CN109125334A - 毛蕊花糖苷在制备治疗新生儿缺氧缺血性脑病药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了毛蕊花糖苷(Verbascoside)在制备治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤药物中的用途。本发明的实验结果表明在安全剂量范围内使用时，剂量为240mg/kg的毛蕊花糖苷可以显著改善新生大鼠缺氧缺血模型早期神经功能障碍，减少缺血区域脑梗死体积以及神经元坏死，证明毛蕊花糖苷具有促进神经功能恢复和预防新生儿缺氧缺血性脑病后致残致死的作用。

Description

毛蕊花糖苷在制备治疗新生儿缺氧缺血性脑病药物中的用途

技术领域

本发明涉及毛蕊花糖苷的应用，特别涉及毛蕊花糖苷在制备治疗新 生儿缺氧缺血性脑损伤药物中的用途。

背景技术

新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD) 是由于围产期窒息、羊水污染等各种因素导致的缺氧与脑血流量减少或 暂停,引起胎儿及新生儿脑功能障碍的疾病。HIBD是导致新生儿神经系 统疾病的主要原因，也是全球儿童死亡率和发病率的主要因素，其发病 率为1-6‰，约40％的幸存儿也深受其害，会产生运动、情感和认知功能 障碍，重者引起新生儿死亡或神经系统后遗症，如脑瘫、癫痫、智力低 下、记忆力及视听障碍，严重影响了新生儿的生活质量，也产生了很大 的家庭和社会负担。新生儿HIBD的发病机制复杂，对新生儿围产期窒息 中度至重度患者来说，迄今为止最有效的神经保护干预措施是亚低温治 疗，目前已被许多发达国家纳入新生儿重症监护病房。然而，患有HIBD 的婴儿中只有六分之一会受益于低温疗法，许多婴儿仍有严重的不良后 果。因此及早恢复脑组织血氧的供应、促进损伤后的修复、减少其损伤 后遗症、寻找安全有效的神经保护剂一直是围产医学和神经医学领域研 究的重点，具有重要的理论意义及积极的临床应用前景。

毛蕊花糖苷(Verbascoside)是从肉苁蓉中分离纯化的一种苯乙醇苷 类化合物,也是药典记载的肉苁蓉主要活性成分之一，经纯化提取后为白 色无定型粉末，目前主要被用于人类的医疗保健。毛蕊花糖苷能够通过 血脑屏障，无毒性且代谢迅速，其具有抗氧化、抗炎杀菌、免疫调节、 舒张血管等多种药理作用。已有学者研究证明肉苁蓉总苷对脑缺血具有 保护作用，但关于毛蕊花糖苷对新生儿缺氧缺血性脑损伤的保护作用目

发明内容

本发明的目的是通过对毛蕊花糖苷的药理作用研究，提供毛蕊花糖 苷在制备治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤药物中的用途。

本发明提供毛蕊花糖苷在制备治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤药物中 的用途，所述毛蕊花糖苷的结构式如式(1)所示：

本发明所用的毛蕊花糖苷均可经商购获得。

具体地，所述新生儿缺氧缺血性脑损伤为急性期或修复期的新生儿 缺氧缺血性脑损伤。

具体地，所述毛蕊花糖苷单次应用剂量仅限于不引起中枢抑制的剂 量。

具体地，所述毛蕊花糖苷单次应用剂量为60-240mg/kg。

优选地，所述毛蕊花糖苷单次应用剂量为120-240mg/kg。

优选地，所述毛蕊花糖苷单次应用剂量为240mg/kg。

具体地，所述药物被配制为通过胃肠道或肠胃外给予的剂型。

优选地，所述药物的剂型为药剂学上允许的口服剂型、注射液剂型 或粉针剂。

具体地，所述的毛蕊花糖苷作为唯一活性成分在制备治疗新生儿缺 氧缺血性脑损伤药物中的用途。

本发明提供的毛蕊花糖苷在制备治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤药物 中的用途具有以下有益效果：

(1)毛蕊花糖苷在不降低血糖的剂量下能显著减少脑梗死体积和细 胞坏死率；

(2)毛蕊花糖苷能减弱过度自噬引起的损伤作用，显著抑制缺氧缺 血后脑组织Beclin-1，LC3-Ⅱ蛋白的表达以及促进P62蛋白的表达。

本发明首次证实，毛蕊花糖苷具有治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤所 致神经元损伤的作用，可用于制备新生儿缺氧缺血性脑损伤的治疗药物。

附图说明

图1为毛蕊花糖苷对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤早期神经功能作用 统计图；(Righting reflex times：翻正反射时间；Negative geotaxis times：被动趋地时间；VB：毛蕊花糖苷组)。

图2为毛蕊花糖苷对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤保护作用的TTC染 色图。

图3为毛蕊花糖苷对新生大鼠缺氧缺血后脑组织病理变化影响的大 脑海马CA3区和皮层病理变化HE染色图。

图4为毛蕊花糖苷对新生大鼠缺氧缺血后脑组织病理变化影响大脑 海马CA3区和皮层病理变化尼氏染色图。

图5为毛蕊花糖苷对新生大鼠大脑缺血侧海马CA3区和皮层Beclin- 1免疫阳性细胞表达的免疫荧光图；(DAPI：4',6-二脒基-2-苯基吲哚； Merge：Beclin-1和DAPI的合成)。

图6为毛蕊花糖苷对新生大鼠大脑缺血侧海马CA3区和皮层LC3免 疫阳性细胞表达的免疫荧光图；(DAPI：4',6-二脒基-2-苯基吲哚； Merge：LC3和DAPI的合成)。

图7为毛蕊花糖苷对新生大鼠大脑缺血侧海马CA3区和皮层p62免 疫阳性细胞表达的免疫荧光图；(DAPI：4',6-二脒基-2-苯基吲哚； Merge：p62和DAPI的合成)。

图8为毛蕊花糖苷对新生大鼠缺血侧脑组织Beclin-1蛋白表达水平 的影响(sham：假手术组；HI：模型组；VB：毛蕊花糖苷组；ratio of Beclin-1：Beclin-1蛋白表达率；与假手术组比较：^##P<0.01，与模型 组比较：^＊＊P<0.01(n＝6))。

图9为毛蕊花糖苷对新生大鼠缺血侧脑组织LC3-Ⅱ蛋白表达水平的 影响(sham：假手术组；HI：模型组；VB：毛蕊花糖苷组；ratio of LC3-Ⅱ：LC3-Ⅱ蛋白表达率；与假手术组比较：^##P<0.01，与模型组比 较：^＊＊P<0.01(n＝6))。

图10为毛蕊花糖苷对新生大鼠缺血侧脑组织P62蛋白表达水平的影 响(sham：假手术组；HI：模型组；VB：毛蕊花糖苷组；ratio of P62： P62蛋白表达率；与假手术组比较：^##P<0.01，与模型组比较：^＊＊P<0.01 (n＝6))。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例中使用 的毛蕊花糖苷均为式(1)所示的结构。毛蕊花糖苷(纯度＞98.84％，分 子量624.59)

实施例1

毛蕊花糖苷在制备治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤药物中的用途，其 中，新生儿缺氧缺血为急性期缺血缺氧性脑损伤，毛蕊花糖苷单次应用 剂量为新生大鼠60mg/Kg，药物的剂型为注射液剂型。

实施例2

毛蕊花糖苷在制备治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤药物中的用途，其 中，新生儿缺氧缺血为修复期缺血缺氧性脑损伤，毛蕊花糖苷单次应用 剂量为新生大鼠120mg/Kg，药物的剂型为粉针剂型。

实施例3

毛蕊花糖苷在制备治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤药物中的用途，其 中，新生儿缺氧缺血为修复期缺血缺氧性脑损伤，毛蕊花糖苷单次应用 剂量为新生大鼠240mg/Kg，药物的剂型为粉针剂型。

下面的动物实验进一步说明了上述实施例1至3的效果：

一、实验材料

1.1动物处理

7日龄，新生SD大鼠，12-18g，购自宁夏医科大学实验动物中心，动 物生产许可证号：SCXK(宁)2015-0001。喂养条件包括标准饲料，自 来水，室温保持在(24±2)℃，湿度50-60％，每日光照与黑暗时间各 12h。实验前，将动物置于实验环境适应3天。

1.2实验药品及仪器

毛蕊花糖苷(北京中科质检生物技术有限公司)，以生理盐水配制， 母液浓度240mg/Kg，-20℃贮存。2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride，TTC，购自sigma公司)，苏木精-尹 红(美国Sigma公司)，Nissl染液(北京索莱宝科技有限公司)，荧 光染料DAPI(ZSGB-BIO公司)，兔抗Beclin-1、LC3、P62(protein公 司)，酶标仪(1510，Thermo Fisher公司)，激光共聚焦显微镜(TCS-SP，德国公司)，电泳仪、电转仪(Powerpac basic,美国Bio-Rad公 司)，凝胶成像分析仪(JS-860B,上海培清公司)。

1.3实验动物分组及给药

新生SD大鼠，12-18g，随机分为假手术组，缺氧缺血(HIBD)模型 组，毛蕊花糖苷不同剂量组(60mg/Kg、120mg/Kg、240mg/Kg)。新生大 鼠在手术造模后，毛蕊花糖苷各剂量组给药(给药量0.1ml/10g体重，腹 腔给药，每隔12小时一次)。假手术组和模型组同法给予等量的生理盐 水。在新生大鼠缺氧缺血48h后进行早期神经功能反射，脑梗死体积、组 织病理与形态学改变、分子生物学表达变化等药效学评价。

1.4新生大鼠缺氧缺血(HIBD)模型建立

参照Rice法，将7日龄SD大鼠放入含乙醚的密闭玻璃缸内进行吸入麻 醉，60-90s麻醉后固定于操作台上。在颈部自甲状软骨下缘正中作一长 约1.0cm皮肤切口，钝性分离皮下组织和肌肉，分离左侧颈总动脉，穿过 4.0号丝线，双线结扎血管，中间剪断，用无损伤线缝合伤口后放回鼠笼， 每只动物手术时间不超过5分钟，放回母鼠笼恢复2小时。向缺氧箱内充 92％氮气和8％氧气混合气体，同时用测氧仪监测箱内氧浓度，使氧浓度 保持在8％，将术后新生大鼠放入箱内，缺氧箱内温度恒定在37℃，持续 2.5小时。在缺氧结束后恢复正常氧供，之后放回母鼠笼里继续喂养。假 手术组仅切开颈部皮肤，分离左侧颈总动脉，不结扎，直接缝合，不缺 氧。在整个实验过程中，房间温度应保持在26℃，湿度60-70％。

二、实验过程

(一)早期神经行为反射检测

1.1实验方法：

a.翻正反射(Righting reflex)：将新生大鼠放于水平台上处于仰 卧位，记录其转到俯卧位置并且四只脚接触到平台的时间。b.被动趋地 (Negative geotaxis)：将新生大鼠放置于45℃长30cm的倾斜板上， 其后肢位于板中央。记录其开始转身至前肢达到板子上缘的时间。观察 时间的上限为60s。

表1.毛蕊花糖苷对新生大鼠缺氧缺血损伤早期神经行为反射的影响 (n＝6)

(与假手术组比较：^##p<0.01；与模型组比较：*p<0.05,**p<0.01)

1.2实验结果：

由表1可知，单次腹腔注射毛蕊花糖苷对新生大鼠缺氧缺血后所致 的早期神经行为反射变化呈现双向反应，随剂量增加，早期神经行为反 射的时间降低，至240mg/kg时，神经行为反射的时间最短(与模型组对 比^*P﹤0.05或^**P﹤0.01)，此后随剂量的增加早期神经行为反射的保护 作用减弱或几无。提示毛蕊花糖苷三个剂量均具有改善缺氧缺血新生大鼠脑损伤后翻正反射障碍的作用；毛蕊花糖苷(240mg/kg、120mg/kg) 可以改善缺氧缺血新生大鼠脑损伤后被动趋地反射障碍的作用。

(二)脑梗死体积测定

2.1实验方法：

用乙醚麻醉新生大鼠并断头处死，冰上迅速取出脑组织，去除嗅球、 小脑及低位脑干，组织包埋液-20℃冷冻15min。自前极(anterior pole) 冠状面连续切取5片厚度的2mm脑切片置于2％2，3，5-氯化三苯基四氮唑 溶液中37℃避光孵育15min，10％甲醛中性缓冲液(pH7.4)固定过夜。 自动微距相机拍摄，Image pro plus5.1图像分析软件计算并统计脑梗 死体积。

表2.毛蕊花糖苷对缺氧缺血脑缺血损伤新生大鼠梗死体积的影响 (n＝6)

(与假手术组比较：^##p<0.01；与模型组比较：**p<0.01)

2.2实验结果：

由表2和图2可以看出，单次腹腔注射毛蕊花糖苷对新生大鼠缺氧缺 血所致脑梗死体积的增加呈双向反应，随剂量增加脑梗死体积降低，至 240mg/kg时保护作用最强(与模型组相比：^**P﹤0.01)，此后随剂量的 增加保护作用减弱或几无。提示毛蕊花糖苷(240mg/kg、120mg/kg)具 有降低新生大鼠缺氧缺血后脑梗死体积的作用。

(三)HE染色观察组织结构病理变化

3.1实验方法：

苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，HE staining)， 组织石蜡切片于70℃烘箱中烘烤2h，之后将切片依次浸泡于二甲苯Ⅰ (10min)，二甲苯Ⅱ(5min)，无水乙醇Ⅰ(1min)，无水乙醇Ⅱ (1min)，95％乙醇(30s)，80％乙醇(30s)和70％乙醇(30s)，水洗3次，之后于苏木素中浸泡5min，水洗3次，在1％的盐酸酒精溶液中浸泡 20s，水洗，伊红溶液中浸泡2min，水速洗，之后石蜡切片继续依次浸泡 于80％乙醇(30s)，95％乙醇(30s)，无水乙醇Ⅰ(1min)，无水乙醇 Ⅱ(3min)，二甲苯Ⅰ(2min)和二甲苯Ⅱ(2min)，最后用中性树胶 封片，每组新生大鼠脑组织石蜡切片HE染色完成后，置于显微镜下观察， 每张切片分别取200×和400×两个视野，每个视野分别取3-6个区域进行 拍照记录。

3.2实验结果：

如图3所示，单次腹腔注射毛蕊花糖苷对新生大鼠缺氧缺血所致的 脑组织结构病理变化影响呈现双向反应，对比缺氧缺血模型组，随着毛 蕊花糖剂量增加，脑缺血区域的海马CA3区和皮层损伤性病理变化减弱， 神经元数目增加，水肿、空泡样改变减弱，核固缩边集减弱。提示毛蕊 花糖苷(240mg/kg)具有减轻新生大鼠缺氧缺血后脑组织细胞结构病理 性损伤的作用。

(四)尼氏染色观察组织结构坏死变化

4.1实验方法：

尼式染色(Nissl staining)，石蜡切片于70℃烘箱中烘烤2h，之 后将玻片依次浸泡于二甲苯Ⅰ(10min)，二甲苯Ⅱ(5min)，无水乙醇 Ⅰ(1min)，无水乙醇Ⅱ(1min)，95％乙醇(30s)，80％乙醇(30s) 和70％乙醇(30s)，水洗3次，之后于尼式染液中50℃烤箱孵育1h，水洗 3次，在1％的盐酸酒精溶液中浸泡20s，水洗，最后用中性树胶封片，每 组新生大鼠脑组织石蜡切片Nissl染色完成后，置于显微镜下观察，每张 切片分别取200×和400×两个视野，每个视野分别取3-6个区域进行拍照 记录。

4.2实验结果：

如图4所示，单次腹腔注射毛蕊花糖苷对新生大鼠缺氧缺血所致的脑 组织结构坏死变化影响呈现双向反应，对比缺氧缺血模型组，随毛蕊花 糖苷剂量增加缺血侧海马CA3区和皮质损伤性病理变化逐渐减弱，神经 元逐渐整齐，尼氏体数量逐渐增加。给予毛蕊花糖苷240mg/kg时，神经 元组织病理损伤最轻，提示毛蕊花糖苷对新生大鼠缺氧缺血损伤后脑组 织坏死的神经元具有保护作用。

(五)免疫荧光法测定新生大鼠缺氧缺血损伤侧海马CA3区和皮层 Beclin-1，LC3和P62免疫阳性细胞表达水平

5.1实验方法：

石蜡切片于70℃烘箱烘2h，常规脱蜡复水，切片浸入含有0.01M/L的 枸橼酸钠缓冲液的高压锅中煮沸10min，自然冷却至室温，完成抗原热修 复。山羊血清封闭非特异性抗原，室温放置20min，勿冲，按一定的稀释 比例滴加一抗(Beclin-1 1:50，LC3 1:50，P62 1:50)，4℃过夜，次 日取出，37℃复温45min，用PBS冲洗3次，每次5min。滴加1：100的 TRITC(四甲基异硫氰酸罗丹明)标记山羊抗兔二抗，湿暗盒中避光37℃ 孵育1h，之后PBS冲洗，滴加荧光染料DAPI处理15min封片，每张切片在 海马CA3区和皮层各取6个区域在200×和400×视野下激光共聚焦观察、 拍照，并用IPP软件统计各组新生大鼠缺血侧大脑皮层中各相关蛋白的平 均光密度值。

5.2实验结果：

如图5，6，7所示，用免疫荧光检测组织细胞Beclin-1，LC3和P62 免疫阳性细胞表达的强度，在激光共聚焦显微镜下，各组新生大鼠脑缺 血侧海马CA3区和皮层组织切片均可见阳性信号表达。与假手术组相比， 缺氧缺血(HIBD)模型组中Beclin-1，LC3在海马CA3和皮质区域免疫 阳性细胞表达数量及其信号强度显著增强而P62显著减弱；对比缺氧缺血(HIBD)模型组，毛蕊花糖苷(240mg/kg)给药组其Beclin-1，LC3 免疫阳性细胞在海马CA3和皮质区域表达数量及其阳性信号强度显著下 降而P62显著增多。提示毛蕊花糖苷的保护作用可能通过减少自噬相关 蛋白的表达，抑制自噬的过度发生，从而促进脑缺血后自噬性神经元的 存活，对新生大鼠缺血缺氧脑损伤起到一定的保护作用。

(六)Western blot检测新生大鼠脑缺血损伤侧脑组织Beclin-1、 LC3II、P62蛋白的表达

6.1实验方法：

使用凯基全蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA蛋白含量检测试剂盒 测定样本总蛋白质浓度并标定蛋白统一浓度。SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳， 用将PVDF膜进行湿法转膜。转膜结束后取出PVDF膜，将其置入5％脱脂奶 粉封闭液中封闭1h。封闭后孵育用5％脱脂奶粉稀释的一抗，4℃过夜，次 日室温复温1h，洗膜孵育二抗。用PBST洗PVDF膜3次，每次15min。滴加 蛋白化学发光剂(ECL)，PVDF膜固定于片盒内，压入胶片进行曝光。取 出胶片，放入显影液和定影液中各1min，最后清水清洗。凝胶图像分析 成像系统(培清，JS-860B)对胶片上每个目的条带进行扫描和图像分析。

6.2实验结果：

如图8，9,10所示，与假手术组比较，缺氧缺血(HIBD)模型组，Beclin‐1、LC3II蛋白表达显著增多而P62蛋白表达显著减少(##P<0.01)；与模型组比较，毛蕊花糖苷 (240mg/kg)组新生大鼠脑缺血侧脑组织Beclin‐1、LC3II蛋白表达明显减少(*P﹤0.05,**P ﹤0.01)；与模型组比较，毛蕊花糖苷(240mg/kg)组新生大鼠脑缺血侧脑组织P62蛋白表 达明显增多(*P﹤0.05,**P﹤0.01)。提示毛蕊花糖苷的保护作用可能通过减少Beclin‐1、LC3II 的表达、上调P62蛋白的表达，减少缺氧缺血损伤后自噬的过度产生,从而促进脑缺血后自 噬性神经元的存活，对新生儿缺氧缺血性脑损伤起到一定的保护作用。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改 进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.毛蕊花糖苷在制备治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤药物中的用途，其特征在于：所述毛蕊花糖苷的结构式如式(1)所示：

2.根据权利要求1所述的毛蕊花糖苷在制备治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤药物中的用途，其特征在于：所述缺氧缺血性脑损伤为急性期或修复期的新生儿缺氧缺血性脑损伤。

3.根据权利要求1所述的毛蕊花糖苷在制备治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤药物中的用途，其特征在于：所述毛蕊花糖苷单次应用剂量仅限于不引起中枢抑制的剂量。

4.根据权利要求3所述的毛蕊花糖苷在制备治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤药物中的用途，其特征在于：所述毛蕊花糖苷单次应用剂量为60-240mg/kg。

5.根据权利要求4所述的毛蕊花糖苷在制备治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤药物中的用途，其特征在于：所述毛蕊花糖苷单次应用剂量为120-240mg/kg。

6.根据权利要求5所述的毛蕊花糖苷在制备治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤药物中的用途，其特征在于：所述毛蕊花糖苷单次应用剂量为240mg/kg。

7.根据权利要求1-6任一项所述的毛蕊花糖苷在制备治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤药物中的用途，其特征在于：所述的药物被配制为通过胃肠道或肠胃外给予的剂型。

8.根据权利要求7所述的毛蕊花糖苷在制备治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤药物中的用途，其特征在于：所述药物的剂型为药剂学上允许的口服剂型、注射液剂型或粉针剂。