物，糖原接近该活性位点也可以导致ATB200酶活性的抑制。据信当在本文所描述的条件下将麦格司他和该重组人酸性α-葡糖苷酶给予患者时，在血浆和组织中的麦格司他和ATB200的浓度是这样使得使ATB200稳定，直到它可以被吸收到组织中并且靶向溶酶体，但是由于麦格司他的快速清除，在溶酶体中通过ATB200的糖原水解没有由于麦格司他的存在而过度抑制，并且该酶保留治疗有用的足够活性。

可以组合上述所有实施例。这包括在涉及以下的具体实施例中：

·药物分子伴侣，例如，麦格司他的性质；以及其特异性针对的活性位点；

·药物分子伴侣(例如，麦格司他)的剂量、给予途径和包括载体性质的药物组合物的类型以及市售组合物的用途；

·该药物(例如，治疗性蛋白质药物产品)的性质，该药物可以是在受试者中表达减少或不存在的内源性蛋白质的对应物，适合地是重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)，例如在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达并且当相比于带有阿葡糖苷酶α的一个或多个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元的含量时包括增加的含量的带有一个或多个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元的重组人酸性α-葡糖苷酶；并且适当地具有如在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中所示出的氨基酸序列；

·在重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)上的N-聚糖单元(如，附接至该重组人溶酶体蛋白的N-乙酰葡糖胺、半乳糖、唾液酸、或由这些组合而形成的复合N-聚糖)的数目和类型；

·在重组人溶酶体蛋白(例如，rhGAA)上甘露糖单元形成甘露糖-6-磷酸和/或双甘露糖-6-磷酸的磷酸化作用的程度；

·该替代酶(例如，重组人酸性α-葡糖苷酶)的剂量和给予途径(例如，静脉内给予，尤其是静脉内输注，或直接给予该靶组织)以及包括载体的配制品的类型和治疗有效量；

·该药物分子伴侣(麦格司他)和该重组人酸性α-葡糖苷酶的剂量间隔；

·治疗反应的性质和联合治疗的结果(例如，如与单独进行的每种治疗的效果相比，增强的结果)；

·联合治疗的给予时间，例如，将麦格司他和该重组人酸性α-葡糖苷酶同时给予或顺序给予，例如其中将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶之前或在该重组人酸性α-葡糖苷酶之后或在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前或之后某一时间内给予；以及

·所治疗的患者的性质(例如，哺乳动物，例如人)以及个体所患有的病症(例如，酶不足)。

可以将以上列表中的任何实施例与列表中的一个或多个其他实施例进行组合。

实例

本发明的其他特征将从以下非限制性实例中变得明显，这些实例通过举例说明本发明的原理。

实例1：现有 和 rhGAA产品的局限性

为了评估rhGAA在和(目前仅有的针对庞贝氏病的批准的治疗)中的能力，将这些rhGAA制剂注射到CIMPR柱(其结合具有M6P基团的rhGAA)上，并且随后用游离M6梯度进行洗脱。将级分在96孔板中收集，并且通过4MU-α-葡萄糖底物测定GAA活性。结合和未结合的rhGAA的相对量是基于GAA活性来确定的，并且报告为总酶的分数。

图4A-B描述了与常规的ERT(和)相关的问题：在中73％的rhGAA(图4B)和在中78％的rhGAA(图4A)未结合至CIMPR，参见在每个图中最左侧的峰。只有在中27％的rhGAA和在中的22％的rhGAA包含M6P，该M6P可以有效地将它靶向至肌细胞上的CIMPR。

和的有效剂量对应于包含M6P的rhGAA的量，该M6P靶向肌细胞上的CIMPR。然而，在这样的两种常规的产品中大部分的rhGAA不靶向目标肌细胞上的CIMPR受体。给予常规rhGAA(其中大部分的rhGAA不靶向肌肉细胞)增加了对非靶向rhGAA的过敏反应或诱导免疫的风险。

实例2：产生具有高含量的带有单-M6P或双-M6P的N-聚糖的ATB-200 rhGAA的CHO细胞 的制备

用表达rhGAA的DNA转染CHO细胞，随后选择产生rhGAA的转化体。用于用编码rhGAA的DNA转化CHO细胞的DNA构建体在图5中示出。用表达rhGAA的DNA转染CHO细胞，随后选择产生rhGAA的转化体。

转染后，用缺乏次黄嘌呤/胸苷(-HT)的介质来选择包含稳定整合的GAA基因的DG44CHO(DHFR-)细胞。通过

甲氨蝶呤处理(MTX，500nM)来诱导在这些细胞中的GAA表达的扩增。通过GAA酶活性测定来鉴定大量表达的GAA的细胞池，并且用于建立产生rhGAA的单个克隆。在半固体培养基板上产生单个克隆，通过ClonePix系统挑选，并且转移至24深孔板。针对GAA酶活性测定单个克隆，以鉴定表达高水平GAA的克隆。用于确定GAA活性的条件培养基使用了4-MU-α-葡糖苷酶底物。针对生存力、生长能力、GAA生产率、N-聚糖结构和稳定的蛋白表达来进一步评估如通过GAA酶测定所测量的产生更高水平的GAA的克隆。使用这一程序分离表达具有增强的单-M6P或双-M6P N-聚糖的rhGAA的CHO细胞系，包括CHO细胞系GA-ATB-200。

实例3：ATB200 rhGAA的捕获和纯化

在摇瓶中产生根据本发明所述的多批次的rhGAA，并且在灌注生物反应器中使用CHO细胞系GA-ATB-200和CIMPR来测量结合。针对来自不同生产批次的经纯化的ATB200rhGAA，观察到与在图7B和图8中所示那些相似的CIMPR受体结合(约70％)，表明可以一致地产生ATB200 rhGAA。。如图4A、4B、7A、和7B所示，和rhGAA比ATB200rhGAA表现出显著更少的CIMPR结合。

实例4：ATB200与 的分析比较

根据末端磷酸根，使用弱阴离子交换(“WAX”)液相色谱，进行ATB200 rhGAA的分级。通过用增加量的盐洗脱ERT来产生洗脱曲线。通过UV(A280nm)监测该曲线。从CHO细胞获得ATB200 rhGAA，并且进行纯化。获得自商业来源。在其洗脱曲线的左侧显示出一个高峰。ATB200 rhGAA显示洗脱在右侧的四个显著的峰(图9)。这证实ATB200 rhGAA被磷酸化到比更大的程度，因为这种评估是通过末端电荷而不是CIMPR亲和力进行的。

实例5：ATB200 rhGAA的寡糖特性

通过MALDI-TOF来评估经纯化的ATB200 rhGAA和聚糖，以确定在每个ERT上发现的单个聚糖结构(图10)。发现ATB200样品比包含更少量的非-磷酸化的高-甘露糖型N-聚糖。ATB200中比中更高含量的M6P聚糖更有效地将ATB200 rhGAA靶向肌细胞。由MALDI确定的高百分比的单-磷酸化和双-磷酸化的结构与CIMPR曲线一致，其说明ATB200与CIMPR受体的显著更大的结合。经由MALDI-TOF质谱的N-聚糖分析证实了平均每个ATB200分子包含至少一个中性的双-M6P N-聚糖结构。ATB-200rhGAA上的这种更高的双-M6P N-聚糖含量与M6P受体板结合测定中与CIMPR的高亲和力结合直接相关(KD约2-4nM)(图12A)。

还使用两种不同的LC-MS/MS分析技术，针对位点特异性N-聚糖曲线分析了ATB200rhGAA。在第一次分析中，在LC-MS/MS分析之前，将该蛋白质变性、还原、烷基化并且消化。蛋白质变性和还原期间，将200μg的蛋白质样品、5μL 1mol/L tris-HCl(终浓度50mM)、75μL8mol/L胍HCl(终浓度6M)、1μL 0.5mol/L EDTA(终浓度5mM)、2μL 1mol/L DTT(终浓度20mM)以及Milli-水添加至1.5mL试管中，以提供100μL的总体积。在干浴中，将该样品混合，并且在56℃下孵育30分钟。烷基化作用期间，将该变性的和还原的蛋白质样品与5μL 1mol/L碘乙酰胺(IAM，终浓度50mM)混合，然后在黑暗中在10℃-30℃下孵育30分钟。烷基化作用之后，将400μL预冷的丙酮添加至该样品中，并且将该混合物在-80℃制冷中冷冻4小时。然后将该样品以13000rpm在4℃下离心5min，并且去除该上清液。将400μL预冷的丙酮添加至球粒中，然后将其以13000rpm在4℃下离心5min，并且去除该上清液。然后将该样品在黑暗中，在冰上风干以去除丙酮残余物。将40μL的8M尿素和160μL的100mM NH₄HCO₃添加至该样品中以溶解蛋白质。然后，在胰蛋白酶消化期间，添加50μg的该蛋白质使胰蛋白酶消化缓冲液达100μL终体积，并且添加5μL 0.5mg/mL胰蛋白酶(20/1w/w的蛋白与酶的比率)。将该溶液混合均匀，并且在37℃下孵育过夜(16±2小时)。添加2.5μL 20％TFA(终浓度0.5％)以淬灭该反应。然后使用赛默科技Orbitrap Velos Pro^TM质谱仪分析该样品。

在第二LC-MS/MS分析中，根据相似的变性、还原、烷基化和消化程序来制备ATB200样品(除了使用碘乙酸(IAA)代替IAM作为烷基化试剂之外)，并且然后使用赛默科技Orbitrap Fusion Lumos Tribid^TM质谱仪进行分析。

将第一和第二分析的结果在图11A-11H中示出。在图11A-11H中，第一次分析的结果由左条(深灰色)表示，并且来自第二次分析的结果由右条(浅灰色)表示。在图11B-11G中，代表聚糖的符号命名法是根据瓦尔基A(Varki,A.)，卡明斯，R.D.(Cummings,R.D.),艾斯克J.D.(Esko J.D.)等人,糖生物学要领(Essentials of Glycobiology)，第2版(2009)。

从图8A-8I可以看出，这两个分析提供了相似的结果，尽管结果之间存在一些变化。该变化可以归因于多个因素，包括使用的仪器和N-聚糖分析的完整性。例如，如果一些种类的磷酸化的聚糖未被鉴定和/或未被定量，则磷酸化聚糖的总数可能是未被充分表示的，并且在该位点带有磷酸化的聚糖的rhGAA的百分比可能是未被充分表示的。作为另一个实例，如果一些种类的非-磷酸化的聚糖未被鉴定和/或未被定量，则非-磷酸化的聚糖的总数可能是未被充分表示的，并且在该位点带有磷酸化的聚糖的rhGAA的百分比可能是过度表示的。图11A示出了ATB200的N-糖基化位点占有率。从图11A可以看出，第一、第二、第三、第四、第五和第六N-糖基化位点大部分被占据，其中这两种分析检测出超过90％且高达约100％的具有在每个潜在位点处检测到的聚糖的ATB200酶。然而，该第七潜在的N-糖基化位点在大约一半的时间时被糖基化。

图11B示出了第一位点N84的N-糖基化图。从图11B可以看出，主要的聚糖种类是双-M6P聚糖。第一和第二分析二者检测出超过75％的该ATB200在第一位点处具有双-M6P聚糖。

图11C示出了第二位点N177的N-糖基化图。从图11C可以看出，主要的聚糖种类是单-M6P聚糖和非磷酸化高甘露糖聚糖。第一和第二分析二者检测出超过40％的该ATB200在第二位点处具有单-M6P聚糖。

图11D示出了第三位点N334的N-糖基化图。从图11D可以看出，主要的聚糖种类是非磷酸化的高甘露糖聚糖，二-、三-、和四-触角复合聚糖，以及混合聚糖。第一和第二分析二者检测出超过20％的该ATB200在第三位点处具有唾液酸残基。

图11E示出了第四位点N414的N-糖基化图。从图11E可以看出，主要的聚糖种类是双-M6P和单-MGP聚糖。第一和第二分析二者检测出超过40％的该ATB200在在第四位点处具有双-M6P聚糖。第一和第二分析二者检测出超过25％的该ATB200在第四位点具有单-M6P聚糖。

图11F示出了第五位点N596的N-糖基化图。从图11F可以看出，主要的聚糖种类是海藻糖化的二-触角复合聚糖。第一和第二分析二者检测出超过70％的该ATB200在第五位点处具有唾液酸残基。

图11G示出了第六位点N826的N-糖基化图。从图11G可以看出，主要的聚糖种类是二-、三-、和四-触角复合聚糖。第一和第二分析二者检测出超过80％的该ATB200在第六位点处具有唾液酸残基。

在第七位点处，N869的糖基化分析示出了大约40％的糖基化，最常见的聚糖是A4S3S3GF(12％)、A5S3G2F(10％)、A4S2G2F(8％)、和A6S3G3F(8％)。

图11H示出了在七个潜在的N-糖基化位点中的每个位点处的磷酸化作用的汇总。从图11H可以看出，第一和第二分析二者检测出在第一、第二、和第四位点处的高磷酸化作用水平。两个分析检测出超过80％的该ATB200在第一位点处是单-或二-磷酸化的，超过40％的该ATB200在第二位点处是单-磷酸化的，并且超过80％的该ATB200在第四位点出是单-或二-磷酸化的。

根据亲水相互作用液相色谱-荧光检验-质谱(HILIC-FLD-MS)法进行ATB200的另一个聚糖分析。

将HILIC-FLD-MS分析的结果提供于下表5中。在表5中，在三位数中的第一个数字表明聚糖中的分支数目，第二个数字表明核心海藻糖单元的数目，并且第三个数字表明末端唾液酸单元的数目。使用该命名法，“303”代表三-触角聚糖(该第一个3)，其具有0个核心海藻糖(该第二个0)和3个末端唾液酸(该最后一个3)；“212”代表1个二-触角聚糖，其具有1个核心海藻糖和2个末端唾液酸；“404”代表四-触角聚糖，其具有0个核心海藻糖和4个末端唾液酸，以此类推。

表5

基于该HILIC-FLD-MS分析，预期所测试的ATB200具有平均2-3mol的海藻糖含量/mol ATB200、20-25mol的GlcNAc含量/mol ATB200、8-12mol的半乳糖含量/mol ATB200、22-27mol的甘露糖含量/mol ATB200、3-5mol的M6P含量/mol ATB200、以及4-7mol的唾液酸含量/mol ATB200。

实例6：ATB200的CIMPR亲和力的特性

除了具有可以结合至CIMPR的更大百分比的rhGAA之外，重要的是理解该相互作用的质量。使用CIMPR板结合测定来确定和ATB200 rhGAA受体结合。简言之，使用CIMPR-包被的板来捕获GAA。将不同浓度的rhGAA应用于固定的受体，并且洗去未结合的rhGAA。通过GAA活性来确定剩余rhGAA的量。如图12A所示，ATB200 rhGAA比结合CIMPR显著更好。

图12B示出了根据本发明的常规rhGAA、和ATB200中的双-M6P聚糖的相对含量。对于平均只有10％的分子具有双-磷酸化的聚糖。将其与ATB-200(其中平均每个rhGAA分子具有至少一个双-磷酸化的聚糖)对比。

实例7：ATB200 rhGAA比Lumizyme更有效地被成纤维细胞内化。

使用正常的和庞贝氏成纤维细胞细胞系来比较ATB200和rhGAA的相对细胞摄取。比较涉及5-100nM的根据本发明的ATB200 rhGAA与10-500nM常规rhGAA16-hr孵育之后，用TRIS碱将外部rhGAA灭活，并且在收获细胞之前用PBS将细胞洗涤3次。通过4MU-α-葡萄糖苷水解测量内化的GAA，并且相对于总细胞的蛋白质作图，并且结果出现在图13A-B中。

还示出ATB200 rhGAA有效内化到细胞中(图13A和13B)，分别地示出ATB200 rhGAA内化到正常的成纤维细胞和庞贝氏成纤维细胞中，并且其比常规的rhGAA更大的程度进行内化。ATB200 rhGAA以约20nM使细胞受体饱和，然而需要约250nM的从这些结果外推的摄取效率常数(K_摄取)对于ATB200为2-3nm，并且对于是56nM，如图13C所示。这些结果表明ATB200 rhGAA是针对庞贝氏病的良好靶向的治疗。

实例8：在Gaa-基因敲除小鼠中的糖原减少

图14A至14C示出了给予阿葡糖苷酶α和ATB200对Gaa基因敲除小鼠中糖原清除的影响。给予动物两次IV推注给予(每隔一周)；在最后一次剂量后两周收获组织，并且针对酸性α-葡糖苷酶活性和糖原含量进行分析。

从图14A至14C看出，发现ATB200以剂量依赖性方式在酸性α-葡糖苷酶(Gaa)基因敲除小鼠中耗尽组织糖原。在Gaa基因敲除小鼠中，20mg/kg剂量的ATB200一致地去除了比5和10mg/kg剂量水平更大比例的储存的糖原。然而，如在图14A至14C看出，相比以20mg/kg给予以5mg/kg给予ATB200示出小鼠心脏和骨骼肌(四头肌和三头肌)中相似的糖原减少，然而相比以10mg/kg和20mg/kg给药ATB200示出在骨骼肌中显著更好的糖原水平减少。

图15示出给予阿葡糖苷酶α和ATB200对Gaa基因敲除小鼠中糖原清除的影响，以及ATB200和麦格司他的共同给予对糖原清除的影响。将12周龄GAA KO小鼠用或ATB200治疗，20mg/kg每隔一周IV注射4次；在如所示的rhGAA之前30分钟，以10mg/kg PO共同给予麦格司他。在最后一次酶剂量后14天收集组织用于糖原测量。图15示出在四头肌和三头肌骨骼肌中的糖原相对减少量，相比ATB200提供了更多的糖原减少，并且ATB200/麦格司他提供了甚至更多的糖原减少。

实例9：Gaa-基因敲除小鼠中的肌肉生理学和形态学

每隔一周以20mg/kg向Gaa基因敲除小鼠给予两次重组人酸性α-葡糖苷酶(阿葡糖苷酶α或ATB200)的IV推注。将麦格司他以10mg/kg的剂量口服给予在给予ATB200之前30min用ATB200处理的动物亚群。单独用运载体治疗对照小鼠。重组人酸性α-葡糖苷酶的最后一次给药后两周，收获比目鱼肌、四头肌和隔膜组织。分析皮肤和隔膜组织，针对糖原水平是通过用高碘酸-希夫试剂(PAS)染色，并且针对溶酶体增殖是通过测量溶酶体相关膜蛋白(LAMP1)标记物的水平，该标记物在在庞贝氏病中上调。将包埋入环氧树脂(Epon)的四头肌的半薄切片用亚甲基蓝染色，并且通过电子显微镜(1000x)观察以确定囊泡存在的程度。用免疫组织化学来分析四头肌肌肉样品，以确定自噬标记物微管相关蛋白1A/1B-轻链3磷脂酰乙醇胺共轭物(LC3A II)和p62，胰岛素依赖性葡萄糖转运蛋白GLUT4和胰岛素非依赖性葡萄糖转运蛋白GLUT1。

在类似的研究中，每隔一周以20mg/kg向Gaa基因敲除小鼠给予四次重组人酸性α-葡糖苷酶(阿葡糖苷酶α或ATB200)的IV推注。将麦格司他以10mg/kg的剂量口服给予在给予ATB200之前30min用ATB200处理的动物亚群。单独用运载体治疗对照小鼠。在重组人酸性α-葡糖苷酶最后一次给药后两周收获心肌组织，并且进行分析，针对糖原水平是通过用高碘酸-希夫试剂(PAS)染色，并且针对溶酶体增殖是通过测量LAMP1的水平。

如图16所示，与用阿葡糖苷酶α的常规治疗相比，ATB200的给予示出在心脏、隔膜和骨骼肌(比目鱼肌)组织中的溶酶体增殖减少，并且麦格司他与ATB200的共同给予示出溶酶体增殖的显著进一步减少，接近在野生型(WT)小鼠中所见的水平。此外，如图17所示，与用阿葡糖苷酶α的常规治疗相比，ATB200的给予示出在心脏和骨骼肌(比目鱼肌)组织中的糖原水平的点状降低，并且麦格司他与ATB200的共同给予示出显著进一步降低，再次接近在野生型(WT)小鼠中所见的水平。

同样地，如图18所示，与未处理的小鼠和用阿葡糖苷酶α处理的小鼠相比，麦格司他与ATB200的共同给予显著减少了Gaa基因敲除小鼠的四头肌肌纤维中的囊泡数目。如图19所示，与野生型小鼠相比，在Gaa基因敲除小鼠中LC3II和p62的水平均增加，但是在用ATB200和麦格司他处理时显著降低，表明与酸性α-葡糖苷酶缺陷相关的自噬增加在ATB200和麦格司他的共同给予时减少。另外，相比于野生型小鼠，在Gaa基因敲除小鼠中，胰岛素依赖性葡萄糖转运体GLUT4和胰岛素非依赖性葡萄糖转运体GLUT1的水平增加，但是同样，在用ATB200和麦格司他处理时显著减少。与酸性α-葡糖苷酶缺乏相关的升高的GLUT4和GLUT1水平可以有助于增加的葡萄糖摄取到肌纤维中和增加的基础的和食物摄取后的糖原合成。因此，在庞贝氏病的小鼠模型中已经发现用ATB200和麦格司他的联合治疗改进骨骼肌形态和生理。

实例10：在Gaa-基因敲除小鼠中的肌肉功能

在12次每两周给予的长期研究中，如通过握力测试和线悬挂测试(图21A-21B)所测量的，20mg/kg ATB200加上10mg/kg麦格司他从基线逐渐地增加了Gaa KO小鼠的功能性肌肉力量。在大部分的研究中，在相同的条件下，观察到接受相同ERT剂量(20mg/kg)的阿葡糖苷酶α治疗的小鼠下降(图21A-21B)。至于短期研究，在3个月(图22A-22C)和6个月(图22D-22G)的治疗后，ATB200/麦格司他比阿葡糖苷酶α具有实质更好的糖原清除率。相比阿葡糖苷酶α，在3个月治疗后，ATB200/麦格司他还减少了自噬和LAMP1和戴斯富林蛋白(dysferlin)的细胞内积累(图23)。在图21A中，^*表示相比单独有统计学意义(p<0.05，两侧t检验)。在图22A-22G中，*表示相比于单独有统计学意义(p<0.05，在单向方差分析下使用邓尼特(Dunnett)方法的多重比较)。。

总之，这些数据表明ATB200/麦格司他有效地靶向肌肉来逆转细胞功能障碍并且改进肌肉功能。重要的是，在肌肉构造中的明显改进以及减少的自噬和LAMP1和戴斯富林蛋白的细胞内积累可以是与功能性肌肉力量改进相关的改进的肌肉生理学的良好替代。这些结果表明，监测自噬和这些关键的肌肉蛋白可以是评估Gaa KO小鼠中庞贝氏病的有效性治疗性治疗的合理、实用的方法，其可以证明是来自临床研究中肌肉活检的有用的生物标记物。

图23示出在有或没有麦格司他的情况下，6个月的ATB200给予降低了Gaa Ko小鼠中抗肌萎缩蛋白的细胞内积累。与用相比，ATB200±麦格司他的抗肌萎缩蛋白积累减少更多。

实例11：rhα-Gal A的捕获

使用AEX色谱(图20A)在产物捕获前，并且使用AEX色谱在产物捕获后(图20B)，测量消耗的细胞培养基中重组人α-半乳糖苷酶A(rhα-Gal A)的CIMPR结合谱。在两种图中的虚线是指M6P洗脱梯度。在AEX产物捕获之前，80％的rhα-Gal A能够结合CIMPR。AEX产物捕获后，该总rhα-Gal A结合增加至96％。

实例12：在患有庞贝氏病的经历过ERT的以及初次接受ERT的患者中，与麦格司他共同 给予的重组酸性α-葡糖苷酶ATB200的药物代谢动力学和安全性数据

设计本研究主要评估与麦格司他共同给予的ATB200的安全性、耐受性、和药物代谢动力学(PK)。来自Gaa基因敲除小鼠的PK/药效(PD)翻译模型预测出，在人体中ATB20020mg/kg与高剂量(例如，260mg)的麦格司他的组合会提供最佳的糖原减少。

在以下描述中，“高剂量”的麦格司他是指约260mg的剂量且“低剂量”的麦格司他是指约130mg的剂量。

目的是评估该1/2期研究中来自10名患者的初步总GAA蛋白、ATB200和麦格司他PK数据，以及安全性标记物。

这是一个开放标记、固定顺序、递增剂量、第一次在人类中研究的、1/2期研究，以在患有庞贝氏病的成年人中评估ATB200的静脉内输注与口服麦格司他共同给予的安全性、耐受性、PK、PD、以及效力(图24)。评价来自在访问9中前8个群组1的患者和前2个群组3患者的平均总GAA蛋白质和麦格司他PK结果。

^a在群组2和3中给药之前，将来自群组1的2名哨兵患者的安全性数据在每个剂量水平下进行评估。

^b在阶段2和3期间，在ATB200静脉内输注开始之前，口服给予麦格司他。对于所有的剂量，将ATB200静脉内输注持续4小时。

^c在群组2和3中，前2名患者充当他们各自群组的哨兵患者。

主要入选标准：

·被诊断患有庞贝氏病的18-65岁的男性和女性是基于记录的GAA酶活性的缺乏或通过GAA基因分型

·在试验开始(群组1)之前，接受用阿葡糖苷酶α进行的ERT持续2-6年(或对于群组2≥2年)

·目前以每隔一周的频率接受阿葡糖苷酶α，并且完成最后2次输注，同时没有导致剂量中断的药物相关的不良事件(群组1和2)

·在6分钟步行测试中，必须能够行走介于200和500米之间(群组1和3)

·直立的用力肺活量必须是预测的正常值的30％-80％(群组1和3)

·必须是坐轮椅的并且不能无辅助地行走(群组2)

PK分析：

·收集血浆总GAA蛋白质和活性浓度的血液样品

·阶段1：在ATB200输注开始之前和输注开始后1、2、3、3.5、4、4.5、5、6、8、10、12和24小时

·阶段2和3：麦格司他口服给予后1、2、3、4、4.5、5、6、7、9、11、13、和25小时

·在麦格司他口服给予(时间0)之前立即并且在麦格司他口服给予后1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、9、11、和25小时，针对血浆麦格司他浓度对血液样品进行取样。通过经验证的LC-MS/MS测定来确定血浆麦格司他

·通过一个或多个rhGAA-特异性“签名”肽的经验证的LC-MS/MS定量来确定血浆中针对ATB200 5mg/kg、10mg/kg、和20mg/kg的总GAA蛋白质浓度。

在完成了阶段1和2的群组1的8名患者中以及开始阶段3的群组3的2名患者中完成了初步分析。

·初始ERT转换的患者是庞贝氏病群体的代表，接受ERT平均5.02年(表6)

表6：基线特征

^an＝在间歇期数据分析中来自群组1的10名(非卧床的ERT转换)；n＝来自群组3的2名(初次)。

总GAA蛋白

当单独给予时，ATB200以略微高于剂量比例的方式增加(表7和图25A-25D)。变异似乎随着麦格司他剂量而增加(图25C)。相对于20mg/kg的单独的ATB200，20mg/kg的ATB200与高剂量的麦格司他(260mg)的共同给予增加了总GAA蛋白质暴露(AUC)大约25％。分布半衰期(α-期)增加了45％，表明高剂量的麦格司他稳定血浆中的ATB200。从达到最大血浆浓度至剂量后大约12小时的时间，分布半衰期的增加伴随着AUC的增加。在末端消除期期间，AUC和半衰期的增加可以在对数标度上观察到(图25B)。ATB200表明了相对高的分配容积。血浆总GAA蛋白质的分布在初次接受ERT(群组3)以及经历过ERT的患者(群组1)之间看起来相似(图25A和25D)。

表7：总GAA蛋白

麦格司他PK

麦格司他表明剂量比例的动力学(表8和图26)。血浆麦格司他在单个剂量和多个剂量之间看起来相似。

表8：麦格司他PK汇总

药效学

在来自群组1的经历过ERT的患者中的第11次随访(图27A和27B)：

·在8名患者中5名丙氨酸氨基转移酶(ALT)减少；4/4患者具有提高的标准化基线水平

·在8名患者中6名天冬氨酸转氨酶(AST)减少；3/4患者具有提高的标准化基线水平

·在8名患者中6名肌酸磷酸激酶(CPK)减少；2/6患者具有提高的标准化基线水平

·在8名患者中8名尿糖四糖(HEX4)水平减少

在第4周，在初次接受治疗的群组(群组3)的2名患者中所有4种生物标记物水平下降(图27C和27D)。

在图27A-27D中，数据被表示为平均值±标准误。

安全性

·在所有患者中155+总输注后，没有报告严重的不良事件(AE)或输注相关的反应

·在11/13(84％)患者中报告的治疗突发性AE通常是轻度和短暂的。

·在7/13(53％)患者中报告的治疗相关的AE：恶心(n＝1)、疲劳(n＝1)、头痛(n＝1)、震颤(n＝2)、痤疮(n＝1)、心动过速(n＝1)、和低血压(n＝1)。

结论

·单独的和与麦格司他组合的ATB200是安全的，并且耐受良好，迄今没有输注相关的反应。

·在暴露方面，单独ATB200示出暴露高于剂量比例的增加，该暴露进一步用麦格司他增强，表明分子伴侣对ATB200的稳定效果。

·从标准护理转换至ATB200/麦格司他后，患者通常示出在肌肉损伤的生物标记物方面的改进，同时许多的患者在第18周证明正常化。

·用ATB200/麦格司他治疗的初始的2名初次接受试验治疗的患者表明肌损伤的所有生物标记物的稳定下降。

本文所描述的该实施例旨在说明本组合物和方法，而并不旨在限制本发明的范围。旨在包括与作为整体的描述一致的并且对于本领域技术人员来说容易理解的不同修改和改变。所附权利要求书不应受实例中所示出的具体实施例的限制，但是应当被给予与作为整体的描述一致的最宽泛的解释。

贯穿本申请，引用了专利、专利申请、出版物、产品描述、基因库登录号、和实验方案，出于所有目的，将其披露内容以其整体通过引用结合在此。

Claims (21)

1.一种用于生产重组人溶酶体蛋白的方法，该方法包括：

在一种生物反应器中培养宿主细胞，这些宿主细胞分泌重组人溶酶体蛋白；

从该生物反应器去除介质；

将该介质过滤以提供滤液；

将该滤液加载到阴离子交换色谱(AEX)柱上，以捕获该溶酶体蛋白；并且

从该AEX柱上洗脱第一蛋白产物。

2.如权利要求1所述的方法，其中该重组人溶酶体蛋白是重组人α-葡糖苷酶(rhGAA)。

3.如权利要求2所述的方法，其中该rhGAA包括与SEQ ID NO:2具有至少95％一致性的氨基酸序列。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，该方法进一步包括：

将该第一蛋白产物加载到固定的金属亲和色谱(IMAC)柱上；并且

从该IMAC柱上洗脱第二蛋白产物。

5.如权利要求4所述的方法，该方法进一步包括：

将该第二蛋白产物加载到第三色谱柱上；并且

从该第三色谱柱上洗脱第三蛋白产物。

6.如权利要求5所述的方法，其中该第三色谱柱选自阳离子交换色谱(CEX)柱和尺寸排阻色谱(SEC)柱。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中对该介质的过滤选自交替切向流过滤(ATF)和切向流过滤(TFF)。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，该方法进一步包括使该第一蛋白产物、该第二蛋白产物、和该第三蛋白产物的一种或多种中的病毒失活。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，该方法进一步包括将该第二蛋白产物或该第三蛋白产物过滤，以提供一种经过滤的产物，并且用该经过滤的产物填充小瓶。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，该方法进一步包括将该经过滤的产物冻干。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中这些宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中这些宿主细胞包括CHO细胞系GA-ATB-200、或ATB-200-001-X5-14、或其次代培养物。

13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中：

(i)至少90％的该第一蛋白产物、或该第二蛋白产物、或该第三蛋白产物结合至阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体(CIMPR)或

(ii)至少90％的该第一蛋白产物、或该第二蛋白产物、或该第三蛋白产物包含携带单-甘露糖-6-磷酸(单-M6P)或双甘露糖-6-磷酸(双-M6P)的N-聚糖。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中该rhGAA包括七个潜在的N-糖基化位点，至少50％的该rhGAA的分子在第一位点处包括带有两个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元，至少30％的该rhGAA的分子在第二位点处包括带有一个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元，至少30％的该rhGAA的分子在第四位点处包括带有两个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元，并且至少20％的该rhGAA的分子在第四位点处包括带有一个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元。

15.一种通过如权利要求1-14中任一项所述的方法而制得的重组蛋白产物。

16.一种药物组合物，包括如权利要求15所述的重组蛋白产物和一种药学上可接受的载体。

17.如权利要求16所述的药物组合物用于治疗溶酶体贮积失调的用途。

18.如权利要求17所述的用途，其中该溶酶体贮积失调是庞贝氏病，并且该重组蛋白是rhGAA。

19.如权利要求18所述的用途，其中在给予该包括rhGAA产物的药物组合物的4小时内，将α-葡糖苷酶的药物分子伴侣共同给予至患者。

20.如权利要求19所述的用途，其中该药物分子伴侣选自1-脱氧野尻霉素和N-丁基-脱氧野尻霉素。

21.如权利要求19或20所述的用途，其中将该药物分子伴侣与该rhGAA产物共同配制。