CN1091747A - 制备溶性葡聚糖的改良方法 - Google Patents

Abstract

本文描述高效快速的制备溶性葡聚糖的方法。

Description

本发明涉及改良的，高效的制备溶性葡聚糖的方法。本发明有利地避免了使用高极性溶剂如二甲亚砜（DMSO）。本发明方法制备的溶性葡聚糖无毒性，且当体内给药时产生显著的免疫生物反应，最明显的免疫刺激巨噬细胞活性和刺激血生成骨髓活性。该溶性葡聚糖还显示很有效的抗恶性瘤（包括黑素瘤和肉瘤）的作用。

术语“葡聚糖”通常是指各种天然产生的血多糖或聚葡萄糖，包括聚合物如纤维素，直链淀粉，糖原，昆布多糖，淀粉，等等。葡聚糖包含支链和非支链的由1-3，1-4，和1-6糖苷键连接的葡萄糖单元，糖苷键可以是α和β型。

如本文中所定义的，“颗粒葡聚糖”是指水不溶性颗粒（约1-3μ）聚葡萄糖如由酵母saccharomyces  cerevisiae的细胞壁衍生的。颗粒葡聚糖为大分子且包含由一系列β-1-3糖苷链组成的闭链吡喃葡萄糖单元（Hassid  et  al，1941，J，Amer，chem，Soc63：295-298;DiLuzio  et  al，1979，Int'l  J  Cancer  24：773-779）。X射线衍射研究说明颗粒葡聚糖以三股螺旋形式存在。（Sarko  etal，1983，Biochem，Soc，Trans.11：139-142）。

颗粒葡聚糖为巨噬细胞/单细胞系列，补体，以及T和B细胞淋巴细胞的强激活剂。因此，颗粒葡聚糖对网状内皮组织和免疫系统具有深切的影响。颗粒葡聚糖已显示广泛调节宿主对各种传染疾病的抗性（参见DiLuzio的综述，1983，Trends  in  Pharmacol.Sci，4：344-347和本文中引用的参考文献）。此外，颗粒葡聚糖已显示抑制肿瘤生长，且延长同基因鼠肿瘤模式的存活时间（DiLuzio  et  al，1979，Advances  in  Exp.Med  Biol  121A：269-290）。采用葡聚糖培养正常细胞和肿瘤细胞的体外研究证实：葡聚糖对肉瘤和黑素瘤细胞产生抑制细胞作用，而对正常脾和骨髓细胞则促进繁殖作用（Williams  et  al.1985，Hepatology  5：198-206）。

虽然颗粒葡聚糖具有有益的生物属性，但颗粒葡聚糖不利的副作用使其在临床医疗上几乎无所作为。

当颗粒葡聚糖对动物体内给药时，显出许多副作用，最突出的是：（1）形成肉芽瘤（结节病）;（2）造成肝脾肿大;（3）增加对格兰氏阴性感染和内毒素的敏感性;（4）激活补体（过敏毒素）;（5）造成肺肉芽瘤血管炎;（6）静脉给药后造成低血压;和（7）当以高浓度给药时造成微栓塞。

此外，当颗粒葡聚糖体内给药时，观察到相当高度的急性毒性。例如，一剂颗粒葡聚糖水悬液静脉注射之后，观察到经250和500mg/kg体重的剂量接受葡聚糖的小鼠中，死亡率分别为20%和100%。

再则，由于葡聚糖制剂的颗粒性质（1-3μ），难以通过静脉途径给药。还需说明一点，接受颗粒葡聚糖的患者在静脉（Ⅳ）施药期间需要时刻监护，不断摇晃Ⅳ点滴瓶，保持颗粒葡聚糖呈悬浮状以避免在病人体内形成栓子。

虽然市场上可以得到微溶性的中性葡聚糖，但由于这些制剂的水溶液具有很高的粘度且，更重要的是，由于当其使用在试验动物时不可避免地随之带来相当的毒性，因此，不适于静脉给药。

鉴于颗粒β-1，3葡聚糖体内施药的不利因素，业已做了大量的研究工作以开发可以是无毒的，不明显致病的，且仍保留明显的免疫生物活性的溶性β-1，3聚葡萄糖。

用甲酸水解颗粒葡聚糖制备的低分子量非磷酸化溶性葡聚糖制剂已显示具有抗肿瘤和抗葡萄球菌活性（DiLuzio  et  al，1979，Internat'l  J.Cancer  24：773-779）。不幸的是，该方法的低产率和所得馏分的复杂性使得该制剂不能用于预防和治疗中（参见DiLuzio，1983，Trends  in  Pharmacological  sciences  4：344-347）。

同样，添加二甲亚砜（DMSO）-一种“分子松驰剂”来溶解颗粒葡聚糖的尝试也不成功。人们认为DMSO会“松驰”葡聚糖分子的三螺旋构型，的确，颗粒葡聚糖在DMSO存在时溶解。但所有将溶性葡聚糖从DMSO溶液中分离的尝试都以失败告终，用各种水溶液介质如葡萄糖或盐水溶液稀释DMSO-葡聚糖溶液之后，颗粒葡萄糖会再形成。用盐水稀释DMSO-溶解的葡聚糖溶液之后，所有的接受这些溶液注射的动物注射之后即刻死亡，原因是高浓度的DMSO或是颗粒葡聚糖再形成而至。添加乙醇（100%）沉淀DMSO溶液中的葡聚糖之后，收集沉淀物并冻干，当将此冻干的葡聚糖加入水中时，该颗粒葡聚糖便再形成。

先前的通过加入磷酸基团或硫酸基团，以及通过乙酰化作用将颗粒葡聚糖的中性葡聚糖制剂转化成极性带电制剂的尝试也未成功。这些方法的每种都是用DMSO来溶解颗粒葡聚糖之后进行的，而在每一种情况下颗粒葡聚糖都再形成。

使用下列简述的方法，通过磷酸水解，成功地将颗粒葡聚糖的中性制剂转化称之为“溶性磷酸化葡聚糖”（下文称作“磷酸葡聚糖”）的稳定溶解形式。如本文定义的，术语“磷酸葡聚糖”或“溶性磷酸化葡聚糖”是指一类由加入带电的磷酸基团，通过与磷酸反应而溶解的葡聚糖。它们相同于或基本上相似于描述在美国专利US  4，739，046;4，761，402;4，818，752和4，833，131中的那些物质。该溶性磷酸化葡聚原为无毒，非免疫糖，和基本上无热原的（参见美国专利US  4，739，046;4，761，402;4，818，752和4，833，131）。

根据美国专利US  4，739，046的方法，磷酸葡聚糖制备如下：将颗粒葡聚糖或聚葡萄糖-蛋白质复合物悬浮于高极性的非质子传递溶剂DMSO中。加入强离液序列高的试剂-脲。加热该混合物并伴随不断搅拌保持在50-150℃，同时缓慢加入磷酸。优选将反应保持在约100℃持续约3-12小时以增加生物活性产物的产率。分离产物并去除DMSO，脲，葡萄糖，和任何未反应的磷酸。在100℃反应约6小时后，产率固定在70-90%。

另一类型的溶性葡聚糖描述在未决专利申请07/649，527号中，这类葡聚糖中，聚吡喃葡萄糖链需要来自非含磷水解酸的带电基团。具带电基团的溶性葡聚糖，包括如硫酸基团或硝酸基团，当体内给药时也能发挥显著的免疫生物效应。这些溶性葡聚糖免疫刺激巨噬细胞活性，导致激活网状内皮组织和免疫系统中的免疫活性细胞。此外，这些溶性葡聚糖增强血生成骨髓活性。

根据专利申请流水号07/649，527的方法，溶性葡聚糖制备如下：将颗粒葡聚糖悬浮于DMSO和脲溶液中。将浓缩的混合物加热至约50-150℃，单独加入浓水解酸如硫酸或硝酸，或在DMSO存在下加入，并将反应物保持在约50-150℃，伴随搅拌。分离生物活性产物并去除DMSO，脲，葡萄糖和任何未反应的酸。在100℃保持6小时之后，单独使用水解酸，产率固定在约37.5%。当另混有DMSO的水解酸加入时，产率固定在约98%。

美国专利US4，707，471描述了水溶性胺化β-1-3键合D-葡聚糖组合物和制备此组合物的方法。根据该方法的一种实施方案，用90%的甲酸水解β-1-3-D葡聚糖，优选水解curdlan或昆布多糖。蒸发去除此酸，加入水并将混合物回流一小时。然后在sephadex  G-50柱上分离混合物并回收最高分子量馏份，并进一步反应如下：将水解的葡聚糖溶于含有溴的PH为7的水中并放置直至所有的溴被消耗掉（24-48小时）。将PH调至5.0，并用水渗析混合物并冻干。将氧化的葡聚糖加至乙酸铵或1，6-己二胺的用乙酸和氰基氢硼化钠一起调至PH7.0的水溶液中，并伴随搅拌放置7天。经渗析和冻干之后得胺化的葡聚糖。该方法的另一实施方案中，在乙酰化作用前，将水解的昆布多糖溶于DMSO，然后如上所述胺化。

Jamas的WO  91/03495描述了用“酸和碱处理的独特顺序”处理葡聚糖颗粒的方法制备中性葡聚糖聚合物的溶性制剂。将整个葡聚糖颗粒悬浮在20-100℃下的通常约PH1-5的酸溶液中，优选使用有机酸如乙酸或甲酸。去除酸不溶葡聚糖并将PH调至7-14。将淤浆再悬浮在热碱中，如4-120℃下的0.1-10N的NaOH或KOH。回收溶性葡聚糖并进一步纯化。

美国专利US3，883，505描述了使用脲，硫脲，胍和它们的N低级烷基衍生物浓热水溶液改善溶性差或水不溶的多糖如茯苓聚糖，explain，香茹糖等等的溶解度。

美国专利Nos  3，987，166和3，943，247分别描述了有关治疗动物肿瘤及预防和治疗细菌感染的内容。如所指出的，这些专利的葡聚糖粘度高且难于制备浓度高于0.5%的水溶液，完全不同于本方法制备的溶性磷酸化葡聚糖，该葡聚糖是非粘性的。

尽管有上述方法，仍需要探索高效快捷的获得可用作生物反应调节剂的生物活性溶性葡聚糖的方法，本发明方法满足此长期以来的愿望。

本发明提供一种制备水可溶葡聚糖的改进的高效的方法。本方法避免使用DMSO。

本发明的制备溶性葡聚糖的方法，包括以下步骤：

（a）将中性聚葡萄糖或聚葡萄糖蛋白质复合物与很强离液序列高的试剂混合并将此混合物研成细粉;

（b）将细粉混合物与强浓磷酸浓溶液反应形式溶性葡聚糖并从混合物中回收所得的溶性葡聚糖。

参照下列详细描述本发明特定的实施方案的实施例和附图会更全面地理解本发明。

图1（A-B）说明螺状旋管转变分析。葡聚糖（70KD）（△-△）作为线性对照。刚果红的氢氧化钠溶液（O-O）作为阴性对照，图1A为根据本发明制备的溶性磷酸化葡聚糖的螺状旋管转变分析。图1B为根据现有技术的方法制备的溶性磷酸化葡聚糖的螺状旋管转变分析。

图2（A-B）表明溶性磷酸化葡聚糖的¹³C-NMR谱。图2A显示根据现有技术制备的溶性磷酸化葡聚糖的NMR谱。图2B显示根据本发明制备的溶性磷酸化葡聚糖的NMR谱。

制备溶性葡聚糖的方法

根据本发明的方法，从各种微生物来源的中性聚葡萄糖或聚葡萄糖-蛋白质复合物制备水溶性葡聚糖，方法如下：将中性聚葡萄糖或聚葡萄糖-蛋白质复合物与强离液序列高的试剂（如脲）混合，并将此干混合物彻底混合并研成细粉。任何形成细粉的研磨工具都适用，对于小量的分批制备，研钵和杵即可。具体是将约1-4gm中性聚葡萄糖或聚葡萄糖-蛋白质复合物与约10-20gm脲混合。加入约5-50ml浓磷酸（浓度约20-43%）形成淤浆并将反应混合物伴随搅拌加热至约60-80℃。将反应混合物保持约60-80℃1-6小时，直到包含溶性磷酸化葡聚糖的沉淀形成。加入约10ml蒸馏水再形成淤浆，并将反应混合物保持在约60-80℃，伴随搅拌。添加水并重复几次，优选三次，以保持淤浆状态并不断地加热。最好保持反应混合物在约60-80℃约1-2小时。具体说来，反应约2小时后，产率为约97%。反应期间，氨从脲中释放出来，并且加热开始后约1-2小时间氨气味最明显。

一种实施方案中，将1-4gm颗粒葡萄糖与10-20m脲和约20-25ml浓磷酸混合形成淤浆，淤浆的处理同上。

按如下方法将溶性磷酸化葡聚糖从反应混合物中分离：将混合物从热源上移出并溶于大量的蒸馏水以使沉淀物再悬浮。经粗、中、细三种烧结过滤器过滤所得的溶液，以去除任何存留的沉淀。然后经分子筛选该溶液去除所有小于10，000MW的成分。因此，任何脲，葡萄糖和未反应的磷酸都从溶液中去除。可以使用任何适合的本领域已知的分子筛选方法。例如：溶液的筛选可以使用spectrapor膜渗析管用流动的蒸馏水渗析。另一实施例中，溶液可使用Millipore渗析仪/带10，000道尔顿MW滤膜浓缩器和大量的渗析溶液筛选。

本发明方法比现有技术的制备溶性磷酸葡聚糖的方法更快捷更有效。溶解所需的时间从6小时降低到至2小时以下。新方法不需要如现有技术方法那样剧烈加热。

本方法中使用的制备溶性磷酸化葡糖的中性聚葡萄糖可以是由已知方法从S，cerevisiae的细胞壁分离出的颗粒葡聚糖（参见例如，DiLuzio  et  al，1979，Int'l  J  Cancer  224：773-779;Hassid  et  al，1941，J，Amer，chem，Soc63：295-298）。此外，可以从由各种微生物来源衍生物的中性聚葡萄糖或聚葡萄糖-蛋白质产物制备溶性磷酸化葡聚糖。美国专利US4，739，046（引入本文作为参考）的表1列出了未包罗完全的这些来源。

溶性葡聚糖产物及其用途。

根据本发明方法制备的水溶性葡聚糖产物用内表面环测试评价为无毒，无热源和非免疫源的。如下文实施例7中所显示的，采用本发明的改进方法制备的溶性磷酸化葡聚糖基本上与现有技术方法形成的组合物相同。

当体内给药时，本方法制备的溶性葡聚糖产生显著的免疫生物反应，更具体地说，因为它们具有作为生物反应调节剂的活性，本方法制得的产品可用于预防和治疗由各种微生物诱导的传染性疾病，所述的微生物包括（但不限于）细菌，病毒，真菌和原虫寄生物。此外，溶性葡聚糖可用于防止和/或治疗由于先天或获得性免疫缺陷造成免疫抑制的动物和人的机会性传染。

由于不能刺激巨噬细胞活性和繁殖，可单独或组合使用该溶性葡聚糖治疗肿瘤。

给药途径包括（但不限于）：口服，注射，包括（但不限于）静脉，腹膜内，皮下，肌内注射，和局部途径。可以水、水溶液或任何生理上可接受的载体组合施用该溶性葡聚糖。

下面给出的实施例系列旨在说明而非限定本发明的范围。

溶性磷酸化葡聚糖的制备

根据DiLuzio等1979年在Int'l  J  Cancer  24：773-779中所述的方法从Saccharomyces  cerevisiae制备颗粒葡聚糖。简而言之，采用6l烧瓶，将540gm干酵母（Universal  Foods  Corp，Milwaukee，WI）悬浮在3%氢氧化钠水溶液中，总体积为5l。将悬浮液置于沸水浴中4小时，冷却过夜并倾析上清液。将该过程重复三次。然后用5.75%盐酸酸化残留物至5l总体积并置于沸水浴中4小时。让悬浮液放置过夜并倾析上清液。在100℃再用3%盐酸消化残留物两次至5l总体积。用沸水洗涤残留物并多次倾析直到残留物成絮状物。向残留物加入1l乙醇，充分混合并让其最少放置24小时以最大量地提取。从残留物吸出暗红棕色的乙醇上清液并弃除。重复乙醇提取步骤直至乙醇上清液基本无色为止。用热水洗涤残留物四次去除乙醇，然后离心收集颗粒葡聚糖制备物，冷却并冻干。

根据本发明通过溶解和磷酸化颗粒葡聚溏制备溶性磷酸化葡聚糖，方法如下：

将18gm脲与1gm颗粒葡聚糖混合，并用杵在研钵中研制成精细研磨的粉状混合物。向该粉状混合物组合物缓慢加入25ml磷酸（43%）形成淤浆。将混合物加热至60-80℃并伴随搅拌保持此温度约1-2小时。形成沉淀，沉淀约1-1.5小时后变得可见，之后大量增加。向混合物中加入约10ml蒸馏水（Milli-Q水）并伴随搅拌继续加热。加入约10ml蒸馏水重复三次并继续加热1-2小时。然后将混合物从热源移出，冷却并用1l蒸馏水稀释来再悬浮沉淀物。用系列过滤过滤器混合物除去任何存留的沉淀物。

然后经分子筛选所得的含有溶性磷酸化葡聚糖的溶液以去除低分子量馏分，包括葡萄糖和脲。在一系列试验中，经粗（1-3μ），中（0.8μ，0.65μ）和细（0.45μ）三种烧结Millipore过滤器过滤混合物，去除沉淀。然后用Millipore渗析仪/带10，000MW滤膜的浓缩器（Millipore  Corp  Bedford  MA）分子筛选溶液。用24-100L蒸馏水（Milli-Q级水）渗析去除低分子量化合物。

分子筛选之后，将含有溶性磷酸化葡聚糖的溶液浓缩并冻干。该产率约97%。

本方法制备的溶性磷酸化葡聚糖的特征鉴定

为将使用上述详细描述的本发明方法制备的溶性磷酸化葡聚糖（称为非DMSO磷酸葡聚糖）和使用现有技术的方法，即美国专利NO.4，739，046制备的溶性磷酸化葡聚糖（称为磷酸葡聚糖）进行比较，进行了一系列试验。

基本成分

由Galbraith  Laboratories，knoxville，TN测定非DMSO磷酸葡聚糖的元素成分。此元素成分与磷酸葡聚糖的元素成分的比较示于表1中。

表1 溶性葡聚糖的化学成分

元素	磷酸葡聚糖摩尔％	磷酸葡聚糖（非DMSO)摩尔％
			碳氢氧磷	34.666.2942.832.23	32.726.3248.674.37

根据本发明制备的磷酸葡聚糖的元素成分基本上与现有技术的磷酸葡聚糖一致。如表1中所示，本发明产品即非DMSO磷酸葡聚糖与现有技术磷酸葡聚糖之间的唯一差别在于磷酸化程度不同。非DMSO磷酸葡聚糖大约每3个葡萄糖单元有一个磷酸取代基，而磷酸葡聚糖大约每7个葡萄糖单元有1个磷酸代基。

分子量分布

用水凝胶渗透色谱（GPC）确定2种葡聚糖的分子量（聚合物）分上。基本的GPC系统由Waters 600E溶剂输送系统，U6K手动注射器和柱加热室组成（Waters，chromatography Division，Millipore Corp，Milford MA）.流动相，0.05M亚硝酸钠，贮存在无菌贮存器中（Kontes，vineland，NJ），并在使用前用氦喷射和掩盖彻底脱气。流动相以0.5ml/min的流速输送。且排阻限为2×10⁶D，5×10⁵D和1.2×10⁵D的三个ultrahydrogel（Waters chromatographyDivision  Milford，MA）含水GPC柱与Ultrahydrogel防护柱串连。将柱保持在30℃。流速、柱温，和泵操作条件由Maxima820GPC软件（Dynamic  Solutions，Ventura  cA）控制。

该系统用窄谱支链淀粉标准物和葡聚糖标准物校准。分析时将葡聚糖以2-3mg/ml的浓度通过轻轻摇晃溶于流动相，直至完全水合（约2-3小时）。所有分析使用200ml注射体积。

采用配有K5流动池的Dawn-F MALLS光度计（Wyatt Technology Corp.Santa Barbara，cA）.通过联机多角激光光散射（MALLS）计光术确定葡聚糖的绝对分子量。绝对MW分布，分子量各要素（数均MW，Z-均MW，重均MW），峰值MW，多分散性和均方根（rms）半径矩用ASTRA软件（V.2.0）确定。采用0.146cm³/g的折光差示指数（dn/dc）。用来对柱校准的支链淀粉和葡聚糖标准物所报道的MWs显示与MALLS数据完全符合。

由联机的差示粘度测量计（d.v）确定聚合葡聚糖的特性粘度[η]，为确定[η]让柱洗脱液流经Viscotek  Model  200差示折射计/粘度计，并用Unical软件（Viscotek，porter，TX）分析数据。用该技术确定的标准物的分子量与MALLS数据完全符合。支链淀粉标准物的特性粘度被确认与先前的数据很符合。

无DMSO的磷酸葡聚糖的分子量平均值，多分散性和特性粘度示于表2中。为了比较，还列出根据美国专利4，739，046的方法制备的磷酸葡聚糖的类似数据。

表2  分子量特征

a  Mn代表：数均MW

Mw代表：重均MW

Mz代表：Z均MW

MwRMS半径：重均均方根半径（nm）

所有MW以g/mol表示，η代表特性粘度

b、该部分样品的RMS半径不能测定。

c、由于峰1聚合物的浓度低，该部分样品中的特性粘度不可能测定。

如表2中显示的，非DMSO磷酸葡聚糖的分子量特征与现有技术磷酸葡聚糖的惊人相似，事实上，基本一致。使用本文描述的技术，每种磷酸葡聚糖制剂出现二个峰。然而，两种制剂聚合物的绝大部分出现在峰＃2;两种制剂中，峰＃1只包括≤2%的总聚合物。表2中清楚可见，Mn，Mw，Mz与两种葡聚糖制剂中的峰＃2基本一致。上述Mn，Mw，Mz分别表示：低分子量聚合物比例，平均分子量，高分子量聚合物比例。此外，多分散性指数基本一致，这表明两种组合物具有相同的聚合物均一性。最后，如表2中所示，两种组合物的特性粘度实际上是一致的。

构象结构分析

使用Ogawa及其合作者的技术评价构象结构（Ogawa  and  Hata-na，1978.Carbohyd，Res.67：527-535;Ogawa  and  Tsurugi，1973，Carbohyd，Res29：397-403）。该技术测定在各种浓度的羟离子存在下与刚果红配合的聚合物溶液的最大吸收。例如，当氢氧化钠浓度增加时，由该溶液最大吸收的移动表明三螺旋化合物的存在。随着聚合物螺旋的松驰出现氢键破裂，且随后，刚果红与糖配合。

前面已经显示，有序（例如螺旋）构象对碳水化合物如葡聚糖与染料刚果红形成复合物是必需的。用各种浓度的NaOH（1mM至1000mM）制备刚果红水溶液。图1（A和B）中分别呈示非DMSO磷葡聚糖和磷酸葡聚糖的结果。

如图1（A和B）所示，葡聚糖磷酸物和非DMSO葡聚糖磷酸物两者的构象分析表明有序或三螺旋结构象。在两种情况下，观察到最大吸收在0.1至约0.4M氢氧化钠浓度中的移动。

核共振谱

使用Bruker 260 MHz NMR分光计（Bruker Instruments，Inc，Billerica MA）¹³C核磁共振谱（¹³C-NMR）分析以测定磷酸葡聚糖和非DMSO磷酸葡聚糖的链间键的性质。将溶性磷酸葡聚糖或非DMSO磷酸葡聚糖以50%的浓度溶于D₂O，条件如下：

场强：50MH;

驰豫：1秒;

脉冲窗：15°-20°;

扫描次数：磷酸葡聚糖694次;

非DMSO磷酸葡聚糖，14，900次。

结果示于图2（A-B）和表3中

表3 葡聚糖的¹³C-NMR的化学位移

碳原子C-1C-2C-3C-4aC-4bC-5aC-5bC-6

磷酸葡聚糖102.5873.2384.4568.2175.6660.81

磷酸葡聚糖非DMSO105.0275.8886.7670.7970.3778.2677.1563.40

＊化学位移：ppm

葡聚糖和非DMSO葡聚糖间的唯一差异是非DMSO磷酸葡聚糖显示峰C4^b和C5^b，这在磷酸葡聚糖中未出现。然而，显然该化合物显示的¹³C-NMR谱与β-1，3-键（colson，Carbohydrate Research 71：265，1979）一致。

本文中对本发明的描述和权利要求不为本文公开的特定实施方案限定其范围，因为这些实施方案旨在说明本发明几个方面。任何等同的实施方案都在本发明的范围内。的确，对于本领域熟练技术人员来说，由于前面的描述，除了本文所示和所描述的外，本发明的各种修改是显而易见的。这些修改已落入所附的权利要求的范围内。文中引述了许多参考文献，它们的公开内容全部引入本文作为参考。

Claims (7)

1、一种制备溶性磷酸葡聚糖的方法，包括：

(a)将中性聚葡萄糖或聚葡萄糖-蛋白质复合物与强离液序列高的试剂混合并将混合物研成细粉；

(b)将细粉与浓磷酸强溶液反应生成含溶性磷酸化葡聚糖的反应混合物；和

(c)从反应混合物中回收所得的溶性磷酸化葡聚糖。

2、根据权利要求1的方法，其中离液序列高的试剂包括脲。

3、根据权利要求1的方法，它进一步包括将步骤（b）的反应混合物加热到约60-80℃约1-6小时。

4、根据权利要求3的方法，其中将反应混合物加热到约60-80℃约1-2小时。

5、根据权利要求1的方法，其中将溶性磷酸化葡聚糖按如下步骤回收：

（a）让溶性磷酸化葡聚糖沉淀;

（b）加入充足量的水将沉淀的溶性磷酸化葡聚糖再悬浮;并

（c）去除所有的小于约10，000道尔顿分子量的成分。

6、根据权利要求1的方法，其中中性聚葡萄糖包括从微生物得到的颗粒葡聚糖。

7、根据权利要求6的方法，其中颗粒葡聚糖是从Saccharomy-ces  cerevisiae获得的。

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