CN110057821A - 用于人类配子快速冻融过程观测的低温显微成像系统 - Google Patents
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Abstract
一种用于人类配子快速冻融过程观测的低温显微成像系统，该系统包括配子冻融装置、液氮循环冷却子系统、显微成像子系统、测量控制子系统和抽真空子系统。本发明可避免密闭腔体在降温过程中产生负压而对生物样本造成损伤，避免内部起雾影响观察，避免细菌病毒或者杂质感染；可实时地观察和记录在几十毫秒至几秒时间内冷冻和复苏过程中配子样本的液态、玻璃态、晶态转换细节。在低温辅助生殖医疗领域具有重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及人类配子细胞冻存，特别是一种用于人类配子快速冻融过程观测的低温显微成像系统。
背景技术
人类配子细胞冻存是辅助生育领域的研究热点之一，相关的冷冻方法主要有程序化冷冻法和玻璃化冷冻法。玻璃化冷冻是一种快速冷冻技术，通常将冷冻对象放在保护剂中，再投入液氮或者低温蒸气熏蒸完成冷冻。玻璃化冷冻理论上可使细胞迅速通过“危险温度区”，使其内的水分/电解液从液态直接变为无结构的玻璃态，避免冰晶的形成，从而减少细胞的机械性损伤。为了从根本上揭示玻璃化冷冻技术的机理，寻找和确认最佳的冷冻工艺，需要提供该快速冷冻过程(几十毫秒至几秒)中发生的物理现象图像作为解读依据和判定证明。
目前已公开的关于生殖细胞玻璃化冷冻技术的论文和专利基本都集中在玻璃化冷冻载体、冷冻保护剂、冻融过程操作工艺等方面，如中国专利CN 206238188 U公开了一种液氮熏蒸箱，用于精子或卵子结合的低温熏蒸，包括：液氮熏蒸箱主体、液氮熏蒸箱绝热盖、配子载体架、温度传感器及报警器。但样本置于液氮熏蒸箱中，无观察窗，更不具备可视化观察配子冻融现象的条件，且样本无法快速受控复温。中国专利CN 108967418A公开了一种存储式液氮熏蒸仪装置，包括：液氮真空罐、工作腔、配子载体架、进液电磁阀、排气电磁阀、液位传感器、温度计、显示屏、保温盖。该装置可以实现配子的精准化熏蒸冷冻，便于存储运输，但冷冻过程中必然起雾，也不具备实时监测配子样本冻融过程的条件。另一方面，以往对生殖细胞冻存研究的可视化手段基本上都是只能完成冷冻前和复温后的显微镜观察，如中国专利CN106153622A公开了一种玻璃化冷冻观察装置，包括：连有拍摄装置、用于观察和拍摄的立式显微镜；中空部呈圆柱形的隔离盒，置于立式显微镜的置物台上，用于承载观察材料和通过立式显微镜置物台下方光线；培养皿，置于隔离盒的中空部，用于放置观察材料。该发明整个装置较为简单，样本暴露在液氮及氮气氛围中，样本易起雾结霜。再如中国专利CN108703138 A提供一种光镊细胞与粒子到液氮内进行冷冻的方法及装置，所述装置包括光辐射压力机、电子显微目镜和液氮机，能够高精准度地完成对细胞进行液氮冷冻实验。该装置通过电子显微目镜观察被液氮冷冻处理的细胞的生理特征和细胞表皮产生的变化，最终将数据记录下来，完成实验的记录与观察。但该装置采用液氮或氮气氛围直接进行玻璃化冻融，没有真空环境保护，样本及整个装置易起雾、结露或结霜；冷冻过程时液氮及氮气与配子样品直接接触进行快速降温，未设有温度计及电加热膜，不能精确测量和控制样品的冷冻或复苏过程的升降温速率及温度。
发明内容
有鉴于上述现有技术的缺陷，本发明提供一种用于人类配子快速冻融过程观测的低温显微成像系统，该系统可避免密闭腔体在降温过程中产生负压而对生物样本造成损伤；避免内部起雾影响观察；避免细菌病毒或者杂质感染；可实时地观察和记录在几十毫秒至几秒时间内冷冻和复苏过程中配子样本的液态、玻璃态、晶态转换细节。在低温辅助生殖医疗领域具有重要作用。
本发明的技术解决方案如下：
一种用于人类配子快速冻融过程观测的低温显微成像系统，包括配子冻融装置、液氮循环冷却子系统、显微成像子系统、测量控制子系统和抽真空子系统，其特点在于，
所述的配子冻融装置包括真空腔、气浮隔振平台、绝热支撑结构、配子可视环境舱、干燥器、预冷换热器和运动执行机构，所述的配子可视环境舱的顶面有石英玻璃窗，底面为高导热薄壁材料，供待冷却的生物样品设置，所述的配子可视环境舱固定在所述的运动执行机构上；
所述的液氮循环冷却子系统包括液氮罐、调节阀、液氮泵、低温绝热输液管、低温绝热回液管和液氮热沉真空腔；
所述的显微成像子系统包括高速相机、显微镜头、柔光罩、氙灯光源、光纤和支架；
所述的测量控制子系统包括热电偶、电加热膜、电加热控制器、数据采集仪和计算机；
所述的抽真空子系统包括真空泵、真空阀及真空波纹管，所述的真空泵经所述的真空波纹管、真空阀与所述的真空腔相连；
所述的真空腔置于所述的气浮隔振平台上，所述的液氮热沉腔体安装在所述的真空腔内，并通过绝热支撑结构与真空腔的底面固定连接；所述的液氮热沉腔体的底部设有进液口，顶部设有排液口，所述的进液口经所述的低温绝热输液管及所述的液氮泵与所述的液氮罐相连，所述的排液口经所述的低温绝热回液管及调节阀与所述的液氮罐相连；所述的真空腔的顶面为法兰结构，中央设有石英观察窗，且采用下凹结构，与所述的配子可视环境舱的顶面的石英观察窗平行贴近布置，在所述的配子可视环境舱内设置所述的热电偶和电加热膜，所述的真空腔的侧面开有多个KF接口法兰，所述的计算机的输出端经所述的电加热控制器通过所述的KF接口法兰与所述的电加热膜的控制端相连，所述的热电偶的输出端通过所述的KF接口法兰经所述的数据采集仪与所述的计算机的输入端相连，所述的配子可视环境舱通过所述的KF接口法兰经所述的毛细管路、预冷换热器和干燥器与大气连通；
所述的高速相机、显微镜头、柔光罩安装在所述的支架上，所述的柔光罩对准所述的真空腔的石英观察窗，所述的氙灯冷光源发出的光经所述的光纤，透过真空腔石英观察窗和环境舱的石英观察窗，实现配子可视环境舱中样品冻融过程的高速成像，所述的高速相机与所述的计算机相连。
所述的配子可视环境舱通过毛细管路先后经预冷换热器和干燥器后与大气连通，形成有氧常压隔离环境。所述的配子可视环境舱固定在外部运动执行机构上，待机状态时悬空，接收指令后通过后者将其从待机位置迅速移动到液氮热沉腔体的正上方，然后向下移动直至与液氮热沉腔体的上表面紧密接触，通过间壁式热传导冷却。配子可视环境舱内还设有热电偶及电加热膜，用于测量和控制样品的冷冻或复苏过程的升降温速率及温度。被冷却的生物样品置于所述的配子可视环境舱内，配子可视环境舱内压力维持常压，避免因压差对样品造成损伤。配子可视环境舱外周为高真空环境，与室温环境之间有良好的隔热条件。
所述的真空腔顶面为法兰结构，可拆，其上设有石英观察窗，薄壁，且采用下凹结构，与所述的配子可视环境舱的顶面石英观察窗平行贴近布置，但不接触。真空腔侧面开有多个KF接口法兰，用于抽真空、引线进出等。整个真空腔安装在气浮隔振平台上，减少外界震动对于显微观测配子可视环境舱中样品冻融过程的影响。
所述的液氮热沉安装在所述的真空腔内，并通过绝热支撑结构与真空腔固定连接，液氮热沉腔体设有进液口和排液口，液氮管路实现底部进液，顶部排液。液氮热沉腔体与液氮罐、调节阀、液氮泵、低温绝热输液管及低温绝热回液管构成循环回路，用于实现液氮的循环流动。
所述的高速相机、显微镜头、柔光罩等安装在支架上，配以氙灯冷光源和光纤，透过真空腔石英观察窗和环境舱石英观察窗，实现配子可视环境舱中样品冻融过程的高速成像。
本发明低温显微成像系统使用时，工作过程为：
依次打开真空腔的顶盖及处于待机工位的配子可视环境舱的顶盖，将伴有冷冻保护剂的人类配子细胞样本置于所述的配子可视环境舱内，依次盖上配子可视环境舱的顶盖及真空腔的顶盖，均气密封闭。配子可视环境舱通过毛细管在穿舱真空腔后，依次经外部的预冷换热器及干燥器连接，再与大气相通。配子可视环境舱在运动执行机构悬臂的挂载下，在真空腔内的待机位就位停放。
安装好所述的真空腔上各接头，并用真空泵抽取真空腔内空气，确保内部压力在10-3Pa以下。操作运动执行机构，将配子可视环境舱移动到液氮热沉腔体的正上方，但与液氮热沉腔体不接触，开启氙灯光源，并调整高速相机、相机镜头、柔光罩、光纤等装置，确保计算机上能高速观测人类配子细胞高分辨率图像。打开调节阀，开启液氮泵，抽取液氮罐内液氮，进行液氮热沉腔体内的冷却。
当达到液氮温度时，再次操作所述的运动执行机构，将配子可视环境舱向下移动，并使其表面与液氮热沉腔体紧密接触，运动停止，液氮热沉腔体快速地将冷量传输给配子可视环境舱内样品，使被冻样本迅速通过“危险温度区”，使其从液态直接变为无结构的玻璃状态，从而避免冰晶的形成，减少细胞机械性损伤。通过运动执行机构施加的向下压紧力以及通过所述的电加热膜提供热量对冲补偿两种组合手段，控制配子样本冷冻过程的降温速率及目标低温温度。
当需要对配子细胞进行复苏研究时，操作所述的运动执行机构，使配子可视环境舱脱离液氮热沉腔体上表面，进而进一步侧向移动，迅速启动配子可视环境舱内所述的电加热膜的加热程序，将热量快速传输给样品，进行复温。通常将复温目标温度设定在36～42℃，根据所需的升温速率施加不同的加热功率。
在上述降温和复温的过程中，利用观察窗顶部的高速相机和显微镜头，实时观测和记录在几十毫秒至几秒时间内配子冷冻和复融过程中的物理形貌状态变化细节。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
1、本装置配子可视环境舱，通过毛细管路经预冷换热器和干燥器后与大气连通，形成有氧常压隔离环境，避免密闭腔体在降温过程中产生负压而对生物样本造成损伤；避免内部起雾影响观察；避免细菌病毒或者杂质感染；预冷常压空气可以提高样本降温速率。
2、本装置配子可视环境舱固定在外部运动执行机构上，待机状态时悬空，接收指令后通过外部运动执行机构将所述的配子可视环境舱从待机位置迅速移动到液氮热沉腔体的正上方，然后向下移动直至与液氮热沉腔体的上表面紧密接触，通过间壁式热传导冷却。这种移动一方面可以让样本在待机状态不受低温影响，而一旦需要降温，则能够快速实现降温；另一方面，载样的环境舱隔离外界环境，通过间壁式导热冷却样品避免非纯净冷冻介质感染样品。
3、本装置液氮热沉腔体与液氮罐、调节阀、液氮泵、低温绝热输液管及低温绝热回液管构成循环回路，用于实现液氮的循环流动，由此保证液氮热沉的恒定低温和提供持续不断的冷量，实现样品的快速降温。
4、本装置配子可视环境舱内还设有热电偶及电加热膜，可精确测量和控制样品的冷冻或复苏过程的升降温速率及温度。
5、本装置高速相机、显微镜头、柔光罩等安装在支架上，配以氙灯冷光源和光纤，透过真空腔石英观察窗和环境舱石英观察窗，可实时地观察和记录几十毫秒至几秒时间内低温状态下的配子样本冻融过程高分辨率瞬态图像。
附图说明
图1为本发明用于人类配子快速冻融过程观测的低温显微成像系统的结构示意图
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
本发明人类配子快速冻融过程观测的低温显微成像系统，参考图1，包括配子冻融装置、液氮循环冷却子系统、显微成像子系统、测量控制子系统和抽真空子系统。配子冻融装置包括真空腔1、气浮隔振平台2、绝热支撑结构3、配子可视环境舱4、干燥器5、预冷换热器6和运动执行机构7；液氮循环冷却子系统包括液氮罐8、调节阀9、液氮泵10、低温绝热输液管11、低温绝热回液管12和液氮热沉腔体13；显微成像子系统包括高速相机14、显微镜头15、柔光罩16、氙灯光源17、光纤18和支架19；测量控制子系统包括热电偶20、电加热膜21、电加热控制器22、数据采集仪23和计算机24；抽真空子系统包括真空泵25、真空阀26及真空波纹管27。
配子可视环境舱4通过毛细管路先后经预冷换热器6和干燥器5后与大气连通，形成有氧常压隔离环境。配子可视环境舱4固定在外部运动执行机构7上，待机状态时悬空，接收指令后通过外部运动执行机构7将所述的配子可视环境舱4从待机位置迅速移动到液氮热沉腔体13的正上方，然后向下移动直至与液氮热沉腔体13的上表面紧密接触，通过间壁式热传导冷却。配子可视环境舱4内还设有热电偶20及电加热膜21，用于测量和控制样品的冷冻或复苏过程的升降温速率及温度。被冷却的生物样品置于配子可视环境舱4内，配子可视环境舱4内压力维持常压，避免因压差对样品造成损伤。配子可视环境舱4顶面为高透石英玻璃，底面为高导热薄壁材料。配子可视环境舱4外周为高真空环境，与室温环境之间有良好的隔热条件。
真空腔1的顶面为法兰结构，可拆，其上设有石英观察窗，薄壁，且采用下凹结构，与配子可视环境舱4的顶面石英观察窗平行贴近布置，但不接触。真空腔1的侧面开有多个KF接口法兰，用于抽真空、引线进出等。所述的真空腔1安装在气浮隔振平台2上，减少外界震动对于显微观测配子可视环境舱4中样品冻融过程的影响。
液氮热沉腔体13通过绝热支撑结构3安装在真空腔1内，液氮热沉腔体13设有进液口和排液口，通过液氮管路实现底部进液，顶部排液。液氮热沉腔体13与液氮罐8、调节阀9、液氮泵10、低温绝热输液管11及低温绝热回液管12构成循环回路，用于实现液氮的循环流动。
高速相机14、显微镜头15、柔光罩16等安装在所述的支架19上，配以氙灯冷光源17和光纤18，透过真空腔石英观察窗和环境舱石英观察窗，实现配子可视环境舱中样品冻融过程的高速成像。
本发明低温显微成像系统使用时，工作过程为：
依次打开真空腔1的顶盖及处于待机工位的配子可视环境舱4的顶盖，将伴有冷冻保护剂的人类配子细胞样本置于所述的配子可视环境舱4内，依次盖上配子可视环境舱4的顶盖及真空腔1的顶盖，均气密封闭。配子可视环境舱4通过毛细管路在穿舱真空腔1后，依次经外部的预冷换热器6、干燥器5再与大气相通。配子可视环境舱4在运动执行机构悬臂的挂载下，在真空腔1内的待机位就位停放。
安装好所述的真空腔1上各接头，并用真空泵25抽取真空腔1内空气，确保内部压力在10-3Pa以下。操作运动执行机构7，将配子可视环境舱4移动到液氮热沉腔体13的正上方，但与液氮热沉腔体13不接触，开启氙灯光源17，并调整高速相机14、相机镜头15、柔光罩16、光纤18等装置，确保计算机24上能高速观测人类配子细胞高分辨率图像。
打开调节阀9，开启液氮泵10，抽取液氮罐8内液氮，进行液氮热沉腔体13内的冷却。当达到液氮温度时，再次操作所述的运动执行机构7，将配子可视环境舱4向下移动，并使其表面与液氮热沉腔体13紧密接触，运动停止，液氮热沉腔体13快速地将冷量传输给配子可视环境舱4内样品，使被冻样本迅速通过“危险温度区”，使其从液态直接变为无结构的玻璃状态，从而避免冰晶的形成，减少细胞机械性损伤。通过运动执行机构7施加的向下压紧力以及通过所述的电加热膜21提供热量对冲补偿两种组合手段，可控制配子样本冷冻过程的降温速率及目标低温温度。
当需要对配子细胞进行复苏研究时，操作所述的运动执行机构7，使配子可视环境舱4脱离液氮热沉腔体13的上表面，进而进一步侧向移动，迅速启动配子可视环境舱4内所述的电加热膜21的加热程序，将热量快速传输给样品，进行复温。通常将复温目标温度设定在36～42℃，根据所需的升温速率施加不同的加热功率。
实验表明，本发明可避免密闭腔体在降温过程中产生负压而对生物样本造成损伤，避免内部起雾影响观察，避免细菌病毒或者杂质感染。可实时地观察和记录在几十毫秒至几秒时间内冷冻和复苏过程中配子样本的液态、玻璃态、晶态的物理形貌状态变化细节。在低温辅助生殖医疗领域具有重要作用。
Claims (1)
1.一种用于人类配子快速冻融过程观测的低温显微成像系统，包括配子冻融装置、液氮循环冷却子系统、显微成像子系统、测量控制子系统和抽真空子系统，其特征在于，
所述的配子冻融装置包括真空腔(1)、气浮隔振平台(2)、绝热支撑结构(3)、配子可视环境舱(4)、干燥器(5)、预冷换热器(6)和运动执行机构(7)，所述的配子可视环境舱(4)的顶面有石英玻璃窗，底面为高导热薄壁材料，供待冷却的生物样品设置，所述的配子可视环境舱(4)固定在所述的运动执行机构(7)上；
所述的液氮循环冷却子系统包括液氮罐(8)、调节阀(9)、液氮泵(10)、低温绝热输液管(11)、低温绝热回液管(12)和液氮热沉真空腔(13)；
所述的显微成像子系统包括高速相机(14)、显微镜头(15)、柔光罩(16)、氙灯光源(17)、光纤(18)和支架(19)；
所述的测量控制子系统包括热电偶(20)、电加热膜(21)、电加热控制器(22)、数据采集仪(23)和计算机(24)；
所述的抽真空子系统包括真空泵(25)、真空阀(26)及真空波纹管(27)，所述的真空泵(25)经所述的真空波纹管(27)、真空阀(26)与所述的真空腔(1)相连；
所述的真空腔(1)置于所述的气浮隔振平台(2)上，所述的液氮热沉腔体(13)安装在所述的真空腔(1)内，并通过绝热支撑结构(3)与真空腔(1)的底面固定连接；所述的液氮热沉腔体(13)的底部设有进液口，顶部设有排液口，所述的进液口经所述的低温绝热输液管(11)及所述的液氮泵(10)与所述的液氮罐(8)相连，所述的排液口经所述的低温绝热回液管(12)及调节阀(9)与所述的液氮罐(8)相连；所述的真空腔(1)的顶面为法兰结构，中央设有石英观察窗，且采用下凹结构，与所述的配子可视环境舱(4)的顶面的石英观察窗平行贴近布置，在所述的配子可视环境舱(4)内设置所述的热电偶(20)和电加热膜(21)，所述的真空腔(1)的侧面开有多个KF接口法兰，所述的计算机(24)的输出端经所述的电加热控制器(22)通过所述的KF接口法兰与所述的电加热膜(21)的控制端相连，所述的热电偶(20)的输出端通过所述的KF接口法兰经所述的数据采集仪(23)与所述的计算机(24)的输入端相连，所述的配子可视环境舱(4)通过所述的KF接口法兰经所述的毛细管路、预冷换热器(6)和干燥器(5)与大气连通；
所述的高速相机(14)、显微镜头(15)、柔光罩(16)安装在所述的支架(19)上，配合所述的氙灯冷光源(17)发出的光经所述的光纤(18)，透过真空腔石英观察窗和环境舱的石英观察窗，实现配子可视环境舱(4)中样品冻融过程的高速成像，所述的高速相机(14)与所述的计算机(24)相连。
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