CN106552256B - Pd149163在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了PD149163在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用。本发明揭示了PD149163在不影响脑缺血再灌过程中病灶区脑血流的前提下、通过降温作用发挥对局灶性脑缺血再灌注所致大鼠急性期脑损伤的保护作用。PD149163可能通过阻滞AMPK‑mTOR信号通路、抑制自噬而对抗脑缺血再灌注急性期所致神经细胞凋亡。

Description

PD149163在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用

技术领域

本发明属于药物研发技术领域，具体涉及PD149163在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用。

背景技术

脑卒中是由脑局部血供异常而引起的神经功能损伤，分为缺血性及出血性卒中两大类。缺血性脑卒中是因脑部血液供应障碍、缺血缺氧导致局部组织坏死、软化，从而引起局灶性或完全神经功能缺损的症状。缺血性脑卒中约占所有卒中病例的85％，其损伤的核心机制在于脑组织的缺血、缺氧及再灌注损伤。目前，全球每年有超过500万的人死于脑卒中；在我国，脑血管疾病占致死病因的首位，而且随着老龄人口的不断增加，我国的脑卒中病人将进一步增多。尽管国内外研究者围绕缺血后神经元的损伤与修复机制进行了大量的研究并取得一定进展，但除早期溶栓外(最长治疗时间窗不超过6小时)，临床尚缺乏切实有效的治疗方法。因此，探索脑卒中的神经损伤及神经保护机制，寻找与研发具有较长治疗时间窗、可增强机体固有的自我保护机制，从而限制损伤进展的新的治疗策略迫在眉睫。

作为一种治疗性的神经保护治疗方法，早期低温诱导治疗可能成为中风发作后的一线治疗手段。然而，只有当调节体温的方法易操作并且效果显著时，低温诱导用于急性期脑卒中治疗方能显效。目前，物理降温的方法起效慢且繁琐的，通常需要3至6小时的体表降温、才能实现降低2～5℃体温的目标。而且，物理降温容易引发寒颤和血管收缩反应，这也是实现精准降温的障碍。药物以中枢温度感受器为靶点通过下调脑内体温调节中枢调定点而达到诱导低温的方法称为药物诱导低温(pharmacologically induced hypothermia,PIH)，它已经被认为是一种更高效、更安全的降低脑温和核心体温的方式。

神经降压素(neurotensin，NT)是1973年Carraway和Leeman从牛的下丘脑组织中发现的一种能使皮下血管扩张和短暂降血压的物质，由于这种物质位于神经组织，又有降血压作用，故称为神经降压素。NT是一种含有13个氨基酸残基的单链多肽，氨基酸序列为pGlu-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu。在中枢神经系统中，NT以神经递质或神经调质的方式影响多巴胺能系统，发挥广泛的生物学功能，具有降低体温、调节情绪、镇痛以及刺激垂体分泌激素等作用。在外周神经系统中，NT以激素和神经内分泌因子的作用调节胃肠道消化功能，包括促进胃和小肠的蠕动、刺激胰腺分泌胰液等作用。

NT主要通过与神经降压素受体(neurotensin receptors，NTRs)结合而发挥作用。目前已知的受体亚型有3种，分别是NTR1，NTR2和NTR3。选择性NTR1激动剂PD149163具有血脑屏障通透性，在动物实验中显示出具有促认知、抗精神病和抗焦虑作用以及减少食物摄入量的中枢效应，并能在大鼠中有效地诱导低温。PD149163降温作用是否有利于脑卒中等脑血管疾病的治疗，目前尚未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供PD149163在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用。

技术方案：PD149163在制备缺血性脑卒中药物中的应用，所述PD149163的分子式是C₄₂H₇₁N₉O₆，结构式如下：

作为本发明的优选，在治疗对象出现缺血性脑卒中症状之后施用。

缺血后0h、4h、7h和10h，腹腔注射给予PD149163(0.5mg/kg)，可使大鼠体温降低2-5℃；多普勒激光血流仪检测结果显示PD149163不影响脑缺血过程中病灶区内脑血流的变化；分别于脑缺血再灌后1.5h、4.5h，腹腔注射给予PD149163(0.5mg/kg)可显著降低大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠的脑梗死体积，并改善其神经功能障碍；PD149163能够显著减轻脑缺血再灌注急性期大鼠患侧皮层与纹状体脑区内神经元的损伤，抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的活化与增殖；提示PD149163对局灶性脑缺血再灌注大鼠急性期的神经损伤具有保护作用。

PD149163可以降低p-JNK/JNK和p-AMPK(Thr172)/AMPK的比率，并增加p-mTOR(Ser2448)/mTOR的比率，显著抑制JNK和AMPK Thr172的磷酸化、增加mTOR Ser。提示PD149163具有阻滞AMPK-mTOR信号通路的作用。

PD149163抑制缺血半影区中Caspase-3和Bax的表达量、增加Bcl-2表达，降低Bax/Bcl-2比率；PD149163显著抑制脑缺血再灌注所致大鼠脑内P62蛋白表达的下降，降低LC₃Ⅱ/LC₃Ⅰ比率、抑制Beclin1蛋白的表达。提示PD149163可能通过抑制自噬而对抗脑缺血再灌注急性期所致神经细胞凋亡。

有益效果：

本发明评估了PD149163在缺血性脑卒中治疗中的作用，发现PD14916可降低大鼠体温、对局灶性脑缺血再灌注大鼠急性期损伤具有神经保护作用，初步阐明PD149163通过改善神经血管单元功能、抑制自噬通路以及对抗细胞凋亡而发挥神经保护作用。

附图说明

图1PD149163不影响脑缺血过程中病灶区内脑血流的变化。

图2.PD149163可诱导大鼠低温下降。

图3.PD149163减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注急性期神经损伤所致神经运动功能障碍。

图4.PD149163减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注急性期神经损伤所致脑梗死。

图5.HE染色结果。

图6.尼氏染色结果。

图7.PD149163减轻MCAO模型大鼠的神经元损伤。

图8.PD149163抑制脑缺血再灌注所导致的星形胶质细胞增殖与活化。

图9.PD149163抑制脑缺血再灌注所导致的小胶质细胞增殖与活化。

图10.PD149163在脑缺血再灌注损伤所致JNK和AMPK/mTOR信号通路活化中的作用。

图11.PD149163抑制脑缺血再灌注所导致的细胞自噬。

图12.PD149163减轻脑缺血再灌注所导致的细胞凋亡。

实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：局灶性脑缺血再灌注动物模型的制备

参照Longa法使用头端包被多聚赖氨酸的尼龙线栓(型号：2634-A4，北京西浓科技有限公司，中国)制备大鼠单丝管腔内右侧大脑中动脉闭塞(middle cerebral arteryocclusion，MCAO)模型。SD大鼠手术前禁食8～10h，腹腔注射10％水合氯醛(0.45ml/100g，无菌生理盐水配置)麻醉大鼠，仰卧位固定，碘伏消毒后作颈正中切口，分离右侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，从颈外动脉剪口插入栓线直至出现阻力(大约20mm)，表明栓线已到达大脑中动脉，结扎栓线。缺血90min后，缓慢抽出线栓，再结扎颈外动脉，继而松开颈总动脉处丝线恢复右侧颈动脉血流，缝合切口，再以碘伏消毒后置于笼中，室温25℃饲养，结束MCAO完成局灶性脑缺血-再灌注模型。全过程采用激光多普勒血流仪(laser Dopplerflowmetry，MoorFLPI Full-field Laser Perfusion Imager，Moor Instruments Let，UK)监测局部脑血流以确保模型制备成功。从手术开始至动物苏醒前，使用体温仪确保大鼠的体温维持在36.5℃±1℃。伪手术(Sham)组动物麻醉后，仅暴露颈内外动脉分叉，不插入线栓。

实施例2：二维激光散斑成像技术

SD大鼠手术前禁食8～10h，将大鼠用10％水合氯醛麻醉，两侧耳道插入耳棒，固定于固定器上，调整两侧的耳棒，使大鼠头颅居于正中，正确固定后的大鼠头部无法移动，且颅顶部呈一水平面。体温通过动物体温维持仪确保大鼠的核心温度在36.5℃±1℃。

用医用剪刀背去大鼠头部毛发，碘伏消毒并切开中线皮肤(切口从双眼后缘连线开始前后延伸约1cm即可)，分离骨膜，用3％过氧化氢进行消毒，暴露骨面，确定前囟位置。然后用手术刀片对血流监测区域处的颅骨进行小心打磨，使之变薄，以利于后面的血流监测(磨骨力道轻柔，以免把骨膜磨透或者引起较大出血)。血流监测点的坐标位置为：前囟后1-3mm、旁开2-4mm的正方形区域。

血流监测时间点：缺血前5min、0min，缺血第5min、15min、30min、60min、90min以及复灌第95min、105min(即：复灌后5min、15min)，复灌后3h、6h、24h、72h。

缺血前基础值的测定：颅骨磨薄之后，对大鼠进行缺血前5min、0min的脑局部血流量(local cerebral blood flow，LCBF)基础值测定，LCBF数值分析以缺血前的LCBF绝对值为基线(Baseline，100％)，用％表示。

缺血期血流值的测定：基础值测定结束后，将大鼠从固定器上取下，进行MCAO手术，线栓进到阻力位置后，用计时器计时以确保缺血第5min、15min、30min、60min、90minLCBF数值的准确性，再将大鼠固定在固定器上进行缺血期大鼠的血流监测。同时为缓解入射光的反射应避免大鼠颅骨表面干燥，可滴注少量甘油于颅骨表面。本研究应用二维激光散斑成像仪(MoorFLPI Full-field Laser Perfusion Imager，Moor Instruments Let，UK)，以25帧/秒的速度拍摄血流图像，每次记录间隔时间为1min。

复灌血流的测定：将大鼠从固定器上取下，将线栓拔出，并用计时器计时以确保复灌后5min、15min、3h、6h、24h、72h LCBF数值的准确性，再将大鼠固定在固定器上进行复灌期大鼠的LCBF数值的监测。

LCBF测定结束后，碘伏消毒并缝合头部和颈部创口，再以碘伏消毒，大鼠单独置于笼内(以免大鼠清醒后相互撕咬，扯开伤口)。复灌后3h、6h、24h、72h时间点的血流监测以此类推。

如图1所示，应用多普勒血流仪实时监测缺血前、缺血期间以及再灌注后5min，15min，3h，6h，24h，72h时大鼠局部脑血流(local cerebral blood flow,LCBF)，结果显示：术前LCBF保持相对平稳设为基础值(Baseline，100％)，栓塞后，LCBF下降约77.66％，MCAO模型对照组在缺血的90min内LCBF变化不大，复灌15min后LCBF迅速回升至基础值的60.36％，而低温组在复灌后LCBF没有进一步降低。

实施例3：实验分组、给药及低温诱导

SD大鼠称重后随机分组：伪手术组(Con-Saline)，MCAO模型组(MCAO-Saline)，PD149163 0.5mg/kg组(MCAO-PD149163)。

给药方法：观察PD14963诱导低温作用的实验中，于缺血后0h、4h、7h和10h腹腔注射药物，缺血后900min内每隔15min使用直肠探头对直肠温度进行监测；观察PD149163神经保护作用的实验中，缺血再灌注模型动物分别于复灌后1.5h、4.5h腹腔注射给予上述药物；

如图2所示，大鼠缺血90min，于缺血后0h、4h、7h和10h腹腔注射给予PD149163(0.5mg/kg)，观察缺血后900min内PD149163对大鼠体温的影响。与模型组相比，PD149163治疗组大鼠直肠温度降低2-5℃。

实施例4：神经运动功能评分

于手术24、48、72h后根据Bederson法对大鼠的神经功能缺陷进行分级评分，去除24h神经功能评分为0的大鼠，计算3d评分均值。标准如下：

0分：正常，未观察到神经症状；

1分：提尾悬空时，动物的手术对侧前肢不能完全伸展，表现为腕肘屈曲，肩内旋，肘外展，紧贴胸壁；

2分：将动物置于光滑平面上，动物自由行走时向手术对侧环转或转圈；

3分：动物自由行走时向手术对侧倾倒；

4分：将动物置于光滑平面上，无自发行走，并伴有意识水平的降低；

5分：死亡。

动物实验中，手术过程出血过多；术后有呼吸异常、提前死亡及处死时发现蛛网膜下腔出血的均弃之不用，剔除动物均在后期实验中随机补充。实验结果如图3所示。

实施例5：脑梗死体积的测定

大鼠于缺血再灌注后72h断头取脑，迅速取出脑组织，去掉嗅球、小脑和低位脑干，－20℃冰冻8min。自前极(anterior pole)连续切取2mm/片厚度脑冠状切片，置1％的2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride，TTC，Sigma，America)生理盐水溶液中37℃避光孵育5min，然后置于4％多聚甲醛溶液(pH 7.4)中4℃固定过夜。拍摄照片后，用Image J图像分析软件分析并计算脑梗死体积。

如图4所示，与模型组相比，PD149163治疗组脑梗死体积百分比下降了23.47％。

实施例6：石蜡包埋、切片

大鼠经10％水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，于左心室插管，快速推注37℃生理盐水，再缓慢、匀速灌注4％多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)，断头取脑、将大鼠脑组织置于4％多聚甲醛进行后固定，4℃，24h～48h。取出固定好的脑组织进行修裁、包埋，经各级浓度乙醇脱水并用二甲苯透明后浸蜡包埋，蜡块冷却后应用石蜡切片机(RM2135型，德国Leica公司)进行冠状位切片，收集前脑脑片，脑片厚 5μm，隔十取一用于实验。

实施例7：苏木素-伊红染色(Hematoxylin–eosin staining,HE)

经二甲苯、梯度酒精脱蜡水化，切片浸入苏木素原液4min，流水冲洗5min，后用1％盐酸酒精分化3-5s左右，流水浸洗20min×3次。滴加伊红染液染色5min，流水冲洗2min，脱水封片后镜下观察，摄片。

HE染色结果表明(图5)：正常SD大鼠脑组织神经细胞HE染色结构清晰完整，神经元密集、排列整齐，胞核居中、大小均匀，胞浆丰富、淡染，细胞间隙致密，无明显变性、坏死等病理学表现。脑缺血再灌注72h后，模型组中大鼠右侧脑组织可见广泛苍白区，呈明显缺血损伤改变；梗死灶累及皮层、纹状体，梗死区域脑组织间质水肿，有炎性细胞浸润，结构紊乱，神经细胞不同程度体积缩小，部分细胞核固缩深染，梗死中心区可见形态改变明显的坏死细胞，神经细胞大量脱失。而PD149163治疗组中大鼠脑组织缺血改变较模型组明显减轻，细胞结构较完整，细胞核固缩减少，坏死范围缩小，细胞水肿减轻，细胞损害和组织结构改变明显改善。

实施例8：尼氏染色(Nissl’staining)

经二甲苯、梯度酒精脱蜡水化，切片浸入0.4％焦油紫醋酸水溶液15s，流水冲洗2min，脱水封片后镜下观察，摄片。

尼氏染色结果表明(图6)：正常SD大鼠脑组织神经细胞基本正常，呈蓝紫色，其中神经元胞体较大、细胞核圆呈空泡状、胞质蓝染，尼氏小体大而数量多，无明显变性、坏死等病理学表现。脑缺血再灌注72h后，模型组大鼠右侧脑组织神经细胞受损，神经元萎缩深染甚至消失，尼氏小体大量减少、细胞间隙增宽，而PD149163治疗组大鼠显著改善脑组织形态变化，部分逆转了局灶性脑缺血再灌所致神经细胞的损伤与死亡。

实施例9：免疫组织化学染色

经二甲苯、梯度酒精脱蜡水化，PBS缓冲液每5min洗3次，滴加3％过氧化氢(H₂O₂)避光反应20min以灭活内源性过氧化物酶，PBS缓冲液每5min洗3次。将切片浸入已微波加热至92-98℃的0.01M(PH 6.0)枸橼酸盐缓冲液中，再微波恒温修复15min，自然冷却至室温。10％山羊血清封闭非特异性抗原后滴加一抗(抗体浓度见表1)，4℃孵育过夜。第二天0.01MPBS洗尽一抗，洗3次，每次5min，随后滴加二抗37℃烘箱孵育1h(抗体浓度见表2)，0.01MPBS洗尽二抗，洗3次，每次5min。滴加二氨基联苯(diaminobenzidin，DAB)(博士德，中国)避光显色，脱水、封片后镜下观察，摄片。

表1.免疫组织化学染色所用一抗

表2.免疫组织化学染色所用二抗

如图7所示，脑缺血再灌注72h后，与假手术组相比，模型组大鼠中皮层和纹状体所含神经元数量分别减少至44.19％和49.38％；于复灌1.5h、4.5h给予PD149163(0.5mg/kg)治疗后，大鼠皮层和纹状体的神经元数量较模型组显著增多。

如图8所示，生理情况下，星形胶质细胞胞体较小，突起细长，细胞形态正常；脑缺血再灌注后72h，模型组大鼠大脑皮层和纹状体的星形胶质细胞显著增多，胞体变大、细胞突起增粗变短。PD149163治疗组大鼠大脑皮层和纹状体的星形胶质细胞数量较模型组减少，且细胞形态恢复正常。

实施例10：蛋白质免疫印迹(Western blotting)

大鼠采用10％水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，断头处死，冰上快速取脑，将大脑半球分为损伤侧与非损伤侧。取损伤侧梗死周围区新鲜脑组织，将脑组织和裂解液按照质量体积比1:10进行充分匀浆，将匀浆液放入冰盒中，置于摇床上摇30min后4℃离心12000rpm15min，吸取上清液，按照体积比加入5×蛋白上样缓冲液，沸水中变性5min，分装后-80℃保存。将-80℃中的蛋白样品拿出溶解，离心机离心，用微量进样器加入到泳道中，进行SDS-聚丙烯酰胺恒压凝胶电泳分离，利用电转系统(miniprotein-III wet transfer unit，Bio-Rad，Hercules，California，USA)转至PVDF膜(Millipore，USA)。10％脱脂奶粉-TBST室温封闭1～2h。加入一抗(抗体浓度见表 3)4℃摇床孵育过夜。次日弃掉一抗加入TBST洗膜10min×3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(抗体浓度见表4)，室温，摇床孵育1h后经TBST漂洗(10min×3)再加入ECL(Pierce，Thermo scientific，USA)发光底物显色。Tanon5200全自动化学发光成像分析系统显影分析。将目的蛋白灰度值与内参β-actin灰度值之比进行半定量分析。

表3.免疫印迹所用一抗

表4.免疫印迹所用二抗

如图9所示，生理状态下，几乎检测不到Iba-1的表达；脑缺血再灌注72h后，模型组大鼠Iba-1的表达显著增加；PD149163治疗组大鼠的脑缺血半影区内Iba-1蛋白表达量显著降低。

如图10所示，脑缺血再灌注72h后，模型对照组大鼠p-JNK/JNK和p-AMPK(Thr172)/AMPK的比率显著升高，而p-mTOR(Ser 2448)/mTOR的比率显著降低；给予PD149163治疗后能显著降低JNK和AMPK的磷酸化水平，并显著增加mTOR的磷酸化水平。

如图11所示，脑缺血再灌注72h后，模型组中大鼠脑内LC₃-Ⅱ/LC₃-Ⅰ的比率和Beclin1蛋白表达上升，P62蛋白表达下降：给予PD149163治疗后能显著抑制MCAO引起的自噬水平升高，表现为增加P62蛋白表达，并且抑制LC₃-Ⅱ/LC₃-Ⅰ比率和Beclin1蛋白表达的上升。

如图12所示，脑缺血再灌注72h后，模型组中大鼠脑内的凋亡执行分子Caspase-3和促凋亡蛋白Bax的表达上调，而抑凋亡蛋白Bcl-2的表达显著减少；PD149163治疗组可显著减少大鼠脑内Caspase-3和Bax的表达、增加Bcl-2表达，使Bax/Bcl-2比率下降。

Claims (2)

1.PD149163在制备缺血性脑卒中药物中的应用，所述PD149163的分子式是C₄₂H₇₁N₉O₆，结构式如下：。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在治疗对象出现缺血性脑卒中后施用。