CN109156887A - 烟草的细菌分布的更改 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种更改未熟化的烟草材料中的某些细菌的含量的方法，该方法包括：将未熟化的烟草材料与处理溶液接触，其中，处理溶液从由以下各项构成的组中选出：(i)包含盐、糖或它们的组合的溶液；(ii)包含一种或多种酶的溶液；和(iii)包含一种或多种益生菌的溶液，其中，所述接触提供处理过的烟草材料，所述处理过的烟草材料在收获之后具有减少的总细菌含量。在一些实施例中，处理过的烟草材料随后被熟化，并且可以任选地被发酵。还提供了包含这样的处理过的烟草材料的发烟制品和无烟烟草产品。

Description

烟草的细菌分布的更改
技术领域
本发明涉及植物以及对种植、收获和/或处理植物(例如，烟草)的方法的更改。具体地，本发明涉及由烟草制成或衍生出或以其他方式包含有烟草且意图用于人类消费的产品。
背景技术
诸如香烟的流行发烟制品具有大致圆柱形的条状结构，并且包括由包装纸所包围的、可发烟材料的包、卷或柱，所述可发烟材料例如是撕碎的烟草(例如，呈切割填充物的形式)，由此形成所谓的“烟丝条”。正常地，香烟具有与烟丝条成端部对端部关系排列的圆柱形过滤元件。典型地，过滤元件包括由已知为“滤棒成型纸”的纸材料围绕的塑化的醋酸纤维素丝束。某些香烟包含有过滤元件，所述过滤元件具有多个分段，并且这些分段之一可以包括活性炭颗粒。典型地，过滤元件使用已知为“接装纸”的外围包卷材料被附装到烟丝条的一个端部。也已经变得期望的是对接装材料和滤棒成型纸穿孔，以便提供用环境空气对抽吸的主流烟气的稀释。吸烟者通过点燃香烟的一个端部并且燃烧烟丝条来使用香烟。继而，吸烟者通过抽吸香烟的相对端部(例如，过滤嘴端部)将主流烟气接收到他/她的嘴中。
用于香烟制造的烟草典型地以掺合的形式使用。例如，通常被称为“美国掺合物”的某些流行烟草掺合物包括烤烟、白肋烟草和香料烟草的混合物，并且在许多情况下，包括某些经加工的烟草，例如，重构的烟草和经加工的烟茎。在用于制造特定香烟品牌的烟草掺合物内的每种烟草的精确量随品牌而不同。然而，对于许多烟草掺合物而言，烤烟占该掺合物的比例较大，而香料烟草占该掺合物的比例较小。例如，参见Tobacco Encyclopedia，Voges(编)第44页至第45页(1984)，Browne，The Design of Cigarettes，第3版，第43页(1990)和Tobacco Production，Chemistry and Technology，Davis等人(编)第346页(1999)。
烟草也可以以所谓的“无烟”的形式享用。通过将某一形式的处理过的烟草或含烟草的制剂插入使用者的嘴中来享有尤其流行的无烟烟草产品。各种类型的无烟烟草产品是已知的。例如，参见在以下文献中阐述的无烟烟草制剂类型、成分和加工方法：Schwartz的美国专利号1,376,586；Levi的美国专利号3,696,917；Pittman等人的美国专利号4,513,756；Sensabaugh,Jr等人的美国专利号4,528,993；Story等人的美国专利号4,624,269；Tibbetts的美国专利号4,991,599；Townsend的美国专利号4,987,907；Sprinkle,III等人的美国专利号5,092,352；White等人的美国专利号5,387,416；Williams的美国专利号6,668,839；Williams的美国专利号6,834,654；Atchley等人的美国专利号6,953,040；Atchley等人的美国专利号7,032,601；和Atchley等人的美国专利号7,694,686；Williams的美国专利公开号2004/0020503；Quinter等人的美国专利公开号2005/0115580；Strickland等人的美国专利公开号2006/0191548；Holton,Jr等人的美国专利公开号2007/0062549；Holton,Jr等人的美国专利公开号2007/0186941；Strickland等人的美国专利公开号2007/0186942；Dube等人的美国专利公开号2008/0029110；Robinson等人的美国专利公开号2008/0029116；Robinson等人的美国专利公开号2008/0173317；Engstrom等人的美国专利公开号2008/0196730；Neilsen等人的美国专利公开号2008/0209586；Crawford等人的美国专利公开号2008/0305216；Essen等人的美国专利公开号2009/0065013；Kumar等人的美国专利公开号2009/0293889；Gao等人等人的美国专利公开号2010/0291245；和Mua等人的美国专利公开号2011/0139164；Arnarp等人的PCT WO 04/095959和Atchley的WO2010/132444；以上文献中的每一篇都通过参考包含于此。
一类无烟烟草产品被称为“鼻烟”。在欧洲、特别是在瑞典已经由或通过诸如下述公司来制造通常被称为“瑞典口含烟”的代表性类型的湿鼻烟产品：Swedish Match AB，Fiedler&Lundgren AB，Gustavus AB，Skandinavisk Tobakskompagni A/S和RockerProduction AB。可在美国得到的瑞典口含烟产品已经由以下公司在以下商业名称下销售：R.J.Reynolds Tobacco Company的Camel Snus Frost、Camel Snus Original和CamelSnus Spice。例如，也参见Bryzgalov等人，1N1800Life Cycle Assessment，ComparativeLife Cycle Assessment of General Loose and Portion Snus(2005)。另外，与瑞典口含烟制造相关联的某些质量标准已经被组合为所谓的GothiaTek标准。代表性的无烟烟草产品也已经由以下公司在以下商业名称下销售：House of Oliver Twist A/S的OliverTwist；U.S.Smokeless Tobacco Co.的Copenhagen、Skoal、SkoalDry、Rooster、Red Seal、Husky和Revel；Philip Morris USA的“taboka”；Conwood Company,LLC的Levi Garrett、Peachy、Taylor’s Pride、Kodiak、Hawken Wintergreen、Grizzly、Dental、Kentucky King和Mammoth Cave；和R.J.Reynolds Tobacco Company的Camel Orbs、Camel Sticks和CamelStrips。
多年以来，已经提出了各种处理方法和添加剂来改变用在烟草产品中的烟草材料的总体特征和性质。例如，已经利用添加剂或处理方法来改变烟草材料的化学或感官特性，或就可发烟的烟草材料而言，来改变由包括烟草材料在内的发烟制品所生成的主流烟气的化学或感官特性。已经将各种类型的酶、细菌和微生物(例如，真菌和酵母)与烟草结合地使用以用于例如通过降低某些化学化合物的含量来改变烟草的化学组成的目的。例如，参见Keifer的美国专利号3,132,651；Silberman的美国专利号3,513,857；Bavley的美国专利号3,240,214；Harvey的美国专利号3,636,097；Rosen的美国专利号3,612,065；Rosen的美国专利号3,943,945；Malan的美国专利号4,135,521；Geiss等人的美国专利号4,140,136；Newton等人的美国专利号4,151,848；Teng的美国专利号4,307,733；Mattina等人的美国专利号4,308,877；Gaisch的美国专利号4,407,307；Gravely等人的美国专利号4,476,881；Gravely等人的美国专利号4,556,073；Gravely等人的美国专利号4,557,280；Semp等人的美国专利号4,566,469；Gaisch的美国专利号4,572,219；Gaisch的美国专利号4,709,710；Poulose的美国专利号4,716,911；Bernasek的美国专利号4,887,618；Clapp的美国专利号4,941,484；White的美国专利号5,099,862；Teague的美国专利号5,343,879；Roth等人的美国专利号5,372,149；DeGranpreet的美国专利号5,601,097；Koga等人的美国专利号7,549,425；Koga等人的美国专利号7,549,426；和Koga等人的美国专利号7,556,046；Kierulff的国际申请公开号WO 2000/02464；和Kierulff的欧洲申请号1094724，以上文献全部通过参考包含于此。
在本技术领域中将期望的是提供用于改变可用在发烟制品或无烟烟草产品中的植物(例如，烟草植物)以及烟草组合物和制剂的特征和性质的其它方法。
发明内容
本公开提供了一种处理植物或其部分以更改(例如，增加和/或减少)存在于其中的某些细菌的量的方法。尤其，所公开的方法可以被施加到烟草植物和材料，并且可以在某些实施例中促使与烟草植物或材料相关联的总细菌含量降低和/或与烟草植物或材料相关联的乳酸菌含量增加。
在本发明的一个方面中，提供一种更改烟草材料的细菌含量的方法，所述方法包括：在收获之前将未收获的烟草材料与处理溶液接触长达约24小时，其中，处理溶液从由以下各项构成的组中选出：(i)包含盐、糖或它们的组合的溶液；(ii)包含一种或多种酶的溶液；和(iii)包含一种或多种益生菌的溶液，其中，所述接触提供处理过的烟草材料，所述处理过的烟草材料在收获之后具有减少的总细菌含量。
在一些实施例中，处理溶液可以包含NaCl。在某些实施例中，处理溶液具有介于约1重量％和约4重量％之间的盐、糖或其组合的浓度。在某些实施例中，处理溶液可以包括乳酸菌。例如，处理溶液可以包括瑞士乳杆菌。在处理溶液包括益生菌的情况下，处理溶液可以例如具有介于约1×105菌落形成单位/mL和约1×1010菌落形成单位/mL之间的益生菌的浓度。在处理溶液包括酶的情况下，处理溶液可以例如具有介于约10AU每株植物和约50000AU每株植物之间的酶的浓度。
在一个实施例中，该方法还包括：将处理过的烟草材料熟化(curing)以给出处理过的、熟化的烟草材料。在一些实施例中，处理过的、熟化的烟草材料的烟草特异性亚硝胺(TSNA)含量相对于未处理的、熟化的烟草材料减少。在本发明的另一方面中，提供一种更改烟草材料的细菌含量的方法，所述方法包括：在收获之前将未收获的烟草材料与包含NaCl的盐溶液接触长达约24小时，所述NaCl的浓度是处理溶液的约0.5重量％至约15重量％，其中，所述接触提供处理过的烟草材料，所述处理过的烟草材料在收获之后具有减少的总细菌含量；收获处理过的烟草材料；以及将已收获的、处理过的烟草材料熟化以给出处理过的、熟化的烟草材料。
未收获的烟草材料可以例如从由以下各项构成的组中选出：烟草种子、烟草幼苗、未成熟的活植物、成熟的活植物、或其部分。在一些实施例中，处理过的烟草材料的总细菌含量在收获之后总共减少了至少约50％，并且在一些实施例中，处理过的烟草材料的总细菌含量在收获之后总共减少了至少约80％。在某些实施例中，烟草材料的总细菌含量包括革兰氏阴性细菌，并且其中处理过的烟草材料的革兰氏阴性细菌含量在收获之后总共减少了至少约50％。在某些实施例中，烟草材料的总细菌含量包括乳杆菌属细菌，并且其中，处理过的烟草材料的乳酸菌含量在收获之后增加。
处理溶液可以添加有一种或多种额外的成分。例如，处理溶液还可以包括一种或多种表面活性剂。在本文所提供的方法中可以包括各种额外的步骤。在某些实施例中，该方法还可以包括：使处理过的、熟化的烟草材料经受发酵，其中，在比由未处理的、熟化的烟草材料发酵所需要的时间少的时间上完成发酵。在某些实施例中，该方法还可以包括：加工处理过的、熟化的烟草材料以提供呈适于掺入烟草产品中的形式的、经加工的烟草材料；以及将经加工的烟草材料掺入无烟烟草产品或发烟制品中。经加工的烟草材料可以例如呈切割填充物的形式和/或烟草掺合物的形式。在一个实施例中，该方法包括：将未收获的烟草材料与含盐溶液接触以给出处理过的烟草材料；收获和熟化处理过的烟草材料；使熟化的烟草材料发酵；以及将已发酵的烟草材料掺入无烟烟草产品中。
还提供了根据本文所述的方法制备的、呈发烟制品(例如，香烟)或无烟烟草产品的形式的烟草产品。在某些实施例中，根据本文所提供的方法所生产的发烟制品在发烟时的特征在于，主流烟气的TSNA含量相对于未处理的控制发烟制品减少。
本发明包括、但不限于，以下实施例。
实施例1：一种更改烟草材料的细菌含量的方法，其包括：在收获之前将未收获的烟草材料与处理溶液接触长达约24小时，其中，处理溶液从由以下各项构成的组中选出：(i)包含盐、糖或它们的组合的溶液；(ii)包含一种或多种酶的溶液；和(iii)包含一种或多种益生菌的溶液，其中，所述接触提供处理过的烟草材料，所述处理过的烟草材料在收获之后具有减少的总细菌含量。
实施例2：任何先前的或随后的实施例的方法，其中，未收获的烟草材料从由以下各项构成的组中选出：烟草种子、烟草幼苗、未成熟的活植物、成熟的活植物、或其部分。
实施例3：任何先前的或随后的实施例的方法，其中，处理过的烟草材料的总细菌含量在收获之后总共减少了至少约50％。
实施例4：任何先前的或随后的实施例的方法，其中，处理过的烟草材料的总细菌含量在收获之后总共减少了至少约80％。
实施例5：任何先前的或随后的实施例的方法，其中，烟草材料的总细菌含量包括革兰氏阴性细菌，并且其中，处理过的烟草材料的革兰氏阴性细菌含量在收获之后总共减少了至少约50％。
实施例6：任何先前的或随后的实施例的方法，其中，烟草材料的总细菌含量包括乳杆菌属细菌，并且其中，处理过的烟草材料的乳酸菌含量在收获之后增加。
实施例7：任何先前的或随后的实施例的方法，其中，处理溶液包含NaCl。
实施例8：任何先前的或随后的实施例的方法，其中，处理溶液具有介于约1重量％和约4重量％之间的盐、糖或其组合的浓度。
实施例9：任何先前的或随后的实施例的方法，其中，处理溶液包含NaCl，NaCl的浓度是约5重量％至约15重量％。
实施例10：任何先前的或随后的实施例的方法，其中，处理溶液包括乳酸菌。
实施例11：任何先前的或随后的实施例的方法，其中，处理溶液包括瑞士乳杆菌。
实施例12：任何先前的或随后的实施例的方法，其中，处理溶液具有介于1×105菌落形成单位/mL和约1×1010菌落形成单位/mL之间的益生菌的浓度。
实施例13：任何先前的或随后的实施例的方法，其中，处理溶液具有介于约10AU每株植物和约50000AU每株植物之间的酶的浓度。
实施例14：任何先前的或随后的实施例的方法，其中，处理溶液还包括表面活性剂。
实施例15：任何先前的或随后的实施例的方法，还包括：收获处理过的烟草材料和将处理过的烟草材料熟化以给出处理过的、熟化的烟草材料。
实施例16：任何先前的或随后的实施例的方法，其中，处理溶液包含NaCl，NaCl的浓度是处理溶液的约0.5重量％至约15重量％；所述方法还包括：收获处理过的烟草材料；和将已收获的、处理过的烟草材料熟化以给出处理过的、熟化的烟草材料。
实施例17：任何先前的或随后的实施例的方法，还包括：使处理过的、熟化的烟草材料经受发酵；和将已发酵的烟草材料掺入无烟烟草产品中。
实施例18：任何先前的或随后的实施例的方法，其中，发酵在比由未处理的、熟化的烟草材料发酵所需要的时间少的时间上完成。
实施例19：一种根据任何先前的或随后的实施例的方法制备的无烟烟草产品。
实施例20：任何先前的或随后的实施例的方法，其中，处理过的、熟化的烟草材料的烟草特异性亚硝胺含量相对于未处理的、熟化的烟草材料减少。
实施例21：任何先前的或随后的实施例的方法，还包括：加工处理过的、熟化的烟草材料以提供呈适于掺入烟草产品中的形式的、经加工的烟草材料；以及将经加工的烟草材料掺入无烟烟草产品或发烟制品中。
实施例22：任何先前的或随后的实施例的方法，其中，经加工的烟草材料呈现切割填充物的形式或烟草掺合物的形式。
实施例23：任何先前的或随后的实施例的方法，其中，根据所公开的方法中的任一个方法制备的发烟制品在发烟时的特征在于，主流烟气的TSNA含量相对于未处理的控制发烟制品减少。
实施例24：根据任何先前的或随后的实施例的方法制备的、呈香烟或无烟烟草产品的形式的烟草产品。
本公开的这些和其它特征、方面和优点将通过连同附图一起阅读以下详细的说明书而变得显而易见，以下简要地说明附图。本发明包括上述实施例中的两个、三个、四个或更多个实施例的任何组合以及在本公开中所阐述的任何两个、三个、四个或更多个特征或元件的任何组合，不管这样的特征或元件是否被特意地组合在本文的特定实施例说明中。本公开意欲被全面地阅读，以便使所公开的本发明的任何可分离的特征或元件在其各种方面和实施例中的任一个中应当被认为意欲是可组合的，除非上下文另外明确地指示以外。本发明的其它方面和优点将从以下说明变得显而易见。
附图说明
为了提供对本发明的实施例的理解，参照附图，附图不必按比例绘制，并且在附图中附图标记指示本发明的示例性实施例的部件。附图仅是示例性的，并且应当不认为限制本发明。
图1是具有香烟形式的发烟制品的分解透视图，其示出香烟的可发烟材料、包卷材料部件和过滤元件；和
图2是沿着无烟烟草产品的宽度得到的无烟烟草产品实施例的剖视图，其示出用本发明的无烟烟草组合物填充的外部烟草袋。
具体实施方式
现在将在下文中更充分地描述本发明。但是，本发明可以以许多不同的形式具体实施，而不应当解释为限于本文所阐述的实施例；相反，提供这些实施例是为了使本公开内容将变得彻底和完整，并且向本领域的技术人员充分传达本发明的范围。如在本说明书和权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地指明以外。对“干重百分比”或“基于干重”的提及表示是基于干燥成分(即，除了水之外的所有成分)的重量。
本发明提供了具有更改的某些细菌水平的植物、植物组分和植物材料。在某些实施例中，这些具有更改的细菌水平的植物、植物组分和植物材料经受熟化并且可以呈现出更改的各种化合物(例如，烟草特异性亚硝胺，TSNA)熟化后水平。在一个示例性方面中，本发明提供了：具有更改的某些细菌和/或各种化合物水平的烟草植物、植物组分或烟草材料；包含有从这样的烟草衍生出的烟草材料的烟草产品；和用于制备具有更改的某些细菌和/或化合物水平的烟草的方法；以及用于将从该烟草衍生出的烟草材料掺入烟草产品内的方法。
用于更改烟草材料内的某些细菌水平的方法通常包括：通过将烟草与以下各项中的一项或多项接触来处理烟草(呈各种形式，例如，呈未收获的或已收获的形式)：盐和/或糖溶液；益生菌溶液；和/或酶溶液(在此统称为“处理溶液”)。注意到，虽然本文所提供的讨论大部分集中于烟草的处理，但是根据本文所提供的方法可以处理各种其它植物(包括水果、蔬菜、花和其组分)以提供其中具有更改的某些化合物(例如，细菌)水平的植物、植物组分和材料以及由它们所生产的产品。
烟草可以在植物生命周期的各种阶段中被处理，但是典型地烟草是在烟草植物或植物组分熟化的早期阶段之前或期间被处理(即，烟草植物或植物组分是“未熟化的或部分熟化的烟草”，其包含有在收获之前经过用处理溶液熟化的变黄/变褐阶段的处理)。在熟化期间出现变黄/变褐阶段，并且该变黄/变褐阶段说明了烟草被收获但是还没有经历完全熟化的时刻。
在一些优选的实施例中，烟草在熟化之前被处理，即，烟草呈“绿色”的形式。在一些实施例中，术语“绿色”意味着，烟草具有使得植物或植物组分内的细胞还没有经历明显或大量细胞死亡的形式，并且能够在一定程度上发生细胞呼吸作用。虽然呈“绿色”形式的烟草材料可以是已收获的或未收获的形式，但是在一些实施例中，经受如本文所述的处理的烟草材料是未收获的。
因此，术语“烟草”、“烟草植物”或“烟草植物组分”意味着处于烟草植物生命周期的各种阶段的烟草。例如，根据本公开所处理的烟草植物组分可以是烟草种子、烟草幼苗、未收获的烟草植物(在不同成熟阶段)、已收获的植物或它们中的任一个的部分，其全部被看作如本文进一步详细地说明的烟草植物的阶段。在一些实施例中，烟草在被干燥之前(即，在收获之前或刚刚收获)被处理。在某些实施例中，烟草在认为是“活”的形式的情况下被处理。在一些实施例中，烟草被现场处理，这意味着在呈未收获的形式的烟草植物的至少一部分上实施处理。在某些实施例中，可以如本文所述那样处理的未收获的烟草植物可以被进一步说明为在田间生长，使植物的根茎处于地面中，并且继续经历生物体的正常生物活性。
在一些实施例中，可以在收获之前在特定的时间范围内执行处理。例如，在某些实施例中，会有益的是在收获之前少于约一周处理烟草，包括在收获之前少于约2天或在收获之前少于约1天。在一些实施例中，会有利的是在收获之前以给定的小时数处理烟草，所述给定的小时数例如是在收获之前介于约1和约24小时之间、在收获之前介于约2和约12小时之间或在收获之前介于约3和约10小时之间。例如，可以在收获之前少于约24小时、在收获之前少于约15小时、在收获之前少于约12小时、在收获之前少于约10小时、在收获之前少于约8小时或在收获之前少于约6小时处理烟草。在一个实施例中，在收获之前约5小时处理烟草。在收获之前在有限的时间段内进行现场处理是尤其有益的，例如，以便避免雨水的稀释影响以及可能的干燥和UV辐射的破坏性影响。注意到，在某些实施例中，可以在完好无损的烟草植物上实施处理，而在其它实施例中，可以在已经去除了一部分的植物上实施处理(例如，在处理之前，已经从植物去除了花，或已经从植物去除了叶的一部分)。
如上所述，处理溶液通常可以包括以下各项中的一项或多项：盐和/或糖溶液；益生菌溶液；和/或酶溶液。本文将更加详细地说明这些类型的处理溶液中的每一种。还应当理解，在本文所述的方法的一些实施例中，也可以使用这样的溶液的混合物(例如，含益生菌的盐和/或糖溶液、含酶的盐和/或糖溶液、或包含酶和益生菌二者的溶液)。处理溶液通常在本文说明为是液体(溶液)的形式。虽然处理溶液被说明为处理“溶液”，但是注意到，在某些实施例中，一定百分比的固体可以被不完全地溶解(例如，使得“处理溶液”可以是溶液、分散液、或悬浮液的形式)。与盐、糖、酶和/或益生菌混合的液体可以改变，但是通常液体将包括水。虽然在优选的实施例中溶液是水溶液(即，包括水)，但是代替水或除了水以外可以使用各种其它溶剂(例如，诸如甲醇、乙醇和丙醇的极性有机溶剂)。所使用的盐、糖、益生菌或酶的浓度和量可以改变。通常，盐、糖、益生菌或酶的量足以改变施加有所述盐、糖、益生菌或酶的烟草材料中的一种或多种细菌的量。在其它实施例中，盐、糖、益生菌和/或酶的施加可以借助于呈干燥(例如，冷冻干燥的)形式的盐、糖、益生菌和/或酶来执行。例如，在某些实施例中，本文可以使用与在青贮饲料中所使用的方法或干腌法类似的方法。例如，参见Stevens H.R.的On Ensilage of Green Forage Crops in Silos(1881)，其通过参考包含于此。
在其中处理溶液包括盐和/或糖溶液的实施例中，溶液的具体组成可以改变。在一些实施例中，处理溶液可以使得处理溶液相对于经受处理的植物或其部分是高渗的。高渗溶液通常被理解为如与其它溶液相比是具有较高的溶质浓度的溶液，所述高渗溶液与所述其它溶液例如通过半渗透膜分离。由于在膜的高渗溶液侧上的溶质浓度较高，流体将通常横过膜流入高渗溶液中，直到达到等渗状态(其中，在膜的两侧上的溶质浓度是相同的)为止。在本申请的上下文中，高渗溶液被理解为是这样的溶液，即，其中溶液中的一种或多种溶质的浓度比待处理的植物中的一种或多种溶质的浓度高。
在一些实施例中，处理溶液是盐溶液。各种类型的植物的盐溶液处理是已知的，例如，如在Hempffing等人的美国专利No.6,755,200以及Li等人的美国专利申请公开号2008/0202538和Marshall等人的美国专利申请公开号2012/0279510中说明的，这些美国专利通过参考包含于此。任何盐可以用于该目的，但是尤其优选的是食品级盐。示例性的盐包括、但不限于，氯化钠(NaCl)、氯化钙(CaCl2)、氯化镁(MgCl2)、氯化钾(KCl)，以及它们的组合。在一些优选的实施例中，处理溶液是NaCl溶液。在某些实施例中，盐溶液不是含碳酸氢盐或碳酸盐阴离子的溶液。盐可以是加碘的盐或不加碘的盐(即，盐添加有较少量的碘)，但是优选地盐是不加碘的盐。盐可以例如是犹太盐、海盐、或酸洗盐。盐的粒度和形状可以改变(例如，盐可以是颗粒状的、薄片状的或粉末状的)，只要盐颗粒的至少一部分能够被溶解在例如水中以形成溶液即可。
在一些实施例中，溶质包括糖。包括食品级糖在内的任何糖可以用于该目的，例如，包括、但不限于，蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖和乳糖、鼠李糖、木糖以及它们的组合。根据本公开所使用的糖的形式可以例如是粉末状的、晶体状的或糖浆的形式，只要糖的至少一部分能够被溶解在例如水中以形成低渗溶液即可。在某些实施例中，根据本文公开的方法可以使用包含盐和糖二者的溶液。
在其中处理溶液包括含益生菌的溶液的实施例中，溶液可以例如是如在Marshall等人于2012年4月11日提交的美国专利申请No.13/444,272中所述的溶液，该美国专利申请通过参考包含于此。简要地，益生菌处理包括借助于一种或多种“益生菌”或“益生菌微生物”的处理，所述“益生菌”或“益生菌微生物”意欲包含有通过各种来源可以被分类为益生菌的所有活微生物。例如，联合国粮食和农业组织(Food and Agriculture Organizationof the United Nations，FAO)将益生菌定义为：“活微生物，其在以适当的量施用时，会给宿主提供健康益处”。在某些报告中，这样的健康益处可以包括、但不限于：对肠、呼吸道和/或泌尿生殖道的定居，胆固醇代谢，乳糖代谢，钙的吸收，维生素的合成，酵母和阴道感染的减少，消化问题(例如，便秘和腹泻疾病)的减少，天然抗生素、乳酸、酶、过氧化氢的产生，通过抗生素样物质的产生对病原性微生物的抑制；和pH的下降。尽管“益生菌”的传统定义涉及人和动物消化生物，但是该术语已经被应用在其它背景中，例如，在农业领域中。示例性的益生菌包括、但不限于，青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、乳糖双歧杆菌、长双歧杆菌、假链状双歧杆菌、假长双歧杆菌、双歧杆菌属种、嗜热双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、消化乳杆菌、食淀粉乳杆菌、保加利亚乳杆菌、两歧乳杆菌、短乳杆菌、干酪乳杆菌、高加索乳杆菌、卷曲乳杆菌、弯曲乳杆菌、德氏乳杆菌、发酵乳杆菌、鸡乳杆菌、加氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、约汉逊氏乳杆菌、乳酸乳杆菌、赖氏乳杆菌、类干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、乳杆菌属种、芽孢乳杆菌、乳乳球菌、乳脂链球菌、屎链球菌、婴儿链球菌、嗜热链球菌、屎肠球菌、乳酸片球菌、嗜热葡萄球菌、肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌、布拉尔酵母菌、酿酒酵母、布拉尔酵母菌、蜡状芽孢杆菌toyo变种、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。
在其中处理溶液包括含酶的溶液的实施例中，溶液可以例如是如在Moldoveanu等人于2012年7月19日提交的美国专利申请No.13/553,222中说明的溶液，该美国专利申请通过参考包含于此。简要地，酶处理包括借助于一种或多种酶的处理，所述一种或多种酶如本文所使用那样指的是具有变化的尺寸和结构的任何球状蛋白质。通常，根据本发明使用的酶以某种方式发挥功能来催化在植物材料内的一种或多种化学反应(例如，通过增大所述化学反应的速率)。根据本发明可以采用任何类型的酶或酶类型的组合；例如，水解酶(其催化化学键的水解)，异构酶(其催化分子内的异构化)，连接酶(其功能是链接两个或更多个分子)，裂解酶(其通过除了水解和氧化以外的机理裂解化学键)，氧化还原酶(其催化氧化/还原反应)和转移酶(其将转移各种基团，例如，官能团)。酶的本源可以改变，并且酶可以例如从微生物源(例如，细菌源或真菌源)、植物源、动物源获得，并且/或者可以被合成产生。示例性的酶包括、但不限于，淀粉酶(例如，α-淀粉酶、β-淀粉酶、γ-淀粉酶，或它们的组合)和/或蛋白酶(例如，丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和谷氨酸蛋白酶，所述谷氨酸蛋白酶包括蛋白酶地衣芽孢杆菌、蛋白酶芽孢杆菌属、蛋白酶米曲霉、蛋白酶解淀粉芽孢杆菌、蛋白酶芽孢杆菌和蛋白酶灰色链霉菌)。在一些实施例中，一种或多种酶包括天门冬酰胺酶(例如，荷兰海尔伦DSM Food Specialties的PreventASeTM和丹麦鲍斯韦A/S诺维信的)。在一些实施例中，一种或多种酶包括多酚氧化酶(PPO)。在某些实施例中，一种或多种酶包括氧化酶，例如，单酚氧化酶(酪氨酸酶)或邻二酚氧氧化还原酶(儿茶酚氧化酶)。其它示例性的氧化酶是漆酶。
处理溶液的溶质(即，一种或多种盐、一种或多种糖、益生菌、酶或它们的组合)可以在改变浓度的情况下存在。通常，根据本文所提供的方法使用有点稀的溶液，但是浓度可以是足以在处理过的烟草植物中引发所需效果的任何浓度。
例如，在某些实施例中，盐、糖、或它们的组合具有处理溶液的约0.5重量％至约15重量％、处理溶液的约0.5重量％至约10重量％或处理溶液的约1重量％至约5重量％(例如，处理溶液的约1.5重量％、约2重量％、约2.5重量％或约3重量％)的浓度。
在某些实施例中，处理溶液包括介于约1×105菌落形成单位(CFU)/mL和约1×1010CFU/mL之间(例如，约2×106CFU/mL)的量的益生菌。CFU提供了对在益生菌样本中的存活的(活的)细胞的测量。
在某些实施例中，处理溶液包括介于约10活性单位(AU)每株植物和约50000活性单位(AU)每株植物之间的量的酶。例如，酶的示例性的量可以是介于约100AU每株植物和约10000AU每株植物之间，例如，介于约500AU每株植物和约5000AU每株植物之间(对于商品PreventASeTML(来自DSM)而言，典型的AU水平是2600AU/mL以用于制备天门冬酰胺酶)。对于干烟草(～12％的湿度)而言，可以使用介于20AU/g和100AU/g之间的范围。在其中酶包括商业多酚氧化酶(PPO)的实施例中，可以使用介于约100AU每株植物和约10000AU每株植物之间的量，例如，介于约1000AU每株植物和约5000AU每株植物的量(对于(来自Worthington)的商品而言，典型的AU水平是1000AU/mL以用于制备)。
在一些实施例中，其它组分可以借助处理溶液而施加到植物。这样的组分可以被添加在相同的制剂(例如，在相同的溶液、分散液、悬浮液内)或可以在单独的制剂中被施加到烟草。例如，在某些实施例中，一种或多种表面活性剂和/或洗涤剂与糖、盐、酶、和/或益生菌一起被施加到的烟草。表面活性剂可以例如是非离子型表面活性剂。可以使用各种表面活性剂，包括、但不限于：聚山梨酯表面活性剂，例如，聚山梨酯20和聚山梨酯80和基于聚(乙二醇)的表面活性剂，例如，TritonTMX系列表面活性剂。用于帮助处理溶液有效地包覆烟草的其它试剂可以包括各种糖、植物提取物(例如，丝兰提取物、海藻提取物)、及其衍生物。某些酶和益生菌仅在特定的pH范围内是有活性的；因此，pH调节剂、酸、碱和/或缓冲剂的使用会有益于施加某些处理溶液。在某些实施例中，处理溶液可以包含有一种或多种氨基酸(例如，赖氨酸、甘氨酸、组氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸和精氨酸)，包含阳离子(例如，二价阳离子和/或三价阳离子)的组合物，某些非还原性糖，某些还原剂，酚类化合物(例如，具有至少一个酚醛官能团的化合物)，某些具有至少一个游离硫醇基团或官能团的化合物，氧化剂(例如，过氧化氢或臭氧)，氧化催化剂(例如，二氧化钛)，天然植物提取物(例如，迷迭香提取物)，以及它们的组合。可以借助处理溶液被任选地添加到植物的一种或多种其它组分的量可以改变。例如，在一些实施例中，处理溶液可以包括直至处理溶液的约25重量％，例如，介于处理溶液的约1重量％和约20重量％之间。
如上所述，处理可以包括用本文所述的一种或多种类型的处理溶液处理烟草材料(例如，绿色烟草植物材料)。在某些实施例中，这样的处理可以包括用两种或更多种不同类型的处理溶液相继地(例如，接连地或在明显不同的时间点处)处理烟草或同时地(例如，通过将两种或更多种不同的溶液分开地施加到烟草或通过将溶液混合以提供包括两种或更多种不同的溶质的单个处理溶液，并且通过将单个处理溶液施加到烟草)处理烟草。烟草可以用处理溶液(即，盐和/或糖溶液；益生菌溶液；和/或酶溶液)处理一次或可以被处理多次。在某些实施例中，两种处理溶液可以是相同的或不同的溶液，两种处理溶液可以被设置在单独的制剂中并且在烟草植物生命周期的不同时刻处被施加(例如，一种处理溶液被施加到在田间生长的植物并且一种处理溶液在收获之后被施加，或者一种处理溶液被施加到种子并且一种处理溶液被施加到在田间生长的植物)。
根据本文所提供的方法用处理溶液处理烟草可以对所得到的处理过的烟草有不同的影响。注意到，所获得的特定结果可以至少部分地与在处理中所使用的特定类型的一种或多种盐、一种或多种糖、一种或多种酶和/或一种或多种益生菌相关。
例如，在一些实施例中，用盐和/或糖溶液；益生菌溶液；和/或酶溶液所处理的烟草可以呈现出与其相关联的更改的某些细菌水平。已知，烟草植物自然地具有与其相关联的各种细菌水平。例如，参见Larsson L.等，烟草源性疾病，4：4(2008)和Huang J.等，应用.微生物.生物工程.88(2)：553(2010)，这些文献通过参考包含于此。
“细菌”通常被理解为指的是科学地归为此类的原核微生物属。大部分的细菌可以被分类为革兰氏阳性(原则上被分类在“放线菌门”的门中)或革兰氏阴性(原则上被分类在“变形菌门”的门中)。如本文所涉及的“革兰氏阴性”指的是由细胞质膜以及外细胞膜所界定的细菌，在两个膜之间仅包含有薄肽聚糖层，所述薄肽聚糖层不能在革兰氏染色技术中保持结晶紫染色(而革兰氏阳性细菌仅由单个单位脂质膜界定并且包含有厚肽聚糖层(20-80nm)，所述厚肽聚糖层保持染色)。示例性的革兰氏阴性细菌包括、但不限于，变形菌门(例如，来自属肠杆菌科(包括埃希氏菌属，沙门氏菌属，志贺氏菌属，沙雷氏菌属，泛菌属，变形杆菌属和克雷伯氏菌属)，假单胞菌科(包括假单胞菌属和根杆菌属)，莫拉氏菌科(例如，莫拉氏菌属和不动杆菌属)，螺杆菌科(例如，螺杆菌属)，黄单胞菌科(例如，寡养单胞菌和黄单胞菌属)，Bdellovibrionacaea(例如，蛭弧菌属)，伯克氏菌科(例如，伯克氏菌属)，军团杆菌科(例如，军团杆菌属)，根瘤菌科(例如，土壤杆菌属)；醋杆菌科(例如，醋酸菌属)，螺旋菌科(例如，螺旋状菌属)，和弯曲杆菌科(例如，弯曲菌属))。在某些实施例中，与烟草植物相关联的某些细菌是厌氧微生物。
肠原杆菌是通常存在于动物的肠包括人的肠中的肠杆菌科的、革兰氏阴性的、厌氧菌。在该肠杆菌科中已经识别出超过40个属，包括沙门氏菌属、变形杆菌属、沙雷氏菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、假单胞菌属和克雷伯氏菌属。典型地存在于动物的肠中的其它细菌类型也可以考虑到肠原杆菌，例如，属于拟杆菌属、梭菌属、梭杆菌属、优杆菌属、瘤胃球菌属、Peptidococcus，消化链球菌属、埃希氏杆菌属和和双歧杆菌属的细菌。各种量化肠原杆菌的测试也可以除了量化肠杆菌科(例如，沙门氏菌属和埃希氏杆菌属)以外量化一些其它革兰氏阴性细菌。虽然这些细菌中的某些可以在没有健康问题的肠中生存，但是某些细菌可以是机会致病菌并且/或者导致感染的迹象，并且因而这样的细菌的存在经常被有利地减到最少。
乳酸菌属是产生乳酸的革兰氏阳性杆状细菌的特定的一个大属。在该菌属中的许多细菌是有益的(并且从而常用于益生菌制备中)。
在某些实施例中，本文所述的处理促使处理过的烟草植物材料具有更改的细菌总数、更改的肠原杆菌数、更改的革兰氏阴性细菌数、和/或更改的乳酸菌数。虽然不旨在限制，但是认为，在某些实施例中，糖和/或盐溶液可以通过相对于烟草材料产生高渗溶液来更改细菌数，并且益生菌和/或酶可以通过提供与烟草材料相关联的、每单位面积的有竞争力的细菌负荷来更改细菌数。
在一些实施例中，如本文所述的处理提供了一种具有更改的细菌总数的处理过的烟草植物材料，并且具体地，所述处理可以使细菌总数总体下降。可以使用本技术领域中已知的任何方法实施总细菌计数，所述方法例如是稀释样本并且将稀释过的一种或多种样本镀敷在培养基(例如，平板计数琼脂，PCA)上。该板继而被培养，并且存在于样本中的每个细菌都预计在板上生长成单独的菌落。所得到的菌落可以(例如，在显微镜下)被观察和计数以提供以菌落形成单位/克(CFU/g)为单位的细菌总数。其它方法包括、但不限于，使用计数室、使用能够保持细菌的膜滤器、光度测定法和/或光谱法(例如，浊度分析)。细菌总数的降低遵循具有以下项目中的一项或多项的处理：盐和/或糖溶液；益生菌溶液；和/或酶溶液可以例如基于细菌总数(所述细菌总数例如通过得到处理过的烟草样本的菌落形成单位/克、将其除以未处理的烟草样本的菌落形成单位/克、从1减去所得到的数字、并且再乘以100来获得)降低了大于约80％、大于约85％、大于约90％、大于约92％、大于约95％或大于约96％。
将应理解，在处理之前存在于烟草植物材料上的总细菌的某一百分比将包括革兰氏阴性细菌。因此，这表明，遵循处理，烟草植物材料总体上会呈现出更改的革兰氏阴性细菌数，并且具体地，会呈现出革兰氏阴性细菌数的总体下降。在某些实施例中，可以通过使用对于革兰氏阴性(如与革兰氏阳性相对)细菌所特定的方法推定出如上所述在处理之前和处理之后的细菌总数来量化革兰氏阴性细菌的减少。这种方法可以在某些实施例中包括革兰氏染色法、在显微镜下观察细菌、快速微生物识别系统和/或聚合酶链反应(PCR)协议。
在一些实施例中，如本文所述的处理提供具有更改的肠原杆菌数的烟草植物材料，并且具体地，所述处理可以提供具有总体下降的肠原杆菌数的植物材料。肠原杆菌数可以例如通过上述细菌总计数方法来量化，其中，细菌在所选的培养基(例如，紫红色胆汁琼脂(VRBA)板)上生长而不是在一般细菌生长培养基(平板计数琼脂(PCA)板)上生长。肠原杆菌数的降低遵循具有以下项目中的一项或多项的处理：盐和/或糖溶液；益生菌溶液；和/或酶溶液可以例如基于细菌总数(所述细菌总数例如通过得到处理过的烟草样本的菌落形成单位/克、将其除以未处理的烟草样本的菌落形成单位/克、从1减去所得到的数字、并且再乘以100来获得)降低了大于约80％、大于约85％、大于约90％、大于约92％、大于约95％或大于约96％。
在一些实施例中，如本文所述的处理提供更改的乳酸菌数，并且具体地，所述处理可以提供总体增加的乳酸菌数。乳酸菌数可以例如在对于乳酸菌属所特定的培养基(例如，deMan Rogosa和Sharpe(MRS)培养基)上使用上述计数方法来获得。MRS培养基可以允许除了乳酸菌以外的某些其它类型的细菌生长，并且从而“更改的乳酸菌数”在一些实施例中指的是在厌氧条件下在MRS培养基上生长的所有细菌的计数，例如，所述所有细菌除了乳酸菌属以外可以包括明串珠菌属和片球菌属。乳酸菌数的增加遵循具有以下项目中的一项或多项的处理：盐和/或糖溶液；益生菌溶液；和/或酶溶液可以例如基于细菌总数(所述细菌总数例如通过得到处理过的烟草样本的菌落形成单位/克、将其除以未处理的烟草样本的菌落形成单位/克、从1减去所得到的数字、并且再乘以100)增加了大于约50％、大于约100％、大于约150％、大于约200％、大于约300％或大于约400％。注意到，虽然在一些实施例中期望的是乳酸菌数增加，但是某些处理导致乳酸菌数减少(例如，在某些实施例中，使处理过的烟草的乳酸菌数降低了介于约0％和约50％之间)。
不同的处理可以对存在于烟草植物材料中的各种细菌水平有不同的影响。如上所述，本文所述的处理会影响处理过的烟草的性能，并且会尤其有益于在熟化处理过的烟草之前更改某些细菌的含量。本文公开的预熟化的处理可以在某些实施例中对于随后的加工步骤具有进一步启示。
在烟草产品的生产中，烟草材料经常被熟化和/或老化，以便将烟草转化成可消费的形式。熟化可以包括例如：在允许某些烟草组分氧化和降解的条件下将已收获的烟草材料置于封装物(例如，谷仓)中。熟化典型地干燥烟草并且通常促使烟草的总体化学反应改变。
用于熟化和/或老化烟草的方法的示例例如在Beinhart的美国专利号1,327,692；Heljo的美国专利号2,758,603；Martin的美国专利号5,676,164；Hempfling等人的美国专利号6,755,200；Perfetti等人的美国专利号7,293,564；和Li等人的美国专利号8,353,300；以及Marshall等人的美国专利申请公开号2010/0116281和美国专利申请公开号2012/0279510中说明，这些美国专利的全部内容通过参考包含于此。在Davis等人的TobaccoProduction,Chemistry and Technology(编)(1999)中说明了用于各种类型的烟草的其它类型的熟化过程和老化过程，该文献也通过参考包含于此。
例如，烟草可以通过以下方法熟化，所述方法包括、但不限于，晾干、深色晾干、晒干、火烘烤和烟道烘烤。烟道烘烤包括在封装物中熟化烟草，其中烟道在烟草不暴露于烟气的情况下热熟化烟草，并且烟道烘烤例如在Nestor等人的Beitrage Tabakforsch.Int.，20(2003)：467-475和Peele的美国专利号6,895,974中说明，所述两个文献通过参考包含于此。烤烟通常包括在封装物中熟化烟草，其中烟草暴露于火的气态燃烧产物，所述火维持在较低的闷烧下，并且所述烤烟例如在Byrd等人的美国专利申请公布2012/0125354中说明，所述美国专利申请公布通过参考包含于此。晾干典型地包括在通风良好的封装物中悬挂烟草以在环境条件下干燥，并且例如在Roton等人的Beitrage Tabakforsch.Int.21(2005)：305-320；Staaf等人，Beitrage Tabakforsch Int.21(2005)：321-330；和Williams的美国专利号6,834,654中说明，所述文献通过参考包含于此。晒干通常包括允许烟草在太阳下未被覆盖地熟化。
包括更改的细菌水平的烟草材料(经由如本文所述的处理所提供)可以在熟化之后的烟草材料中产生更改的其它类型的化合物水平，如与在熟化之后的未处理的烟草材料比较。这样的化合物可以在一些实施例中是烟气毒物和/或烟气毒物前体。例如，应当认为，在熟化过程期间通过细菌(例如，革兰氏阴性细菌)的作用至少部分地产生某些化合物。具体地，细菌可以产生酶硝酸还原酶，所述酶硝酸还原酶将硝酸盐转化成亚硝酸盐和一氧化氮；一氧化氮随后可以与前体烟草生物碱起化学反应以产生烟草特异性亚硝胺(TSNA)。示例性的TSNA化合物包括N-亚硝基去甲烟碱(NNN)、4-甲基-N-亚硝氨基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAT)、4-甲基-N-亚硝氨基-1-(3-吡啶基)-1-丁醇(NNAL)和N-亚硝基八角枫碱(NAB)。
虽然典型地在绿色烟草材料中观察到较低的TSN水平，但是通常理解，在烟草熟化、发酵和/或老化过程期间形成TSNA。结果，已经尝试了通过更改生长或熟化过程来降低TSNA水平的各种努力。例如，参见Bokelman的美国专利号4,343,317和美国专利号4,347,859；O’Donnell的美国专利号5,803,081；Williams的美国专利号6,202,649；Peele的美国专利号6,805,134；Perfetti等人的美国专利号7,293,564；Peele的美国专利号7,404,406；Li等人的美国专利号8,353,300；Chen等人的美国专利申请公开号2012/0234334；Malik的PCT申请公开号WO 83/01180；Williams的WO 98/05226和WO 98/58555；以及Hempfling等人的WO 01/35770和WO 02/13636、Koga等人的WO 03/094639和Müller等人的Molec.Gen.Genet.161，67-76(1987)，这些文献通过参考包含于此。
因此，通常与受到熟化的烟草材料相关联的、细菌(例如，革兰氏阴性细菌)水平的更改可以在某些实施例中使得熟化的烟草材料具有更改的TSNA水平(例如，其与在如本文所述熟化之前还未被处理的相当的烟草材料相比具有更低重量的TSNA)。在本发明的一些实施例中，TSNA水平的降低可以改变，但是通常如与存在于相当的、熟化的(但未处理的)烟草中的TSNA的量比较，通常处理过的、熟化的烟草将包括介于约10重量％和约90重量％之间的TSNA。例如，在一些实施例中，如与在熟化之后的未处理的烟草材料比较，处理过的烟草材料在熟化之后会呈现出TSNA化合物降低了至少10重量％、20重量％、30重量％、40重量％、50重量％、60重量％、70重量％或80重量％。
如本文所述，用包括盐和/或糖溶液；益生菌溶液；和/或酶溶液在内的处理溶液处理烟草材料可以在某些实施例中相对于未处理的烟草材料促使与处理过的烟草材料相关联的乳酸菌数量更改(例如，增加)。这能够增加与如本文所述的烟草材料处理相关联的乳酸菌，从而可以在某些实施例中具有进一步有益的效果。在一些实施例(例如，其中烟草材料正准备在某些无烟烟草产品中使用)中，烟草材料被熟化并且继而被发酵。
发酵通常需要使烟草材料经受水(例如，湿度)和热。可以在其中可以控制温度和含水量的室中实施发酵过程。由于在发酵过程期间烟草所暴露的高温和含水量，可以有效地从烟草去除一些组分(例如，氨)。在某些实施例中，发酵是细菌过程，在所述细菌过程中某些细菌产生酶，所述酶起反应以在发酵的烟草材料内产生香料前体。
用于烟草的示例性的发酵过程在Brenik等人的美国专利号2,927,188；Sensabaugh等人的美国专利号4,660,577；Sensabaugh等人的美国专利号4,528,993；和Roth等人的美国专利号5,327,149中提供，所述美国专利通过参考包含于此。发酵通过乳酸菌的存在来增强；结果，与给定的烟草样本相关联的乳酸菌量的更改会影响该烟草样本的发酵。在该处理过的烟草随后经受发酵的情况下，发酵可以在某些实施例中通过存在更大数量的乳酸菌来增强。术语“增强”意味着发酵过程例如更加快速地和/或更加均匀地进行。
可应用本文所提供的方法的一种或多种烟草可以改变。在一些实施例中，可以采用的烟草包括：烤烟或弗吉尼亚烟草(例如，K326)、白肋烟草、晒干的烟草(例如，印度Kurnool和香料烟草，包括Katerini、Prelip、Komotini、Xanthi和Yambol烟草)、马里兰烟草、深色烟草、深色烘烤的烟草、深色晾干的烟草(例如，Pasado、Cubano、Jatim和Bezuki烟草)、浅色晾干的烟草(例如，North Wisconsin和Galpao烟草)、印度晾干的烟草、红色俄罗斯烟草和黄花烟草以及各种其它罕见的烟草或专门的烟草和任意前述烟草的各种掺合物。在Tobacco Production,Chemistry and Technology，Davis等人(编)(1999)(其通过参考包含于此)中，阐述了各种类型的烟草、栽培实践和收获实践的描述。来自烟草属种的各种代表性的其它植物类型参见：Goodspeed,The Genus Nicotiana，(Chonica Botanica)(1954)；Sensabaugh,Jr.等人的美国专利号4,660,577；White等人的美国专利号5,387,416，和Lawson等人的美国专利号7,025,066；Lawrence,Jr.的美国专利申请公开号2006/0037623，和Marshall等人的美国专利申请公开号2008/0245377；这些文献中的每篇都通过参考包含于此。示例性的烟草属种包括：红花烟草(N.tabacum)、黄花烟草(N.rustica)、花烟草(N.alata)、N.arentsii、N.excelsior、福尔吉特氏烟草(N.forgetiana)、粉蓝烟草(N.glauca)、粘烟草(N.glutinosa)、哥西氏烟草(N.gossei)、卡瓦卡米氏烟草(N.kawakamii)、奈特氏烟草(N.knightiana)、朗氏烟草(N.langsdorffi)、耳状烟草(N.otophora)、赛特氏烟草(N.setchelli)、林烟草(N.sylvestris)、绒毛烟草(N.tomentosa)、绒毛状烟草(N.tomentosiformis)、波叶烟草(N.undulata)、花烟草(N.xsanderae)、非洲烟草(N.africana)、抱茎烟草(N.amplexicaulis)、贝纳末特氏烟草(N.benavidesii)、博内里烟草(N.bonariensis)、迪勃纳氏烟草(N.debneyi)、长苞烟草(N.longiflora)、海滨烟草(N.maritina)、特大管烟草(N.megalosiphon)、西方烟草(N.occidentalis)、圆锥烟草(N.paniculata)、蓝茉莉叶烟草(N.plumbaginifolia)、雷蒙德氏烟草(N.raimondii)、莲坐叶烟草(N.rosulata)、拟似烟草(N.simulans)、斯托克同氏烟草(N.stocktonii)、香甜烟草(N.suaveolens)、荫生烟草(N.umbratica)、颤毛烟草(N.velutina)、芹叶烟草(N.wigandioides)、无茎烟草(N.acaulis)、渐尖叶烟草(N.acuminata)、渐狭叶烟草(N.attenuata)、本赛姆氏烟草(N.benthamiana)、洞生烟草(N.cavicola)、克里夫兰氏烟草(N.clevelandii)、心叶烟草(N.cordifolia)、伞床烟草(N.corymbosa)、香烟草(N.fragrans)、古特斯比氏烟草(N.goodspeedii)、狭叶烟草(N.linearis)、摩西氏烟草(N.miersii)、裸茎烟草(N.nudicaulis)、欧布特斯烟草(N.obtusifolia)、蓟马烟Hersperis亚种(N.occidentalis subsp.Hersperis)、少花烟草(N.pauciflora)、矮牵牛状烟草(N.petunioides)、夸德瑞伍氏烟草(N.quadrivalvis)、残波烟草(N.repanda)、圆叶烟草(N.rotundifolia)、茄子烟草(N.solanifolia)和斯佩格茨烟草(N.spegazzinii)。
使用遗传修饰或杂交育种技术，可以衍生出烟草属种(例如，可以对烟草植物进行遗传工程改造或杂交育种，以增加或减少组分、性状或特征的产生)。例如，参见在下述文献中阐述的植物的遗传修饰的类型：Fitzmaurice等人的美国专利号5,539,093；Wahab等人的美国专利号5,668,295；Fitzmaurice等人的美国专利号5,705,624；Weigl的美国专利号5,844,119；Dominguez等人的美国专利号6,730,832；Liu等人的美国专利号7,173,170；Colliver等人的美国专利号7,208,659，和Benning等人的美国专利号7,230,160；Conkling等人的美国专利申请公开号2006/0236434；和Nielsen等人的PCT WO 2008/103935。也参见在以下文献中阐述的烟草类型：Sensabaugh,Jr.等人的美国专利号4,660,577；White等人的美国专利号5,387,416；和Dominguez等人的美国专利号6,730,832，所述文献中的每篇通过参考包含于此。最优选地，烟草材料是已经被适当地烘烤和老化的那些。用于烘烤烤烟的尤其优选的技术和条件参见：Nestor等人，Beitrage Tabakforsch.Int.,20(2003)467-475和Peele的美国专利号6,895,974，所述文献通过参考包含于此。用于晾干烟草的代表性技术和条件参见Roton等人，Beitrage Tabakforsch.Int.,21(2005)305-320和Staaf等人，Beitrage Tabakforsch.Int.,21(2005)321-330，这些文献通过参考包含于此。可以用太阳晒干某些类型的罕见或稀有烟草。用于改善香料烟草的发烟质量的方式和方法参见Lawson等人的美国专利号7,025,066，其通过参考包含于此。代表性的香料烟草包括katerini、prelip、komotini、xanthi和yambol烟草。包含深色晾干的烟草的烟草组合物参见Marshall等人的美国专利申请公开号2008/0245377，所述美国专利申请通过参考包含于此。也参见例如在Beeson等人的美国专利申请公开号2011/0247640中阐述的烟草类型，所述美国专利申请通过参考包含于此。
可以针对其中存在的各种化合物的含量来选择烟草属种。例如，在某些实施例中，针对它们的叶表面化合物丰度而专门种植烟草属种植物(例如，Galpao commun烟草)。在某些实施例中，由于它们的较低的某些不希望的化合物(例如，天冬酰胺)的水平而特别种植烟草属种的植物。可以在温室、栽培室或室外田野中种植烟草植物，或者可以无土栽培。
可以将本文所述的处理溶液施加到烟草植物或植物材料的方式可以改变。用盐和/或糖溶液、益生菌溶液和/或酶溶液处理植物的某些方法(其可以用在本发明中或经更改而用在本发明中)在以下文献中提供：Geiss等人的美国专利号4,140,136；Newton等人的美国专利号4,151,848；Mattina等人的美国专利号4,308,877；Gravely等人的美国专利号4,476,881；Gravely等人的美国专利号4,556,073；Gravely等人的美国专利号4,557,280；Semp等人的美国专利号4,566,469；Roth等人的美国专利号5,372,149；Koga等人的美国专利号7,549,425；Koga等人的美国专利号7,549,426；和Koga等人的美国专利号7,556,046，这些美国专利全部通过参考包含于此。
如本文公开的处理溶液的施加方法将经常至少部分地取决于烟草植物的阶段。例如，在一些实施例中，在种植之前，盐和/或糖溶液；益生菌溶液；和/或酶溶液被施加到烟草种子。在这样的实施例中，处理溶液可以以种子处理或包衣的形式施加。例如，可以将种子浸入这种溶液中、泡在该溶液中、或用该溶液喷雾。在一些实施例中，溶液可以被施加到呈幼苗或未收获的(活)植物形式的烟草或可以被施加到土壤，在所述土壤中将种植有或目前种植有烟草植物。在这样的实施例中，可以使用处理溶液的喷雾施加(例如，使用液压喷杆式喷雾机、风送式喷雾机、洒水系统、润湿器或航空喷雾机)，尽管施加方法不限于此。用微生物处理植物的某些方法(其可以用在本发明中或经更改而用在本发明中)在以下文献中提供：Geiss等人的美国专利号4,140,136；Newton等人的美国专利号4,151,848；Mattina等人的美国专利号4,308,877；Gravely等人的美国专利号4,476,881；Gravely等人的美国专利号4,556,073；Gravely等人的美国专利号4,557,280；Semp等人的美国专利号4,566,469；Roth等人的美国专利号5,372,149；Koga等人的美国专利号7,549,425；Koga等人的美国专利号7,549,426；和Koga等人的美国专利号7,556,046，这些美国专利全部通过参考包含于此。
尽管会有利的是在烟草植物仍然呈活形式的同时施加处理(即，包含盐和/或糖、一种或多种益生菌和/或一种或多种酶的溶液)，但是在某些实施例中也能够在收获烟草植物之后施加处理溶液。这样的施加可以发生在收获之后的任何时间，包括收获后立即、在收获后加工(例如，植物的干燥、熟化和/或物理加工)之前或之后、或在二者之间的任何阶段。有利地，在烟草植物材料的任何明显熟化之前实施处理。盐和/或糖溶液、益生菌溶液和/或酶溶液的施加可以在植物生命周期中的一个阶段完成，或可以在两个或更多个阶段实施。
可以如本文所提供的那样使用和/或处理整个烟草植株或烟草属种植株的某些部位或部分。例如，可以收获植物的基本整株(例如，整个植株)，并原样使用。可替代地，可以收获或分离植株的各个部位或片段，用于在收获后处理。例如，可以分隔花、叶、茎、杆、根、种子和它们的各种组合，用于使用或进一步处理。
在处理之后，处理过的烟草材料可以以绿色形式被使用(例如，植株或其部分可以在不经受任何熟化加工的情况下被使用)。例如，植株或其部分可以在不经受大量储存、搬运或加工条件的情况下被使用。在某些情况下，有利的是在收获后几乎立即使用植株或其部分。可替代地，例如，可以将绿色形式的植株或其部分冷藏或冷冻以供以后使用、冷冻干燥、进行辐照、变黄、干燥、熟化(例如，使用晾干技术或采取施加热的技术)、加热或烹制(例如，烤、炒或煮)，或以其它方式进行储存或处理以供以后使用。将应理解，在熟化之后实现了以下益处，例如，减少TSNA的形成、增强发酵，等等；因此，本文所述的处理过的材料有利地例如在烟草产品中使用之前被熟化。
可以将烟草材料物理加工(在处理之前或之后和在熟化之前或之后)。可以将植株或其部分分离成单个部分或片段(例如，可以从茎取下叶子，和/或可以从秆取下茎和叶)。可以将已收获的植株或单个部分或片段进一步细分成部分或片段(例如，可以将叶子切丝、切碎、破碎、粉碎、研磨或磨碎成可表征为填充物型碎片、丸粒、颗粒或细粉的碎片或部分)。烟草材料可以具有以下形式：经加工的烟草部分或片段、基本上天然的片和/或茎形式的烘烤的和老化的烟草、烟草提取物、提取的烟草浆(例如，使用水作为溶剂)或前述物质的混合物(例如，将提取的烟草浆与造粒的烘烤的和老化的天然烟草片组合的混合物)。用于烟草产品的烟草最优选地包括烟草片、或烟草片和茎混合物。在烟草产品内的烟草的部分可以具有经加工的形式，例如，经加工的烟草茎(例如，碾压后切割的茎、膨胀后碾压后切割的茎或蓬松后切割的茎)、或体积膨胀的烟草(例如，经蓬松处理的烟草，例如，用干冰膨胀处理的烟草(DIET))。例如，参见在以下文献中阐述的烟草膨胀方法：de la Burde等人的美国专利号4,340,073；Guy等人的美国专利号5,259,403；和Poindexter等人的美国专利号5,908,032；和Poindexter等人的美国专利号7,556,047，这些文献全部通过参考包含于此。另外，所述烟草产品任选地可以包含已经发酵的烟草。也参见在Atchley等人的PCT WO 05/063060中阐述的烟草加工技术的类型，该文献通过参考包含于此。
以这样的形式提供烟草的方式可以改变。可以对植株或其部分(例如，通过加压或进行辊压处理)施加外力或压力。当实施这样的加工条件时，植株或其部分的含水量可以接近其天然含水量(例如，其在收获后不久的含水量)、通过对植株或其部分增湿所实现的含水量、或从干燥植株或其部分得到的含水量。例如，植株或其部分的粉状、破碎的、研磨的或磨碎的碎片可以具有小于约25重量％、经常小于约20重量％和经常小于约15重量％的含水量。使用用于碾磨、研磨等的设备和技术，可以将烟草部分或片段粉碎、研磨或粉末化成粉末类型的形式。最优选地，使用诸如锤式研磨机、刀盘、气控研磨机等的设备，使烟草在碾磨或研磨过程中呈相对干燥的形式。例如，当烟草部分或片段的含水量是小于约15重量％至小于约5重量％时，可以将烟草部分或片段碾磨或研磨。
意图以可发烟形式或无烟形式使用的烟草组合物可以包含单一类型的烟草(例如，以所谓的“直级”形式)。例如，在烟草组合物内的烟草可以仅由烤烟组成(例如，烟草的全部可以由烤烟片或烤烟片和烤烟茎的混合物组成，或者自烤烟片或烤烟片和烤烟茎的混合物衍生出)。在烟草组合物内的烟草还可以具有所谓的“掺合的”形式。例如，本发明的烟草组合物内的烟草可以包括烟道烘烤的白肋烟草(例如，马拉维白肋烟草)和香料烟草(例如，作为由烟草片、或烟草片和烟草茎的混合物构成的烟草，或者自烟草片、或烟草片和烟草茎的混合物衍生出的烟草)的部分或片段的混合物。例如，基于干重，一种代表性的掺合物可以包含约30份至约70份白肋烟草(例如，片、或片和茎)和约30份至约70份烤烟(例如，茎、片、或片和茎)。其它示例性的烟草掺合物包含：约75份烤烟、约15份白肋烟草、至约10份香料烟草；或约65份烤烟、约25份白肋烟草、至约10份香料烟草；或约65份烤烟、约10份白肋烟草、至约25份香料烟草；基于干重。其它示例性的烟草掺合物包含约20份至约30份香料烟草和约70份至约80份烤烟。
在某些实施例中，可以随后提取已经根据本公开处理过的烟草。可以使用各种提取技术。例如，参见在Beeson等人的美国专利申请公开号2011/0247640(其通过参考包含于此)中描述的提取过程。用于提取烟草组分的其它示例性技术在下述文献中描述：Fiore的美国专利号4,144,895；Osborne,Jr.等人的美国专利号4,150,677；Reid的美国专利号4,267,847；Wildman等人的美国专利号4,289,147；Brummer等人的美国专利号4,351,346；Brummer等人的美国专利号4,359,059；Muller的美国专利号4,506,682；Keritsis的美国专利号4,589,428；Soga等人的美国专利号4,605,016；Poulose等人的美国专利号4,716,911；Niven,Jr.等人的美国专利号4,727,889；Bernasek等人的美国专利号4,887,618；Clapp等人的美国专利号4,941,484；Fagg等人的美国专利号4,967,771；Roberts等人的美国专利号4,986,286；Fagg等人的美国专利号5,005,593；Grubbs等人的美国专利号5,018,540；White等人的美国专利号5,060,669；Fagg的美国专利号5,065,775；White等人的美国专利号5,074,319；White等人的美国专利号5,099,862；White等人的美国专利号5,121,757；Fagg的美国专利号5,131,414；Munoz等人的美国专利号5,131,415；Fagg的美国专利号5,148,819；Kramer的美国专利号5,197,494；Smith等人的美国专利号5,230,354；Fagg的美国专利号5,234,008；Smith的美国专利号5,243,999；Raymond等人的美国专利号5,301,694；Gonzalez-Parra等人的美国专利号5,318,050；Teague的美国专利号5,343,879；Newton的美国专利号5,360,022；Clapp等人的美国专利号5,435,325；Brinkley等人的美国专利号5,445,169；Lauterbach的美国专利号6,131,584；Kierulff等人的美国专利号6,298,859；Mua等人的美国专利号6,772,767；和Thompson的美国专利号7,337,782，它们都通过参考包含于此。
在本文描述的酶处理之前、之后或过程中，可以以其它方式进一步处理和/或加工在本发明中讨论的烟草材料。例如，如果需要的话，可以对烟草材料进行照射、巴氏消毒或者用其它方式进行受控的热处理。这样的处理加工在例如Mua等人的美国专利公开号2009/0025738中详述，该美国专利通过参考包含于此。注意到，有利地，在其中处理溶液包含酶的实施例中，酶的至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或全部在高温下失效和/或降解。因此，在一些实施例中，在酶处理过的烟草被热处理和/或在高温下使用(例如，被包含在高温下燃烧的香烟内)的情况下，在烟草材料中会几乎没有活性酶。
在某些实施例中，如本文所述的处理过的烟草材料可以进一步与水和添加剂接触，所述添加剂能够抑制在加热烟草材料后天冬酰胺形成丙烯酰胺的反应(例如，添加剂从由以下各物构成的组中选出：赖氨酸，甘氨酸，组氨酸，丙氨酸，蛋氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，缬氨酸，精氨酸，包含二价和三价阳离子的组合物，天门冬酰胺酶，某些非还原性糖，某些还原剂，酚类化合物，某些具有至少一个游离硫醇基团或官能团的化合物，氧化剂，氧化催化剂，天然植物提取物(例如，迷迭香提取物)和它们的组合)和它们的组合。例如，参见在以下文献中描述的处理加工的类型：Chen等人的美国专利公开号2010/0300463、美国专利公开号2011/0048434和美国专利公开号2012/0060854，这些美国专利全部通过参考包含于此。在某些实施例中，在前面描述的提取和/或蒸馏过程中对原始烟草材料进行加热的情况下，这类处理是有用的。
可以将处理过的烟草掺入根据本发明的各种类型的烟草产品内。例如，在某些实施例中，本发明提供了诸如香烟的发烟制品，其包含已经经受本文所述的一种或多种类型的处理后的处理过的烟草材料。参照图1，示出香烟形式的发烟制品10，其具有本发明的发烟制品的某些代表性组分。香烟10包括被容纳在外围包卷材料16中的一团或一卷可发烟的填充材料(例如，约0.3g至约1.0g的可发烟的填充材料，例如，如上所述处理过的烟草材料)的大致圆柱形条12。条12照惯例被称为“烟丝条”。烟丝条12的端部是开放的，以暴露可发烟的填充材料。香烟10被示出为具有附着在所述包卷材料16上的一个任选带22(例如，印制覆层，其包括成膜剂，例如，淀粉、乙基纤维素或海藻酸钠)，且该带在与香烟的纵向轴线横切的方向上包围香烟条。也就是说，带22提供了相对于香烟的纵向轴线的横过区域。带22可以被印制在包卷材料的内表面上(即，面对可发烟的填充材料)，或者次优选地，被印制在所述包卷材料的外表面上。尽管所述香烟可以拥有具有一个任选带的包卷材料，但是所述香烟也可以拥有具有两个、三个或更多数量的其它任选间隔带的包卷材料。
在烟丝条12的一个端部处的是点燃端18，在嘴端20处定位有过滤元件26。所述过滤元件26被定位在烟丝条12的一个端部附近，使得所述过滤元件和烟丝条以端部对端部关系呈轴向排列，优选地彼此相邻。过滤元件26可以具有大致圆柱形形状，且其直径可以基本上等于烟丝条的直径。过滤元件26的两端允许空气和烟气在其中通过。
可以给通气的或空气稀释的发烟制品提供任选的空气稀释装置，例如，一系列洞孔30，其中的每个洞孔都穿过滤棒成型纸28延伸。通过本领域的普通技术人员已知的诸如激光穿孔技术的各种技术，可以制成任选的洞孔30。可替代地，可以使用所谓的离线空气稀释技术(例如，通过使用多孔滤棒成型纸和预穿孔的接装纸)。过滤元件26沿其外圆周或纵向周边被一层外围滤棒成型纸28包裹。在使用期间，吸烟者使用火柴或香烟打火机点燃香烟10的点燃端28。如此，可发烟的材料12开始燃烧。将香烟10的嘴端20置于吸烟者的嘴唇中。通过燃烧可发烟的材料12所产生的热分解产物(例如，烟草烟气的组分)被抽吸穿过香烟10、穿过过滤元件26而进入吸烟者的嘴中。
在某些实施例中，根据本发明，发烟制品包含已经如上所述被处理(即，用盐和/或糖溶液；益生菌溶液；和/或酶溶液中的一种或多种预熟化处理)的烟草。在某些实施例中，在发烟制品内的烟草可以仅包含这样的处理过的烟草，或可以包含与其它烟草材料组合的各种量的处理过的烟草。例如，基于发烟制品中的所有烟草材料的重量，处理过的烟草可以以约25％或更多、约50％或更多、约75％或更多、约80％或更多、约85％或更多、约90％或更多、约95％或更多或约100％的量存在。有利地，在某些实施例中，在烟草材料的处理中所使用的盐、糖、酶和/或益生菌不转移到从由这样的烟草制成的香烟发出的烟气中。
参照图2，示出了包含如本文所述的处理过的烟草(即，用盐和/或糖溶液；益生菌溶液；和/或酶溶液中的一种或多种处理的烟草)的代表性瑞典口含烟型烟草产品。具体地，图2示出了具有可透水的外部烟草袋42的无烟烟草产品40，所述外部烟草袋42容纳无烟烟草组合物44，其中所述烟草组合物包括已经如本文所述处理过的碎片或微粒烟草材料。其它添加剂可以与根据本发明的无烟烟草组合物混合，或以其它方式掺入其中。所述添加剂可以是人工添加剂，或可以从草药或生物源得到或衍生出。示例性的添加剂类型包括：盐(例如，氯化钠、氯化钾、柠檬酸钠、柠檬酸钾、醋酸钠、乙酸钾等)、天然甜味剂(例如，果糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、香草醛、乙基香草醛葡萄糖苷、甘露糖、半乳糖、乳糖等)、人工甜味剂(例如，三氯蔗糖、糖精、阿斯巴甜、安赛蜜、纽甜等)、有机和无机填充物(例如，细粒、经加工的细粒、疏松细粒、麦芽糊精、右旋糖、碳酸钙、磷酸钙、玉米淀粉、乳糖、甘露醇、木糖醇、山梨醇、精细粉碎的纤维素等)、粘合剂(例如，聚维酮、羧甲基纤维素钠和其它改性纤维素类粘合剂、藻酸钠、黄原胶、淀粉基粘合剂、阿拉伯树胶、卵磷脂等)、pH调节剂或缓冲剂(例如，金属氢氧化物，优选碱金属氢氧化物，如氢氧化钠和氢氧化钾，和其它碱金属缓冲剂，如金属碳酸盐，优选碳酸钾或碳酸钠，或金属碳酸氢盐，如碳酸氢钠等)、着色剂(例如，染料和颜料、包括焦糖色和二氧化钛等)、保湿剂(例如，甘油、丙二醇等)、口腔护理添加剂(例如，百里香油、桉叶油和锌)、防腐剂(例如，山梨酸钾等)、糖浆(例如，蜂蜜、高果糖玉米糖浆等)、崩解助剂(例如，微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、淀粉羟乙酸钠、预胶凝化玉米淀粉等)、调味剂和调味混合物、抗氧化剂、及其混合物。如果需要的话，可以将所述添加剂包囊化，如在Dube等人的美国专利申请公开号2008/0029110中阐述，该美国专利通过参考包含于此。另外，示例性的包囊化的添加剂例如参见Atchley的WO 2010/132444A2，该文献已经在前面通过参考包含于此。
实验
本发明通过以下示例被更加完全地例证，以下示例被阐述以例证本发明而不解释为限制本发明。除非另外注释以外，否则所有部分和百分比是按重量计算，并且所有重量百分比是基于干重来表述，这意味着排除水含量，除非另外指出以外。
深色晾干的烟草在收获之前用益生菌溶液、和酶溶液、和/或3％氯化钠盐溶液中的一种或多种被处理了五个小时。使用背负式喷雾机来施加溶液。溶液是基于每英亩100加仑溶液，以下提供推荐使用的株距和每株植物的剂量。
将处理过的烟草收获，并且对中部茎叶样本分析细菌总数、肠原杆菌数和乳酸菌数。十克的每份处理过的烟草样本被置于巴特菲尔德磷酸盐缓冲液中并且用水稀释了10-2倍至10-8倍。处理过的烟草样本稀释物被施加到平板计数琼脂(PCA)以用于需氧菌总数，被施加到紫红色胆汁琼脂(VRBA)以用于革兰氏阴性细菌数并且被施加到MRS以用于厌氧菌(乳酸菌)数。如在放大镜下观察，对细菌菌落的数量计数，以便推断出每克菌落形成单位CFU/g的总数。
用可从CVS得到的益生菌溶液(准备提供每株植物6.00×109CFU的溶液)处理的烟草呈现出，细菌总数在处理之后减少了91％，肠原杆菌在处理之后减少了40％并且乳酸菌在处理之后减少了46％(全部基于在处理之前和处理之后的细菌总数)。
用可从Walgreens得到的益生菌溶液(准备提供每株植物6.40×109CFU的溶液)处理的烟草呈现出，细菌总数在处理之后减少了96％，肠原杆菌在处理之后减少了58％并且乳酸菌在处理之后减少了42％(全部基于在处理之前和处理之后的细菌总数)。
用与表面活性剂(来自Drexel Chemical Company的)组合的、可从CVS得到的益生菌溶液(准备提供每株植物6.00×109CFU的溶液)处理的烟草呈现出，细菌总数在处理之后减少了95％，肠原杆菌在处理之后减少了66％并且乳酸菌在处理之后增加了57％(全部基于在处理之前和处理之后的细菌总数)。
用植物乳杆菌益生菌溶液(准备提供每株植物6.64×1010CFU的溶液)处理的烟草呈现出，细菌总数在处理之后减少了95％，肠原杆菌在处理之后减少了75％并且乳酸菌在处理之后增加了43％(全部基于在处理之前和处理之后的细菌总数)。
用嗜酸乳杆菌益生菌溶液(准备提供每株植物2.72×1010CFU的溶液)处理的烟草呈现出，细菌总数在处理之后减少了93％、肠原杆菌在处理之后减少了20％并且乳酸菌在处理之后减少了33％(全部基于在处理之前和处理之后的细菌总数)。
用双歧杆菌益生菌溶液(准备提供每株植物4.16×1010CFU的溶液)处理的烟草呈现出，细菌总数在处理之后减少了82％、肠原杆菌在处理之后减少了25％并且乳酸菌在处理之后减少了16％(全部基于在处理之前和处理之后的细菌总数)。
用瑞士乳杆菌益生菌溶液(准备提供每株植物5.20×109CFU的溶液)处理的烟草呈现出，细菌总数在处理之后减少了97％、肠原杆菌在处理之后减少了39％并且乳酸菌在处理之后增加了大于400％(全部基于在处理之前和处理之后的细菌总数)。
用PreventASeTM酶溶液(准备提供每株植物3.2mL天门冬酰胺酶的溶液)处理的烟草呈现出，细菌总数在处理之后减少了88％、肠原杆菌在处理之后减少了75％并且乳酸菌在处理之后减少了43％(全部基于在处理之前和处理之后的细菌总数)。
用3％NaCl溶液处理的烟草呈现出，细菌总数在处理之后减少了94％、肠原杆菌在处理之后减少了76％并且乳酸菌在处理之后增加了多于400％(全部基于在处理之前和处理之后的细菌总数)。
数据示出，所有处理溶液设置成使与处理过的烟草材料相关联的细菌总数减少(如与处理之前的烟草材料比较)。盐(NaCl)处理过的烟草材料呈现出，所需的乳酸菌大量增加。该发现可以致使这样的NaCl(和其它盐)处理过的烟草材料尤其适用于其它发酵过程和适用于将这样的已发酵的烟草材料掺入无烟烟草产品中。另外地，瑞士乳杆菌处理过的烟草材料呈现出，在处理之后乳酸菌大量增加。尽管所述瑞士乳杆菌处理过的烟草材料由于在处理溶液中存在乳酸菌而预计会使乳酸菌有些增加，但是该乳酸菌增加明显高于对于其它乳酸菌益生菌溶液处理过的烟草材料所述的乳酸菌增加(例如，用植物乳酸菌处理的烟草呈现出乳酸菌仅增加了43％，并且用嗜酸乳杆菌处理的烟草呈现出乳酸菌减少了33％)。结果，瑞士乳杆菌处理过的烟草材料可以尤其较好地适用于其它发酵过程并且也尤其较好地适用于将这样的已发酵的烟草材料掺入无烟烟草产品中。
具有在前述描述中提供的教导益处的本发明所属领域的技术人员将想到本发明的许多修改方案和其它实施方案。因此，应当理解，本发明不限于所公开的具体实施例，并且修改方案和其它实施方案意图被包含在所附权利要求的范围内。尽管本文采用了特定的术语，但是它们仅以一般性的和描述性的含义使用，而不用于限制的目的。

Claims (23)

1.一种更改烟草材料的细菌含量的方法，所述方法包括：在收获之前将未收获的烟草材料与处理溶液接触长达约24小时，其中，所述处理溶液从由以下各项构成的组中选出：(i)包含盐、糖或它们的组合的溶液；(ii)包含一种或多种酶的溶液；和(iii)包含一种或多种益生菌的溶液，其中，所述接触提供处理过的烟草材料，所述处理过的烟草材料在收获之后具有减少的总细菌含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述未收获的烟草材料从由以下各项构成的组中选出：烟草种子、烟草幼苗、未成熟的活植物、成熟的活植物、或其部分。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述处理过的烟草材料的总细菌含量在收获之后总共减少了至少约50％。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述处理过的烟草材料的总细菌含量在收获之后总共减少了至少约80％。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述烟草材料的总细菌含量包括革兰氏阴性细菌，并且其中，所述处理过的烟草材料的革兰氏阴性细菌含量在收获之后总共减少了至少约50％。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述烟草材料的总细菌含量包括乳杆菌属细菌，并且其中，所述处理过的烟草材料的乳酸菌含量在收获之后增加。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述处理溶液具有介于约1重量％和约4重量％之间的盐、糖或其组合的浓度。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述处理溶液包含NaCl。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述处理溶液包含乳酸菌。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述处理溶液包含瑞士乳杆菌。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述处理溶液具有介于约1×105菌落形成单位/mL和约1×1010菌落形成单位/mL之间的益生菌的浓度。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述处理溶液具有介于约10AU每株植物和约50000AU每株植物之间的酶的浓度。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述处理溶液还包括表面活性剂。
14.根据权利要求1所述的方法，还包括：
收获所述处理过的烟草材料；以及
将已收获的、处理过的烟草材料熟化以给出处理过的、熟化的烟草材料。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，所述处理溶液包含NaCl，所述NaCl的浓度是所述处理溶液的约0.5重量％至约15重量％，所述方法还包括：
收获所述处理过的烟草材料；以及
将已收获的、处理过的烟草材料熟化以给出处理过的、熟化的烟草材料。
16.根据权利要求14或15所述的方法，还包括：
使所述处理过的、熟化的烟草材料经受发酵；以及
将已发酵的烟草材料掺入无烟烟草产品中。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述发酵在比由未处理的、熟化的烟草材料发酵所需要的时间少的时间上完成。
18.一种根据权利要求16所述的方法制备的无烟烟草产品。
19.根据权利要求14或15所述的方法，其中，所述处理过的、熟化的烟草材料的烟草特异性亚硝胺含量相对于未处理的、熟化的烟草材料减少。
20.根据权利要求14或15所述的方法，还包括：
加工所述处理过的、熟化的烟草材料以提供呈能够掺入烟草产品中的形式的、经加工的烟草材料；以及
将所述经加工的烟草材料掺入无烟烟草产品或发烟制品中。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述经加工的烟草材料是切割填充物的形式或烟草掺合物的形式。
22.根据权利要求20所述的方法，其中，所述发烟制品在发烟时的特征在于，主流烟气的TSNA含量相对于未处理的控制发烟制品减少。
23.一种根据权利要求20所述的方法制备的、呈香烟或无烟烟草产品的形式的烟草产品。
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