CN109169269A - 一种香芋茎尖快繁脱毒的方法 - Google Patents

一种香芋茎尖快繁脱毒的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及蔬菜脱毒繁殖技术领域，具体是一种茎尖快繁脱毒的方法，包括以下步骤：(1)外植体的选择与消毒：选取健壮的匍匐茎或植株个体，将取得的材料种在混合基质中，用内吸性杀菌剂进行浇灌，10‑30天后取顶芽，用75％酒精处理10S,再用10％升汞处理20min，然后用无菌水冲洗3‑4次，在超净工作台上的解剖镜下进行顶芽剥离，选取顶芽的茎尖作为备用或者直接使用消毒后的顶芽备用；(2)培养基的筛选：采用MS培养基，添加细胞分裂素，植物生长激素和杀菌剂；本发明通过对外植体的灭菌、组培中分阶段培养基及激素的选择，建立一种香芋茎尖快繁脱毒的方法，为香芋脱毒组培苗工厂化生产提供理论依据和技术支持，进一步促进香芋产业的发展。

Description

一种香芋茎尖快繁脱毒的方法
技术领域
本发明涉及蔬菜脱毒繁殖技术领域，具体是一种茎尖快繁脱毒的方法。
背景技术
江永县是全国580个蔬菜产业重点县之一，香芋是久负盛名的传统出口特色蔬菜。香芋产业是江永县农业的优势产业，是农民致富的支柱性产业之一，2002年江永县被国家认定为“中国香芋之乡”，江永香芋2008年获得国家农产品地理标志，2009年被国家工商总局批准注册为地理标志证明商标，2012年获得绿色食品认证，产业优势明显。大力发展香芋产业，是充分发挥江永县自然资源优势，优化农业产业结构，加快农业产业化进程，帮助农民致富奔小康的重要途径，做好香芋产业发展工作意义重大。
2013年，香芋种植面积3.8万亩、产量7.5万吨，分别占全县蔬菜总面积的18.59％、蔬菜总产量的15.72％。源口、桃川、夏层铺、允山、千家峒、上江圩等乡镇组成的“香芋生产带”布局框架基本形成；初步建立了“政府引导、龙头带动、业主参与、农民主体”的发展机制，农民种植香芋的积极性高涨，发展香芋产业对调整农业结构、增加农民收入、繁荣农村经济发挥着越来越重要的作用。但是，江永县香芋产业发展仍然面临较为严峻的形势，存在着不少困难和问题。品种退化渐显，品种更新滞后，育苗集约化缺失，连作障碍没有突破，科技创新不足；基础设施配套不完善，农民自我投入能力弱，水、渠、路不适应标准化生产要求；香芋基地建设不规范，香芋培管不到位，产量较低、质量不一等问题较突出，其中进一步加大香芋品种提纯、复壮、选育力度，促进现代生物技术和常规技术有机结合，加强种质资源创新，改进育种方法，培育一批优质、抗病、高产、抗逆性强的香芋优良品种十分迫切。
发明内容
针对江永县香芋产业出现的以上问题，为快速培育一批优质、抗病、高产、抗逆性强的香芋优良品种，且为香芋脱毒组培苗工厂化生产提供理论依据和技术支持，进一步促进香芋产业的发展。现提出一种香芋茎尖快繁脱毒的方法，包括以下步骤：
(1)外植体的选择与消毒：所述外植体包括顶芽或者茎尖，
所述顶芽消毒方式为：选取健壮的匍匐茎或植株个体，将取得的材料种在混合基质中，用内吸性杀菌剂进行浇灌，10-30天后取顶芽，用75％酒精处理10S,再用10％升汞处理20min，然后用无菌水冲洗3-4次，得到备用顶芽；
所述茎尖的消毒方法为：将上述消毒后的顶芽在超净工作台上的解剖镜下进行顶芽剥离，得到备用茎尖；
(2)培养基的筛选：采用MS培养基：pH5.8,琼脂粉用量6.5g/L，蔗糖30g/L，活性炭1.5g/L，添加细胞分裂素，植物生长激素和杀菌剂；
所述顶芽培养基为：MS+6-BA1.0-5.0mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L+山农1号1mL/L；
所述茎尖初代培养基为：MS+6-BA4.0mg/L+NAA 0.1mg/L+山农1号1mL/L；
所述茎尖继代培养基为：MS+6-BA4.0mg/L+NAA 0.5mg/L+山农1号1mL/L。
进一步的，所述步骤(1)中的混合基质，按质量比计算，由珍珠岩5份、育苗基质3份、细沙1份组成。
进一步的，所述步骤(1)中的混合基质，三种基质按层堆放，不进行混合。
进一步的，所述步骤(1)中的混合基质，沙子置于最上层。
进一步的，所述步骤(1)中的杀菌剂为800倍的多菌灵。
进一步的，所述步骤(1)中的外植体在混合基质中培养20天取顶芽。
进一步的，步骤(2)中所述顶芽培养基为：MS+6-BA3.0-4.0mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L+山农1号1mL/L。
优选的，所述顶芽培养基为：MS+6-BA4.0mg/L+NAA 0.5mg/L+山农1号1mL/L。本发明取得的有益效果：
(1)接种材料进一步在混合基质中培养，添加杀菌剂进行处理，污染率由80-90％降低到10-15％，脱毒率达到85％，显著的降低了接种后的污染率。
(2)采用混合基质分层处理外植体，混合基质最上层的材料，影响外植体的污染率，采用最上层放置沙子，沙子具有吸附杀菌剂的效果，且沙子本身含杂菌量较珍珠岩和土壤少，顶芽长出后，顶芽接触的是相对菌体更少的一个环境，减少了后续无菌台杀菌操作次数，及减缓了无菌台杀菌不全面彻底的问题。
(3)采用顶芽直接培养育苗方式，加快育苗的时间，不用进行初代培养到继代培养的再次无菌台操作过程，节省人力，也降低了再次操作导致的污染率增高的状况，且顶芽培养，更有利于工厂化，大规模推广育苗。
(4)采用顶芽剥离茎尖培养方式，脱毒率达到98％以上，脱毒效果明显。
(5)在MS培养基中加入4.0mg/L的6-BA和0.5mg/L的NAA进行顶芽培育，平均每株增殖2-4个侧芽，多者达到5-6个侧芽，起到显著的育苗效果。
具体实施方式
以下用具体实施例对本发明进一步进行说明,本发明中未特殊说明的材料都可以在市场获得。
(1)外植体的选择和处理
两次田间取样，第一次在江永县千家峒乡和千层铺镇，所取样品分别命名为①号和②号，①号材料为千家峒乡芋头，②号材料为夏层铺镇鸡腿芋。第二次取样在江永县千家峒凤岩山蔬菜专业合作社和夏层铺镇，所取样品分别为：②-1号材料，夏层铺鸡腿芋；②-2号材料，夏层铺鸡腿芋(取样地点不同)；③号材料为青狗藤。
在香芋营养生长和生殖生长期，分别从不同田块选取健壮的匍匐茎和香芋块根用于香芋脱毒及扩繁实验。
接种材料处理方法：将取回的样品栽种由质量分数为5:3:1的珍珠岩、育苗基质、细沙按层堆放组成的混合基质中，用800倍的多菌灵处理15-30天，用于接种。
对比处理方法：将取回的样直接经过常规处理直接接种，将两者比较，常规处理方法在接种后两到三天，会迅速产生菌液(细菌)，污染率达到80-90％，将材料再次重复处理后接种，依然为染菌株；在800倍多菌灵的处理下接种，污染率为10-15％，可用于后续增殖及剥茎尖实验，极大程度节约了材料，为后期实验节省时间。
对比基质选择：选用上述比例下，沙子和珍珠岩对换置于基质最上层进行实验，比对发现，同一批材料，同一时间段处理，后期生长表现有明显区别，表现为沙子置于最上层处理的材料生长势明显强于珍珠岩处理的材料。
对比杀菌剂处理天数：选用800倍的多菌灵处理10天和20天进行实验，同一批材料，不同时间取样，对后期样品的处理有明显的影响，取样时间短，顶芽发育不健壮且杀菌时间短，接种后两三天污染率显著上升，取样时间过长，顶芽老化，不利于样品繁殖。
接种材料消毒：选取优良的顶芽，在流水下冲洗15-20min,然后在超净工作台中分别用75％酒精浸泡10s，升汞处理20min杀菌，每次处理后用无菌水冲洗三次，用于后续接种，或在超净工作台上的解剖镜下进行顶芽剥离，选取顶芽的茎尖用于后续接种。
(2)培养基的筛选
采用MS培养基：pH5.8,琼脂粉用量6.5g/L，蔗糖30g/L，活性炭1.5g/L，添加细胞分裂素，植物生长激素和杀菌剂配置的培养基进行植株培养。
顶芽培养6-BA浓度筛选和杀菌剂删选，共设计10种培养基，分别为：
1：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+病毒唑30mg/L
2：MS+6-BA 1.5.0mg/L+NAA 0.1mg/L+病毒唑30mg/L
3：MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+病毒唑30mg/L
4：MS+6-BA 2.5mg/L+NAA 0.1mg/L+病毒唑30mg/L
5：MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.1mg/L+病毒唑30mg/L
6：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+山农1号1mL/L
7：MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+山农1号1mL/L
8：MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.1mg/L+山农1号1mL/L
9：MS+6-BA 4.0mg/L+NAA 0.1mg/L+山农1号1mL/L
10：MS+6-BA 5.0mg/L+NAA 0.1mg/L+山农1号1mL/L
分别在10种培养基上接种30个顶芽，然后进行增殖及污染数据统计，实验结果分析发现，初选的五种培养基增系数为1-2，因此进行了第二轮的筛选。通过后5种实验分析结果表明：在MS培养基中加入3.0mg/L和4.0mg/L的6-BA增殖效果比较好，增殖系数为2-4，他6-BA浓度的增殖系数为0-2，两轮培养基比较，采用山农1号杀菌剂可以达到更好的杀菌效果。
顶芽培养6-BA和NAA浓度筛选，共设计十种培养基，分别为：
11：MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.1mg/L+山农1号1mL/L
12：MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.2mg/L+山农1号1mL/L
13：MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.3mg/L+山农1号1mL/L
14：MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.4mg/L+山农1号1mL/L
15：MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.5mg/L+山农1号1mL/L
16：MS+6-BA 4.0mg/L+NAA 0.1mg/L+山农1号1mL/L
17：MS+6-BA 4.0mg/L+NAA 0.2mg/L+山农1号1mL/L
18：MS+6-BA 4.0mg/L+NAA 0.3mg/L+山农1号1mL/L
19：MS+6-BA 4.0mg/L+NAA 0.4mg/L+山农1号1mL/L
20：MS+6-BA 4.0mg/L+NAA 0.5mg/L+山农1号1mL/L
分别在十种培养基上接种30个顶芽，然后进行增殖及污染数据统计，分析结果表明：在MS培养基中加入4.0mg/L的6-BA和0.5mg/L的NAA效果是最好的，平均每株增殖2-4个侧芽，多者达到5-6个侧芽。
茎尖初代培养基删选，共设计4种培养基，分别为：
1：MS+山农1号1mL/L
2：MS+6-BA 4.0mg/L+NAA 0.5mg/L+山农1号1mL/L
3：MS+6-BA 4.0mg/L+NAA 0.1mg/L+山农1号1mL/L
4：MS+6-BA 4.0mg/L+NAA 0.2mg/L+山农1号1mL/L
分别在四种培养基上接种10个茎尖生长点，然后进行生长情况数据统计，分析结果表明，茎尖生长点在培养基MS+6-BA 4.0mg/L+NAA 0.1mg/L+山农1号1mL/L上10后转绿，在其他三种培养基上均变成乳白色，失去活力，说明NAA浓度对茎尖生长点具有很大的影响，在此培养基内NAA浓度在0.1mg/L左右更适于茎尖生长。
茎尖继代培养基删选，采用培养基MS+6-BA 4.0mg/L+NAA 0.5mg/L+山农1号1mL/L对接种的材料每隔15-20d进行一次增殖培养，获得了一批组培苗，为接下来的继代培养材料提供了有力的支撑。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (8)

1.一种香芋茎尖快繁脱毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)外植体的选择与消毒：所述外植体包括顶芽或者茎尖，
所述顶芽消毒方式为：选取健壮的匍匐茎或植株个体，将取得的材料种在混合基质中，用内吸性杀菌剂进行浇灌，10-30天后取顶芽，用75％酒精处理10S,再用10％升汞处理20min，然后用无菌水冲洗3-4次，得到备用顶芽；
所述茎尖的消毒方法为：将上述消毒后的顶芽在超净工作台上的解剖镜下进行顶芽剥离，得到备用茎尖；
(2)培养基的筛选：采用MS培养基：pH5.8,琼脂粉用量6.5g/L，蔗糖30g/L，活性炭1.5g/L，添加细胞分裂素，植物生长激素和杀菌剂；
所述顶芽培养基为：MS+6-BA1.0-5.0mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L+山农1号1mL/L；
所述茎尖初代培养基为：MS+6-BA4.0mg/L+NAA 0.1mg/L+山农1号1mL/L；
所述茎尖继代培养基为：MS+6-BA4.0mg/L+NAA 0.5mg/L+山农1号1mL/L。
2.根据权利要求1所述的香芋茎尖快繁脱毒的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的混合基质，按质量比计算，由珍珠岩5份、育苗基质3份、细沙1份组成。
3.根据权利要求2所述的香芋茎尖快繁脱毒的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的混合基质，三种基质按层堆放，不进行混合。
4.根据权利要求2或3所述的香芋茎尖快繁脱毒的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的混合基质，沙子置于最上层。
5.根据权利要求1所述的香芋茎尖快繁脱毒的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的杀菌剂为800倍的多菌灵。
6.根据权利要求1所述的香芋茎尖快繁脱毒的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的外植体在混合基质中培养20天取顶芽。
7.根据权利要求1所述的香芋茎尖快繁脱毒的方法，其特征在于，步骤(2)中所述顶芽培养基为：MS+6-BA3.0-4.0mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L+山农1号1mL/L。
8.根据权利要求7所述的香芋茎尖快繁脱毒的方法，其特征在于，所述顶芽培养基为：MS+6-BA4.0mg/L+NAA 0.5mg/L+山农1号1mL/L。
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