TW202241923A - 用於選擇高m6p重組蛋白之方法 - Google Patents

Abstract

描述了用於生產、捕獲、和純化重組人溶酶體蛋白之方法。此類重組人溶酶體蛋白可以具有高含量的甘露糖-6-磷酸殘基。亦描述了包括此類重組人溶酶體蛋白之藥物組成物，以及此類重組人溶酶體蛋白的治療方法及用途。

Description

用於選擇高M6P重組蛋白之方法

本發明的的原理和實施例大體而言係關於製造重組蛋白，特定言之係具有高含量的甘露糖-6-磷酸的溶酶體酶。

溶酶體貯積失調係一組常染色體隱性遺傳疾病，其特徵在於細胞的糖鞘脂、肝醣、或黏多糖在細胞內的區室（稱為溶酶體）內的積累。患有該等疾病的個體攜帶編碼在催化一種或多種該等物質的水解方面有缺陷的酶的突變基因，該等物質隨後在溶酶體中積累。例如，龐貝氏病，又稱為酸性麥芽糖酶缺乏症或肝醣貯積症II型，係若干種溶酶體貯積失調之一。溶酶體失調的其他實例包括高歇氏病、GM1-神經節苷脂貯積症、岩藻糖苷貯積病、黏多糖貯積症、胡爾勒-施埃爾病（Hurler-Scheie disease）、尼曼-匹克A和B病（Niemann-Pick A和B），以及法布裡氏病（Fabry disease）。龐貝氏病亦被分類為神經肌肉疾病或代謝性肌病。

龐貝氏病的發病率被估計為在40,000人中約1例，並且係由GAA基因的突變引起的，該GAA基因編碼酶溶酶體α-葡萄糖苷酶（EC:3.2.1.20），該酶亦常被稱為酸性α-葡萄糖苷酶。酸性α-葡萄糖苷酶藉由在溶酶體內將肝醣催化水解為葡萄糖來參與肝醣（一種分支多糖，係動物中葡萄糖的主要儲存形式）的代謝。因為患有龐貝氏病的個體產生無活性的或具有減少的活性的突變的、缺陷的酸性α-葡萄糖苷酶，肝醣分解發生緩慢或根本不發生，並且在不同組織的溶酶體中（特別是在橫紋肌中）發生肝醣積累，導致了包括進行性肌無力和呼吸功能不全的廣譜臨床表現。組織（如，心臟和骨骼肌）特別受影響。

龐貝氏病可以在酶的缺乏程度、嚴重程度和發病年齡方面差別很大，並且已經鑒定了在GAA基因中的超過500種不同的突變，它們中的許多引起不同嚴重程度的疾病症狀。該疾病已經被分類為以下廣泛類型：早發型或嬰兒型，以及晚發型。早發型疾病和較低酶活性通常與更嚴重的臨床病程相關。嬰兒型龐貝氏病係最嚴重的，係由完全的或接近完全的酸性α-葡萄糖苷酶缺乏引起，並且出現包括肌肉張力嚴重缺乏、虛弱、肝臟和心臟增大、和心肌病的症狀。舌頭可能變得增大和突出，並且吞咽可能變得困難。多數染病的兒童在兩歲之前死於呼吸併發症或心臟併發症。晚發型龐貝氏病可以出現在大於12個月的任何年齡，並且其特徵在於缺乏心臟損害和更好的短期預後。症狀與進行性骨骼肌功能障礙相關，並且涉及全身性肌無力以及在軀幹、近端下肢、和隔膜中的呼吸肌的消耗。一些成年患者缺乏主要症狀或運動限制。預後通常取決於呼吸肌損害的程度。大多數患有龐貝氏病的受試者最終發展為需要使用輪椅和輔助通氣的身體衰弱的狀態，其中由於呼吸衰竭而經常發生過早死亡。

針對龐貝氏病的最近的治療選項包括用重組人酸性α-葡萄糖苷酶（rhGAA）進行的酶替代療法（ERT）。常規的rhGAA產品係已知以阿葡萄糖苷酶α（alglucosidase alfa）、Myozyme®或Lumizyme®的名稱購自健贊公司（Genzyme,Inc.）。ERT係貫穿患者一生所必需的慢性治療，並且涉及藉由靜脈內輸注來給予替代酶。該替代酶隨後在循環中轉運，並且進入細胞內的溶酶體中，在溶酶體中該替代酶的作用係分解積累的肝醣，補償內源性缺陷突變型酶缺乏的活性，並且從而緩解該疾病症狀。在患有嬰兒型龐貝氏病的受試者中，相比於歷史對照，使用阿葡萄糖苷酶α的治療已經顯示出顯著改善存活率，並且在晚發型龐貝氏病中，與安慰劑相比，阿葡萄糖苷酶α已經顯示出對6分鐘步行測試（6MWT）和用力肺活量（FVC）具有統計學顯著的影響（若適度）。

然而，在經歷使用阿葡萄糖苷酶α的治療時，大多數受試者保持穩定或繼續惡化。用阿葡萄糖苷酶α進行的ERT的明顯次優效應的原因尚不清楚，但是可以部分歸因於潛在肌肉病理的進行性性質，或當前ERT的差的組織靶向。例如，輸注的酶在中性pH（包括血漿的pH（約pH 7.4））下不穩定，並且會在循環內不可逆地失活。此外，輸注的阿葡萄糖苷酶α在關鍵的疾病相關肌肉中顯示出攝取不足，可能歸因於甘露糖-6-磷酸（M6P）殘基的糖基化不足。此類殘基在細胞表面結合非陽離子依賴性甘露糖-6-磷酸受體（CIMPR），從而允許該酶進入細胞及其中的溶酶體中。因此，高劑量的該酶對於有效的治療係必需的，如此使得充足量的活性酶可以到達溶酶體，使得此種治療昂貴並且費時。

在rhGAA上存在七個潛在的N-聯糖基化位點。由於每個糖基化位點在存在的N聯寡糖（N-聚糖）的類型中是異質的，所以rhGAA由具有N-聚糖的蛋白的複雜混合物組成，該等N-聚糖對M6P受體和其他碳水化合物受體具有不同結合親和力。包含具有一個M6P基團（單-M6P）的高甘露糖N-聚糖的rhGAA以低（約6,000 nM）親和力結合至CIMPR，而在相同N-聚糖上包含兩個M6P基團（雙-M6P）的rhGAA以高（約2 nM）親和力結合。非磷酸化的、單-M6P、和雙-M6P聚糖的代表性結構如圖1A所示。甘露糖-6-P基團如圖1B所示。一旦在溶酶體內，rhGAA可以酶促降解積累的肝醣。然而，常規rhGAA具有低總水平的帶有M6P和雙-M6P的聚糖，並且因此靶向肌細胞很差，導致rhGAA至溶酶體的較差遞送。rhGAA的生產性藥物靶向如圖2A所示。該等常規產品中的大多數rhGAA分子不具有磷酸化的N-聚糖，從而缺乏對CIMPR的親和力。非磷酸化的高甘露糖聚糖亦可以被甘露糖受體清除，該甘露糖受體導致ERT的非生產性清除（圖2B）。

包含半乳糖和唾液酸的其他類型的N-聚糖、複合碳水化合物，亦存在於rhGAA上。由於複合N-聚糖沒有被磷酸化，所以它們對CIMPR沒有親和力。然而，具有暴露的半乳糖殘基的複合型N-聚糖對肝臟肝細胞上的脫唾液酸糖蛋白受體具有中度至高度親和力，此導致rhGAA的快速非生產性清除（圖2B）。

用於製備常規rhGAA（如Myozyme®、Lumizyme®或阿葡萄糖苷酶α）的現有製造方法沒有顯著增加M6P或雙-M6P的含量，因為細胞碳水化合物加工係自然複雜的且極難操作。因此，仍然需要進一步的改善用於治療龐貝氏病的酶替代療法，如針對rhGAA的新的製造、捕獲、和純化方法。

類似地，靶向溶酶體的其他重組蛋白，如其他溶酶體酶，亦結合CIMPR。然而，目前用於產生靶向溶酶體的其他常規重組蛋白的製造方法不提供具有高含量的M6P或雙-M6P的重組蛋白。因此，亦仍然需要進一步改善針對該等其他重組蛋白的製造、捕獲、和純化方法。

本發明的一個態樣涉及一種用於生產重組人溶酶體蛋白之方法。在此態樣的各種實施例中，該方法包括在生物反應器中培養分泌重組人溶酶體蛋白的宿主細胞，從該生物反應器中去除介質，將該介質過濾以提供濾液，將該濾液載入到陰離子交換層析（AEX）柱上以捕獲溶酶體蛋白，並且從該AEX柱上洗提第一蛋白產物。

在一個或多個實施例中，該重組人溶酶體蛋白係重組人α-葡萄糖苷酶（rhGAA）。在一個或多個實施例中，該rhGAA包括與SEQ ID NO: 2具有至少95%一致性的胺基酸序列。

在一個或多個實施例中，該方法進一步包括將第一蛋白產物載入到層析柱上，並且從該柱上洗提第二蛋白產物。在一些實施例中，該柱係固定的金屬親和層析（IMAC）柱

在一個或多個實施例中，該方法進一步包括將第二蛋白產物載入到層析柱上，並且從該層析柱上洗提第三蛋白產物。在一些實施例中，第三層析柱選自陽離子交換層析（CEX）柱，並且係尺寸排阻層析（SEC）柱。

在一個或多個實施例中，對介質的過濾選自交替切向流過濾（ATF）和切向流過濾（TFF）。

在一個或多個實施例中，該方法進一步包括使第一蛋白產物、第二蛋白產物、和第三蛋白產物的一種或多種中的病毒失活。

在一個或多個實施例中，該方法進一步包括將第二蛋白產物或第三蛋白產物過濾，以提供經過濾的產物，並且用該經過濾的產物填充小瓶。在一個或多個實施例中，該方法進一步包括將該經過濾的產物凍乾。

在一個或多個實施例中，該等宿主細胞包括中國倉鼠卵巢（CHO）細胞。在一些實施例中，該等宿主細胞包括CHO細胞系GA-ATB-200、或ATB-200-X5-14、或其次代培養物。

在一個或多個實施例中，(i)至少90%的第一蛋白產物或第二蛋白產物或第三蛋白產物結合至非陽離子依賴性甘露糖-6-磷酸受體（CIMPR）或(ii)至少90%的第一蛋白產物或第二蛋白產物或第三蛋白產物包含帶有單-甘露糖-6-磷酸（單-M6P）或雙甘露糖-6-磷酸（雙-M6P）的N-聚糖。

在一個或多個實施例中，該重組人溶酶體蛋白係包括七個潛在的N-糖基化位點的rhGAA，至少50%的該rhGAA的分子在第一位點處包括帶有兩個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元，至少30%的該rhGAA的分子在第二位點處包括帶有一個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元，至少30%的該rhGAA的分子在第四位點處包括帶有兩個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元，並且至少20%的該rhGAA的分子在第四位點處包括帶有一個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元。

本發明的另一個態樣涉及藉由本文所述的任何方法而製得的重組蛋白產物。

本發明的另一態樣涉及包括重組蛋白產物和藥學上可接受的載體的藥物組成物。

本發明的又另一態樣涉及用於治療溶酶體貯積失調的方法，該方法包括將該藥物組成物投予至對其有需要的患者。

在一個或多個實施例中，該溶酶體貯積失調係龐貝氏病，並且該重組蛋白係rhGAA。在一個或多個實施例中，在投予該包括rhGAA產物的藥物組成物的4小時內將α-葡萄糖苷酶的藥物伴護蛋白共同投予至患者。在一些實施例中，該藥物伴護蛋白選自1-去氧野尻黴素（deoxynojirimycin）和N-丁基-去氧野尻黴素。在一些實施例中，將該藥物伴護蛋白與rhGAA產物共同配製。

以下列出了不同實施例。應當理解的是，以下列出的實施例不僅如下所列結合，而且可以根據本發明的範圍以其他合適的組合而結合。

在描述本發明若干示例性實施例之前，應當理解的是，本發明不限於以下描述中列出的構建或方法步驟的細節。本發明能夠有其他的實施例，並且能夠以不同的方式被實施或進行。

儘管特別提及GAA，本領域的具有普通技術的人員將理解到本文所描述的該等方法可以用於生產、捕獲、和純化靶向溶酶體的其他重組蛋白，該等其他重組蛋白包括但不限於溶酶體酶α-半乳糖苷酶A。

本發明的各種態樣涉及用於生產、捕獲、和純化重組人溶酶體蛋白，如重組人酸性α-葡萄糖苷酶（rhGAA）之新方法。本發明的其他態樣涉及藉由本文所述的方法而產生的重組蛋白，連同此類重組蛋白的藥物組成物、治療方法、及用途。 定義

在本發明的上下文中以及在每個術語使用的特定上下文中，在本說明書中使用的術語通常具有其在本領域中的一般含義。某些術語在下文或說明書中的其他地方論述，以向從業者提供描述本發明的組成物和方法以及如何製作和使用它們的另外指導。

在本說明書中，除非上下文需要，否則歸因於表達語言或必要的含義，詞語“包括（comprises）”，或變化形式如“包括（comprises或comprising）”係以包容性的意義使用，亦即用於指明所述特徵的存在，但是不排除在本發明的不同實施例中存在或添加的其他特徵。

如本文中所使用，術語“溶酶體蛋白”係指靶向溶酶體的任何蛋白質，如溶酶體酶。將溶酶體酶和相關疾病的實例提供在下表1中： 表1

溶酶體酶	疾病
酸性α-葡萄糖苷酶	龐貝氏病
α-半乳糖苷酶A	法布裡氏病
酸性β-葡萄糖苷酶	高歇氏病
α-L-艾杜糖苷酸酶	胡爾勒-施埃爾病（Hurler-Scheie disease）
艾杜糖醛酸硫酸酯酶	亨特病（Hunter disease）
β-半乳糖苷酶	GM1-神經節苷脂貯積症；莫爾基奧氏病B（Morquio disease B）
β-葡糖醛酸糖苷酶	斯利氏病（Sly disease）（MPS VI）
α-岩藻糖苷酶	岩藻糖苷貯積病
酸性鞘磷脂酶	尼曼-匹克（Niemann-Pick）A型和B型
β-己糖胺酶A	泰－薩二氏症
β-己糖胺酶B	山多夫氏病
β-半乳糖腦苷脂酶	克拉培氏病
酸性神經醯胺酶	Farber氏病
類肝素-N-硫酸酯酶	Sanfilippo氏病（Sanfilippo disease）A（MPS IIIa）
α-N-乙醯基-葡糖胺酶	Sanfilippo氏病B（MPS IIIb）
α-胺基葡糖苷N-乙醯轉移酶	Sanfilippo氏病C（MPS IIIc）
N-乙醯葡糖胺-6-硫酸硫酸酯酶	Sanfilippo氏病D（MPS IIId）
N-乙醯基半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶	莫爾基奧氏病A（MPS Ivb）
芳基硫酸酯酶A	異染性白質失養症
芳基硫酸酯酶B	馬-拉氏（Maroteaux-Lamy）（MPS VI）
酸性脂酶	沃夫（Wolf）病
酸性α-甘露糖苷酶	α-甘露醣儲積症
酸性β-甘露糖苷酶	β-甘露醣儲積症
α-N-乙醯基-神經胺酸苷酶	唾液酸沈積症
α-N-乙醯半乳糖胺酶	辛德勒-坎沙基（Schindler-Kanzaki）病
N-天冬胺醯-β-葡糖胺酶	天冬胺醯葡糖胺尿症（Aspartylglucosaminuria）

如本文中所使用，術語“龐貝氏病”亦稱為酸性麥芽糖酶缺乏症、肝醣貯積症II型（GSDII）、和肝醣貯積病II型，意欲係指遺傳性的溶酶體貯積失調，其特徵在於在編碼人酸性α-葡萄糖苷酶的GAA基因的突變。術語包括但不限於該疾病的早發型和晚發型形式，包括但不限於嬰兒型、青年型和成年型龐貝氏病。

如本文中所使用，術語“酸性α-葡萄糖苷酶”意欲係指水解肝醣、麥芽糖和異麥芽糖的D-葡萄糖單元之間的α-1,4鍵的溶酶體酶。替代名包括但不限於：溶酶體的α-葡萄糖苷酶（EC:3.2.1.20）；葡萄糖澱粉酶；1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶；澱粉葡萄糖苷酶；γ-澱粉酶和外切-1,4-α-葡萄糖苷酶。人酸性α-葡萄糖苷酶係由GAA基因（美國國家生物技術資訊中心（NCBI）基因ID 2548）編碼的，該基因已經被定位至染色體17的長臂上（位置17q25.2-q25.3）。目前已經在人類GAA基因中鑒定了超過500個突變，其中的許多突變與龐貝氏病有關。導致該酸性α-葡萄糖苷酶的錯折疊或錯加工的突變包括T1064C（Leu355Pro）和C2104T（Arg702Cys）。另外，影響酶的成熟和加工的GAA突變包括Leu405Pro和Met519Thr。在胺基酸殘基516-521處的保守六肽WIDMNE對於酸性α-葡萄糖苷酶蛋白的活性係必需的。如本文中所使用，縮寫“GAA”意欲係指酸性α-葡萄糖苷酶酶，而斜體縮寫“GAA”意欲係指編碼人酸性α-葡萄糖苷酶的人類基因。斜體縮寫“Gaa”意欲係指編碼非人酸性α-葡萄糖苷酶的非人類基因，包括但不限於大鼠或小鼠基因，並且縮寫“Gaa”意欲係指非人酸性α-葡萄糖苷酶。因此，縮寫“rhGAA”意欲係指重組人酸性α-葡萄糖苷酶。

如本文中所使用，術語“阿葡萄糖苷酶α”意欲係指被鑒定為[199-精胺酸,223-組胺酸]先質原（prepro）-α-葡萄糖苷酶（人）的重組人酸性α-葡萄糖苷酶；化學文摘登記號420794-05-0。阿葡萄糖苷酶α被批准在美國由健贊公司在2016年1月作為產品Lumizyme®和Myozyme®進行市場行銷。

如本文中所使用，術語“ATB200”意欲係指共同未決的專利申請案PCT/US 2015/053252中所描述的重組人酸性α-葡萄糖苷酶，該專利申請的揭露內容藉由引用併入本文。

如本文中所使用，術語“聚糖”意欲係指共價結合至蛋白質或多肽上的胺基酸殘基的多糖鏈。如本文中所使用，術語“N-聚糖”或“N-聯聚糖”意欲係指藉由共價結合至胺基酸殘基的氮原子而附接至蛋白質或多肽上的胺基酸殘基的多糖鏈。例如，N-聚糖可以共價結合至天冬醯胺殘基的側鏈氮原子上。聚糖可以包含一個或若干個單糖單元，並且該單糖單元可以共價連接以形成直鏈或支鏈。在至少一個實施例中，附接至ATB200的N-聚糖單元可以包括每一獨立地選自N-乙醯葡糖胺、甘露糖、半乳糖或唾液酸的一個或多個單糖單元。蛋白質上的該N-聚糖單元可以藉由任何適當的分析技術（例如，質譜）來確定。在一些實施例中，N-聚糖單元可以藉由液相層析-串聯質譜（LC-MS/MS），利用儀器，如賽默科技（Thermo Scientific）Orbitrap Velos Pro ^TM質譜儀、賽默科技Orbitrap Fusion Lumos Tribid ^TM質譜儀或沃特斯（Waters）Xevo® G2-XS QTof質譜儀來確定。

如本文中所使用，術語“高甘露糖N-聚糖”意欲係指具有一個至六個或更多個甘露糖單元的N-聚糖。在至少一個實施例中，高甘露糖N-聚糖單元可以包含結合至天冬醯胺殘基並且進一步結合至分支的聚甘露糖鏈的一個雙(N-乙醯葡糖胺)鏈。如在本文可互換地使用，術語“M6P”或“甘露糖-6-磷酸鹽”意欲係指在位置6處磷酸化的甘露糖單元；亦即，具有與位置6處的羥基基團結合的磷酸基基團。在至少一個實施例中，一個或多個N-聚糖單元的一個或多個甘露糖單元係在位置6處磷酸化以形成甘露糖-6-磷酸單元。在至少一個實施例中，術語“M6P”或“甘露糖-6-磷酸”係指在磷酸基團上具有作為“帽”的N-乙醯葡糖胺（GlcNAc）的甘露糖磷酸二酯，連同具有缺少GlcNAc帽的暴露的磷酸基團的甘露糖單元。在至少一個實施例中，蛋白質的N-聚糖可以具有多種M6P基團，其中至少一個M6P基團具有GlcNAc帽，並且至少另一個M6P基團缺少GlcNAc帽。

如本文中所使用，術語“複合N-聚糖”意欲係指包含一個或多個半乳糖和/或唾液酸單元的N-聚糖。在至少一個實施例中，複合N-聚糖可以是高-甘露糖N-聚糖，其中一個或多個甘露糖單元進一步結合至各自獨立地選自N-乙醯葡糖胺、半乳糖和唾液酸的一個或多個單糖單元。

如本文中所使用，化合物麥格司他，亦稱為N-丁基-1-去氧野尻黴素NB-DNJ或(2R,3R,4R,5S)-1-丁基-2-(羥甲基)哌啶-3,4,5-三醇，係具有以下化學式的化合物：

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麥格司他的一種配製物作為針對1型高歇氏病的單一療法以商品名Zavesca®進行商業銷售。

如下論述，麥格司他的藥學上可接受的鹽亦可以用於本發明。當使用麥格司他的一種鹽時，將調整該鹽的劑量，如此使得患者接受的麥格司他的劑量與使用麥格司他遊離鹼時接受的量係相當的。

如本文中所使用，化合物去氧野尻黴素（duvoglustat），亦稱為1-去氧野尻黴素或DNJ或(2 R,3 R,4 R,5 S)-2-(羥甲基)哌啶-3,4,5-三醇，係具有以下化學式的化合物：

。

當使用去氧野尻黴素的一種鹽時，調整該鹽的劑量，如此使得由患者接受的去氧野尻黴素的該劑量與使用去氧野尻黴素遊離鹼時接受的量係相當的。

如本文中所使用，術語“藥物伴護蛋白”或有時簡稱為術語“伴護蛋白”意欲係指特異性結合溶酶體蛋白，並且具有以下作用中的一種或多種的分子： ●  增強蛋白質的穩定分子構象的形成； ●  增強蛋白質從內質網到另一個細胞位置，較佳的是天然的細胞位置的適當運輸，以便於防止蛋白質的內質網-相關降解； ●  防止構象不穩定或錯誤折疊的蛋白質的聚集； ●  恢復和/或增強蛋白質的至少部分的野生型功能、穩定性，和/或活性；和/或 ●  改善具有該蛋白質的細胞的表型或功能。

因此，用於酸性α-葡萄糖苷酶的藥物伴護蛋白係結合酸性α-葡萄糖苷酶，導致酸性α-葡萄糖苷酶的適當的折疊、運輸、非聚集，和活性的分子。如本文中所使用，該術語包括但不限於結合在酶、抑制劑或拮抗劑，和激動劑的活性位點的活性位點特異性伴護蛋白（ASSC）。在至少一個實施例中，該藥物伴護蛋白可以是酸性α-葡萄糖苷酶的抑制劑或拮抗劑。如本文中所使用，術語“拮抗劑”意欲係指結合酸性α-葡萄糖苷酶，並且部分地抑或完全地阻斷、抑制、降低、或中和酸性α-葡萄糖苷酶活性的任何分子。在至少一個實施例中，該藥物伴護蛋白係麥格司他。酸性α-葡萄糖苷酶的藥物伴護蛋白的另一個非限制性實例係去氧野尻黴素。

如本文中所使用，術語“活性位點”意欲係指與蛋白質的特定生物活性相關的並且係蛋白質的特定生物活性必需的蛋白質區域。在至少一個實施例中，該活性位點可以是結合受質或其他結合配偶體的，並且有助於直接參與化學鍵的形成和斷裂的胺基酸殘基的位點。

如本文中所使用，該“治療有效劑量”和“有效量”意欲係指足夠導致受試者治療反應的重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA）的量、和/或伴護蛋白的量、和/或其組合的量。治療反應可以是使用者（例如，臨床醫生）將會識別為對治療的有效響應的任何反應，包括本文所述和本領域已知的任何替代性臨床標記物或症狀。因此，在至少一個實施例中，治療反應可以是龐貝氏病的一個或多個症狀或標記物（例如本領域已知的彼等）的改善或抑制。龐貝氏病的症狀或標記物包括但不限於：降低的酸性α-葡萄糖苷酶組織活性；心肌病；心臟肥大；進行性肌無力（尤其在軀幹或下肢）；深度張力減退；巨舌（並且在一些病例中，舌突出）；吞咽、吮吸，和/或攝食困難；呼吸功能不全；肝腫大（中等的）；面肌鬆弛；無反射；運動不耐受；運動性呼吸困難；端坐呼吸；睡眠呼吸中止；上午頭痛；嗜睡；脊柱前凸和/或脊柱側彎；減少的深腱反射；下腰痛；以及不滿足發展性的動作發展指標。應當注意的是，出於本發明的目的，對酸性α-葡萄糖苷酶具有抑制作用的伴護蛋白（例如，麥格司他）的濃度可以構成“有效量”，係因為在體內投予時，伴護蛋白的稀釋（以及由於平衡變化導致的結合隨之轉變）、生物利用度和代謝。

如本文中所使用，術語“酶替代療法”或“ERT”意欲係指將非天然的、經純化的酶引入具有此種酶缺乏的個體中。投予的蛋白質可以從自然來源或藉由重組表現而獲得。該術語亦指將經純化的酶引入個體，該個體在其他情況下需要或受益於投予的經純化的酶。在至少一個實施例中，此類個體患有酶缺乏症。該引入的酶可以是在體外產生的經純化的重組酶，或從離體組織或體液例如像胎盤或動物奶，或從植物純化的蛋白質。

如本文中所使用，術語“聯合治療”意欲係指同時地或連續地投予兩種或兩種以上個體化治療的任何療法。在至少一個實施例中，與單獨進行每種治療時的效果相比，聯合治療的結果係增強的。增強可以包括，與藉由單獨進行治療時所實現的結果相比，可以產生有利的結果的不同治療的效果的任何改善。增強的效果或結果可以包括協同增強，其中增強的效果大於每種療法獨自進行時的加和效應；加和增強，其中該增強效果基本上等於每種治療獨自進行時的加和效應；或小於協同效應，其中該增強的效果低於每種治療獨自進行時的加和效應，但仍優於每種治療獨自進行時的效果。增強的效果可以藉由本領域已知的可以量測的治療功效或結果的任何手段來量測。

如本文中所使用，術語“藥學上可接受的”意欲係指當投予人類時，生理上可耐受的，並且通常不會產生不良反應的分子實體以及組成物。較佳的是，如本文中所使用，術語“藥學上可接受的”意指由聯邦或州政府的管理機構批准的或者在美國藥典或其他普遍認可的藥典中列出的，用於在動物體內並且更特定地在人體內的使用。

如本文中所使用，術語“載體”意欲係指與化合物一起投予的稀釋劑、助劑、賦形劑、或運載體。適合的藥物載體係本領域已知的，並且在至少一個實施例中，其描述於“雷明頓藥物科學”（"Remington's Pharmaceutical Sciences"），E. W.馬丁（E. W. Martin）著，第18版，或其他版本。

如本文中所使用，術語“受試者”或“患者”意欲係指人類或非人類動物。在至少一個實施例中，受試者係哺乳動物。在至少一個實施例中，受試者係人類。

如本文中所使用，術語“抗藥物抗體”意欲係指特異性結合投予至受試者的藥物並且作為向受試者投予藥物的體液免疫反應的至少一部分由受試者產生的抗體。在至少一個實施例中，該藥物係治療性蛋白質藥物產品。抗藥物抗體在受試者中的存在可以引起範圍從輕微到嚴重的免疫反應，包括但不限於危及生命的免疫反應，包括但不限於過敏反應、細胞介素釋放綜合症、以及介導關鍵功能的內源性蛋白質的交叉反應中和。另外或可替代地，抗藥物抗體在受試者中的存在可以降低該藥物的功效。

如本文中所使用，術語“中和抗體”意欲係指用於中和藥物功能的抗藥物抗體。在至少一個實施例中，該治療性蛋白質藥物產品係在受試者中表現減少或缺失的內源性蛋白質的對應物。在至少一個實施例中，該中和抗體可以用於中和內源性蛋白質的功能。

如本文中所使用，術語“約”和“大約”意欲係指對於給定量測的性質或精度的量測的量而言可接受程度的誤差。例如，如本領域中所理解的，誤差的程度可以由為量測提供的有效數字的數值來指示，並且包括但不限於對於量測所報告的最精確的有效數字中±1的變化。典型的示例性誤差程度係在給定值或值範圍的百分之20（20%）內，較佳的是在10%內，並且更較佳的是在5%內。可替代地，並且特別是在生物系統中，術語“約”和“大約”可以意指係在給定值的一個數量級內，較佳的是在5倍以內，並且更較佳的是在2倍以內的值。除非另有說明，本文給出的數字量係大約的，意指當沒有明確說明時，可以推斷出術語“約”或“大約”。

如熟習該項技術者將理解的，如本文中使用的術語“同時地”意欲意指同時或在之前或之後的相當短的時間內。例如，若兩種治療彼此同時投予，則一種治療可以在另一種治療之前或之後投予，以允許為兩種治療的後者做準備所需要的時間。因此，兩種治療的“同時投予”包括但不限於一種治療在另一種治療之後20分鐘或更短，約20分鐘、約15分鐘、約10分鐘、約5分鐘、約2分鐘、約1分鐘或比1分鐘更短。

如本文中使用的術語“藥學上可接受的鹽”意欲意指在合理醫學判斷的範圍內，適合與人類和低等動物的組織接觸使用而無不當毒性、刺激、過敏反應等，與合理的效益/風險比相稱的，通常是水或油可溶的或可分散的，並且對於它們的預期用途有效的鹽。術語包括藥學上可接受的酸加成鹽以及藥學上可接受的鹼加成鹽。適合的鹽的列表發現於，例如，S. M.伯奇（S. M. Birge）等人，藥物科學雜誌（J. Pharm. Sci.），1977, 66，第1-19頁，藉由引用併入本文。

如本文中使用的術語“藥學上可接受的酸加成鹽”意欲意指彼等保持生物有效性和遊離鹼特性的，並且不是生物學或其他態樣不希望的鹽，該等鹽係用以下各項形成：無機酸，包括但不限於鹽酸、氫溴酸、硫酸、胺基磺酸、硝酸、磷酸等，以及有機酸，包括但不限於乙酸、三氟乙酸、己二酸、抗壞血酸、天冬胺酸、苯磺酸、苯甲酸、丁酸、樟腦酸、樟腦磺酸、肉桂酸、檸檬酸、二葡萄糖酸、乙磺酸、穀胺酸、乙醇酸、甘油磷酸、半硫酸、己酸、甲酸、富馬酸、2-羥乙基磺酸（羥基乙磺酸）、乳酸、羥基馬來酸、蘋果酸、丙二酸、苯乙醇酸、均三甲苯磺酸、甲磺酸、萘磺酸、菸鹼酸、2-萘磺酸、草酸、撲酸、果膠酯酸、苯乙酸、3-苯丙酸、三甲基乙酸、丙酸、丙酮酸、水楊酸、硬脂酸、琥珀酸、磺胺酸、酒石酸、對甲苯磺酸，十一烷酸等。

如本文中使用的術語“藥學上可接受的鹼加成鹽”意欲意指彼等保持生物有效性和遊離酸特性的，並且不是生物學或其他態樣不希望的鹽，該等鹽係用以下各項形成：無機鹼，包括但不限於氨或銨或金屬陽離子，如鈉、鉀、鋰、鈣、鎂、鐵、鋅、銅、錳，鋁等的氫氧化物、碳酸鹽、或碳酸氫鹽。來源於藥學上可接受的有機無毒鹼的鹽包括但不限於以下各項的鹽：一級、二級和三級胺，季胺化合物，經取代胺包括天然存在的經取代胺，環胺和鹼性離子交換樹脂，如甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、二乙胺、三乙胺、異丙胺、三丙胺、三丁胺、乙醇胺、二乙醇胺、2-二甲胺基乙醇、2-二乙胺基乙醇、二環己基胺、賴胺酸、精胺酸、組胺酸、咖啡因、海巴明、膽鹼、甜菜鹼、乙二胺、葡糖胺、甲葡糖胺、可可鹼、嘌呤、哌𠯤、哌啶、N-乙基哌啶、四甲基銨化合物、四乙銨化合物、吡啶、N,N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基𠰌啉、二環己胺、二苄胺、N,N-二苄基苯乙胺、1-二苯羥甲胺、N,N'-二苄基乙二胺，聚胺樹脂等。 ATB200 rhGAA

在至少一個實施例中，該重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA）在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞中表現，並且當相比於帶有常規重組人溶酶體蛋白（如阿葡萄糖苷酶α）的一個或多個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元的含量，該重組人溶酶體蛋白包括增加的含量的帶有一個或多個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元。在至少一個實施例中，該酸性α-葡萄糖苷酶係本文稱為ATB200的重組人酸性α-葡萄糖苷酶，如在共同未決的國際專利申請案PCT/US 2015/053252中描述。已經顯示ATB200以高親和力（ K _D 約2-4 nM）結合非陽離子依賴性甘露糖-6-磷酸受體（CIMPR），並且由龐貝氏成纖維細胞和骼肌成肌細胞有效內化（ K _攝取約7-14 nM）。ATB200在體內表徵，並且顯示具有比阿葡萄糖苷酶α（t _1/2約60 min）更短的表觀血漿半衰期（t _1/2約45 min）。

在至少一個實施例中，該重組人酸性α-葡萄糖苷酶係具有如在SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2中所示的胺基酸序列的酶。

SEQ ID NO: 1

Met Gly Val Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val Cys Ala Leu Val Ser Leu Ala Thr Ala Ala Leu Leu Gly His Ile Leu Leu His Asp Phe Leu Leu Val Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro Val Leu Glu Glu Thr His Pro Ala His Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu Glu Thr Pro Arg Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val His Arg Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Ile Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys

SEQ ID NO: 2

Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu Glu Thr Pro Arg Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val His Arg Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Ile Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys

在至少一個實施例中，該重組人酸性α-葡萄糖苷酶具有如在SEQ ID NO: 1中所示的野生型GAA胺基酸序列，如在美國專利案第8,592,362號中所描述的，並且具有基因庫登錄號AHE24104.1（GI:568760974）。在至少一個實施例中，該重組人酸性α-葡萄糖苷酶係葡萄糖苷酶α，此係由最主要的九個觀察到的GAA基因的單倍型編碼的人酸性α-葡萄糖苷酶。

在至少一個實施例中，該重組人酸性α-葡萄糖苷酶初始表現為具有在如SEQ ID NO: 1中所示的野生型GAA的全長952胺基酸序列，並且該重組人酸性α-葡萄糖苷酶經歷去除一部分胺基酸，例如，前56個胺基酸的細胞內加工。因此，由宿主細胞分泌的該重組人酸性α-葡萄糖苷酶可以具有比在細胞內初始表現的重組人酸性α-葡萄糖苷酶更短的胺基酸序列。在至少一個實施例中，該更短的蛋白質可以具有在SEQ ID NO: 2中所示的胺基酸序列，其與SEQ ID NO: 1不同僅在於已經去除了包括信號肽和先質肽的前56個胺基酸，因此產生具有896個胺基酸的蛋白質。胺基酸數目的其他變化亦是可能的，如相對由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2描述的胺基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個缺失、取代和/或插入。在一些實施例中，該rhGAA產物包括具有不同胺基酸長度的重組人酸性α-葡萄糖苷酶分子的混合物。

在至少一個實施例中，該重組人酸性α-葡萄糖苷酶在蛋白質的一個或多個胺基酸殘基處經歷翻譯後修飾和/或化學修飾。例如，甲硫胺酸和色胺酸殘基可以經歷氧化反應。作為另一個實例，N-末端穀胺醯胺可以形成焦穀胺酸。作為另一個實例，天冬醯胺殘基可以經歷脫醯胺作用以形成天冬胺酸。作為又另一個實例，天冬胺酸殘基可以經歷異構化作用以形成異天冬胺酸。作為又另一個實例，蛋白質中未配對的半胱胺酸殘基可以與游離麩胱甘肽和/或半胱胺酸形成二硫鍵。因此，在一些實施例中，該酶初始表現為具有如在SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2中所示的胺基酸序列，並且該酶經歷一個或多個該等翻譯後修飾和/或化學修飾。此類修飾亦在本揭露的範疇內。

亦考慮編碼GAA和此類變體人GAA的多核苷酸序列，並且可以根據本發明用於重組表現rhGAA。

較佳的是，不多於70%、65%、60%、55%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、或5%的總重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA）分子缺少帶有一個或多個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元，或缺少結合非陽離子依賴性甘露糖-6-磷酸受體（CIMPR）的能力。可替代地，30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、＜ 100%或更多的該重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA）分子包括帶有一個或多個甘露糖-6-磷酸殘基的至少一個N-聚糖單元，或具有結合CIMPR的能力。

該重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA）分子可以具有在它們的聚糖上的1、2、3、或4個甘露糖-6-磷酸（M6P）基團。例如，在重組人溶酶體蛋白分子上的唯一一個N-聚糖可以帶有M6P（單-磷酸化的），單個N-聚糖可以帶有兩個M6P基團（雙-磷酸化的），或在相同重組人溶酶體蛋白分子上的兩個不同的N-聚糖可以各自帶有單個M6P基團。重組人溶酶體蛋白分子亦可以具有不帶有M6P基團的N-聚糖。在另一個實施例中，平均而言，N-聚糖包含大於3 mol/mol的M6P和大於4 mol/mol唾液酸，如此使得該重組人溶酶體蛋白包括平均至少3莫耳的甘露糖-6-磷酸殘基/莫耳的重組人溶酶體蛋白，以及至少4莫耳的唾液酸/莫耳的重組人溶酶體蛋白。平均而言，在重組人溶酶體蛋白上的至少約3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、或10%的總聚糖可以處於單-M6P聚糖的形式，例如，約6.25%的總聚糖可以攜帶單個M6P基團，並且平均而言，在重組人溶酶體蛋白上的至少約0.5%、1%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的總聚糖係處於雙-M6P聚糖的形式，並且平均而言，少於25%總重組人溶酶體蛋白不包含結合CIMPR的經磷酸化的聚糖。

該重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA）可以具有平均含量的攜帶M6P的N-聚糖，該平均含量範圍係從0.5至7.0 mol/mol的溶酶體蛋白，或包括0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、或7.0 mol/mol溶酶體蛋白的子範圍的任意中間值。可以將該溶酶體蛋白分級以提供具有不同平均數量的帶有M6P或帶有雙M6P的聚糖的溶酶體蛋白製劑，從而藉由選擇特定級分或藉由選擇性地組合不同級分來允許進一步定製靶向靶組織中溶酶體的溶酶體蛋白。

在一些實施例中，平均而言，該重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA）將帶有2.0至8.0莫耳的M6P/莫耳重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA）。此範圍包括所有的中間值和子範圍，包括2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、和8.0 mol M6P/mol重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA）。

在重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA）上高達60%的N-聚糖可以被完全地唾液酸化，例如，高達10%、20%、30%、40%、50%、或60%的N-聚糖可以完全地唾液酸化。在一些實施例中，從4%至20%的總N-聚糖被完全地唾液酸化。在其他實施例中，在該重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA）上不多於5%、10%、20%、或30%的N-聚糖攜帶唾液酸和末端半乳糖殘基（Gal）。此範圍包括所有的中間值和子範圍，例如，在該重組人溶酶體蛋白上7%至30%的總N-聚糖可以攜帶唾液酸和末端半乳糖。在又其他實施例中，在重組人溶酶體蛋白上不多於5%、10%、15%、16%、17%、18%、19%、或20%的N-聚糖僅具有末端半乳糖，並且不包含唾液酸。此範圍包括所有的中間值和子範圍，例如，在組成物中重組人溶酶體蛋白上從8%至19%的總N-聚糖可以僅具有末端半乳糖，並且不包含唾液酸。

在本發明的其他實施例中，在該重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA）上的40%、45%、50%、55%至60%的總N-聚糖係複合物型N-聚糖；或在該重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA）上不多於1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%的總N-聚糖係混合型N-聚糖；在該重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA）上不多於5%、10%、或15%的高甘露糖型N-聚糖係非磷酸化的；在該重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA）上至少5%或10%的高甘露糖型N-聚糖係單-M6P磷酸化的；和/或在重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA）上至少1%或2%的高甘露糖型N-聚糖係雙-M6P磷酸化的。該等值包括所有的中間值和子範圍。重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA）可以滿足以上所述的一個或多個含量範圍。

在一些實施例中，平均而言，該重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA）將帶有2.0至8.0莫耳的唾液酸殘基/莫耳重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA）。此範圍包括所有的中間值和子範圍，包括2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、和8.0 mol殘基/mol重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA）。不受理論的約束，據信帶有唾液酸殘基的N-聚糖單元的存在可以藉由脫唾液酸蛋白受體來防止重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA）的非生產性清除。

在一個或多個實施例中，在該重組人溶酶體蛋白的某些N-糖基化位點處，該重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA）具有M6P和/或唾液酸單元。例如，如上所述，在rhGAA上存在七個潛在的N-聯糖基化位點。該等潛在的糖基化位點在SEQ ID NO: 2的以下位置處：N84、N177、N334、N414、N596、N826和N869。相似地，對於SEQ ID NO: 1的全長胺基酸序列，該等潛在的糖基化位點係在以下位置處：N140、N233、N390、N470、N652、N882和N925。取決於天冬醯胺殘基的位置，rhGAA的其他變體可以具有相似的糖基化位點。通常，除了X不能是HIS或PRO以外，在蛋白質胺基酸序列中的ASN-X-SER或ASN-X-THR序列指示潛在的糖基化位點。

在不同的實施例中，該rhGAA具有某一N-糖基化圖。在一個或多個實施例中，在第一N-糖基化位點處至少20%的該rhGAA係經磷酸化的（例如，SEQ ID NO: 2的N84以及SEQ ID NO: 1的N140）。例如，在第一N-糖基化位點處，至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的該rhGAA可以被磷酸化。此種磷酸化作用可以是單-M6P和/或雙-M6P單元的結果。在一些實施例中，在第一N-糖基化位點處，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的該rhGAA帶有單-M6P單元。在一些實施例中，在第一N-糖基化位點處，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的該rhGAA帶有雙-M6P單元。

在一個或多個實施例中，在第二N-糖基化位點處（例如，SEQ ID NO: 2的N177，以及SEQ ID NO: 1的N223），至少20%的該rhGAA係經磷酸化的。例如，在第二N-糖基化位點處，至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的該rhGAA可以被磷酸化。此種磷酸化作用可以是單-M6P和/或雙-M6P單元的結果。在一些實施例中，在第二N-糖基化位點處，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的該rhGAA帶有單-M6P單元。在一些實施例中，在第二N-糖基化位點處，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的該rhGAA帶有雙-M6P單元。在一個或多個實施例中，在第三N-糖基化位點處（例如，SEQ ID NO: 2的N334，以及SEQ ID NO: 1的N390）至少5%的該rhGAA係經磷酸化的。在其他實施例中，在第三N-糖基化位點處，少於5%、10%、15%、20%或25%的該rhGAA係磷酸化的。例如，該第三N-糖基化位點可以具有作為主要種類的非-磷酸化的高甘露糖聚糖、二-、三-、和四-觸角複合物聚糖，以及混合聚糖的混合物。在一些實施例中，在第三N-糖基化位點處，至少3%、5%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%的該rhGAA係經唾液酸化的。

在一個或多個實施例中，在第四N-糖基化位點處（例如，SEQ ID NO: 2的N414，以及SEQ ID NO: 1的N470），至少20%的該rhGAA係經磷酸化的。例如，在第四N-糖基化位點處，至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的該rhGAA可以被磷酸化。此種磷酸化作用可以是單-M6P和/或雙-M6P單元的結果。在一些實施例中，在第四N-糖基化位點處，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的該rhGAA帶有單-M6P單元。在一些實施例中，在第四N-糖基化位點處，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的該rhGAA帶有雙-M6P單元。在一些實施例中，在第四N-糖基化位點處，至少3%、5%、8%、10%、15%、20%或25%的該rhGAA係經唾液酸化的。

在一個或多個實施例中，在第五N-糖基化位點處（例如，SEQ ID NO: 2的N596，以及SEQ ID NO: 1的N692），至少5%的該rhGAA係經磷酸化的。在其他實施例中，在第五N-糖基化位點處，少於5%、10%、15%、20%或25%的該rhGAA係經磷酸化的。例如，該第五N-糖基化位點可以具有作為主要種類的岩藻糖化的二-觸角複合聚糖。在一些實施例中，在第五N-糖基化位點處，至少3%、5%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的該rhGAA係經唾液酸化的。

在一個或多個實施例中，在第六N-糖基化位點處（例如，SEQ ID NO: 2的N826，以及SEQ ID NO: 1的N882），至少5%的該rhGAA係經磷酸化的。在其他實施例中，在第六N-糖基化位點處，少於5%、10%、15%、20%或25%的該rhGAA係經磷酸化的。例如，該第六N-糖基化位點可以具有作為主要種類的二-、三-、和四-觸角複合聚糖的混合物。在一些實施例中，在第六N-糖基化位點處，至少3%、5%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的該rhGAA係經唾液酸化的。

在一個或多個實施例中，在第七N-糖基化位點處（例如，SEQ ID NO: 2的N869，以及SEQ ID NO: 1的N925），至少5%的該rhGAA係經磷酸化的。在其他實施例中，在第七N-糖基化位點處，少於5%、10%、15%、20%或25%的該rhGAA係經磷酸化的。在一些實施例中，在第七N-糖基化位點處，少於40%、45%、50%、55%、60%或65%的該rhGAA具有任何聚糖。在一些實施例中，在第七N-糖基化位點處，至少30%、35%或40%的該rhGAA具有一個聚糖。

在各種實施例中，該rhGAA具有平均0-5 mol的海藻糖含量/mol的rhGAA、10-30 mol的GlcNAc含量/mol的rhGAA、5-20 mol的半乳糖含量/mol的rhGAA、10-40 mol的甘露糖含量/mol的rhGAA、2-8 mol的M6P含量/mol的rhGAA、以及2-8 mol的唾液酸含量/mol的rhGAA。在各種實施例中，該rhGAA具有平均2-3 mol的海藻糖含量/mol的rhGAA、20-25 mol的GlcNAc含量/mol的rhGAA、8-12 mol的半乳糖含量/mol的rhGAA、22-27 mol的甘露糖含量/mol的rhGAA、3-5 mol的M6P含量/mol的rhGAA、以及4-7 mol的唾液酸含量/mol的rhGAA。

該重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA）較佳的是由中國倉鼠卵巢（CHO）細胞，如CHO細胞系GA-ATB-200或ATB-200-001-X5-14，或由此種CHO細胞培養物的次代培養物或衍生物產生。表現酸性α-葡萄糖苷酶的等位變體或其他變體酸性α-葡萄糖苷酶胺基酸序列（如與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少90%、95%、98%或99%一致性的彼等）的DNA構建體可以在CHO細胞中構建並表現。該等變體酸性α-葡萄糖苷酶胺基酸序列相對SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2可以包含缺失、取代，和/或插入，如相對由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2描述的胺基酸序列，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個缺失、取代和/或插入。熟習該項技術者可以選擇適合於轉化CHO細胞用於產生此類DNA構建體的替代載體。

可以使用不同比對演算法和/或程序來計算兩個序列之間的一致性，包括可用作GCG序列分析包（威斯康辛大學，麥迪森市，威斯康辛州）的一部分的FASTA或BLAST，並且可以與例如，默認設置一起使用。例如，考慮與本文所述的特定多肽具有至少90%、95%、98%或99%一致性，並且較佳的是表現出基本相同功能的多肽，連同編碼此類多肽的多核苷酸。除非另有說明，相似性分數將基於BLOSUM62的使用。當使用BLASTP時，相似性百分比係基於BLASTP陽性得分，並且序列一致性百分比係基於BLASTP一致性得分。BLASTP“一致性”顯示出相同的高分序列對中總殘基的數量和分數；並且BLASTP“陽性”顯示出其比對分數具有正值並且彼此相似的殘基的數量和分數。本揭露考慮和涵蓋具有與本文揭露的胺基酸序列具有該等程度的一致性或相似性或任何中間程度的一致性或相似性的胺基酸序列。相似多肽的多核苷酸序列使用遺傳密碼推導出，並且可以藉由常規手段（特別地藉由使用遺傳密碼來逆轉錄其胺基酸序列）獲得。

諸位發明人已經發現，可以使用中國倉鼠卵巢（CHO）細胞生產重組人酸性α-葡萄糖苷酶，該重組人酸性α-葡萄糖苷酶具有靶向非陽離子依賴性甘露糖-6-磷酸受體（CIMPR）和細胞溶酶體的優異能力，連同降低其體內非生產性清除的糖基化模式。可以誘導該等細胞表現比常規重組人酸性α-葡萄糖苷酶產物（如阿葡萄糖苷酶α）具有顯著更高水平的帶有一個或多個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元的重組人酸性α-葡萄糖苷酶。由該等細胞產生的該重組人酸性α-葡萄糖苷酶，例如，由ATB200例證的，比常規的酸性α-葡萄糖苷酶（例如Lumizyme®），具有顯著更多的肌細胞靶向的甘露糖-6-磷酸鹽（M6P）和雙-甘露糖-6-磷酸鹽N-聚糖殘基。不受理論的約束，據信此種廣泛的糖基化允許ATB200酶被更有效地吸收到靶細胞中，並且因此比其他重組人酸性α-葡萄糖苷酶（例如像，具有遠遠更低的M6P和雙-M6P含量的阿葡萄糖苷酶α）更有效地從循環中清除。已經顯示ATB200有效地結合CIMPR，並且被骨骼肌和心肌有效吸收，並且具有提供有利的藥代動力學曲線並且減少體內非生產性清除的糖基化模式。

相比例如阿葡萄糖苷酶α，亦考慮ATB200的大量糖基化可以有助於ATB200免疫原性的降低。如熟習該項技術者將理解的，用保守的哺乳動物糖對蛋白質的糖基化通常增強產物溶解度，並且減少產物的聚集和免疫原性。糖基化藉由最小化蛋白質聚集連同藉由從免疫系統中遮罩免疫原性蛋白質表位來間接改變蛋白質免疫原性（工業指導-治療性蛋白質產品的免疫原性評估（Guidance for Industry-Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products），美國衛生和人類服務部，食品與藥品管理局，藥物評估和研究中心，生物製劑評估和研究中心，2014年8月）。因此，在至少一個實施例中，該重組人酸性α-葡萄糖苷酶的投予不會引起抗藥物抗體。在至少一個實施例中，相比藉由投予葡萄糖苷酶α引起的抗藥物抗體的水平，該重組人酸性α-葡萄糖苷酶的投予引起受試者中抗藥物抗體的更低發生率。

如在共同未決的國際專利申請PCT/US 2015/053252中所述，可以使用細胞（如，CHO細胞）來產生其中所述的rhGAA，並且該rhGAA可以用於本發明。此類CHO細胞系的實例係產生如其中所述的rhGAA組成物的GA-ATB-200或ATB-200-001-X5-14，或其次代培養物。此類CHO細胞系可以包含編碼GAA的多核苷酸的基因的多個拷貝，如5、10、15或20或更多個拷貝。

該高M6P和雙-M6P rhGAA（如ATB200 rhGAA）可以藉由用編碼GAA的DNA構建體轉化CHO細胞來產生。儘管CHO細胞之前被用於製備rhGAA，但是沒有意識到轉化的CHO細胞可以按產生具有高含量的靶向CIMPR的M6P和雙-M6P聚糖的rhGAA的方式進行培養和選擇。

出人意料地，發現可以轉化CHO細胞系，選擇產生rhGAA的轉化體，該rhGAA包含高含量的帶有靶向CIMPR的M6P或雙-M6P的聚糖，並穩定表現該高-M6P rhGAA。因此，用於製備該等CHO細胞系的方法亦描述在共同未決的國際專利申請案PCT/US 2015/053252中。該方法涉及用編碼GAA或GAA變體的DNA轉化CHO細胞，選擇將編碼GAA的DNA穩定整合到其染色體中並穩定表現GAA的CHO細胞，並且選擇表現具有高含量的帶有M6P或雙-M6P的聚糖的GAA的CHO細胞，以及視情況選擇一種CHO細胞，該CHO細胞具有含高唾液酸含量的N-聚糖，和/或具有含低非磷酸化的高甘露糖含量的N-聚糖。

藉由培養該CHO細胞系，並且從CHO細胞培養物中回收所述的組成物，該等CHO細胞系可以用於產生rhGAA和rhGAA組成物。 重組人溶酶體蛋白的生產、捕獲、和純化

本發明的各種實施例涉及用於產生和/或捕獲和/或純化重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA）的方法。將用於生產、捕獲、和純化重組人溶酶體蛋白的示例性方法600在圖6中圖示。

在圖6中，箭頭表明針對包含該重組人溶酶體蛋白的各種液相的運動方向。生物反應器601包含培養細胞，如CHO細胞，該等細胞表現重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA），並將其分泌至周圍的液體培養基中。生物反應器601可以是用於培養細胞的任何合適的生物反應器，如灌注式、分批式、或補料分批式生物反應器。在各種實施例中，該生物反應器具有約1 L和約20,000 L之間的體積。示例性生物反應器的體積包括約1 L、約10 L、約20 L、約30 L、約40 L、約50 L、約60 L、約70 L、約80 L、約90 L、約100 L、約150 L、約200 L、約250 L、約300 L、約350 L、約400 L、約500 L、約600 L、約700 L、約800 L、約900 L、約1,000 L、約1,500 L、約2,000 L、約2,500 L、約3,000、約3,500 L、約4,000 L、約5,000 L、約6,000 L、約7,000 L、約8,000 L、約9,000 L、約10,000 L、約15,000 L、和約20,000 L。

如圖6所示，該介質可以從該生物反應器中去除。此類介質的去除對於灌注式生物反應器可以是連續的，或對於分批式或補料分批式反應器可以是分批的。將該介質藉由過濾系統603過濾以去除細胞。在一些實施例中，將從介質中去除的該等細胞再引入至該生物反應器中，並且可以將包括分泌重組人溶酶體蛋白的介質做進一步處理。過濾系統603可以是任何合適的過濾系統，包括交替切向流過濾（ATF）系統、切向流過濾（TFF）系統、離心過濾系統等。在各種實施例中，該過濾系統利用具有孔徑大小在約10奈米和約2微米之間的過濾器。示例性過濾器孔徑大小包括約10 nm、約20 nm、約30 nm、約40 nm、約50 nm、約60 nm、約70 nm、約80 nm、約90 nm、約100 nm、約150 nm、約200 nm、約250 nm、約300 nm、約350 nm、約400 nm、約500 nm、約600 nm、約700 nm、約800 nm、約900 nm、約1 µm、約1.5 µm、和約2 µm。

在各種實施例中，該介質去除速率在約1 L/天和約20,000 L/天之間。示例性介質去除速率包括約1 L/天、約10 L/天、約20 L/天、約30 L/天、約40 L/天、約50 L/天、約60 L/天、約70 L/天、約80 L/天、約90 L/天、約100 L/天、約150 L/天、約200 L/天、約250 L/天、約300 L/天、約350 L/天、約400 L/天、約500 L/天、約600 L/天、約700 L/天、約800 L/天、約900 L/天、約1,000 L/天、約1,500 L/天、約2,000 L/天、約2,500 L/天、約3,000 L/天、約3,500 L/天、約4,000 L/天、約5,000 L/天、約6,000 L/天、約7,000 L/天、約8,000 L/天、約9,000 L/天、約10,000 L/天、約15,000 L/天、和約20,000 L/天。可替代地，該介質去除速率可以表示為該生物反應器體積的函數，如約0.1至約3個反應器體積/天。示例性介質去除速率包括約0.1、約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1、約1.1、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約2、約2.5、和約3個反應器體積/天。

對於連續的或補料分批過程，其中將新鮮介質提供給該生物反應器的速率可以是在約1 L/天和約20,000 L/天之間。示例性介質引入速率包括約1 L/天、約10 L/天、約20 L/天、約30 L/天、約40 L/天、約50 L/天、約60 L/天、約70 L/天、約80 L/天、約90 L/天、約100 L/天、約150 L/天、約200 L/天、約250 L/天、約300 L/天、約350 L/天、約400 L/天、約500 L/天、約600 L/天、約700 L/天、約800 L/天、約900 L/天、約1,000 L/天、約1,500 L/天、約2,000 L/天、約2,500 L/天、約3,000 L/天、約3,500 L/天、約4,000 L/天、約5,000 L/天、約6,000 L/天、約7,000 L/天、約8,000 L/天、約9,000 L/天、約10,000 L/天、約15,000 L/天、和約20,000 L/天。可替代地，該介質引入速率可以表示為該生物反應器體積的函數，如約0.1至約3個反應器體積/天。示例性介質引入速率包括約0.1、約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1、約1.1、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約2、約2.5、和約3個反應器體積/天。

過濾後，將該濾液載入到蛋白質捕獲系統605上。該蛋白質捕獲系統605可以包括一個或多個層析柱。若使用多於一個層析柱，則該等層析柱可以串聯放置，如此使得下一個層析柱可以在第一個層析柱載入後立即開始載入。可替代地，該介質去除過程可以在該等層析柱轉換的期間被中止。

在各種實施例中，該蛋白質捕獲系統605包括用於直接產品捕獲重組人溶酶體蛋白（特別是具有高M6P含量的溶酶體蛋白）的一個或多個陰離子交換（AEX）柱。儘管不希望受任何特定理論的束縛，據信使用AEX層析捕獲來自經過濾的介質中的該重組人溶酶體蛋白可確保該捕獲的重組蛋白產物具有更高的M6P含量，此歸因於具有一個或多個M6P基團的重組蛋白的更多的負電荷。其結果係，非磷酸化的重組蛋白和宿主細胞雜質不結合樹脂柱連同高度磷酸化的重組蛋白，並且將該非磷酸化的重組蛋白和宿主細胞雜質穿過該柱。因此，該AEX層析可以用於豐富該蛋白產物的M6P含量（亦即，選擇具有更多M6P的蛋白質），此歸因於包含M6P的蛋白質對於AEX樹脂的高親和力。

此外，儘管不希望受任何特定理論的束縛，亦據信藉由使用AEX層析的重組蛋白的直接產物捕獲可確保將具有高M6P含量的重組蛋白從包含蛋白酶和其他酶的介質中去除，該等蛋白酶和其他酶可以降解該蛋白質和/或將該蛋白質脫磷酸。其結果係，該高質量的產物被保存。

合適的AEX層析柱具有結合帶負電荷的蛋白質的功能性化學基團。示例性官能團包括，但不限於：一級、二級、三級、和季銨、或胺基團。該等官能團可能結合至膜（例如纖維素膜）或常規的層析樹脂。示例性柱介質包括來自通用醫療生命科學公司（GE Healthcare Lifesciences）的SP、CM、Q、和DEAE Sepharose®快速流動介質。

AEX層析柱的體積可以是任何合適的體積，如在1 L和1,000 L之間。示例性柱體積包括約1 L、約2 L、約3 L、約4 L、約5 L、約6 L、約7 L、約8 L、約9 L、約10 L、約20 L、約30 L、約40 L、約50 L、約60 L、約70 L、約80 L、約90 L、約100 L、約150 L、約200 L、約250 L、約300 L、約350 L、約400 L、和約500 L、約600 L、約700 L、約800 L、約900 L、和約1,000 L。

將陰離子交換柱的示例性條件提供在以下表2中： 表2

程序	緩衝液	流速（ cm/h ）	體積（ CV ）	溫度（ ℃ ）
用前消毒	0.1-10 M NaOH	≤ 25-2500	≥ 1-3 （≥ 10-120 min）	15 - 25
預平衡	20-2000 mM磷酸鹽緩衝液（PB），pH 6.9-7.3	≤ 25-2500	≥ 1-5	15 - 25
平衡	4-400 mM PB，pH 6.9-7.3	≤ 25-2500	≥ 1-5	2 - 15
載入	NA	≤ 10-1000	NA	2 - 15
洗滌1	4-400 mM PB，pH 6.9-7.3	≤ 25-2500	≥ 2-10	2 - 15
洗滌2	4-400 mM PB，pH 6.9-7.3	≤ 25-2500	≥ 2-10	15 - 25
洗提	4-400 mM PB，20-2000 mM NaCl，pH 6.1-6.5	≤ 25-2500	NA	15 - 25
脫去	4-400 mM PB，0.1-10 M NaCl，pH 6.1-6.5	≤ 25-2500	≥ 1-5	15 - 25
用後消毒	0.1-10 M NaOH	≤ 25-2500	≥ 1-3 （≥ 10-120 min）	15 - 25
儲存	0.01-1.0 M NaOH	≤ 25-2500	≥ 1-5	15 - 25

將該重組人溶酶體蛋白載入到蛋白質捕獲系統605上後，藉由改變該柱中的pH和/或鹽含量，將該重組人溶酶體蛋白從該一個或多個柱上進行洗提。

可以將經洗提的重組人溶酶體蛋白經受進一步的純化步驟和/或質量保證步驟。例如，如圖6所示，可以將經洗提的重組人溶酶體蛋白經受病毒殺滅步驟607。此種病毒殺滅607可以包括低pH殺滅、洗滌劑殺滅、或本領域已知的其他技術中的一個或多個。

可以將來自病毒殺滅步驟607的重組蛋白產物引入第二個層析系統609中以進一步純化該重組蛋白產物。可替代地，可以將來自蛋白質捕獲系統605的經洗提的重組蛋白直接補料至第二層析系統609。在各種實施例中，該第二層析系統609包括用於進一步去除雜質的一個或多個固定的金屬親和層析（IMAC）柱。示例性金屬離子包括鈷、鎳、銅、鐵、鋅、或鎵。

該第二層析柱（例如，IMAC柱）的體積可以是任何合適的體積，如在0.1 L和100 L之間。示例性柱體積包括約0.1 L、約0.2 L、約0.3 L、約0.4 L、約0.5 L、約0.6 L、約0.7 L、約0.8 L、約0.9 L、約1 L、約1.5 L、約2 L、約2.5L、約3 L、約3.5 L、約4 L、約4.5 L、約5 L、約6 L、約7 L、約8 L、約9 L、約10 L、約15 L、約20 L、約25 L、約30 L、約35 L、約40 L、和約50 L、約60 L、約70 L、約80 L、約90 L、和約100 L。

將IMAC柱的示例性條件提供在以下表3中： 表3

程序	緩衝液	流速 （cm/h）	體積 （CV）
沖洗	4-400 mM PB，pH 6.3-6.7	≤ 25-2500	≥ 1-5
用前消毒	0.01-1.0 M NaOH	≤ 25-2500	≥ 1-3 （10 - 30 min）
平衡	4-400 mM PB，pH 6.5	≤ 25-2500	≥ 1-5
用WFI洗滌	注射用水（WFI）	≤ 25-2500	≥ 1-3
螯合	0.01-1.0 M乙酸銅	≤ 25-2500	≥ 1-5
用WFI洗滌	WFI	≤ 25-2500	≥ 2-10
用酸性緩衝液洗滌	2-200 mM乙酸鈉、0.05-5 M NaCl、pH 3.5-4.5	≤ 25-2500	≥ 2-10
平衡	4-400 mM PB，pH 6.3-6.7	≤ 25-2500	≥ 1-5
用洗提緩衝液運行空白	4-400 mM PB，15-1500 mM甘胺酸，pH 6.1-6.5	≤ 25-2500	≥ 2-20
平衡	4-400 mM PB，pH 6.3-6.7	≤ 25-2500	≥ 1-5
載入	NA	≤ 25-2500	≥ 1-5
洗滌1	4-400 mM PB，pH 6.3-6.7	≤ 25-2500	≥ 2-10
洗滌2	4-400 mM PB，0.1-10 M NaCl，5%-30%丙二醇，pH 6.3-6.7	≤ 25-2500	≥ 2-10
洗滌3	4-400 mM PB，pH 6.3-6.7	≤ 25-2500	≥ 2-10
洗提	4-400 mM PB，15-1500 mM甘胺酸，pH 6.1-6.5	≤ 25-2500	NA
脫去	4-400 mM PB，50-5000 mM咪唑，pH 6.3-6.7	≤ 25-2500	≥ 1-5
用後消毒	0.01-1 M NaOH	≤ 25-2500	≥ 1-3 （10 - 30 min）
沖洗	4-400 mM PB，pH 6.3-6.7	≤ 25-2500	≥ 1-5
儲存	5%-30%乙醇	≤ 25-2500	≥ 1-5

將該重組蛋白載入到第二層析系統609上後，將該重組蛋白從柱上進行洗提。如圖6所示，該經洗提的重組蛋白可以經受病毒殺滅步驟611。如同病毒殺滅607一樣，病毒殺滅611可以包括低pH殺滅、洗滌劑殺滅、或本領域已知的其他技術中的一個或多個。在一些實施例中，僅使用病毒殺滅607或611中的一個，或在純化過程的相同階段進行病毒殺滅。

如圖6所示，可以將來自病毒殺滅步驟611的重組蛋白產物引入第三層析系統613中以進一步純化該重組蛋白產物。可替代地，可以將來自第二層析系統609的經洗提的重組蛋白直接補料至第三層析系統613中。在各種實施例中，第三層析系統613包括用於進一步去除雜質的一個或多個陽離子交換層析（CEX）柱和/或尺寸排阻層析（SEC）柱。隨後將該重組蛋白產物從第三層析系統613中洗提。

該第三層析柱（例如，CEX或SEC柱）的體積可以是任何合適的體積，如在0.1 L和200 L之間。示例性柱體積包括約0.1 L、約0.2 L、約0.3 L、約0.4 L、約0.5 L、約0.6 L、約0.7 L、約0.8 L、約0.9 L、約1 L、約1.5 L、約2 L、約2.5L、約3 L、約3.5 L、約4 L、約4.5 L、約5 L、約6 L、約7 L、約8 L、約9 L、約10 L、約15 L、約20 L、約25 L、約30 L、約35 L、約40 L、和約50 L、約60 L、約70 L、約80 L、約90 L、約100 L、約150 L、和約200 L。

將CEX柱的示例性條件提供在以下表4中： 表4

程序	緩衝液	流速 （cm/h）	體積 （CV）
用前消毒	0.1-10 M NaOH	≤ 25-2500	≥ 1-3 （≥ 10-120 min）
平衡	2-200 mM檸檬酸鈉，pH 4.0-5.0	≤ 30-3000	≥ 2-10
載入	NA	≤ 30-3000	NA
洗滌	2-200 mM檸檬酸鈉，pH 4.0-5.0	≤ 30-3000	≥ 2-10
洗提	2-200 mM檸檬酸鈉，15-1500 mM NaCl，pH 4.0-5.0	≤ 30-3000	≥ 2-10
脫去	2-200 mM檸檬酸鈉，0.1-10 M NaCl，pH 4.0-5.0	≤ 30-3000	≥ 1-5
用後消毒	0.1-10 M NaOH	≤ 25-2500	≥ 1-3 （≥ 10-120 min）
儲存	0.01-1.0 M NaOH	≤ 30-3000	≥ 1-5

亦可以將該重組蛋白產物進行進一步的處理。例如，可以使用另一個過濾系統615去除病毒。在一些實施例中，此種過濾可以利用具有孔徑在5和50 µm之間的過濾器。其他產物處理可以包括產物調節步驟617，其中該重組蛋白產物可以被滅菌、過濾、濃縮、儲存和/或具有用於終產物配製物而添加的另外的組分。例如，可以將該重組蛋白產物濃縮2-10倍，如從約2至約20 mg/ml的最初的蛋白質濃度到約4至約200 mg/ml最終的蛋白質濃度。可以將該終產物用於填充小瓶，並且可以凍乾用於將來使用。 重組蛋白的投予

可以根據常規程序將該重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA），或其藥學上可接受的鹽配製為適合向人類投予的藥物組成物。例如，在較佳的實施例中，用於靜脈內投予的組成物係在無菌等滲水緩衝液中的溶液。必要時，該組成物亦可以包括增溶劑和局部麻醉劑以緩解注射部位的疼痛。通常，成分以單位劑量形式分開或混合在一起提供，例如，作為在氣密容器中的乾燥凍乾粉或無水濃縮物，氣密容器如指明活性劑的量的安瓿或小藥囊。在藉由輸注投予組成物時，可以用包含無菌藥用級的水、鹽水或右旋糖/水的輸液瓶進行分配。在藉由注射投予組成物時，可以提供無菌注射用水或鹽水的安瓿，如此使得可以在投予前將該等成分混合。

藉由適當的途徑投予重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA）（或包含重組人溶酶體蛋白的組成物或藥物）。在一個實施例中，經靜脈內投予該重組人溶酶體蛋白。在其他實施例中，藉由直接投予靶組織（如至心臟或骨骼肌（例如，肌內））或神經系統（例如，直接注射到腦中；腦室內；鞘內）來投予重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA）。若需要，可以同時使用多於一個途徑。

將該重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA）（或包含重組人溶酶體蛋白的組成物或藥物）以治療有效量投予（例如，當以規律間隔投予時，足以治療疾病的劑量，例如藉由減輕與與疾病相關的症狀，預防或延遲疾病的發作，和/或減輕疾病的症狀的嚴重性或頻率實現的）。在治療疾病中治療有效的量將取決於疾病影響的性質和程度，並且可以藉由標準臨床技術來確定。另外，可以視情況採用體外或體內測定來幫助鑒定最佳劑量範圍。待採用的確切劑量亦取決於投予途徑和疾病的嚴重程度，並且應根據從業者的判斷和每個患者的情況來決定。可以從源自體外或動物模型測試系統的劑量-反應曲線外推有效劑量。在至少一個實施例中，將該重組人酸性α-葡萄糖苷酶以約1 mg/kg至約100 mg/kg，如約5 mg/kg至約30 mg/kg，典型地約5 mg/kg至約20 mg/kg的劑量藉由靜脈內輸注投予。在至少一個實施例中，將該重組人酸性α-葡萄糖苷酶以約5 mg/kg、約10 mg/kg、約15 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約30 mg/kg、約35 mg/kg、約40 mg/kg、約50 mg/kg、約50 mg/kg、約60 mg/kg、約70 mg/kg、約80 mg/kg、約90 mg/kg、或約100 mg/kg的劑量藉由靜脈內輸注投予。在至少一個實施例中，將該重組人酸性α-葡萄糖苷酶以約20 mg/kg的劑量藉由靜脈內輸注投予。對特定個體的有效劑量可以是隨著時間變化的（例如，增加的或減少的），此取決於該個體的需要。例如，在生理疾病或軀體應激的時候，或若抗-酸性α-葡萄糖苷酶抗體存在或增加，或若疾病症狀惡化，該量可以增加。

以規律的間隔投予的重組人酸性α-葡萄糖苷酶（或包含重組人酸性α-葡萄糖苷酶的組成物或藥物）的治療有效量取決於疾病影響的性質和程度，以及持續進行的基礎。如本文中所使用，以“規律的間隔”投予表示，將該治療有效量定期地投予（如區別於一次性劑量）。該間隔可以藉由標準臨床技術來確定。在較佳的實施例中，將重組人酸性α-葡萄糖苷酶以每月、每兩個月；每週；每週兩次；或每日投予。單個個體的投予間隔不需要係固定的間隔，但是可以是隨時間變化的，其取決於該個體的需要。例如，在生理疾病或軀體應激的時候，若抗-重組人酸性α-葡萄糖苷酶抗體存在或增加，或若疾病症狀惡化，可以減小劑量之間的間隔。在一些實施例中，將5、10、20、50、100，或200 mg酶/kg體重的治療有效量以每週兩次、每週一次或每隔一週，伴有或不伴有伴護蛋白來投予。

該重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA）可以製備用於以後使用，如在單位劑量小瓶或注射器中，或在用於靜脈內投予的瓶或袋中。包含重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA），連同任選的賦形劑或其他活性成分，如伴護蛋白或或其他藥物的套組，可以封裝在包裝材料中，並且附有用於復水、稀釋或給藥的說明書，用於治療對其有需要的受試者，如患有龐貝氏病的患者。 rhGAA 和藥物伴護蛋白的聯合治療

在各種實施例中，可以將藉由本文所述的過程而產生的該rhGAA（例如，ATB200）與藥物伴護蛋白（如麥格司他或去氧野尻黴素）用於聯合治療。

在至少一個實施例中，將該藥物伴護蛋白（例如麥格司他）口服投予。在至少一個實施例中，將麥格司他以約200 mg至約400 mg的口服劑量，或以約200 mg、約250 mg、約300 mg、約350 mg、或約400 mg的口服劑量投予。在至少一個實施例中，將麥格司他以約233 mg至約400 mg的口服劑量投予。在至少一個實施例中，將麥格司他以約250 mg至約270 mg的口服劑量，或以約250 mg、約255 mg、約260 mg、約265 mg、或約270 mg的口服劑量投予。在至少一個實施例中，將麥格司他以約260 mg的口服劑量投予。

熟習該項技術者將理解，在約200 mg至400 mg的範圍或其中任何更小範圍中的麥格司他的口服劑量可以適用於平均體重為約70 kg的成年患者。對於體重顯著低於約70 kg的患者，包括但不限於嬰兒、兒童或體重不足的成人，醫生可以認為更小的劑量係適合的。因此，在至少一個實施例中，將麥格司他按從約50 mg至約200 mg的口服劑量投予，或按以下口服劑量投予：約50 mg、約75 mg、約100 mg、125 mg、約150 mg、約175 mg 或約200 mg。在至少一個實施例中，將麥格司他按從約65 mg至約195 mg口服劑量投予，或按以下口服劑量投予：約65 mg、約130 mg 或約195 mg。

在至少一個實施例中，將該麥格司他以合適口服投予的藥學上可接受的劑型投予，並且包括但不限於片劑、膠囊劑、珠粒劑（ovule）、酏劑、溶液或混懸劑、凝膠劑、糖漿劑、漱口劑，或在使用前用水或其他合適的運載體重構的乾粉，可視情況具有用於速釋、延遲釋放、改性釋放、持續釋放、脈衝釋放或控釋應用的調味劑和著色劑。亦可以使用固體組成物，如片劑、膠囊、錠劑、軟錠劑、丸劑、大丸劑（boluse）、粉劑、糊劑、顆粒劑、子彈劑、糖衣丸或預混製劑。在至少一個實施例中，將麥格司他作為片劑投予。在至少一個實施例中，將麥格司他作為膠囊投予。在至少一個實施例中，該劑型包含從約50 mg至約300 mg的麥格司他。在至少一個實施例中，該劑型包含約65 mg的麥格司他。在至少一個實施例中，該劑型包含約130 mg的麥格司他。在至少一個實施例中，該劑型包含約260 mg的麥格司他。預期當該劑型包含約65 mg的麥格司他時，麥格司他可以按四種劑型投予，或麥格司他總劑量為260 mg。然而，對於具有體重顯著低於平均成年人體重（70 kg）的患者，包括但不限於嬰兒、兒童或體重不足的成人，將麥格司他可以按以下劑型的劑量投予：一個劑型（總劑量65 mg的麥格司他）、兩個劑型（總劑量130 mg的麥格司他），或三個劑型（總劑量195 mg的麥格司他）。

可以根據本領域已知的方法來製備用於口服使用的固體和液體組成物。此類組成物亦可以包含一種或多種藥學上可接受的，可以是固體或液體形式的載體和賦形劑。片劑或膠囊可以藉由常規手段與藥學上可接受的賦形劑（包括但不限於黏合劑、填充劑、潤滑劑、崩解劑或潤濕劑）一起來製備。適合的藥學上可接受的賦形劑係本領域已知的，並且包括但不限於：預膠化澱粉、聚乙烯吡咯啶酮、聚維酮、羥丙基甲基纖維素（HPMC）、羥丙基乙基纖維素（HPEC）、羥丙基纖維素（HPC）、蔗糖、明膠、阿拉伯樹膠、乳糖、微晶纖維素、磷酸氫鈣、硬脂酸鎂、硬脂酸、山崳酸甘油酯、滑石、矽石、玉米、馬鈴薯或木薯澱粉、澱粉乙醇酸鈉、十二烷基硫酸鈉、檸檬酸鈉、碳酸鈣、二鹼式磷酸鈣、甘胺酸交聯羧甲基纖維素鈉，以及複合矽酸鹽。可以將片劑藉由本領域熟知的方法進行包被。在至少一個實施例中，將麥格司他以作為Zavesca®（Actelion Pharmaceuticals公司）可商購的配製物來投予。

在至少一個實施例中，將麥格司他和該重組人酸性α-葡萄糖苷酶同時投予。在至少一個實施例中，將麥格司他和該重組人酸性α-葡萄糖苷酶順序投予。在至少一個實施例中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予之前投予。在至少一個實施例中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予之前少於三小時投予。在至少一個實施例中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予之前約兩小時投予。在至少一個實施例中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予之前少於兩小時投予。在至少一個實施例中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予之前約1.5小時投予。在至少一個實施例中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予之前約一小時投予。在至少一個實施例中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予之前約50分鐘至約70分鐘投予。在至少一個實施例中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予之前約55分鐘至約65分鐘投予。在至少一個實施例中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予之前約30分鐘投予在至少一個實施例中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予之前約25分鐘至約35分鐘投予。在至少一個實施例中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予之前約27分鐘至約33分鐘投予。

在至少一個實施例中，將麥格司他的投予與該重組人酸性α-葡萄糖苷酶的投予同時進行。在至少一個實施例中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予之前或之後20分鐘內投予。在至少一個實施例中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予之前或之後15分鐘內投予。在至少一個實施例中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予之前或之後10分鐘內投予。在至少一個實施例中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予之前或之後5分鐘內投予。

在至少一個實施例中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予之後投予。在至少一個實施例中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予之後長達2小時投予。在至少一個實施例中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予之後約30分鐘投予。在至少一個實施例中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予之後約一小時投予。在至少一個實施例中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予之後約1.5小時投予。在至少一個實施例中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予之後約2小時投予。

本發明的另一態樣提供了在對其有需要的患者中用於聯合治療龐貝氏病的一種套組（kit）。該套組包括以下各項：包括麥格司他的藥學上可接受的劑型，包括如本文定義的重組人酸性α-葡萄糖苷酶的藥學上可接受的劑型，以及用於將包括麥格司他的該藥學上可接受的劑型和包括重組酸性α-葡萄糖苷酶的該藥學上可接受的劑型投予至對其有需要的患者的說明書。在至少一個實施例中，包括麥格司他的藥學上可接受的劑型係如本文所描述的口服劑型，包括但不限於片劑或膠囊。在至少一個實施例中，包括重組人酸性α-葡萄糖苷酶的藥學上可接受的劑型係如本文所述的適合注射的無菌溶液。在至少一個實施例中，用於投予該等劑型的說明包括如本文所述的，在藉由靜脈內輸注包括重組人酸性α-葡萄糖苷酶的藥學上可接受的劑型之前口服投予包括麥格司他的藥學上可接受的劑型的說明。

不受理論束縛，據信麥格司他充當該重組人酸性α-葡萄糖苷酶ATB200的藥物伴護蛋白，並且結合其活性位點。例如，已發現麥格司他降低了未折疊的ATB200蛋白的百分比，並且穩定了ATB200的活性構象，防止在血漿的中性pH下變性和不可逆失活，並且允許其在循環條件中存活足夠長以到達組織，並且被組織吸收。然而，麥格司他與ATB200活性位點的結合，藉由防止天然受質，肝醣接近該活性位點亦可以導致ATB200酶活性的抑制。據信當在本文所描述的條件下將麥格司他和該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予患者時，在血漿和組織中的麥格司他和ATB200的濃度係如此使得使ATB200穩定，直到它可以被吸收到組織中並且靶向溶酶體，但是由於麥格司他的快速清除，在溶酶體中藉由ATB200的肝醣水解沒有由於麥格司他的存在而過度抑制，並且該酶保留治療有用的足夠活性。

可以組合上述所有實施例。此包括在涉及以下的具體實施例中： •   藥物伴護蛋白，例如，麥格司他的性質；以及其特異性針對的活性位點； •   藥物伴護蛋白（例如，麥格司他）的劑量、投予途徑和包括載體性質的藥物組成物的類型以及市售組成物的用途； •   該藥物（例如，治療性蛋白質藥物產品）的性質，該藥物可以是在受試者中表現減少或不存在的內源性蛋白質的對應物，適合地是重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA），例如在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞中表現並且當相比於帶有帶有阿葡萄糖苷酶α的一個或多個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元的含量時包括增加的含量的帶有一個或多個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元的重組人酸性α-葡萄糖苷酶；並且適當地具有如在SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2中所圖示的胺基酸序列； •   在重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA）上的N-聚糖單元（如，附接至該重組人溶酶體蛋白的N-乙醯葡糖胺、半乳糖、唾液酸、或由該等組合而形成的複合N-聚糖）的數目和類型； •   在重組人溶酶體蛋白（例如，rhGAA）上甘露糖單元形成甘露糖-6-磷酸和/或雙甘露糖-6-磷酸的磷酸化作用的程度； •   該替代酶（例如，重組人酸性α-葡萄糖苷酶）的劑量和投予途徑（例如，靜脈內投予，尤其是靜脈內輸注，或直接投予該靶組織）以及包括載體的配製物的類型和治療有效量； •   該藥物伴護蛋白（麥格司他）和該重組人酸性α-葡萄糖苷酶的劑量間隔； •   治療反應的性質和聯合治療的結果（例如，如與單獨進行的每種治療的效果相比，增強的結果）； •   聯合治療的投予時間，例如，將麥格司他和該重組人酸性α-葡萄糖苷酶同時投予或順序投予，例如其中將麥格司他在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶之前或在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶之後或在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予之前或之後某一時間內投予；以及 •   所治療的患者的性質（例如，哺乳動物，例如人）以及個體所患有的病症（例如，酶不足）。

可以將以上清單中的任何實施例與清單中的一個或多個其他實施例進行組合。 實例

本發明的其他特徵將從以下非限制性實例中變得明顯，該等實例藉由舉例說明本發明的原理。 實例 1 ：現有 Myozyme® 和 Lumizyme® rhGAA 產品的局限

為了評估rhGAA在Myozyme®和Lumizyme®（目前僅有的針對龐貝氏病的批准的治療）中的能力，將該等rhGAA製劑注射到CIMPR柱（其結合具有M6P基團的rhGAA）上，並且隨後用遊離M6梯度進行洗提。將級分在96孔板中收集，並且藉由4MU-α-葡萄糖受質測定GAA活性。結合和未結合的rhGAA的相對量係基於GAA活性來確定的，並且報告為總酶的分數。

圖4A至圖4B描述了與常規的ERT（Myozyme®和Lumizyme®）相關的問題：在Myozyme®中73%的rhGAA（圖4B）和在Lumizyme®中78%的rhGAA（圖4A）未結合至CIMPR，參見在每個圖中最左側的峰。只有在Myozyme®中27%的rhGAA和在Lumizyme®中的22%的rhGAA包含M6P，該M6P可以有效地將它靶向至肌細胞上的CIMPR。

Myozyme®和Lumizyme®的有效劑量對應於包含M6P的rhGAA的量，該M6P靶向肌細胞上的CIMPR。然而，在此類兩種常規的產品中大部分的rhGAA不靶向目標肌細胞上的CIMPR受體。投予常規rhGAA（其中大部分的rhGAA不靶向肌肉細胞）增加了對非靶向rhGAA的過敏反應或誘導免疫的風險。 實例 2 ：產生具有高含量的帶有單 -M6P 或雙 -M6P 的 N- 聚糖的 ATB-200 rhGAA 的 CHO 細胞的製備

用表現rhGAA的DNA轉染CHO細胞，隨後選擇產生rhGAA的轉化體。用於用編碼rhGAA的DNA轉化CHO細胞的DNA構建體在圖5中圖示。用表現rhGAA的DNA轉染CHO細胞，隨後選擇產生rhGAA的轉化體。

轉染後，用缺乏次黃嘌呤/胸苷（-HT）的介質來選擇包含穩定整合的GAA基因的DG44 CHO（DHFR-）細胞。

藉由胺甲喋呤處理（MTX，500 nM）來誘導在該等細胞中的GAA表現的擴增。藉由GAA酶活性測定來鑒定大量表現的GAA的細胞池，並且用於建立產生rhGAA的單個殖株。在半固體培養基板上產生單個殖株，藉由ClonePix系統挑選，並且轉移至24深孔板。針對GAA酶活性測定單個殖株，以鑒定表現高水平GAA的殖株。用於確定GAA活性的條件培養基使用了4-MU-α-葡萄糖苷酶受質。針對生存力、生長能力、GAA生產率、N-聚糖結構和穩定的蛋白表現來進一步評估如藉由GAA酶測定所量測的產生更高水平的GAA的殖株。使用此程序分離表現具有增強的單-M6P或雙-M6P N-聚糖的rhGAA的CHO細胞系，包括CHO細胞系GA-ATB-200。 實例 3 ： ATB200 rhGAA 的捕獲和純化

在搖瓶中產生根據本發明所述的多批次的rhGAA，並且在灌注生物反應器中使用CHO細胞系GA-ATB-200和CIMPR來量測結合。針對來自不同生產批次的經純化的ATB200 rhGAA，觀察到與在圖7B和圖8中所示彼等相似的CIMPR受體結合（約70%），表明可以一致地產生ATB200 rhGAA。如圖4A、圖4B、圖7A、和圖7B所示，Myozyme®和Lumizyme® rhGAA比ATB200 rhGAA表現出顯著更少的CIMPR結合。 實例 4 ： ATB200 與 Lumizyme® 的分析比較

根據末端磷酸根，使用弱陰離子交換（“WAX”）液相層析，進行ATB200 rhGAA的分級。藉由用增加量的鹽洗提ERT來產生洗提曲線。藉由UV（A280 nm）監測該曲線。從CHO細胞獲得ATB200 rhGAA，並且進行純化。Lumizyme®獲得自商業來源。Lumizyme®在其洗提曲線的左側顯示出一個高峰。ATB200 rhGAA顯示洗提在Lumizyme®右側的四個顯著的峰（圖9）。此證實ATB200 rhGAA被磷酸化到比Lumizyme®更大的程度，因為此種評估係藉由末端電荷而不是CIMPR親和力進行的。 實例 5 ： ATB200 rhGAA 的寡糖特性

藉由MALDI-TOF來評估經純化的ATB200 rhGAA和Lumizyme®聚糖，以確定在每個ERT上發現的單個聚糖結構（圖10）。發現ATB200樣品比Lumizyme®包含更少量的非-磷酸化的高-甘露糖型N-聚糖。ATB200中比Lumizyme®中更高含量的M6P聚糖更有效地將ATB200 rhGAA靶向肌細胞。由MALDI確定的高百分比的單-磷酸化和雙-磷酸化的結構與CIMPR曲線一致，其說明ATB200與CIMPR受體的顯著更大的結合。經由MALDI-TOF質譜的N-聚糖分析證實了平均每個ATB200分子包含至少一個中性的雙-M6P N-聚糖結構。ATB-200 rhGAA上的此種更高的雙-M6P N-聚糖含量與M6P受體板結合測定中與CIMPR的高親和力結合直接相關（KD約2-4 nM）（圖12A）。

亦使用兩種不同的LC-MS/MS分析技術，針對位點特異性N-聚糖曲線分析了ATB200 rhGAA。在第一次分析中，在LC-MS/MS分析之前，將該蛋白質變性、還原、烷基化並且消化。蛋白質變性和還原期間，將200 µg的蛋白質樣品、5 μL 1 mol/L tris-HCl（終濃度50 mM）、75 μL 8 mol/L胍HCl（終濃度6 M）、1 μL 0.5 mol/L EDTA（終濃度5 mM）、2 μL 1 mol/L DTT（終濃度20 mM）以及Milli-Q®水添加至1.5 mL試管中，以提供100 µL的總體積。在乾浴中，將該樣品混合，並且在56℃下培養30分鐘。烷基化作用期間，將該變性的和還原的蛋白質樣品與5 μL 1 mol/L碘乙醯胺（IAM，終濃度50 mM）混合，隨後在黑暗中在10℃-30℃下培養30分鐘。烷基化作用之後，將400 μL預冷的丙酮添加至該樣品中，並且將該混合物在-80℃製冷中冷凍4小時。隨後將該樣品以13000 rpm在4℃下離心5 min，並且去除該上清液。將400 μL預冷的丙酮添加至球粒中，隨後將其以13000 rpm在4℃下離心5 min，並且去除該上清液。隨後將該樣品在黑暗中，在冰上風乾以去除丙酮殘餘物。將40 μL的8 M尿素和160 μL的100 mM NH ₄HCO ₃添加至該樣品中以溶解蛋白質。隨後，在胰蛋白酶消化期間，添加50 μg的該蛋白質使胰蛋白酶消化緩衝液達100 μL終體積，並且添加5 μL 0.5 mg/mL胰蛋白酶（20/1 w/w的蛋白與酶的比率）。將該溶液混合均勻，並且在37℃下培養過夜（16 ± 2小時）。添加2.5 μL 20% TFA（終濃度0.5%）以淬滅該反應。隨後使用賽默科技Orbitrap Velos Pro ^TM質譜儀分析該樣品。

在第二LC-MS/MS分析中，根據相似的變性、還原、烷基化和消化程序來製備ATB200樣品（除了使用碘乙酸（IAA）代替IAM作為烷基化試劑之外），並且隨後使用賽默科技Orbitrap Fusion Lumos Tribid ^TM質譜儀進行分析。

將第一和第二分析的結果在圖11A至圖11I中圖示。在圖11A至圖11I中，第一次分析的結果由左條（深灰色）表示，並且來自第二次分析的結果由右條（淺灰色）表示。在圖11B至圖11H中，代表聚糖的符號命名法係根據瓦爾基A（Varki, A.），卡明斯，R.D.（Cummings, R.D.）,艾斯克J.D.（Esko J.D.）等人,糖生物學要領（Essentials of Glycobiology），第2版（2009）。

從圖8A至圖8I可以看出，該兩個分析提供了相似的結果，儘管結果之間存在一些變化。該變化可以歸因於多個因素，包括使用的儀器和N-聚糖分析的完整性。例如，若一些種類的磷酸化的聚糖未被鑒定和/或未被定量，則磷酸化聚糖的總數可能是未被充分表示的，並且在該位點帶有磷酸化的聚糖的rhGAA的百分比可能是未被充分表示的。作為另一個實例，若一些種類的非-磷酸化的聚糖未被鑒定和/或未被定量，則非-磷酸化的聚糖的總數可能是未被充分表示的，並且在該位點帶有磷酸化的聚糖的rhGAA的百分比可能是過度表示的。圖11A圖示了ATB200的N-糖基化位點佔有率。從圖11A可以看出，第一、第二、第三、第四、第五和第六N-糖基化位點大部分被佔據，其中該兩種分析偵測出超過90%且高達約100%的具有在每個潛在位點處偵測到的聚糖的ATB200酶。然而，該第七潛在的N-糖基化位點在大約一半的時間時被糖基化。

圖11B圖示了第一位點N84之N-糖基化圖。從圖11B可以看出，主要的聚糖種類係雙-M6P聚糖。第一和第二分析二者偵測出超過75%的該ATB200在第一位點處具有雙-M6P聚糖。

圖11C圖示了第二位點N177之N-糖基化圖。從圖11C可以看出，主要的聚糖種類係單-M6P聚糖和非磷酸化高甘露糖聚糖。第一和第二分析二者偵測出超過40%的該ATB200在第二位點處具有單-M6P聚糖。

圖11D圖示了第三位點N334之N-糖基化圖。從圖11D可以看出，主要的聚糖種類係非磷酸化的高甘露糖聚糖，二-、三-、和四-觸角複合聚糖，以及混合聚糖。第一和第二分析二者偵測出超過20%的該ATB200在第三位點處具有唾液酸殘基。

圖11E圖示了第四位點N414之N-糖基化圖。從圖11E可以看出，主要的聚糖種類係雙-M6P和單-MGP聚糖。第一和第二分析二者偵測出超過40%的該ATB200在在第四位點處具有雙-M6P聚糖。第一和第二分析二者偵測出超過25%的該ATB200在第四位點具有單-M6P聚糖。

圖11F圖示了第五位點N596之N-糖基化圖。從圖11F可以看出，主要的聚糖種類係海藻糖化的二-觸角複合聚糖。第一和第二分析二者偵測出超過70%的該ATB200在第五位點處具有唾液酸殘基。

圖11G圖示了第六位點N826之N-糖基化圖。從圖11G可以看出，主要的聚糖種類係二-、三-、和四-觸角複合聚糖。第一和第二分析二者偵測出超過80%的該ATB200在第六位點處具有唾液酸殘基。

在第七位點處，N869的糖基化分析圖示了大約40%的糖基化，最常見的聚糖係A4S3S3GF（12%）、A5S3G2F（10%）、A4S2G2F（8%）、和A6S3G3F（8%）。

圖11H圖示了在七個潛在的N-糖基化位點中的每個位點處的磷酸化作用的匯總。從圖11I可以看出，第一和第二分析二者偵測出在第一、第二、和第四位點處的高磷酸化作用水平。兩個分析偵測出超過80%的該ATB200在第一位點處係單-或二-磷酸化的，超過40%的該ATB200在第二位點處係單-磷酸化的，並且超過80%的該ATB200在第四位點出係單-或二-磷酸化的。

根據親水相互作用液相層析-螢光檢驗-質譜（HILIC-FLD-MS）法進行ATB200的另一個聚糖分析。

將HILIC-FLD-MS分析的結果提供於下表5中。在表5中，在三位數中的第一個數表明聚糖中的分支數目，第二個數表明核心海藻糖單元的數目，並且第三個數表明末端唾液酸單元的數目。使用該命名法，“303”代表三-觸角聚糖（該第一個3），其具有0個核心海藻糖（該第二個0）和3個末端唾液酸（該最後一個3）；“212”代表1個二-觸角聚糖，其具有1個核心海藻糖和2個末端唾液酸；“404”代表四-觸角聚糖，其具有0個核心海藻糖和4個末端唾液酸，以此類推。 表5

FLD 峰編號	MS 峰編號	RT （ min ）	聚糖結構	峰面積 %
1	1		雙P_Man 8	2.83%
2	2	13.41	雙P_Man 7	17.58%
	3	14.30	雙P_Man 6	1.02%
3	4	20.89	單P_Man 6	2.34%
4	5	21.65	單P_Man 5	1.16%
5	6	23.51	單P_Man 8	1.28%
6	7	24.33	單P_Man 7	4.35%
7	8	25.61	單P_Man 7 _(+)GlcNAc	0.50%
8	9	28.76	單P_hMan6_101	0.48%
9	10	30.54	單P_Man 6_(+)GlcNAc	0.68%
10	11	33.50	Man 6	3.97%
	12	33.65	303	0.74%
11	13	34.97	Man 7	0.20%
12	14	35.64	403	0.39%
13	15	36.61	302	0.36%
14	16	38.07	302	0.61%
15	17	38.53	Man 5	1.85%
16	18	39.57	302	0.48%
	19	39.78	hMan 5_101	0.42%
	20	40.05	hMan 5_100_(-)Gal	0.30%
17	21	40.77	301_(-)Gal	0.52%
	22	40.58	301	0.50%
18	23	41.47	300_(-)Gal	0.80%
19	24	42.17	301_(-)Gal	0.11%
	25	42.13	301	0.58%
20	26	42.89	301_(-)Gal	0.07%
	27	42.79	301	0.80%
21	28	43.41	300	0.85%
	29	43.28	101	0.39%
22	30	43.94	202	0.63%
23	31	44.45	401	0.39%
24	32	45.04	單P_hMan6_111	0.36%
25	33	45.69	單P_hMan6_111	1.45%
	34	45.90	100	0.23%
	35	45.90	400	0.19%
26	36	46.87	201	0.49%
	37	47.15	202	0.34%
27	38	48.19	414	0.37%
28	39	48.94	202	1.97%
29	40	50.79	單P_Man 6 _110_(-)Gal	1.31%
	41	51.37	414	0.62%
30	42	52.22	313	0.74%
	43	52.42	201_(-)Gal	0.46%
	44	52.42	201	1.18%
	45	53.11	hMan6_111	0.20%
31	46	53.83	200_(-)Gal	0.80%
	47	54.23	201	1.27%
	48	54.75	413	0.30%
32	49	55.47	200	1.30%
33	50	57.45，58.34	414_(+)GlcNAcGal	0.14%
	51	56.62，56.91，57.99	413	0.94%
	52	56.11，57.26，57.99	312	0.98%
34	53	60.19	413	0.33%
	54	59.39	413_(+)GlcNAcGal	0.42%
	55	59.80	312	0.52%
	56	59.49	412	0.18%
35	57	60.75	413	0.78%
	58	60.89	413_(+)GlcNAcGal	0.07%
36	59	61.79	413	0.20%
	60	61.75	312	0.16%
	61	62.12	412	0.64%
37	62	63.87	311	0.73%
	63	63.18，64.32	412	0.29%
	64	63.84	413_(+)GlcNAcGal	0.45%
	65	63.5，64.36	311_(-)Gal	0.42%
38	66	65.73，66.20	311	0.68%
	67	65.85，66.49	412	0.72%
	68	65.91	310_(-)Gal	0.28%
39	69	67.37	212	1.42%
	70	67.57	310	0.34%
40	71	68.67	412_(+)GlcNAcGal	0.24%
	72	68.36	412	0.53%
41	73	68.36	412_(+)GlcNAcGal	0.17%
	74	69.03	412	0.35%
	75	69.30	413_(+)2(GlcNAcGal)	0.16%
42	76	70.66	412_(+)GlcNAcGal	0.73%
43	77	71.74	211	1.09%
	78	71.23	211_(-)Gal	0.19%
44	79	72.46	212	3.66%
45	80	74.82	221_(-)Gal(+)GalNAc	0.38%
	81	74.43，74.96	411_(+)GlcNAcGal	0.66%
46	82	75.92	410	0.42%
47	83	76.73，77.87	211_(-)Gal	1.24%
	84	77.23	211	3.64%
48	85	79.05	211	1.52%
	86	79.38	210_(-)2Gal	0.45%
49	87	80.11	210_(-)Gal	1.58%
50	88	81.15	210	2.41%
51	89	84.22-87.15	311	1.26%
52	90	95.35	單_乙醯基_NANA_212	0.99%
53	91	96.23	單_乙醯基_NANA_211	0.76%
54	92	97.37	雙_乙醯基_NANA_212	0.42%

基於該HILIC-FLD-MS分析，預期所測試的ATB200具有平均2-3 mol的海藻糖含量/mol ATB200、20-25 mol的GlcNAc含量/mol ATB200、8-12 mol的半乳糖含量/mol ATB200、22-27 mol的甘露糖含量/mol ATB200、3-5 mol的M6P含量/mol ATB200、以及4-7 mol的唾液酸含量/mol ATB200。 實例 6 ： ATB200 的 CIMPR 親和力的特性

除了具有可以結合至CIMPR的更大百分比的rhGAA之外，重要的是理解該相互作用的質量。使用CIMPR板結合測定來確定Lumizyme®和ATB200 rhGAA受體結合。簡言之，使用CIMPR-包被的板來捕獲GAA。將不同濃度的rhGAA應用於固定的受體，並且洗去未結合的rhGAA。藉由GAA活性來確定剩餘rhGAA的量。如圖12A所示，ATB200 rhGAA比Lumizyme®結合CIMPR顯著更好。

圖12B圖示了根據本發明的Lumizyme®、常規rhGAA、和ATB200中的雙-M6P聚糖的相對含量。對於Lumizyme®，平均只有10%的分子具有雙-磷酸化的聚糖。將其與ATB-200（其中平均每個rhGAA分子具有至少一個雙-磷酸化的聚糖）對比。 實例 7 ： ATB200 rhGAA 比 Lumizyme 更有效地被成纖維細胞內化。

使用正常的和龐貝氏成纖維細胞細胞系來比較ATB200和Lumizyme® rhGAA的相對細胞攝取。比較涉及5-100 nM的根據本發明的ATB200 rhGAA與10-500 nM常規rhGAA Lumizyme®。16-hr培養之後，用TRIS鹼將外部rhGAA滅活，並且在收穫細胞之前用PBS將細胞洗滌3次。藉由4MU-α-葡萄糖苷水解量測內化的GAA，並且相對於總細胞的蛋白質作圖，並且結果出現在圖13A至圖13B中。

亦圖示ATB200 rhGAA有效內化到細胞中（圖13A和圖13B），分別地圖示ATB200 rhGAA內化到正常的成纖維細胞和龐貝氏成纖維細胞中，並且其比常規的Lumizyme® rhGAA更大的程度進行內化。ATB200 rhGAA以約20 nM使細胞受體飽和，然而需要約250 nM的Lumizyme®。從該等結果外推的攝取效率常數（K _攝取）對於ATB200為2-3 nm，並且對於Lumizyme®係56 nM，如圖13C所示。該等結果表明ATB200 rhGAA係針對龐貝氏病的良好靶向的治療。 實例 8 ：在 Gaa - 基因敲除小鼠中的肝醣減少

圖14A至圖14C圖示了投予阿葡萄糖苷酶α（Lumizyme®）和ATB200對Gaa基因敲除小鼠中肝醣清除的影響。投予動物兩次IV推注投予（每隔一週）；在最後一次劑量後兩週收穫組織，並且針對酸性α-葡萄糖苷酶活性和肝醣含量進行分析。

從圖14A至圖14C看出，發現ATB200以劑量依賴性方式在酸性α-葡萄糖苷酶（Gaa）基因敲除小鼠中耗盡組織肝醣。在 Gaa基因敲除小鼠中，20 mg/kg劑量的ATB200一致地去除了比5和10 mg/kg劑量水平更大比例的儲存的肝醣。然而，如在圖14A至14C看出，相比以20 mg/kg投予Lumizyme®，以5 mg/kg投予ATB200圖示小鼠心臟和骨骼肌（四頭肌和三頭肌）中相似的肝醣減少，然而相比Lumizyme®，以10 mg/kg和20 mg/kg給藥ATB200圖示在骨骼肌中顯著更好的肝醣水平減少。

圖15圖示投予阿葡萄糖苷酶α（Lumizyme®）和ATB200對 Gaa基因敲除小鼠中肝醣清除的影響，以及ATB200和麥格司他的共同投予對肝醣清除的影響。將12週齡GAA KO小鼠用Lumizyme®或ATB200治療，20 mg/kg 每隔一週IV注射4次；在如所示的rhGAA之前30分鐘，以10 mg/kg PO共同投予麥格司他。在最後一次酶劑量後14天收集組織用於肝醣量測。圖15圖示在四頭肌和三頭肌骨骼肌中的肝醣相對減少量，相比Lumizyme®，ATB200提供了更多的肝醣減少，並且ATB200/麥格司他提供了甚至更多的肝醣減少。 實例 9 ： Gaa - 基因敲除小鼠中的肌肉生理學和形態學

每隔一週以20 mg/kg向Gaa基因敲除小鼠投予兩次重組人酸性α-葡萄糖苷酶（阿葡萄糖苷酶α或ATB200）的IV推注。將麥格司他以10 mg/kg的劑量口服投予在投予ATB200之前30 min用ATB200處理的動物亞群。單獨用運載體治療對照小鼠。重組人酸性α-葡萄糖苷酶的最後一次給藥後兩週，收穫比目魚肌、四頭肌和隔膜組織。分析皮膚和隔膜組織，針對肝醣水平係藉由用高碘酸-希夫試劑（PAS）染色，並且針對溶酶體增殖係藉由量測溶酶體相關膜蛋白（LAMP1）標記物的水平，該標記物在在龐貝氏病中上調。將包埋入環氧樹脂（Epon）的四頭肌的半薄切片用亞甲基藍染色，並且藉由電子顯微鏡（1000x）觀察以確定囊泡存在的程度。用免疫組織化學來分析四頭肌肌肉樣品，以確定自噬標記物微管相關蛋白1A/1B-輕鏈3磷脂醯乙醇胺共軛物（LC3A II）和p62，胰島素依賴性葡萄糖轉運蛋白GLUT4和非胰島素依賴性葡萄糖轉運蛋白GLUT1。

在類似的研究中，每隔一週以20 mg/kg向Gaa基因敲除小鼠投予四次重組人酸性α-葡萄糖苷酶（阿葡萄糖苷酶α或ATB200）的IV推注。將麥格司他以10 mg/kg的劑量口服投予在投予ATB200之前30 min用ATB200處理的動物亞群。單獨用運載體治療對照小鼠。在重組人酸性α-葡萄糖苷酶最後一次給藥後兩週收穫心肌組織，並且進行分析，針對肝醣水平係藉由用高碘酸-希夫試劑（PAS）染色，並且針對溶酶體增殖係藉由量測LAMP1的水平。

如圖16所示，與用阿葡萄糖苷酶α的常規治療相比，ATB200的投予圖示在心臟、隔膜和骨骼肌（比目魚肌）組織中的溶酶體增殖減少，並且麥格司他與ATB200的共同投予圖示溶酶體增殖的顯著進一步減少，接近在野生型（WT）小鼠中所見的水平。此外，如圖17所示，與用阿葡萄糖苷酶α的常規治療相比，ATB200的投予圖示在心臟和骨骼肌（比目魚肌）組織中的肝醣水平的點狀降低，並且麥格司他與ATB200的共同投予圖示顯著進一步降低，再次接近在野生型（WT）小鼠中所見的水平。

同樣地，如圖18所示，與未處理的小鼠和用阿葡萄糖苷酶α處理的小鼠相比，麥格司他與ATB200的共同投予顯著減少了Gaa基因敲除小鼠的四頭肌肌纖維中的囊泡數目。如圖19所示，與野生型小鼠相比，在Gaa基因敲除小鼠中LC3 II和p62的水平均增加，但是在用ATB200和麥格司他處理時顯著降低，表明與酸性α-葡萄糖苷酶缺陷相關的自噬增加在ATB200和麥格司他的共同投予時減少。另外，相比於野生型小鼠，在Gaa基因敲除小鼠中，胰島素依賴性葡萄糖轉運體GLUT4和非胰島素依賴性葡萄糖轉運體GLUT1的水平增加，但是同樣，在用ATB200和麥格司他處理時顯著減少。與酸性α-葡萄糖苷酶缺乏相關的升高的GLUT4和GLUT1水平可以有助於增加的葡萄糖攝取到肌纖維中和增加的基礎的和食物攝取後的肝醣合成。因此，在龐貝氏病的小鼠模型中已經發現用ATB200和麥格司他的聯合治療改善骨骼肌形態和生理。 實例 10 ：在 Gaa - 基因敲除小鼠中的肌肉功能

在12次每兩週投予的長期研究中，如藉由握力測試和線懸掛測試（圖21A-21B）所量測的，20 mg/kg ATB200加上10 mg/kg麥格司他從基線逐漸地增加了 GaaKO小鼠的功能性肌肉力量。在大部分的研究中，在相同的條件下，觀察到接受相同ERT劑量（20 mg/kg）的阿葡萄糖苷酶α（Lumizyme®）治療的小鼠下降（圖21A至圖21B）。至於短期研究，在3個月（圖22A-22C）和6個月（圖22D-22G）的治療後，ATB200/麥格司他比阿葡萄糖苷酶α具有實質更好的肝醣清除率。相比阿葡萄糖苷酶α，在3個月治療後，ATB200/麥格司他亦減少了自噬和LAMP1和戴斯富林蛋白（dysferlin）的細胞內積累（圖23）。在圖21A中， ^*表示相比單獨Lumizyme®有統計學意義（p ＜ 0.05，兩側t檢驗）。在圖22A-22G中，*表示相比於單獨Lumizyme®有統計學意義（p ＜ 0.05，在單向方差分析下使用鄧尼特（Dunnett）方法的多重比較）。

總之，該等資料表明ATB200/麥格司他有效地靶向肌肉來逆轉細胞功能障礙並且改善肌肉功能。重要的是，在肌肉構造中的明顯改善以及減少的自噬和LAMP1和戴斯富林蛋白的細胞內積累可以是與功能性肌肉力量改善相關的改善的肌肉生理學的良好替代。該等結果表明，監測自噬和該等關鍵的肌肉蛋白可以是評估 GaaKO小鼠中龐貝氏病的有效性治療性治療的合理、實用的方法，其可以證明係來自臨床研究中肌肉活檢的有用的生物標記物。

圖23圖示在有或沒有麥格司他的情況下，6個月的ATB200投予降低了 GaaKo小鼠中抗肌萎縮蛋白的細胞內積累。與用Lumizyme®相比，ATB200 ± 麥格司他的抗肌萎縮蛋白積累減少更多。 實例 11 ： rhα-Gal A 的捕獲

使用AEX層析（圖20A）在產物捕獲前，並且使用AEX層析在產物捕獲後（圖20B），量測消耗的細胞培養基中重組人α-半乳糖苷酶A（rhα-Gal A）的CIMPR結合譜。在兩種圖中的虛線係指M6P洗提梯度。在AEX產物捕獲之前，80%的rhα-Gal A能夠結合CIMPR。AEX產物捕獲後，該總rhα-Gal A結合增加至96%。 實例 12 ：在患有龐貝氏病的經歷過 ERT 的以及初次接受 ERT 的患者中，與麥格司他共同投予的重組酸性 α- 葡萄糖苷酶 ATB200 的藥物代謝動力學和安全性資料

設計本研究主要評估與麥格司他共同投予的ATB200的安全性、耐受性、和藥物代謝動力學（PK）。來自Gaa基因敲除小鼠的PK/藥效（PD）翻譯模型預測出，在人體中ATB200 20 mg/kg與高劑量（例如，260 mg）的麥格司他的組合會提供最佳的肝醣減少。

在以下描述中，“高劑量”的麥格司他係指約260 mg的劑量且“低劑量”的麥格司他係指約130 mg的劑量。

目的是評估該1/2期研究中來自10名患者的初步總GAA蛋白、ATB200和麥格司他PK資料，以及安全性標記物。

此係一個開放標記、固定順序、遞增劑量、第一次在人類中研究的、1/2期研究，以在患有龐貝氏病的成年人中評估ATB200的靜脈內輸注與口服麥格司他共同投予的安全性、耐受性、PK、PD、以及效力（圖24）。評價來自在訪問9中前8個群組1的患者和前2個群組3患者的平均總GAA蛋白質和麥格司他PK結果。 ^a在群組2和3中給藥之前，將來自群組1的2名哨兵患者的安全性資料在每個劑量水平下進行評估。 ^b在階段2和3期間，在ATB200靜脈內輸注開始之前，口服投予麥格司他。對於所有的劑量，將ATB200靜脈內輸注持續4小時。 ^c在群組2和3中，前2名患者充當他們各自群組的哨兵患者。 主要入選標準： •   被診斷患有龐貝氏病的18-65歲的男性和女性係基於記錄的GAA酶活性的缺乏或藉由GAA基因分型 •   在試驗開始（群組1）之前，接受用阿葡萄糖苷酶α進行的ERT持續2-6年（或對於群組2 ≥ 2年） •   目前以每隔一週的頻率接受阿葡萄糖苷酶α，並且完成最後2次輸注，同時沒有導致劑量中斷的藥物相關的不良事件（群組1和2） •   在6分鐘步行測試中，必須能夠行走介於200和500米之間（群組1和3） •   直立的用力肺活量必須是預測的正常值的30%-80%（群組1和3） •   必須是坐輪椅的並且不能無輔助地行走（群組2） PK分析： •   收集血漿總GAA蛋白質和活性濃度的血液樣品 •   階段1：在ATB200輸注開始之前和輸注開始後1、2、3、3.5、4、4.5、5、6、8、10、12和24小時 •   階段2和3：麥格司他口服投予後1、2、3、4、4.5、5、6、7、9、11、13、和25小時 •   在麥格司他口服投予（時間0）之前立即並且在麥格司他口服投予後1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、9、11、和25小時，針對血漿麥格司他濃度對血液樣品進行取樣。藉由經驗證的LC-MS/MS測定來確定血漿麥格司他 •   藉由一個或多個rhGAA-特異性“簽名”肽的經驗證的LC-MS/MS定量來確定血漿中針對ATB200 5 mg/kg、10 mg/kg、和20 mg/kg的總GAA蛋白質濃度。

在完成了階段1和2的群組1的8名患者中以及開始階段3的群組3的2名患者中完成了初步分析。 •   初始ERT轉換的患者係龐貝氏病群體的代表，接受ERT平均5.02年（表6） 表6：基線特徵

^an = 在間歇期資料分析中來自群組1的10名（非臥床的ERT轉換）；n = 來自群組3的2名（初次）。 總GAA蛋白

當單獨投予時，ATB200以略微高於劑量比例的方式增加（表7和圖25A-25D）。變異似乎隨著麥格司他劑量而增加（圖25C）。相對於20 mg/kg的單獨的ATB200，20 mg/kg的ATB200與高劑量的麥格司他（260 mg）的共同投予增加了總GAA蛋白質暴露（AUC）大約25%。分佈半衰期（α-期）增加了45%，表明高劑量的麥格司他穩定血漿中的ATB200。從達到最大血漿濃度至劑量後大約12小時的時間，分佈半衰期的增加伴隨著AUC的增加。在末端消除期期間，AUC和半衰期的增加可以在對數標度上觀察到（圖25B）。ATB200表明了相對高的分配容積。血漿總GAA蛋白質的分佈在初次接受ERT（群組3）以及經歷過ERT的患者（群組1）之間看起來相似（圖25A和圖25D）。 表7：總GAA蛋白

麥格司他PK

麥格司他表明劑量比例的動力學（表8和圖26）。血漿麥格司他在單個劑量和多個劑量之間看起來相似。 表8：麥格司他PK匯總

藥效學

在來自群組1的經歷過ERT的患者中的第11次隨訪（圖27A和27B）： •   在8名患者中5名丙胺酸胺基轉移酶（ALT）減少；4/4患者具有提高的標準化基線水平 •   在8名患者中6名天冬胺酸轉胺酶（AST）減少；3/4患者具有提高的標準化基線水平 •   在8名患者中6名肌酸磷酸激酶（CPK）減少；2/6患者具有提高的標準化基線水平 •   在8名患者中8名尿糖四糖（HEX4）水平減少

在第4週，在初次接受治療的群組（群組3）的2名患者中所有4種生物標記物水平下降（圖27C和27D）。

在圖27A-27D中，資料被表示為平均值±標準誤。

安全性 •   在所有患者中155+ 總輸注後，沒有報告嚴重的不良事件（AE）或輸注相關的反應 •   在11/13（84%）患者中報告的治療突發性AE通常是輕度和短暫的。 •   在7/13（53%）患者中報告的治療相關的AE：噁心（n = 1）、疲勞（n = 1）、頭痛（n = 1）、震顫（n = 2）、痤瘡（n = 1）、心動過速（n = 1）、和低血壓（n = 1）。

結論 •   單獨的和與麥格司他組合的ATB200係安全的，並且耐受良好，迄今沒有輸注相關的反應。 •   在暴露態樣，單獨ATB200圖示暴露高於劑量比例的增加，該暴露進一步用麥格司他增強，表明伴護蛋白對ATB200的穩定效果。 •   從標準護理轉換至ATB200/麥格司他後，患者通常圖示在肌肉損傷的生物標記物態樣的改善，同時許多的患者在第18週證明正常化。 •   用ATB200/麥格司他治療的初始的2名初次接受試驗治療的患者表明肌損傷的所有生物標記物的穩定下降。

本文所描述的該實施例意欲說明本組成物和方法，而並不意欲限制本發明的範疇。意欲包括與作為整體的描述一致的並且對於熟習該項技術者而言容易理解的不同修改和改變。所附申請專利範圍不應受實例中所圖示的特定實施例的限制，但是應當被投予與作為整體的描述一致的最寬泛的解釋。

貫穿本申請，引用了專利、專利申請、出版物、產品描述、基因庫登錄號、和實驗方案，出於所有目的，將其揭露內容以其整體藉由引用方式併入本文。

600:方法 601:生物反應器 603:過濾系統 605:蛋白質捕獲系統 607:病毒殺滅步驟 609:第二層析系統 611:病毒殺滅步驟 613:第三層析系統 615:過濾系統 617:產物調節步驟21:基板

從以下書面描述和附圖中，本發明的其他特徵將變得明顯，其中：

圖1A圖示非磷酸化高甘露糖聚糖、單-M6P聚糖、和雙-M6P聚糖。

圖1B圖示M6P基團的化學結構。

圖2A描述了rhGAA經由帶有M6P的聚糖對靶組織（例如，患有龐貝氏病的受試者的肌肉組織）的生產性靶向。

圖2B描述了對非靶組織（例如，肝臟和脾）或藉由非M6P聚糖與非靶組織的結合的非生產性藥物清除。

圖3A圖示了CIMPR受體（又稱IGF2受體）和該受體的結構域。

圖3B係一表，該表顯示了帶有雙-和單-M6P的聚糖對CIMPR的結合親和力（奈莫耳）、高甘露糖型聚糖與甘露糖受體的結合親和力、以及脫唾液酸化複合物聚糖對去唾液酸糖蛋白受體的結合親和力。具有帶有單-M6P和雙-M6P的聚糖的RhGAA可以生產性地結合至肌肉上的CIMPR。

圖4A和圖4B分別是圖示Lumizyme®和Myozyme®的CIMPR親和層析的結果的圖。虛線係指M6P洗提梯度。用M6P洗提替代經由包含M6P的聚糖結合到CIMPR的GAA分子。如在圖2A中所示，Lumizyme®中78%的GAA活性在添加M6P前被洗提。圖2B圖示73%的GAA Myozyme®活性在M6P添加前被洗提。在Lumizyme®或Myozyme®中只有22%或27%的rhGAA，分別用M6P洗提。該等圖圖示，在該兩種常規rhGAA產品中大多數rhGAA缺乏具有在靶肌肉組織中靶向CIMPR所需M6P的聚糖。

圖5圖示了用於用編碼rhGAA的DNA轉化CHO細胞的DNA構建體。用編碼rhGAA的DNA構建體轉化CHO細胞。

圖6係用於製造、捕獲、和純化重組溶酶體蛋白的示例性方法之示意圖。

圖7A和圖7B分別是圖示Myozyme®和ATB200 rhGAA的CIMPR親和層析的結果之圖。從圖7B可以看出，在ATB200 rhGAA中約70%的rhGAA包含M6P。

圖8係圖示在陰離子交換（AEX）柱上被捕獲和不被捕獲的ATB200 rhGAA的CIMPR親和層析的結果之圖。

圖9係圖示Lumizyme®和ATB200 rhGAA的波利韋克斯（Polywax）洗提曲線之圖。

圖10係圖示相比鑒定為BP-rhGAA、ATB200-1、和ATB200-2的ATB200 rhGAA的三種不同的製劑，Lumizyme®的N-聚糖結構的概述之表。

圖11A至圖11H圖示了ATB200 rhGAA的位點特異性N-糖基化分析之結果。

圖12A係比較ATB200 rhGAA的CIMPR結合親和力（左軌跡線）與Lumizyme®的CIMPR結合親和力（右軌跡線）之圖。

圖12B係比較Lumizyme®和ATB200 rhGAA的雙-M6P含量之表。

圖13A係在不同GAA濃度下，比較在正常成纖維細胞內的ATB200 rhGAA活性（左軌跡線）與Lumizyme® rhGAA活性（右軌跡線）之圖。

圖13B係在不同GAA濃度下，比較來自患有龐貝氏病的受試者的成纖維細胞中的ATB200 rhGAA活性（左軌跡線）與Lumizyme® rhGAA活性（右軌跡線）之表。

圖13C係比較來自正常受試者和患有龐貝氏病的受試者的成纖維細胞的K _攝取之表。

圖14A係圖示與運載體（陰性對照），與20 mg/ml的阿葡萄糖苷酶α（Lumizyme®），或與5 mg/kg、10 mg/kg、或20 mg/kg的ATB200接觸後，相對於在小鼠心肌中的重組人酸性α-葡萄糖苷酶的劑量的肝醣量之圖。

圖14B係圖示與運載體（陰性對照），與20 mg/ml阿葡萄糖苷酶α（Lumizyme®），或與5 mg/kg、10 mg/kg、或20 mg/kg ATB200接觸後，相對於在小鼠四頭肌中的重組人酸性α-葡萄糖苷酶的劑量的肝醣量的圖。

圖14C係圖示與運載體（陰性對照），與20 mg/ml阿葡萄糖苷酶α（Lumizyme®），或與5 mg/kg、10 mg/kg、或20 mg/kg ATB200接觸後，相對於在小鼠三頭肌中的重組人酸性α-葡萄糖苷酶的劑量的肝醣量之圖。

圖15係圖示ATB200 rhGAA和伴護蛋白麥格司他（miglustat）的組合在GAA基因敲除小鼠中比用不具有麥格司他伴護蛋白的Lumizyme®或TB200 rhGAA的治療提供顯著更好的肝醣清除之表。

圖16係來自在麥格司他存在和不存在的情況下，用運載體、阿葡萄糖苷酶α、和ATB200治療的野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的心臟、隔膜和比目魚肌的一系列電子顯微圖，圖示溶酶體相關膜蛋白（LAMP-1）水平。

圖17係來自在麥格司他存在和不存在的情況下，用運載體、阿葡萄糖苷酶α、和ATB200治療的野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的心臟和比目魚肌的一系列電子顯微圖，圖示用過碘酸-希夫（Schiff）試劑（PAS）染色之肝醣水平。

圖18係來自在麥格司他存在和不存在的情況下，用運載體、阿葡萄糖苷酶α、和ATB200治療的野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的四頭肌的一系列電子顯微圖（1000x），用亞甲藍染色來顯示囊泡（用箭頭指示）。

圖19係來自在麥格司他存在和不存在的情況下，用運載體、阿葡萄糖苷酶α、和ATB200治療的野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的四頭肌的一系列電子顯微圖（40x），圖示自噬標記物微管相關蛋白質1A/1B-輕鏈3磷脂醯乙醇胺共軛物（LC3A II）和p62，胰島素依賴性葡萄糖轉運體GLUT4和非胰島素依賴性葡萄糖轉運體GLUT1之水平。

圖20A和圖20B分別地是圖示在在陰離子交換（AEX）柱上捕獲和純化之前和之後，重組α-半乳糖苷酶A（rhα-Gal A）酶的CIMPR親和層析的結果之圖。

圖21A和圖21B係圖示在麥格司他存在的情況下，用運載體、阿葡萄糖苷酶α、和ATB200治療的野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的線懸掛和握力肌資料之圖。

圖22A至圖22G係圖示來自在麥格司他存在和不存在的情況下，用運載體、阿葡萄糖苷酶α、和ATB200治療的野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的四頭肌、三頭肌和心臟細胞中的肝醣水平的圖。

圖23係來自在麥格司他存在和不存在的情況下，用運載體、阿葡萄糖苷酶α、和ATB200治療的野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的股外側肌（VL）的肌纖維的一系列顯微照片（100x和200x），圖示抗肌萎縮蛋白信號。

圖24圖示一個開放標記、固定順序、遞增劑量、第一次在人類中研究的、1/2期研究的研究設計，以在患有龐貝氏病的成年人中評估安全性、耐受性、PK、PD、以及ATB200的靜脈內輸注與口服麥格司他共同投予之效力。

圖25A至圖25B係圖示在給藥5、10、或20 mg/kg ATB200，20 mg/kg ATB200和130 mg麥格司他，或20 mg/kg ATB200和260 mg麥格司他後，在人類受試者血漿中的GAA總蛋白的濃度-時間曲線之圖。

圖25C係圖示在給藥20 mg/kg ATB200，20 mg/kg ATB200和130 mg麥格司他，或20 mg/kg ATB200和260 mg麥格司他後，在人類受試者血漿中的GAA總蛋白的AUC之圖。

圖25D係圖示在給藥20 mg/kg ATB200和260 mg麥格司他後，在兩名個體人類受試者血漿中的GAA總蛋白的濃度-時間曲線之圖。

圖26係圖示在給藥130 mg或260 mg麥格司他後，在人類受試者血漿中的麥格司他的濃度-時間曲線之圖。

圖27A至圖27D係圖示在投予遞增劑量的ATB200（5、10、和20 mg/kg），隨後共同投予ATB200（20 mg/kg）和麥格司他（130 mg和260 mg）後，在人類患者中的丙胺酸胺基轉移酶（ALT）、天冬胺酸轉胺酶（AST）、肌酸磷酸激酶（CPK）和己糖四糖（Hex4）水平的變化之圖。

國內寄存資訊(請依寄存機構、日期、號碼順序註記) 無 國外寄存資訊(請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 無

600:方法

601:生物反應器

603:過濾系統

605:蛋白質捕獲系統

607:病毒殺滅步驟

609:第二層析系統

611:病毒殺滅步驟

613:第三層析系統

615:過濾系統

617:產物調節步驟

Claims (1)

1. 一種用於製造重組人溶酶體蛋白的方法，該方法包括： 在一生物反應器中培養宿主細胞，該等宿主細胞分泌重組人溶酶體蛋白； 從該生物反應器去除介質； 將該介質過濾以提供濾液； 將該濾液載入到一陰離子交換層析（AEX）柱上，以捕獲該溶酶體蛋白；以及 從該AEX柱上洗提一第一蛋白產物。

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