CN109157552A - 一种灵芝提取物组份组方、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

所述灵芝提取物组份组方，由灵芝多糖提取物和灵芝三萜提取物混合组方组成，其中，灵芝多糖提取物和灵芝三萜提取物两种成分的生药质量3‑5:1；灵芝多糖提取物和灵芝三萜提取物得到灵芝提取物组份组方能够有效的增强人体免疫力，同时具有抗肿瘤的良好活性，较传统的灵芝孢子粉或者全子实体入药活性有大幅度的提升；为中药组方药物提供新的思路。

Description

一种灵芝提取物组份组方、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及灵芝提取物制备方法及其应用。
技术背景
诞生于公元前1世纪的我国第一部药学著作《神农本草经》收载了灵芝并列为上品。它记载的灵芝功效为：“治胸中结、益心气、补中、增智慧、不忘、久食轻身不老、延年神仙。”1991年，日本厚生省根据该国对灵芝大量的科学研究，将灵芝特定为保健食品。在韩国，灵芝被广泛用于神经、免疫、心脑血管系统是食疗，年消费达4500吨。在欧美，通过对灵芝广泛而深入的研究得出的结论是：“灵芝被证实是一种神奇的药草，它是抗癌、防癌、抗衰老、治疗慢性病等诸多领域当之无愧的明星。”2000年，《美国草药药典于治疗概要》正式收录了10种中药，灵芝名列其中。
现代研究表明，灵芝制剂是一种免疫调节剂，对机体的免疫防御机制具有非常罕见的良性双向调节功能。当机体免疫监视功能低下时，灵芝可增强机体细胞免疫和体液免疫功能，当机体产生各种变态反应或免疫性病例损害时，灵芝又可以抑制亢进的免疫水平从而促进自身稳定。
灵芝提取物主要功效成分为灵芝多糖和灵芝三萜类化合物。其中灵芝多糖主要是通过提高机体抗肿瘤免疫功能，如通过增强巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)和细胞毒性T细胞的功能，间接杀死肿瘤细胞，也可以通过巨噬细胞、T淋巴细胞释放能抑制或杀死肿瘤细胞的细胞因子，如肿瘤坏死因子(TNF)和干扰素(IFN)来杀死肿瘤细胞或促其凋亡。灵芝多糖还能通过抑制血管内皮细胞增殖，而抑制肿瘤血管新生，肿瘤细胞缺乏血液供应，得不到营养，从而抑制肿瘤新生。
灵芝提取物可调节免疫系统的众多组成成分，其中部分被认为具有明显的抗肿瘤特性。在中国的一次包括2000个病例的实验中，利用浓缩灵芝制品治疗老年慢性支气管炎后显示出良好的反应。该研究显示了超过60％的成功比率。在数月的治疗后，痰中的免疫球蛋白A水平出现了明显的上升。免疫球蛋白A是在呼吸道中发现的主要免疫球蛋白。在鼻过敏症，系统性狼疮和类风湿性关节炎中其一般会出现不足。灵芝提取物补充剂曾显示改善哮喘和鼻过敏症状。灵芝提取物的两种重要成分，油酸和环八硫显示可抑制组胺的释放，这可能是为何其有益于哮喘的原因，同时灵芝提取物中一种被称为Glhw-02的特殊的蛋白结合多糖，在实验室条件下显示出拥有有效的对抗1型和2型单纯性病毒的抗病毒特性。一次小规模的人体实验显示灵芝提取物“戏剧性地”减少了两名疱疹后神经痛患者的疼痛以及另两位带状疱疹感染(带状疱疹，因疱疹病毒而引起)患者的剧烈疼痛。在实验室条件下，灵芝提取物中多种灵芝酸和多糖显示可作为活性抗HIV物质，并表现出在保守剂量下降低病毒复制达50％的能力，和其它中药混合后，灵芝现在被用于对艾滋病相关综合症，AIDS的治疗，并单独或+与其它药材混用治疗慢性疲劳症候群。
发明内容
本发明提供了含有灵芝多糖得提取物，并通过药理实验确认灵芝提取物在增强免疫力方面的应用。
所述灵芝提取物组份组方，由灵芝多糖提取物和灵芝三萜提取物混合组方组成，其中，灵芝多糖提取物和灵芝三萜提取物两种成分的生药质量3-5:1。
所述的灵芝提取物组份组方，由灵芝多糖和灵芝三萜混合组方组成，其中，灵芝多糖和灵芝三萜两种成分的生药质量3.5:1。
3.灵芝提取物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)先用水提取灵芝子实体干燥药材，收集提取溶液，浓缩，干燥，得灵芝多糖提取物；
2)将步骤1)水提取过的药渣，用95-99％的乙醇提取，收集提取溶液，减压回收乙醇，干燥，得灵芝三萜提取物；
3)根据质量比混合灵芝多糖提取物和灵芝三萜提取物得到灵芝提取物组份组方。
所述的灵芝提取物组份组方在制备增强免疫力药物中的应用。
所述的灵芝提取物组份组方在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述的灵芝提取物组份组方在制剂，其特征在于：灵芝提取物组份组方可以制备成为片剂的一种。
本发明的有益技术效果是：灵芝多糖提取物和灵芝三萜提取物得到灵芝提取物组份组方能够有效的增强人体免疫力，同时具有抗肿瘤的良好活性，较传统的灵芝孢子粉或者全子实体入药活性有大幅度的提升；为中药组方药物提供新的思路。
具体实施方式
实施例1灵芝多糖提取物提取工艺考察
据文献及动物实验表明，灵芝水提取工艺灵芝多糖含量高，并且免疫调节效果好，依据影响水提取工艺的3个因素：加水量、提取次数、提取时间，设计3因素4水平的L(3)4正交试验见表1。选择灵芝多糖作为工艺筛选指标，通过测定浸膏得率和灵芝多糖总量，考察加水量、提取次数、提取时间的影响，以确定最佳提取工艺。药材用量均为50g。
表1正交试验因素水平
以灵芝多糖总量和浸膏得率为考察指标，对结果进行直观分析和方差分析，结果见表2，表3.
表2提取工艺正交实验设计表及结果
表3提取物得率正交试验的方差分析结果
表4灵芝多糖正交试验的方差分析结果
对表2进行数据处理，方差分析见表3、表4，由直观分析可知，以灵芝多糖测得值为评价指标，在考察的影响因素中，重要性依次为C＞A＞B，即提取次数为最大影响因素，其他依次为加水量和提取时间，最佳工艺为A2B2C2，即药材煎煮2次，第1次10倍药材量水，煮沸回流提取1.5h，过滤；第2次加8倍药材量水，煮沸回流提取1.5h，过滤，合并2次滤液，减压浓缩成浸膏，减压干燥得灵芝多糖提取物。因此，确定灵芝多糖最佳提取工艺为A2B2C2，即提取2次，第一次加10倍量水，第二次加8倍量水，每次提取1.5h。
提取工艺验证称取中药材灵芝原料10份，每份400g，按照正交试验筛选的最佳提取工艺对灵芝煎煮2次，第一次加10倍量水，第二次加8倍量水，每次提取1.5h。水提液浓缩，烘干，得干膏，测定其灵芝多糖含量(干膏)及提取干膏的收率，结果见表5。
表5灵芝多糖提取测定结果
提取物得率、灵芝多糖含量均在预测范围内，说明了该工艺的合理性。
实施例2灵芝三萜提取物提取工艺考察
先用水提取多糖，药渣再用95％乙醇提取三萜
据文献及动物实验表明，灵芝乙醇提取工艺灵芝三萜含量高，并且抗肿瘤效果好，依据影响乙醇提取工艺的3个因素：加乙醇量、乙醇浓度、提取时间，设计3因素4水平的L(3)4正交试验见表6。选择灵芝三萜作为工艺筛选指标，通过测定浸膏得率和灵芝三萜总量，考察加乙醇量、提取次数、提取时间的影响，以确定最佳提取工艺。药材用量均为50g。
表6正交试验因素水平
以灵芝三萜总量和浸膏得率为考察指标，对结果进行直观分析和方差分析，结果见表7、表8、表9。
表7提取工艺正交实验设计表及结果
表8提取物得率正交试验的方差分析结果
表9灵芝三萜正交试验的方差分析结果
对表7进行数据处理，方差分析见表8、表9，由直观分析可知，以灵芝三萜测得值为评价指标，在考察的影响因素中，重要性依次为C＞A＞B，即乙醇浓度为最大影响因素，其他依次为加乙醇量和提取时间，最佳工艺为A2B2C2，即采用95％的乙醇，采用药材重量8倍的乙醇量，煮沸回流提取1.5h，过滤，合并2次滤液，减压回收乙醇，浓缩成浸膏，减压干燥得灵芝三萜提取物。因此，确定灵芝三萜最佳提取工艺为A2B2C2，即提取2次，第一次加10倍量乙醇，第二次加8倍量乙醇，每次提取1.5h。
提取工艺验证取提取灵芝多糖后的药渣，按照正交试验筛选的最佳提取工艺采用药材重量8倍的95％的乙醇对灵芝药渣煮沸回流提取2次，每次提取1.5h。合并醇提液，减压回收乙醇，浓缩，烘干，得干膏，测定其灵芝三萜含量(干膏)及提取干膏的收率，结果见表10。
表10灵芝三萜提取测定结果
提取物得率、灵芝三萜含量均在预测范围内，说明了该工艺的合理性。
实施例3灵芝提取物组份组方在增强免疫力方面的应用
采用实施例1、2中最优化的提取方法，提取灵芝多糖提取物和灵芝三萜提取物。按照生药质量比配制灵芝多糖提取物和灵芝三萜提取物，分别制备原药重量为1:1的灵芝多糖提取物和灵芝三萜提取物作为实验组1，原药材重量比为2:1的灵芝多糖提取物和灵芝三萜提取物作为实验组2，原药材重量比为3:1的灵芝多糖提取物和灵芝三萜提取物作为实验组3，原药材重量比为4:1的灵芝多糖提取物和灵芝三萜提取物作为实验组4，原药材重量比为5:1的灵芝多糖提取物和灵芝三萜提取物作为实验组5，原药材重量比为6:1的灵芝多糖提取物和灵芝三萜提取物作为实验组6，原药材重量比为7:1的灵芝多糖提取物和灵芝三萜提取物作为实验组7。
SPF级雄性Balb/c小鼠，体重18g～22g，160只，分为四个指标测定组。第一组用于血清溶血素、抗体生成细胞与迟发型变态反应实验，第二组用于NK细胞活性测定与脾淋巴细胞转化实验，第三组用于腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验，第四组用于碳廓清实验，每个指标测定组均分别包括三个实验组和对照组，每组5只动物。实验组以相应剂量的样品分别给药实验组1、实验组2、实验组3、实验组4、实验组5、实验组6和实验组7，加少量蒸馏水充分研磨后，，给药量为3.0g/kg，加蒸馏水至100ml，充分混匀，作为低实验组灌胃液、中实验组灌胃液和高实验组灌胃液)，对照组以蒸馏水灌胃，灌胃量均为20ml/kg.bw，每天一次，连续灌胃30天后进行测试。
实验数据统计采用各实验组与对照组均数比较方差分析对数据进行处理。所用软件为《中国医学百科全书·医学统计学》统计软件包。
灵芝提取物组份组方对小鼠体重及体重与脏器比值的影响在体重测定中，各实验组与对照组小鼠相比，体重及增重均无显著性差异(P＞0.05)。在小鼠脏器/体重比值测定中，各实验组与对照组小鼠相比，脏器/体重比值及胸腺/体重比值均无显著性差异(P＞0.05)。见表11。
表11灵芝多糖对小鼠体重脏器/体重比值的影响
灵芝提取物组份组方对细胞免疫功能影响在小鼠迟发型变态反应实验中，抗原攻击24小时后，实验组1、2、6、7与对照组小鼠相比，其足跖肿胀度均无显著性差异(P＞0.05)；实验组3、4、5与对照组小鼠相比，其足跖肿胀度显著增加(P＜0.05)。在小鼠淋巴细胞转化实验中(MTT法)，实验组1、7与对照组小鼠相比，其光密度差值均无显著性差异(P＞0.05)；实验组2、3、4、5、6与对照组小鼠相比，其光密度差值显著增加(P＜0.05)。见表12。
表12灵芝多糖对小鼠迟发型变态反应(DTH)及小鼠脾淋巴细胞转化(MTT)的影响
*表示与对照组相比，P＜0.05。
灵芝提取物组份组方对体液免疫功能的影在小鼠血清血溶素检测实验中，各实验组与对照组小鼠相比，其抗体积数均无显著性差异(P＞0.05)。在小鼠抗体生成细胞检测实验中，实验组与对照组小鼠相比，其抗体生成细胞数均显著增加(P＜0.05)，其中实验组4的抗体细胞较其他组有显著增长(P＜0.01)，见表13。
表13灵芝多糖对小鼠血清血溶素产生及抗体生成细胞的影响
*表示与对照组相比，P＜0.05，**表示与对照组相比，P＜0.01。
灵芝提取物组份组方对单核-巨噬细胞功能的影响在小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验中，各实验组与对照组小鼠相比，其腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬百分率和吞噬指数均无显著性差异(P＞0.05)。在小鼠碳廓清实验中，各实验组与对照组小鼠相比，碳廓清指数a均无显著性差异(P＞0.05)，结果见表14。
表14灵芝多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力及碳廓清的影响
灵芝提取物组份组方对小鼠NK细胞活性的影响在小鼠NK细胞活性测定实验中，实验组1、6、7与对照组相比，其NK细胞活性率无显著性差异(P＞0.05)；实验组2、3、4、5与对照组小鼠相比，其NK细胞活性率均显著增加(P＜0.05)，结果见表15。
表15灵芝多糖对小鼠NK细胞活性的影响
*表示与对照组相比，P＜0.05。
结论经口给予灵芝提取物组份组方30天后，未见本检品对小鼠体重和增重有不良影响。该样品在细胞免疫功能、体液免疫功能和NK细胞活性三个方面结果为阳性，在单核-巨噬细胞功能结果为阴性，具有增强免疫力功能。
实施例4灵芝三萜提取物在抗肿瘤方面的应用
体外实验
细胞生长形态观察将6种肿瘤细胞分别调至细胞浓度为2×105cells/ml，各分为6组，分别为阴性组及5μg/ml实验组，处理24h、48h后，观察细胞形态和生长状况。结果6种肿瘤细胞经药物处理后细胞形态结果基本类似，灵芝三萜提取物处理细胞48h后，实验组1、2细胞与阴性组比较未见明显形态改变；经较高浓度40μg/ml处理后有部分细胞漂浮，形状改变，呈现空泡状；经实验组4处理后细胞大部分悬浮死亡，折光率增加，部分细胞碎裂，可见细胞碎片，见表16。
MTT法测抑制率将6种肿瘤细胞分别接种于96孔板，SW1990、HepG2、MCF-7调至细胞浓度为5×104cells/ml，A549、Hela、MKN45调至细胞浓度为1×105cells/ml，每孔100μ1细胞悬液，各分为10组，分别为阴性组、阳性组及5μg/ml实验组，每组设6个复孔。给药48h后，加入MTT(5mg/m1)20μL/孔，4h后加入二甲基亚砜(DMSO)150μL/孔，测吸光值(OD值)，计算半数抑制率(IC50)。胰腺癌SW1990、肺癌A549、宫颈癌Hela、肝癌HepG2、胃癌MKN45、乳腺癌MCF-7细胞的阳性药分别为吉西他滨(5μg/m1)、吉非替尼(1μg/m1)、顺铂(1μg/m1)、顺铂(5μg/m1)、氟尿嘧啶(0.5μg/m1)、多西他赛(0.5μg/m1)。结果实验组1、2、、6、7有一定抑制肿瘤细胞生长的作用，但作用较弱，其生长抑制率均在30％以下；实验组3、5浓度5μg/ml药物组对肿瘤细胞的抑制作用较强，实验组4浓度达到160μg/ml时，其生长抑制率均在50％以上。
生长曲线实验将6种肿瘤细胞分别接种于24孔板，SW1990调至细胞浓度为1×104cells/ml，其余5种细胞系调至细胞浓度为2×104cells/ml，每孔1ml，各分为7组，分别为阴性组、阳性组及5μg/ml各实验组，每组每天设3个复孔，分别计数。每孔于加药后1、2、3、4、5、6、7天将细胞进行消化计数。记录细胞数，绘制生长曲线。
平板集落形成实验将6种肿瘤细胞分别接种于6孔板，每孔加入细胞500个，各分为7组，分别为阴性组、阳性组及5μg/ml各实验组，给药10天后用4％多聚甲醛溶液固定细胞，台盼蓝染色，记录集落数，计算集落抑制率。
实验组1、2、7在浓度5μg/ml时对肿瘤细胞的生长抑制作用不明显。实验组3、5、6对肿瘤细胞有明显的生长抑制作用。实验组4在第二天即有显著的的抑制细胞生长的作用，实验后期基本无存活细胞。证明灵芝三萜提取物对MCF-7细胞的抑制增殖作用较强，5μg/ml浓度处理后细胞生长即受到明显抑制，实验组4处理后表现出明显的细胞毒性作用，细胞生长停滞。
平板集落形成实验6种肿瘤细胞的平板集落形成实验结果，见表16-表21。
表16灵芝三萜提取物对SW1990细胞集落形成的影响
与阴性对照组相比*P<0.05，**P<0.01；为细胞数高于阴性组出现显著差异ΔP<0.05ΔΔP<0.05(下同)
表17灵芝三萜提取物对A549细胞集落形成的影响
表18灵芝三萜提取物对Hela细胞集落形成的影响
表19灵芝三萜提取物对HepG2细胞集落形成的影响
表20灵芝三萜提取物对MKN45细胞集落形成的影响
表21灵芝三萜提取物对MCF-7细胞集落形成的影响
实施例1、3结果表明灵芝提取物组份组方中芝多糖提取物和灵芝三萜提取物两种成分的生药质量3-5:1的配方能提高迟发型变态反应和淋巴细胞分化，促进小鼠脾淋巴细胞增殖能力；增强抗体细胞生成，增加血清溶血素；提高碳廓清能力和腹腔巨噬细胞吞噬能力；增强NK细胞活性。结果提示芝多糖提取物和灵芝三萜提取物两种成分的生药质量3-5:1的灵芝提取物组份组方对小鼠的细胞免疫，体液免疫和非特异性免疫均有增强作用。
实施例2、4结果表明芝多糖提取物和灵芝三萜提取物两种成分的生药质量3-5:1的灵芝提取物组份组方能对胰腺癌SW1990、肺癌A549、宫颈癌Hela、肝癌HepG2、胃癌MKN45、乳腺癌MCF-7细胞6种肿瘤细胞均具有抑制增殖的作用，且芝多糖提取物和灵芝三萜提取物两种成分的生药质量4:1的灵芝提取物组份组方上时抑制增殖的作用较强。结果提示灵芝提取物组份组方具有抗肿瘤活性。

Claims (6)

1.一种灵芝提取物组份组方，其技术特征是：由灵芝多糖提取物和灵芝三萜提取物混合组方组成，其中，灵芝多糖提取物和灵芝三萜提取物两种成分的生药质量3-5:1。
2.根据权利要求1所述的灵芝提取物组份组方，其技术特征是：由灵芝多糖和灵芝三萜混合组方组成，其中，灵芝多糖和灵芝三萜两种成分的生药质量4:1。
3.灵芝提取物组份组方的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）先用水提取灵芝子实体干燥药材，收集提取溶液，浓缩，干燥，得灵芝多糖提取物；
2）将步骤1）水提取过的药渣，用90-98%的乙醇提取，收集提取溶液，减压回收乙醇，干燥，得灵芝三萜提取物；
3）根据质量比混合灵芝多糖提取物和灵芝三萜提取物得到灵芝提取物组份组方。
4.权利要求1或2所述的灵芝提取物组份组方在制备增强免疫力药物中的应用。
5.权利要求1或2所述的灵芝提取物组份组方在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.权利要求1或2所述的灵芝提取物组份组方在制剂，其特征在于：灵芝提取物组份组方可以制备成为片剂的一种。
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