CN109122663A - 一种用于长期保存太平洋真宽水蚤休眠卵的冻干冷藏法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种包含二甲基亚砜、马来酸和透明质酸钠的保护剂。本发明还公开了一种用于长期保存太平洋真宽水蚤休眠卵的冻干冷藏法，该方法为：将休眠卵过筛并清洗干净后，移至盛放有保护剂的容器内，再通入由惰性化学干燥剂干燥后的循环氮气干燥，待卵粒干燥后，转移至避光容器中，密封保存即可。本发明提供的保护剂能保持太平洋真宽水蚤休眠卵基质的完整性，减弱休眠卵组织结构的损伤，保持休眠卵的高活性，增加休眠卵的孵化萌发率；提供的一种用于长期保存太平洋真宽水蚤休眠卵的冻干冷藏法，技术操作简单，具有可重复性，成本低廉，安全可靠，体系稳定干燥，环境无菌化，能延长休眠卵成活率，达到大量、长期储存休眠卵的目的。

Description

一种用于长期保存太平洋真宽水蚤休眠卵的冻干冷藏法

技术领域

本发明涉及水产生物技术领域，尤其是涉及一种用于长期保存太平洋真宽水蚤休眠卵的冻干冷藏法。

技术背景

桡足类，隶属于节肢动物门、甲壳纲、桡足亚纲，是浮游动物的重要组成部分，为小型甲壳动物，体长<3mm，营浮游与寄生生活，分布于海洋、淡水或半咸水中。因其是大多数鱼类幼体的开口饵料之一，故在水生态系统食物网和水产养殖中具有重要意义。太平洋真宽水蚤隶属于哲水蚤目、宽水蚤科、真宽水蚤属，是低盐区十分常见的暖水性沿岸桡足类物种之一。太平洋真宽水蚤主要出现在夏秋季，到秋末开始产休眠卵，休眠卵沉入海底被埋入海泥并间续孵化以补充种群，休眠卵结构独特，可以长期处于休眠状态，是卵粒储存很好的阶段。

桡足类是水域生态系统的关键类群，在物质循环、能量流动和信息传递中起着重要作用。休眠卵是桡足类的重要生存策略，在抵抗不利环境、维持种群延续等方面起着重要作用，对桡足类种群的季节动态和物种延续具有十分重要的意义。休眠卵是桡足类在不良环境条件下进行有性生殖延续后代的产物，休眠卵具有抵抗外界不良环境、易于扩散和通过重组产生遗传多样性等特点，也是浮游动物集约化培养的重要种源，通过桡足类快速的孤雌生殖在短时间内大量繁殖，使得桡足类作为鲜活饵料为水产经济动物的苗种生产起到极其重要的作用。

休眠卵的产生、诱导休眠卵的形成以及休眠卵的适时孵化利用也是水产养殖业中非常有意义的课题。桡足类因其体内富含某些必需脂肪酸，特别是EPA和DHA，在水产育苗上有很多应用，常常被用来作为一些经济鱼类的开口饵料。随着研究的深入和科学技术的发展，通过桡足类休眠卵获得大量无节幼体逐渐被人们重视和利用，休眠卵的规模培养将在现代海水养殖中发挥重要作用，具有广阔的应用前景。

目前，将休眠卵应用于水产养殖业还有很多困难，比如，对休眠卵的保存、孵化等方面的研究还不够，无法按照规模生产的需求对其进行控制，而育苗池中过早从休眠卵萌发的桡足类易捕食经济动物幼体等。因此，深入研究桡足类休眠卵生态学对于海水养殖业具有重要意义，而如何大量、长期储存休眠卵是一个亟待解决的难题。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种能保持休眠卵基质完整性，减弱休眠卵组织结构损伤，保持休眠卵的高活性，增加休眠卵孵化萌发率的保护剂。

本发明的目的之二在于提供一种技术操作简单，具有可重复性，成本低廉，安全可靠，体系稳定干燥，环境无菌化，能延长休眠卵成活率的用于长期保存太平洋真宽水蚤休眠卵的冻干冷藏法。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：

一种保护剂，其中包含二甲基亚砜、马来酸和透明质酸钠。该保护剂能够保持休眠卵细胞中基质的完整性，并且减弱低温对休眠卵组织结构的损伤，以此保持休眠卵的高活性，增加休眠卵的孵化萌发率。

为了达到最佳技术方案，保护剂中马来酸的重量占比为0.055～0.075％，透明质酸钠和马来酸的重量比为1.2～1.5:0.6。在进行休眠卵的冻干冷藏时，加入上述休眠卵保护剂，其中马来酸和透明质酸钠之间由配糖键和不饱和键相互交结，利用高粘结性和二甲基亚砜的高渗透性，进入休眠卵内部，并形成一定的渗透压，使得基质纤维连接蛋白富集在休眠卵外部的质膜上，间质胶原纤维的重新排列减缓，从而保持了休眠卵中基质的完整性，减弱了低温氮气对休眠卵组织结构的损伤，使得休眠卵在冻存期间能尽可能的保持活性，增加其孵化萌发率。

作为优选，上述保护剂用于保存休眠卵。

一种用于长期保存太平洋真宽水蚤休眠卵的冻干冷藏法，其中使用了包含二甲基亚砜、马来酸和透明质酸钠的保护剂。利用干燥氮气来完成冻干冷藏，同时使用保护剂对细胞进行保护，使得休眠卵在常压下低温脱水，并抑制氧化作用，能延长休眠卵的保存周期，并使休眠卵在冻存期间保持活性。

作为优选，冻干冷藏法为：将收集的休眠卵清洗干净后，移至保护剂中，再通入循环干燥的氮气干燥，待卵粒干燥后，转移至避光容器中，密封保存即可。桡足类休眠卵的保存方式一般包括：低温干燥保存、低温带水保存和常温干燥保存，而采用的冻干冷藏法，在使用液氮冻干时，休眠卵的质量损失很小，体积稳定，可溶性固形物、溶胶分布梯度小，能够长期保存休眠卵的高活性，有利于后期对休眠卵的孵化。

进一步优选，清洗步骤为：将休眠卵放置在300～320目筛网内，用双蒸水洗去卵粒表面的培养基，移至盛放有保护剂的玻璃容器内即可。

进一步优选，氮气干燥步骤为：将玻璃转移至左右通透的管道内，管道一端为进气口，另一端为出气口，将液氮使用惰性化学干燥剂干燥后，由循环气泵从进气口通入，氮气从出气口经过循环气泵的吸气口进入干燥循环。经干燥后的氮气经过湿润的卵粒表面，带走水分，能实现卵粒的快速干燥，在低温下进行操作，对于许多热敏性的物质，如蛋白质、微生物之类不会发生变性或失去生物活力，并且保持了原来的结构，不会发生浓缩现象，同时由于干燥在真空下进行，氧气极少，因此一些易氧化的物质得到了保护，实现了休眠卵常压低温脱水并抑制氧化作用。

再进一步优选，干燥氮气输入速率为10～35L/min。

进一步优选，保存步骤为：将干燥之后的干燥休眠卵转移至避光容器内，在容器口放置可显色的惰性干燥剂包，密封保存于0～4℃冰箱中即可。

与现有技术相比，本发明的优点在于：1)本发明中在冻干冷藏时加入保护剂，能够保护休眠卵中基质的完整性，减弱低温氮气对休眠卵组织结构的损伤，使得休眠卵在冻存期间能尽可能的保持活性，增加其孵化萌发率；2)本发明中利用干燥氮气来完成冻干冷藏法，使得休眠卵在常压下低温脱水，并抑制其氧化作用，能延长休眠卵的保存周期，使休眠卵在冻存期间保持活性，并且冻存期间保持高稳定、高干燥性的环境，对外界细菌具有一定的抵抗效果，达到大量、长期储存休眠卵的目的；3)本发明中提供的用于长期保存太平洋真宽水蚤休眠卵的冻干冷藏法，技术操作简单，具有可重复性，成本低廉，安全可靠，体系稳定。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

一种保护剂，其中包含二甲基亚砜、马来酸和透明质酸钠。该保护剂能够保持休眠卵细胞中基质的完整性，并且减弱低温对休眠卵组织结构的损伤，以此保持休眠卵的高活性，增加休眠卵的孵化萌发率。

保护剂中马来酸的重量占比为0.056％，透明质酸钠和马来酸的重量比为1.3:0.6。在进行休眠卵的冻干冷藏时，加入上述休眠卵保护剂，其中马来酸和透明质酸钠之间由配糖键和不饱和键相互交结，利用高粘结性和二甲基亚砜的高渗透性，进入休眠卵内部，并形成一定的渗透压，使得基质纤维连接蛋白富集在休眠卵外部的质膜上，间质胶原纤维的重新排列减缓，从而保持了休眠卵中基质的完整性，减弱了低温氮气对休眠卵组织结构的损伤，使得休眠卵在冻存期间能尽可能的保持活性，增加其孵化萌发率。

上述保护剂用于保存休眠卵。

一种用于长期保存太平洋真宽水蚤休眠卵的冻干冷藏法，其中使用了包含二甲基亚砜、马来酸和透明质酸钠的保护剂。利用干燥氮气来完成冻干冷藏，同时使用保护剂对细胞进行保护，使得休眠卵在常压下低温脱水，并抑制氧化作用，能延长休眠卵的保存周期，并使休眠卵在冻存期间保持活性。

冻干冷藏法为：将收集的休眠卵清洗干净后，移至保护剂中，再通入循环干燥的氮气干燥，待卵粒干燥后，转移至避光容器中，密封保存即可。桡足类休眠卵的保存方式一般包括：低温干燥保存、低温带水保存和常温干燥保存，而采用的冻干冷藏法，在使用液氮冻干时，休眠卵的质量损失很小，体积稳定，可溶性固形物、溶胶分布梯度小，能够长期保存休眠卵的高活性，有利于后期对休眠卵的孵化。

清洗步骤为：将休眠卵放置在320目筛网内，用双蒸水洗去卵粒表面的培养基，移至盛放有保护剂的玻璃容器内即可。

氮气干燥步骤为：将玻璃转移至左右通透的管道内，管道一端为进气口，另一端为出气口，将液氮使用惰性化学干燥剂干燥后，由循环气泵从进气口通入，氮气从出气口经过循环气泵的吸气口进入干燥循环。经干燥后的氮气经过湿润的卵粒表面，带走水分，能实现卵粒的快速干燥，在低温下进行操作，对于许多热敏性的物质，如蛋白质、微生物之类不会发生变性或失去生物活力，并且保持了原来的结构，不会发生浓缩现象，同时由于干燥在真空下进行，氧气极少，因此一些易氧化的物质得到了保护，实现了休眠卵常压低温脱水并抑制氧化作用。

干燥氮气输入速率为10L/min。

保存步骤为：将干燥之后的干燥休眠卵转移至避光容器内，在容器口放置可显色的惰性干燥剂包，密封保存于0℃冰箱中即可。

实施例2：

一种保护剂，其中包含二甲基亚砜、马来酸和透明质酸钠，保护剂中马来酸的重量占比为0.062％，透明质酸钠和马来酸的重量比为1.5:0.6。

一种用于长期保存太平洋真宽水蚤休眠卵的冻干冷藏法，其具体步骤为：

1)清洗步骤为：将休眠卵放置在320目筛网内，用双蒸水洗去卵粒表面的培养基，移至盛放有保护剂的玻璃容器内即可；

2)氮气干燥步骤为：将玻璃转移至左右通透的管道内，管道一端为进气口，另一端为出气口，将液氮使用惰性化学干燥剂干燥后，由循环气泵从进气口通入，干燥氮气输入速率为15L/min，氮气从出气口经过循环气泵的吸气口进入干燥循环；

3)保存步骤为：将干燥之后的干燥休眠卵转移至避光容器内，在容器口放置可显色的惰性干燥剂包，密封保存于2℃冰箱中即可。

实施例3：

一种保护剂，其中包含二甲基亚砜、马来酸和透明质酸钠，保护剂中马来酸的重量占比为0.074％，透明质酸钠和马来酸的重量比为1.4:0.6。

一种用于长期保存太平洋真宽水蚤休眠卵的冻干冷藏法，其具体步骤为：

1)清洗步骤为：将休眠卵放置在300目筛网内，用双蒸水洗去卵粒表面的培养基，移至盛放有保护剂的玻璃容器内即可；

2)氮气干燥步骤为：将玻璃转移至左右通透的管道内，管道一端为进气口，另一端为出气口，将液氮使用惰性化学干燥剂干燥后，由循环气泵从进气口通入，干燥氮气输入速率为25L/min，氮气从出气口经过循环气泵的吸气口进入干燥循环；

3)保存步骤为：将干燥之后的干燥休眠卵转移至避光容器内，在容器口放置可显色的惰性干燥剂包，密封保存于4℃冰箱中即可。

实施例4：

一种用于长期保存太平洋真宽水蚤休眠卵的冻干冷藏法，其进一步优化步骤为：

1)清洗步骤为：将休眠卵放置在300目筛网内，用双蒸水洗去卵粒表面的培养基，移至盛放有保护剂的玻璃容器内即可，上述保护剂中包含二甲基亚砜、马来酸和透明质酸钠，二甲基亚砜的重量占比为10％，马来酸的重量占比为0.07％，透明质酸钠和马来酸的重量比为1.4:0.6；

2)氮气干燥步骤为：将玻璃转移至左右通透的管道内，管道一端为进气口，另一端为出气口，将液氮使用惰性化学干燥剂干燥后，由循环气泵从进气口通入，干燥氮气输入速率为25L/min，氮气从出气口经过循环气泵的吸气口进入干燥循环；

3)保存步骤为：将干燥之后的干燥休眠卵转移至避光容器内，在容器口放置可显色的惰性干燥剂包，密封保存于4℃冰箱中即可，上述干燥剂包中含有硅胶干燥剂、钛酸丁酯和纳米级二氧化钛，钛酸丁酯和纳米级二氧化钛在干燥剂包中的重量占比分别为0.047％和0.036％，钛酸丁酯加入干燥剂包中，在长期储存中，能迅速遇水吸潮而分解，其水解产物吸附在硅胶微孔之间，与硅胶干燥剂和纳米级二氧化钛之间形成交联，从而提高硅胶之间的粘合性，使得干燥包中的干燥剂形成类似凝胶的结构，进而利用这种结构，在休眠卵上方形成更加致密、稳定的干燥环境，同时钛酸丁酯和纳米级二氧化钛中的高活性阳离子能够打入细菌细胞内部，使其丧失活性，具有一定的杀菌效果，保证了休眠卵存储环境的无菌化，延长休眠卵的成活率。

实施例5：

一种用于长期保存太平洋真宽水蚤休眠卵的冻干冷藏法，其具体步骤为：

1)清洗步骤为：将休眠卵放置在300目筛网内，用双蒸水洗去卵粒表面的培养基，移至盛放有保护剂的玻璃容器内即可，上述保护剂为二甲基亚砜溶液；

2)氮气干燥步骤为：将玻璃转移至左右通透的管道内，管道一端为进气口，另一端为出气口，将液氮使用惰性化学干燥剂干燥后，由循环气泵从进气口通入，干燥氮气输入速率为25L/min，氮气从出气口经过循环气泵的吸气口进入干燥循环；

3)保存步骤为：将干燥之后的干燥休眠卵转移至避光容器内，在容器口放置可显色的惰性干燥剂包，密封保存于4℃冰箱中即可。

实施例6：

太平洋真宽水蚤休眠卵冻干冷藏法保存试验

将收集得到的3060粒太平洋真宽水蚤的休眠卵，平均分为6组，每组3个重复，试验组1～5分别采用实施例1～5的方法进行保存，将使用低温干燥保存的组别设为对比组进行保存，分别在保存至10d、30d、180d时，取出干燥冷藏的卵粒进行孵化，试验结果如下。

表1太平洋真宽水蚤休眠卵冻干冷藏法保存试验

由上表1可得，由于实验组5保护剂中未添加透明质酸钠和马来酸，因此在孵化率上具有显著差异，实验1～4组休眠卵在10d、30d、180d时的孵化率平均比实验组5高出1.9％、2.7％、3.6％，平均高出对比组12.9％、12.8％、9.9％；试验4组由于干燥包与试验3组不同，因而在长期存储后的孵化率上略高，有一定的增益效果。由试验结果可知，本发明实施例中所用的冻干冷藏法，对真宽水蚤休眠卵的保存较为完好，能够在长期保存中保持休眠卵的高活性，增加其孵化萌发率，并且冻存期间保持高稳定、高干燥性的环境，对外界细菌具有一定的抵抗效果，能延长休眠卵的保存周期，达到大量、长期储存休眠卵的目的。

本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种保护剂，其特征在于：包含二甲基亚砜、马来酸和透明质酸钠。

2.根据权利要求1所述的一种保护剂，其特征在于：所述保护剂中马来酸的重量占比为0.055~0.075%；所述透明质酸钠和马来酸的重量比为1.2~1.5:0.6。

3.根据权利要求1或2所述的一种保护剂，其特征在于：所述保护剂用于保存休眠卵。

4.一种用于长期保存太平洋真宽水蚤休眠卵的冻干冷藏法，其特征在于：使用如权利要求1~3任一项所述的保护剂。

5.根据权利要求4所述的一种用于长期保存太平洋真宽水蚤休眠卵的冻干冷藏法，其特征在于：所述冻干冷藏法为：休眠卵清洗后，移至保护剂中，再通入氮气干燥后，密封保存即可。

6.根据权利要求5所述的一种用于长期保存太平洋真宽水蚤休眠卵的冻干冷藏法，其特征在于：所述清洗步骤为：将休眠卵放置在300~320目筛网内，用双蒸水洗去卵粒表面的培养基，移至盛放有保护剂的玻璃容器内即可。

7.根据权利要求5所述的一种用于长期保存太平洋真宽水蚤休眠卵的冻干冷藏法，其特征在于：所述氮气干燥步骤为：将玻璃转移至左右通透的管道内，管道一端为进气口，另一端为出气口，将液氮使用惰性化学干燥剂干燥后，由循环气泵从进气口通入，氮气从出气口经过循环气泵的吸气口进入干燥循环。

8.根据权利要求5或7所述的一种用于长期保存太平洋真宽水蚤休眠卵的冻干冷藏法，其特征在于：所述干燥氮气的输入速率为10~35L/min。

9.根据权利要求5所述的一种用于长期保存太平洋真宽水蚤休眠卵的冻干冷藏法，其特征在于：所述保存步骤为：将干燥之后的干燥休眠卵转移至避光容器内，在容器口放置可显色的惰性干燥剂包，密封保存于0~4°C冰箱中即可。