CN109134294B - 一种顺式双键酰胺类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种顺式双键酰胺类化合物，其结构式如下，本发明顺式双键酰胺类化合物的制备方法，以及在制备抗类风湿关节炎药物中的应用。本发明首次发现了含有顺式双键的酰胺类化合物在抑制类风湿关节炎滑膜细胞增殖中的活性，可用于制备抗类风湿关节炎的药物；并通过柱层析、薄层层析、分子筛层析成功在瓜馥木中提取出了该含有顺式双键的酰胺类化合物。

Description

一种顺式双键酰胺类化合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种顺式双键酰胺类化合物及其制备方法与应用，属于植物化学技术领域。
背景技术
瓜馥木(Fissistigma oldhamii(Hemsl.)Merr.)，别名小香花藤、藤龙眼、降香藤，是番荔枝科(Annonaceae)瓜馥木属植物。该植物可做药用，茎、叶可以治骨折水肿，全株可以治疗风湿骨痛、手足麻木等。未见从瓜馥木分离得到的含有顺式双键的酰胺类化合物的报道，也未见该类化合物在抑制类风湿关节炎滑膜细胞增殖中的应用中的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种从瓜馥木中提取分离得到的含有顺式双键的酰胺类化合物。
本发明进一步解决的技术问题是提供上述含有顺式双键酰胺类化合物的制备方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述含有顺式双键酰胺类化合物的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：
一种顺式双键酰胺类化合物，它的结构通式如下：
Figure BDA0001755515770000011
其中，R1、R2、R3、R4分别独立选自为-OH或-OCH3或H。
上述顺式双键酰胺类化合物，优选的结构式如下：
Figure BDA0001755515770000012
上述顺式双键酰胺类化合物的制备方法，它包括如下步骤：
(1)制备瓜馥木提取物
将瓜馥木干燥的茎用30～95％v/v的乙醇冷浸或者是热提，得到提取液，减压浓缩成膏状，即为瓜馥木提取物；
(2)分离纯化
将上述提取物用水稀释制成悬浮液后，依次用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯萃取液浓缩成浸膏，经柱层析、薄层层析、分子筛层析以及半制备高效液相分离得到该含有顺式双键的酰胺类化合物。
步骤(1)中，所述减压浓缩的条件为：温度控制在在25～100℃，压力控制在0.6-0.01Pa。
步骤(2)中，所述浓缩为减压浓缩，条件为：温度控制在25～100℃，压力控制在0.6-0.01Pa。
其中，所述柱层析的条件为：用200～300目硅胶上柱，乙酸乙酯体积百分数为25％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为洗脱剂。
所述薄层层析的条件为：以乙酸乙酯体积百分数为33.3％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为展开剂。
所述分子筛层析的条件为：分子筛为Sephadex LH-20，以氯仿体积百分数为50％的氯仿-甲醇混合溶剂为洗脱剂。
所述半制备高效液相分离的条件为：半制备柱为C-18填料，以乙腈体积百分数为50％的乙腈-水混合溶剂为洗脱剂。
本发明还要求保护上述顺式双键酰胺类化合物在制备抗类风湿关节炎药物中的应用。
上述顺式双键酰胺类化合物在制备抑制类风湿关节炎滑膜细胞增殖药物中的应用也在本发明的保护范围之内。
有益效果：
本发明首次发现了含有顺式双键的酰胺类化合物在抑制类风湿关节炎滑膜细胞增殖中的活性，可用于制备抗类风湿关节炎的药物；并通过柱层析、薄层层析、分子筛层析成功在瓜馥木中提取出了该含有顺式双键的酰胺类化合物。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1是该顺式双键酰胺类化合物结构通式示意图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。
实施例1含有顺式双键的酰胺类化合物的制备。
瓜馥木干燥的茎10Kg按常规用95％v/v的乙醇浸提3次每次7天，得到提取液，将提取液减压浓缩成膏状，得到瓜馥木提取物1200g。将提取物用蒸馏水(3L)稀释成悬浮液，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯萃取(3L×3次)，将乙酸乙酯萃取液浓缩成浸膏(约250g)，进行硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯混和溶剂(100:0-0:100，V/V)及乙酸乙酯-甲醇(100:0-0:100，V/V)按极性递增进行硅胶柱层析，并按每次约400mL收集馏分。通过TLC检测合并相似流分分成7个组分，即Fr.1-7。Fr.2组分通过分子筛Sephadex LH-20，以氯仿体积百分数为50％的氯仿-甲醇混合溶剂为洗脱剂进行葡聚糖凝胶柱层析去掉色素后，以乙酸乙酯体积百分数为33.3％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为展开剂进行TLC薄层层析合并较纯的流分，再用半制备高效液相分离进行制备，洗脱溶剂为按体积配比为1:1的乙腈和水，最终得到含有顺式双键的酰胺类化合物化合物Fissistigmamide A。
含有顺式双键的酰胺类化合物化合物Fissistigmamide A的结构鉴定结果如下：
Fissistigmamide A：为白色粉末状。紫外254nm有暗斑。HR-ESI-MS m/z 342.1337[M-H]-，结合1H-NMR和13C NMR可知分子式为C19H21NO5。根据1H/13C-NMR和DEPT可知化合物由5-hydroxy-6-methoxycinnamoyl和3-methoxydopamine组成，通过HMBC中H-2’和C-1相关可知这两部分是通过酰胺键连接在一起。至此，确定该化合物为含有顺式双键的酰胺类化合物，其结构式见图1。
Fissistigmamide A：Colorless gum；IR(KBr)νmax -1 3321,2948,1643 and 710cm-1；HR-ESI-MS m/z 342.1337[M-H]-(C19H20NO5；calc’d 342.1341)；1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ:7.20(1H,d,J＝2.0Hz,H-5),6.91(1H,dd,J＝8.4,2.0Hz,H-9),6.84(1H,d,J＝8.4Hz,H-8),6.77(1H,d,J＝8.0Hz,H-8'),6.63(1H,J＝12.4Hz,H-3),6.58(1H,d,J＝2.0,H-5'),6.52(1H,dd,J＝8.0,2.0Hz,H-9'),5.81(1H,J＝12.8Hz,H-2),4.00(1H,d,J＝10.4,H-4”b),3.87(1H,dd,J＝5.6,3.2,H-6'β),3.84(3H,s,6-OMe),3.86(3H,s,7-OMe),3.81(3H,s,6'-OMe),3.49(2H,dd,J＝12.8,6.8Hz,H-2'),2.68(1H,t,J＝6.8Hz,H-3')；13CNMR(CDCl3,100MHz)δ:167.6(C-1),146.8(C-6′),146.5(C-7),146.4(C-6),144.4(C-7'),137.0(C-2),130.5(C-4'),127.4(C-4),123.5(C-9),122.6(C-2),121.3(C-9'),114.6(C-8),114.4(C-8'),111.6(C-5),111.2(C-5'),56.1(6'-OMe),56.0(7-OMe),40.9(C-2'),35.1(C-3').
实施例2药理活性实验
实验材料
细胞：滑膜细胞(原代大鼠滑膜细胞)。
细胞培养液：原代大鼠滑膜细胞培养基。
试剂：噻唑蓝(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazoliumbromide，MTT，Sigma生产)。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)试剂盒(购自碧云天公司)。甲氨蝶呤(methot rexate，MTX，上海信宜药厂有限公司，批号20140307)。
仪器：96孔细胞培养板；infinite 200Pro多功能酶标仪。
实验方法
MTT法测定药物对滑膜细胞的抑制作用
取对数期的滑膜细胞接种至96孔培养板(1×104个细胞/孔)，设置为空白组(不给予药物)、甲氨蝶呤组(给予1μg/mL的甲氨蝶呤)、给药组(给予10、50、100μg/mL浓度的药物)，培养孵育过夜后用于实验。细胞给予不同浓度的药物培养48h后，每孔加入10μL浓度为5mg/mL MTT，继续培养4h后，小心吸弃培养上清液，每孔加入100μL的DMSO溶解甲瓒结晶，室温震摇5min，完全溶解后，用酶标仪在570nm处检测光密度(OD值)。根据OD值计算细胞存活率。
Figure BDA0001755515770000041
统计方法
采用SPSS 22.0统计软件分析实验数据。结果用均数±标准差
Figure BDA0001755515770000042
表示，用单因素方差(one-way ANOVA)分析组间差异。以P<0.05认为具有统计学差异。
实验结果
MTT法测定药物对滑膜细胞的抑制作用
使用不同浓度药物培养48h后，MTT法检测细胞增殖作用结果见下表1。结果表明Fissistigmaterpene A对滑膜细胞具有较好的抑制作用。
表1各药物对滑膜细胞的抑制作用
Figure BDA0001755515770000051
注：与空白组比较，*P﹤0.05，**P﹤0.01。
以上结果表明该化合物浓度在20μg/mL对滑膜细胞的抑制率为69.83％，体现出较好的抑制活性，可用于制备抗类风湿关节炎药物。
本发明提供了一种顺式双键酰胺类化合物及其制备方法与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (6)

1.一种顺式双键酰胺类化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）制备瓜馥木提取物
将瓜馥木干燥的茎用30~95%v/v的乙醇冷浸或者是热提，得到提取液，减压浓缩成膏状，即为瓜馥木提取物；
（2）分离纯化
将上述提取物用水稀释制成悬浮液后，依次用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯萃取液浓缩成浸膏，经柱层析、薄层层析、分子筛层析以及半制备高效液相分离得到该顺式双键酰胺类化合物，其结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
2.根据权利要求1所述顺式双键酰胺类化合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述减压浓缩的条件为：温度控制在25~100℃，压力控制在0.6-0.01 Pa。
3.根据权利要求1所述顺式双键酰胺类化合物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述柱层析的条件为：用200~300目硅胶上柱，乙酸乙酯体积百分数为25%的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为洗脱剂。
4.根据权利要求1所述顺式双键酰胺类化合物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述薄层层析的条件为：以乙酸乙酯体积百分数为33.3%的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为展开剂。
5.根据权利要求1所述顺式双键酰胺类化合物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述分子筛层析的条件为：分子筛为Sephadex LH-20，以氯仿体积百分数为50%的氯仿-甲醇混合溶剂为洗脱剂。
6.根据权利要求1所述顺式双键酰胺类化合物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述半制备高效液相分离的条件为：半制备柱为C-18填料，以乙腈体积百分数为50%的乙腈-水混合溶剂为洗脱剂。
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