CN109142718B - 一步法制备氨基胶体碳及其标记抗体的方法 - Google Patents
一步法制备氨基胶体碳及其标记抗体的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109142718B CN109142718B CN201810430647.6A CN201810430647A CN109142718B CN 109142718 B CN109142718 B CN 109142718B CN 201810430647 A CN201810430647 A CN 201810430647A CN 109142718 B CN109142718 B CN 109142718B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- amino
- colloidal carbon
- carbon
- antibody
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Carbon And Carbon Compounds (AREA)
Abstract
本发明涉及一种单分散的氨基胶体碳的制备方法，以及相应的标记抗体的方法。一步法制备氨基胶体碳，步骤包括：将葡萄糖和乙酰葡萄糖溶于稀碱溶液中，于微波消解仪中反应，压力1.0‑1.5MPa，温度为170‑210℃，时间10‑120min；将该产物离心并用水和乙醇洗涤三次，冷冻干燥得氨基胶体碳粉末。所得胶体碳粒径为100‑2000nm，分散性好（PDI<0.1），且具有多种可修饰基团，如氨基、羧基、羟基等。利用胶体碳的氨基，使用环氧基分子作为偶联臂，共价结合形成碳‑抗体复合物，步骤包括：使用缩水甘油醚在碱性环境下活化氨基胶体碳，将偶联臂接于胶体碳的氨基部位，再加入抗体，通过开环反应偶联至连接分子的另一端；加入BSA封闭后，将产物离心，用BSA溶液洗涤两次，再用复溶液复溶至初始体积，即得胶体碳‑抗体复合物。该标记方法避免了胶体碳酸性或中性条件活化时易聚集的问题，通过共价键偶联，复合物更稳定。
Description
技术领域
本发明属于碳纳米材料制备和免疫检测分析技术领域，涉及一步法制备氨基胶体碳，与之对应的抗体标记方法，以及在生物免疫检测领域的潜在应用。
背景技术
免疫层析分析方法是药残、真菌毒素快检领域常用的方法，具有操作简便、快速定性或半定量、灵敏度较高等特点，对于大量样本的现场初筛具有很大优势，目前市面上主要是胶体金免疫层析产品。相比于胶体金，胶体碳有着独特的优势：原料来源广泛、廉价，容易制备，成本更低，受pH值和盐浓度等因素影响小，更稳定；抗体标记效率高；黑白色差大，信噪比高，灵敏度更高，检测范围更广；生物兼容性好，无污染，更环保。自1993年VanAmerongen 等人将胶体碳作为一种新的标记物，用于免疫检测以来，胶体碳在生物快检领域得到了长足的发展，使之替代胶体金成为可能。
胶体碳的制备方法主要有水热法、超声法、模板法等，其中水热法具有成本低、产量高，所得产物富含丰富的官能团等特点，微波水热法进一步降低了反应时间，提高了反应时效，通常前驱体有葡萄糖、蔗糖、果糖等，可制得粒径为100-2000nm的胶体碳。胶体碳的蛋白标记通常是靠电荷吸附，也可用胶体碳上的官能团偶联，如一般采用EDC/NHS活化羧基再与蛋白的氨基偶联，因此种偶联方法在酸性环境下活化羧基最佳，而在酸性环境下，带羧基的胶体碳容易聚集，所以活化效率不高。胶体碳在碱性条件下溶解性很好，因此，需要开发一种具有氨基官能团的胶体碳，以及在碱性环境下偶联的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供了一种新的胶体碳的制备方法，该胶体碳富含伯氨基，同时也含有大量的羟基、羧基、醛基等其它可修饰基团。
为实现以上目的，本发明的技术方案是这样实现的：
1、一种新的氨基胶体碳的制备方法，包括如下步骤，
1）将糖类和酰氨糖类按比例2-10:1溶于稀碱溶液中，于微波消解仪中反应，反应压力为1.0-1.5MPa，温度为170-210℃，时间10-120min。
2）将步骤1）所得产物离心，洗涤数次得沉淀。
3）将步骤2）所得沉淀冷冻干燥得固体粉末，即为氨基胶体碳。
优选的，步骤1）中糖类选择葡萄糖，酰氨糖类选择N-乙酰-D-氨基葡萄糖，优选比例为4:1。
优选的，步骤1）中稀碱溶液选择5mM的NaOH溶液， 葡萄糖浓度为10%（w/v），乙酰氨基葡萄糖浓度2.5%（w/v）。
优选的，步骤1）微波消解仪设置为压力主控1.2Mpa，温度185℃，时间为20min，功率400W。
优选的，步骤2）离心力8000g 15min，洗涤溶液为水和乙醇，各洗涤三次。
优选的，步骤3）冷冻干燥时间为6-10小时。
优选的，步骤1）-3）所得胶体碳粒径为200nm，PDI<0.1。
本发明的另一目的是提出了利用该胶体碳的氨基标记抗体的方法，使标记物具有更高的稳定性，且不会导致胶体碳的聚集，可用于侧向流层析免疫分析，适合药残、真菌毒素残留等领域的检测。
2、一种氨基胶体碳标记抗体的方法，包括如下步骤，
1）称取固体胶体碳溶于稀碱溶液中，冰浴超声5-10min，使之充分分散，得到单分散胶体碳溶液。
2）取二缩水甘油醚加入至步骤1）的胶体碳溶液中，室温反应过夜，二缩水甘油醚的终浓度为0.01%-0.05%。
3）将抗体用抗体稀释液稀释至0.2-1mg/mL，逐滴加入至步骤2）的溶液中，室温反应过夜。
4）用缓冲液配制BSA母液，加入至步骤3）的溶液中，室温反应1-2小时。
5）将步骤4）得到的溶液离心，去掉上清，并用BSA溶液洗涤两次。
6）将步骤5）的沉淀用复溶液复溶至初始体积，即得免疫碳溶液，4℃保存。
优选的，步骤1）胶体碳浓度为0.1%（w/v），稀碱溶液为pH=11的NaOH水溶液，冰浴超声5min。
优选的，步骤2）二缩水甘油醚为乙二醇二缩水甘油醚或丙二醇二缩水甘油醚，终浓度为0.02%，室温（25℃）反应16小时。
优选的，步骤3）抗体稀释液为0.05M pH8.5的Tris缓冲液，抗体终浓度为0.02-0.1mg/mL，室温（25℃）反应14小时。
优选的，步骤4）缓冲液为0.05M pH8.5的Tris缓冲液，BSA母液浓度为10%（w/v），BSA终浓度为1%（w/v），室温（25℃）2小时。
优选的，步骤5）离心力8000g 15min，BSA溶液浓度为1%（w/v），0.05M pH8.5的Tris缓冲液配制。
优选的，步骤6）复溶液配方为：称取2gBSA、0.878gNaCl、243mgTris、10g蔗糖、50mgNaN3于100mL烧杯中，加入70mL超纯水溶解，调pH至9.0，后定容至100mL。
本发明提供了一种新的氨基胶体碳的制备方法和蛋白标记技术，主要创新之处在于：
传统的胶体碳虽然具有大量的羟基、羧基等亲水性基团，理论上可以用来标记蛋白质，但在实际操作过程中或多或少会出现各种问题，如活化条件（酸性或中性）易使碳析出而聚集，传统胶体碳及羧基胶体碳均富含大量羧基，在酸性和中性环境中溶解性明显低于在碱性环境中，但在碱性环境中活化剂如EDC易失活从而失去作用，因此传统胶体碳和羧基胶体碳主要还是以电荷吸附的形式组成碳-蛋白复合物，该复合物显然没有通过共价键偶联的复合物稳定性好。本发明制备的氨基胶体碳则解决了共价偶联的问题，该胶体碳不仅富含羟基、羧基，也含有大量的氨基，从而提供了一种以氨基作为偶联官能团的可能。本发明的另一创新点在于微波一步法制得含氨基的胶体碳，相比于其它通过后期修饰制得的氨基胶体碳，省去了大量的实验步骤和人工，成本低，绿色环保，具有高时效性，由微波消解仪程序控制反应条件，重复性好，制备的胶体碳形貌均一，可批量制备。本发明的抗体标记方法，采用环氧基分子作为胶体碳氨基与蛋白氨基的反应桥梁，反应环境为微碱性条件，完美地解决了胶体碳在酸性和中性易聚集的问题，从而提高了碳-蛋白复合物的稳定性。
附图说明
图1是实施例1所述的胶体碳的透射电子显微镜扫描图；
图2是实施例1所述的胶体碳的傅里叶红外图谱；
图3是实施例2所述的胶体碳的透射电子显微镜扫描图；
图4是氨基胶体碳标记抗体的反应示意图；
图5是呕吐毒素胶体碳试纸条标准曲线。
具体实施方式
为了方便理解本发明，下面具体列举了部分实施例，配合附图对本发明做进一步阐释，但不限于本文所描述的实施例。
实施例1
平均粒径200nm的氨基胶体碳的制备方法，步骤如下：
称取2.0g葡萄糖和0.5gN-乙酰-D-氨基葡萄糖溶于20mL 5mM的NaOH溶液中，混匀后转移至聚四氟乙烯消解罐中，插入温度计，安装好消解罐，设置微波消解仪程序：
运行程序开始反应，结束后自然降压降温，完毕后将反应产物转移至50mL离心管中，8000g离心15min，取出去上清，沉淀用水和乙醇各洗涤三次，最后冷冻干燥6小时，得到棕色粉末。通过透射电镜观察，如图1所示，所得胶体碳形貌规则，为圆球形，粒径约在200nm左右；通过动态光散射测得水合粒径为293.9nm，PDI为0.091；傅里叶红外图谱如图2所示，1616.87cm-1（N-H弯曲振动吸收峰）、1052.33cm-1（C-N伸缩振动吸收峰）、792.63cm-1（N-H面外变形振动吸收峰），三个吸收峰说明了氨基的存在，而2926.82cm-1（O-H伸缩振动吸收峰）、1702.28cm-1（C=O伸缩振动吸收峰）说明了羧基的存在。
实施例2
平均粒径1μm的氨基胶体碳的制备方法，步骤如下：
称取2.0g蔗糖和0.5gN-乙酰-D-氨基葡萄糖溶于20mL 5mM的NaOH溶液中，混匀后转移至聚四氟乙烯消解罐中，插入温度计，安装好消解罐，设置微波消解仪程序：
运行程序开始反应，结束后自然降压降温，完毕后将反应产物转移至50mL离心管中，6000g离心15min，取出去上清，沉淀用水和乙醇各洗涤三次，最后冷冻干燥8小时，得到黑色粉末。通过透射电镜观察，如图3所示，所得胶体碳形貌为圆球形，粒径约在1μm左右。通过动态光散射测得水合粒径为1216nm，PDI为0.086。
实施例3
氨基胶体碳标记呕吐毒素抗体的方法，反应流程如图4所示，具体操作步骤如下：
称取1mg胶体碳，加入1mL pH11的NaOH溶液，冰浴超声5min，得到浓度为0.1%（w/v）的单分散胶体碳溶液。取1μL乙二醇二缩水甘油醚，加9μL pH11的NaOH溶液混匀，再取2μL该混匀液加入到上述单分散胶体碳溶液中，室温反应16小时，得到胶体碳活化液。取2μg呕吐毒素抗体，用0.05M pH8.5的Tris缓冲液稀释成0.5mg/mL的抗体溶液，逐滴加入至胶体碳活化液中，室温反应14小时。向反应液中加入110μL 10%的BSA溶液（0.05M pH8.5的Tris缓冲液配制），室温反应2小时，结束后将反应产物转移至离心管，8000g离心15min，去掉上清，用1%BSA溶液（0.05M pH8.5的Tris缓冲液配制）洗涤两次，沉淀用复溶液复溶至1mL，4℃保存备用。
实验验证：如图5所示，使用该免疫碳制备的试纸条，曲线范围为1-80ppb，配合仪器读数，可以看出各点区分度很好（T/C比值），仪器读数见下表。
Claims (4)
1.一步法制备氨基胶体碳及其标记抗体的方法，其特征在于，包括氨基胶体碳的一步法制备，氨基碳共价偶联抗体的方法，包括如下步骤：
将糖和酰胺糖溶于稀碱溶液中，于压力1.0-1.5MPa，温度170-210℃下反应10-120min；离心，洗涤，冷冻干燥后得棕色或黑色氨基胶体碳粉末；所述糖和所述酰胺糖比例为2-10:1；稀碱溶液为1-10mM NaOH或KOH溶液；
配制胶体碳溶液，在pH=11的NaOH溶液存在下用乙二醇二缩水甘油醚活化，再加入抗体，生成胶体碳-蛋白复合物，加BSA溶液封闭，离心，洗涤，用复溶液复溶至初始体积，即得碳-抗体复合物。
2.根据权利要求1所述的制备氨基胶体碳及其标记抗体的方法，其特征在于，所制得的胶体碳含有氨基，反应一步到位，而非后期修饰得到氨基。
3.根据权利要求1所述的制备氨基胶体碳及其标记抗体的方法，其特征在于，所述糖为葡萄糖或蔗糖，所述酰胺糖为N-乙酰-D-氨基葡萄糖。
4.根据权利要求1所述的制备氨基胶体碳及其标记抗体的方法，其特征在于，制备的胶体碳粒径为100-2000nm，PDI＜0.1。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810430647.6A CN109142718B (zh) | 2018-05-08 | 2018-05-08 | 一步法制备氨基胶体碳及其标记抗体的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810430647.6A CN109142718B (zh) | 2018-05-08 | 2018-05-08 | 一步法制备氨基胶体碳及其标记抗体的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109142718A CN109142718A (zh) | 2019-01-04 |
| CN109142718B true CN109142718B (zh) | 2021-09-10 |
Family
ID=64801681
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810430647.6A Active CN109142718B (zh) | 2018-05-08 | 2018-05-08 | 一步法制备氨基胶体碳及其标记抗体的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109142718B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112698039A (zh) * | 2020-12-08 | 2021-04-23 | 黑龙江八一农垦大学 | 一种食品中罗丹明b胶体金刚碳检测试纸条的制备方法 |
| CN112698038A (zh) * | 2020-12-08 | 2021-04-23 | 黑龙江八一农垦大学 | 一种食品中苏丹红i胶体金刚碳检测试纸条的制备方法 |
| CN113003562A (zh) * | 2021-02-05 | 2021-06-22 | 广东粤港澳大湾区国家纳米科技创新研究院 | 一种碳纳米粒及其制备方法和应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011112068A1 (en) * | 2010-03-08 | 2011-09-15 | Universiti Sains Malaysia (U.S.M.) | Lateral flow device and method of detection of nucleic acid sequence |
| CN104316679A (zh) * | 2014-10-29 | 2015-01-28 | 南京基蛋生物科技有限公司 | 超支化聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球在化学发光免疫分析中的应用 |
| CN106824096A (zh) * | 2017-03-03 | 2017-06-13 | 武汉理工大学 | 一步水热法制备胺基功能化炭材料吸附剂 |
| CN106885907A (zh) * | 2015-12-16 | 2017-06-23 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 快速检测转基因植物中cp4-epsps的方法 |
-
2018
- 2018-05-08 CN CN201810430647.6A patent/CN109142718B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011112068A1 (en) * | 2010-03-08 | 2011-09-15 | Universiti Sains Malaysia (U.S.M.) | Lateral flow device and method of detection of nucleic acid sequence |
| CN104316679A (zh) * | 2014-10-29 | 2015-01-28 | 南京基蛋生物科技有限公司 | 超支化聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球在化学发光免疫分析中的应用 |
| CN106885907A (zh) * | 2015-12-16 | 2017-06-23 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 快速检测转基因植物中cp4-epsps的方法 |
| CN106824096A (zh) * | 2017-03-03 | 2017-06-13 | 武汉理工大学 | 一步水热法制备胺基功能化炭材料吸附剂 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Colloidal carbon particles as a new label for rapid immunochemical test methods: Quantitative computer image analysis of results;A.van Amerongen et al.;《Journal of Biotechnology》;19930831;第30卷(第2期);全文 * |
| Colloidal carbon spheres and their core/shell structures with noble-metal nanoparticles;Xiaoming Sun et al.;《Angew Chem Int Ed Engl》;20040228;第43卷(第5期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109142718A (zh) | 2019-01-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109142718B (zh) | 一步法制备氨基胶体碳及其标记抗体的方法 | |
| TWI464403B (zh) | Cellulose derivative fine particles, a dispersion thereof, a dispersion thereof and a diagnostic agent | |
| Peterson et al. | Chromatography of proteins. I. Cellulose ion-exchange adsorbents | |
| JPWO2011062157A1 (ja) | 有機着色微粒子、それを含む診断薬キット及びインビトロ診断方法 | |
| CN101220128B (zh) | 一种聚甲基丙烯酸甲酯复合微球及其制备方法和应用 | |
| Zhang et al. | Nano-crystalline cellulose-coated magnetic nanoparticles for affinity adsorption of glycoproteins | |
| CN104820100A (zh) | 基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法与应用 | |
| CN110152624A (zh) | 一种微孔聚合物包覆的亲水性树脂及其在糖肽富集中的应用 | |
| CN113687063B (zh) | 一种基于苯硼酸交联剂的糖蛋白动态光散射免疫方法 | |
| CN110240704A (zh) | 基于磁性分子印迹技术的靶向酶固定化载体的制备方法及应用 | |
| CN111610323A (zh) | 一种等离激元增强荧光免疫检测芯片及其应用 | |
| CN106771149B (zh) | 传染性法氏囊病毒抗原偶联磁性微粒及其制备方法和应用 | |
| CN114755337B (zh) | 二硫键介导的光交联磁性二氧化硅亲和探针及其制备方法和应用 | |
| CN113304708B (zh) | 介孔分子筛硼亲和表面印迹的糖蛋白微反应器的制备方法 | |
| CN111320696A (zh) | 基于链霉亲和素化胶乳的mmp-3抗体复合物及其试剂盒 | |
| CN108344793B (zh) | 一种基质及其制备方法、代谢分子的质谱分析检测方法 | |
| CN109444401A (zh) | 一种磁微粒化学发光产品的制备方法 | |
| WO2019059182A1 (ja) | 有機着色微粒子、診断薬キット、及びインビトロ診断方法 | |
| CN110433779A (zh) | 一种蛋白质酪氨酸磷酸化分子识别材料与方法 | |
| CN106477585A (zh) | 一种功能化介孔硅基材料及其制备方法和应用 | |
| CN111195512A (zh) | 蛋白a包覆磁性纳米团簇以及制备方法及其在捕获抗体方面的应用 | |
| CN116786834A (zh) | 一种大粒径胶体金及其制备方法和应用 | |
| CN111103429B (zh) | 人血清白蛋白磁性仿生免疫分析试剂盒 | |
| CN105717288B (zh) | 一种表面修饰的磁性纳米颗粒及其制备方法与应用 | |
| CN113003562A (zh) | 一种碳纳米粒及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20190104 Assignee: Guangna Dakang (Guangzhou) Biotechnology Co.,Ltd. Assignor: WUHAN NANO DIAGNOSIS FOR HEALTH BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Contract record no.: X2021980010910 Denomination of invention: Preparation of amino colloidal carbon and its labeled antibody by one-step method Granted publication date: 20210910 License type: Exclusive License Record date: 20211019 |
|
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |