CN1162900A - 用于低温保存和随后移植的器官的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及器官和组织灌流的领域。更具体的是，本发明涉及通过引入玻璃化浓度的低温保护剂来低温保存的器官，如肾脏和肝脏的器官制备方法。为了制备低温保存的器官，人或动物供体以通常的方法处理，也可用伊洛前列腺素或其它血管舒张剂和/或转化生长因子β1进行处理。另一种方法，或另外的是，对被低温保存的器官直接将伊洛前列腺素或其它血管舒张剂和/或转化生长因子β1用于动脉。本发明也涉及通过用低分子量(如棉子糖、蔗糖、甘露醇等)、中等分子量(如分子量为600-20,000的中等分子量)如高分子(如羟乙基淀粉)的渗透缓冲剂除去器官中的低温保护剂来制备移植的器官。本发明也涉及新的移植后处理，如使用转化生长因子β1、N-乙酰基半胱氨酸、亚金基硫代葡萄糖。
Description
发明领域
本发明涉及器官的灌流。更具体的是它涉及用来灌流离体的动物(包括人)的器官的计算机控制装置和方法。更为具体的是，本发明涉及在低温保存制备中，向离体的器官或组织引入可玻璃化浓度的低温保护剂，并在其低温保存后，在准备移植入动物体，包括人体时从器官和组织上除去这些低温保护剂的装置和方法。
背景技术
低温保存(即在极低温度下保存)器官可以建立用于移植使外科的器官库，类似于当今医学界使用的血库。目前，低温保存可通过器官的冷冻或器官的玻璃化来达到。若器官被冷冻，器官内形成的冰晶会机械地破坏它的结构，因此在移植进接受者体内时，损伤其正确发挥功能的能力。相反，玻璃化意味着固化成玻璃态，没有形成冰晶。
低温保存的主要困难在于它需要用高浓度的低温保护剂(在冷却到极低温度时水溶性的有机分子最少或防止冻伤)灌流器官。当今没有开发出完全合适的设备或方法来执行该灌流过程。这阻滞了可能拯救生命的活器官库的建立。
1970年早期以来文献中已有人描述了用低温保护剂灌流器官的装置和方法。参见Pegg，D.E，低温生物学的现况(Current Trends in Cryobiology)(A.U.Smith编辑)Plenmu出版，纽约，1970，153-180页，特别是175-177页；和Pegg，D.E.，低温生物学(Cryobiology)9：411-419(1972)。
Pegg最初描述的装置中两个灌流回路同时运行，一个具有低温保护剂，另一个没有。通过从没有低温保护剂的回路突然转换到含低温保护剂的回路，然后再返回的办法来引入和除去低温保护剂。通过未揭示的技术控制压力，将数据输入数据记录仪，该记录仪输出由程序化的Wang台式计算器处理的纸带。实验结果不良。所述的设备和技术被Pegg和他的同事们认为是不合适的。后来他们作了很大改进。
1973年，Sherwood等(器官保存，D.E.Pegg编辑，伦敦(1973)，152-174页)揭示了四种可能的灌流系统，没有一种现已得以建立。第一种系统由直接通过多路径阀与器官相连的一组贮液器构成，通过从一个贮液器简单地转换到另一个贮液器就可逐步做出改变。
第二种系统通过计量来自稀释贮液器和来自低温保护剂浓缩物贮液器并流入混合室、然后流入肾的液流量来改变浓度。没有独立的泵来控制流入肾的流量。总流量通过用于混合的计量泵的输出来控制。在过滤器前而不是过滤器后使用热交换器(这样限制了热交换器效率)，大多没有动脉样感觉。正如在下面的说明中会揭示的，该系统和本发明的唯一相似之处是使用两个浓度传感器，一个处于肾脏的动脉管上，另一个处于静脉上。为了使动脉静脉(A-V)浓度差最小，器官的流速被强制地改变。对肾脏前和后的回路中浓度的感知类似于，但明显比本发明中使用的折射计和差示折射计差。本发明者的经验表明使用差示折射计对于较大的灵敏度是必不可少的。通过控制器官流量控制A-V梯度的概念比本发明的系统明显要差。
Sherwood等揭示的第三个系统也缺少肾脏灌流泵，依靠“背压控制阀”使来自滤器的灌流液再循环，这样可维持所需的对肾脏的灌流压。和第二种Sherwood系统一样，热交换器接近于过滤器，没有防泡阀。和第二种Sherwood系统中一样通过计量加入的低温保护剂或稀释剂来控制灌流液贮器的浓度，若来自器官的液流不再循环，维持和控制灌流注体积和浓度就产生了大问题。这些都是不希望的特征。
Pegg在主要论文的附录里提出了第四种系统。在该系统中，灌流液靠重力直接从混合器通过热交换器到达肾脏，在通过肾脏后再进入贮器。也通过直接和独立的泵将液体从贮器泵到折射计并返回来监测浓度。
Pegg等(低温生物学(Cryobiology)14：168-178(1977))报道了修改和补充的细节。该装置使用了一个混合器，和一个用来向混合器中加入浓甘油或无甘油灌流液以控制浓度的贮器。混合器的体积在灌流时保持恒定，在洗去低温保护剂时稀释液的加入必须呈指数增长以保持浓度改变的线性速率。恒定的混合器体积和只有一个输送贮器存在也使灌流液浓度不可能突然改变。除了肾和肾脏前的热交换器外，所有回路里的组成部分都位于室温下的实验室工作台上，贮器是30℃恒温的。肾脏和热交换器处于苯乙烯泡沫塑料盒内，没有控制其内部温度。尽管对肾脏周围的空气没有控制，只对动脉温度测量而对静脉温度或甚至对肾脏的表面温度不作测量。使用苯乙烯泡沫塑料盒也不允许在无菌的条件下灌流。测量器官流速的唯一可能的方式是关掉流出的再循环泵，人工记录给定体积的液体在流出贮器中积聚所需的时间，因为没有特定用于器官的灌流泵，这与本发明不同。压力不是基于肾脏的阻力，而是基于肾脏和用来让灌流液通过热交换器并返回混合贮器快速循环的可用于调节的旁路阀的综合阻力来控制的。压力传感器处于动脉套管处，这产生了需要人工清除液体的死角，这有可能使未混合的死角液体加入动脉套管中。通过在早期文献中述及(Pegg等，低温生物学，10：56-66(1973))的电路特定制作的压力控制单位来控制压力。测量动脉浓度而不是静脉浓度。没有使用计算机控制或监测。通过将折射记录输入“工艺控制器”与线性电压斜面生成器(linear voltage ramp generator)的输出比较来控制浓度，并对浓度或稀释液流速作适当的调整。以5分钟的间隔在混合贮器的两端和动脉样品出口处人工测量甘油的浓度，显然，没有用折射计将可测量的信号发送到记录装置内。以5分钟的间隔人工测量温度和流量。在条幅式的图表记录器上以笔痕记录动脉压和肾重。这些特征都是不需要的。
Jacobsen等(低温生物学15：18-26(1978))报道了进一步的改进。加上防泡阀，取消肾脏通道的样品出口(在通道的远端测量浓度)，在条幅式的图表记录器上记录温度而不是人工每5分钟记录。另外，这些作者报道，通道浓度比贮器浓度延迟5分钟(而在本发明中对于动脉浓度为3分钟或更少时间)，在向混合贮器内加入5升稀释液后最终的低温保护剂浓度不低于70mM(而本发明中接近0终点浓度是使用少于3升的稀释液，低温保护剂的最大值是Jacobsen等人所述的两倍)。
同年I.A.Jacobsen(低温生物学15：302-311(1978))也报道了对系统的改进。Jacobsen测量了但没有报道灌流时肾脏周围的空气温度。他将混合贮器的体积减少到70毫升，这是400毫升回路总体积中极小的部分。没有使用电输出折射计来直接测量甘油的浓度，并控制加入和洗脱过程。取而代之的是浓度或稀释液流速的计算值用India墨汁画在纸上，由控制浓度/稀释液泵的Leeds和Northrup Trendtrak程序器读数。尽管回路体积很低，低温保护剂的最小浓度可达约100mM。
Armitage等(低温生物学18：370-377(1981))报道了相似系统的另外的变化。必不可少的是，将预先使用的整个灌流回路放入冰柜内。用凸轮随动件代替电压斜面控制器。但是，为了正确地分割凸轮，需要用热平衡计算出加入甘油或稀释液所需的速度，在实际所需的浓度-时间关系曲线中会引入误差。最后，将另外的贮器加入回路中进行改进。该库用人工活塞进入(没有清除地解释进入贮器和出贮器的转换方式)，新贮器的使用可以滤去灌流液或让它通过防泡阀。不用新贮器来改变低温保护剂的浓度；它用于改变加入低温保护剂后介质中的离子组合物的浓度。混合贮器的体积为500毫升，最终低温保护剂的浓度为40mM。
根据发明人的理解，上述的装置和方法代表了低温保护剂灌流领域中其他人实施的现状。
由申请人所述的一种低温下器官保存的方法是冷却时的器官玻璃化而不是冷冻(参见，例如Fahy等，低温生物学21：407-426(1984)；和美国专利4,559,298)。“玻璃化”是无冷冻的固化，为低温保存形式。当系统或器官冷冻时，可通过用抑制水结晶(如形成冰)的低温保护剂置换活系统内大量水，玻璃化就可在如离体的人或其它动物体器官内完成。典型过程玻璃化需要大于6摩尔(M)低温保护剂。但是，用已有技术，可以用足够高浓度的低温保护剂浓度使器官玻璃化而不杀伤器官。对器官存活来说，限定浓度典型地为4M以上。
低温保护剂引起的一类损伤是渗透损伤。低温生物学家在1950年就了解了低温保护剂的渗透作用，和控制这些作用以便在向离体的细胞和组织中加入和除去低温保护剂时能防止不必要的损伤。当低温生物学家着眼于研究用低温保护剂灌流整个器官时也有相似的结论。注意渗透原理，必须诱导器官对加入的低温保护剂的耐受能力。尽管努力控制低温保护剂的有害渗透作用，仍可观察到对低温保护剂耐受力的限度。这似乎是低温保护剂真正的、内在的毒害影响，它不依赖于这些化学剂短暂的渗透作用。
本发明者和另一些人已检查了对低温保护剂非渗透、内在毒性的控制方法。结果显示：一些技术单独或结合使用是很有效的。这些技术包括(a)在较低温度下暴露于最高浓度；(b)使用能相互排除毒性的低温保护剂的特定组合；(c)将低温保护剂暴露于对于这些特定低温保护剂最佳的载体溶液中；(d)使用非渗透剂代替部分必需的渗透剂，这样可使细胞内部不暴露于更多的细胞内试剂；和(e)使依赖于时间的快速毒性的浓度范围里所化的时间最少。但是，对整个器官使用这些原理，使之能被可玻璃化的溶液处理而没有损伤的手段是不清楚的或不可得的。
这些技术中的一些技术与控制渗透力的需要有潜在的抵触性。例如，降低温度也降低了低温保护剂的流入率和流出率，从而延长和加强了它们的渗透作用。相似的是，使暴露于低温保护剂的时间减至最短则使它们潜在的渗透作用增至最大。这样，在控制渗透损伤和控制毒性之间必需寻求一个平衡。获得该平衡的合适手段是这些文献中所未述及的。有时，通过减小暴露于这些药剂中的时间而加强低温保护剂的渗透作用是有益的，可以降低造成的毒性，但没有述及用来在整个器官中得到该结果的安全措施。
在低温下保存器官可以减少宝贵的人体器官的浪费，并使供者和接受者更好地相配，尽管近来在控制排斥上有了许多进展[参见，Takiff等，移植(Transplantation)47：102-105(1989)；Gilks等，移植(Transplantation)43：699-674(1987)]，但这一点仍是很重要的因素。此外，目前正在开发的用以激发接受者对特定供体器官的免疫耐受性的大多数技术可能由于接受体的制备有了更多的时间而受到促进。
器官低温保存研究的一个主要局限是缺少用来控制灌流参数(如低温保护剂浓度-时间关系曲线、压力和温度)的合适的装置。前述标准的灌流机器不是为本申请设计的，不能满足本申请的需求。至今已知的专利技术如下：
美国专利3,753,865授予Belzer等；
美国专利3,772,153授予De Roissart等；
美国专利3,843,455授予Bier，M；
美国专利3,892,628授予Thorne等；
美国专利3,914,954授予Doerig，R.K.；
美国专利3,995,444授予Clark等；
美国专利3,629,686授予Gruenberg，M.L.；和
美国专利3,837,390授予Reneau，R.P.。
过去用于低温保存的装置只允许实施相当简单的实验方案，常常在实用中力不从心。只有Adem等报道了使用计算机用低温保护剂对器官进行灌流(参见，例如生物医学工程(J.Biomed.Engineering)3：134-139(1981))。但是，他们特定的设计有一些重大的缺陷限制了它的应用。
本发明明显克服了已知装置和方法中所有的缺陷。
发明综述
在一个技术方案中，本发明涉及用灌流液灌流入体或其它动物器官，如肾脏、肝脏、心等的计算机控制装置和方法，并包括为进行这类灌流而对器官进行制备。器官的灌流由于下列许多理由中(不仅仅局限于这些理由)的任何一个而得以进行：例如制备用于低温保存的器官；制备低温保存后用于移植的器官；用常规的手段在0℃以上保存；在高温下暂时的保持活力以研究其生理学；试验器官的活力；尝试使器官复活；和固定器官进行结构研究。装置和方法也可用来使器官或组织薄切片过冷。在另一个技术方案中，本发明涉及用伊洛前列腺和/或其它药物来制备的灌流液对供体动物和/或准供体器官进行的处理。在另一个技术方案中，本发明涉及用来制备低温保存器官的装置和方法，如玻璃化方法。在另一个技术方案中，本发明涉及在低温保存后用于移植进合适宿主的器官的制备装置和方法。
在一个技术方案中，本发明涉及低温保存的生物器官的制备方法，包括下列步骤：
(a)用逐步增加到第一预定浓度的低温保护剂溶液灌流器官，同时降低器官的温度；
(b)将低温保护剂的浓度维持足够时间以允许器官产生近似的渗透平衡；和
(c)将溶液的低温保护剂浓度增加到更高的第二预定浓度，并维持该浓度足够的时间以允许器官产生近似的渗透平衡。
然后将器官从灌流装置中取出，用合适的方法进行低温保存，或为进一步的低温保存准备。
在低温保存后，让器官在并非是本发明的装置中温热。
在准备将器官移植入接受体内时，将器官再连接到本发明的灌流装置内。
在另一个技术方案中，本发明涉及在低温保存和随后的温热后用于移植的器官的制备方法，包括：
(a)将器官温热到可进行再灌流的温度，使器官的损伤最小；
(b)用非玻璃化浓度的低温保护剂对器官灌流足够时间，以允许器官达到近似的渗透平衡；和
(c)将所用的低温保护剂基本上灌出来，同时将器官的温度升高到适合移植的温度。
在另一个技术方案中，本发明涉及用于移植的器官的制备方法，进一步包括用浓度降低的低温保护剂与：低分子量(LMW)“非渗透性”渗透缓冲剂(OBA)；或高分子量(HMW)“非渗透性”OBA；或LMW和HMW的OBA混合物的灌流器官，HMW的OBA或LMW的OBA的加入和除去是以和谐的方式进行的，用器官的不同而不同。对于肝脏，根本不用渗透缓冲液。对于大多数其它器官，用含第一OBA浓度适当的低温保护剂溶液对器官灌流足够时间以允许器官达到渗透平衡。然后基本上洗去所有的低温保护剂(最终的低温保护剂浓度低于200毫摩尔)同时将OBA浓度降到非0水平但明显低于第一缓冲剂浓度水平的第二水平，同时提高器官的温度。最后，灌流器官以除去OBA而使器官适合于移植。
器官的例子包括兔肾、鼠肝和人肾。
本发明的装置包括操纵含多个液体贮器的灌流回路的计算机、升高和降低浓度的装置和器官容器。第一液体流程途径被定义为从多个贮器必不可少的传感器和温度调节装置再到多个贮器的回路。贮器可选择性地与第一流程途径相连。泵装置介入第二液体流程途径以将第一液体流程途径中的液体泵到第二液体流程途径中。器官容器处于第二液体流程途径中。泵装置也可包括于第二液体流程途径以便将来自器官容器的液体泵到一个或多个贮器或泵到废液池。一个或多个传感器被插入液体流程途径以监测在第一和/或第二液体流程途径中液体的至少一个浓度、浓度差、温度、压力和pH。测量装置被插入第一和第二液体流程途径以测量器官容器中液体流向的上游和下游之间的浓度差和温度差。传感器和测量装置与程序化的计算机相连以提供从传感器到计算机连续的信息流。最后计算机与选择装置和泵装置偶联以连续地选择性地控制(a)来自每个贮器进入液体流程途径的液体流量，(b)来自每个液体流程途径进入每个贮器的液体流量，和(c)根据预定的计算机程序，在基本没有操作者介入下测出的在第一和/或第二液体流程途径中液体的至少一个浓度、温度、压力和pH。
本发明装置的附加特征可包括插入第一液体流程途径、用来调节该液体流程途径中液流温度的热交换器。第二热交换器可插入第二液体流程途径用来调节第二液体流程途径中液流的温度。
在本发明装置和方法的阐述中，各个相同的许多方面已经作了编号。该编号使本申请产生了一个概念性的组织和结构。该编号不是表示必不可少的装置或意味着本发明中必须按它们所指的顺序进行的特定的步骤。
本发明的特征和优点
本发明具有多个特征和优点，最重要的为：
1.在灌流器官时根据各种广为不同的预定浓度-时间关系曲线图可控制灌流液中低温保护剂或任何其它液体或药物的浓度，在同时改变其它药物或渗透剂浓度时，它或多或少与经过器官的灌流液的流速无关。逐步改变浓度是可行的，也可将浓度有效地降为0。
2.它提供了在线路中感知浓度、pH、灌流温度和其它参数的方法，这样避免在灌流贮器中装传感器和人工测量的必要。
3.通过使灌流液从贮器到灌流传感器再返回贮器的运行所需时间缩短使被监测引起的低温保护剂浓度和灌流贮器里的低温保护剂浓度之间的差最小。
4.通过使灌流液从主液体回路到被灌流器官(或过冷组织)所需的时间最少从而使被监测的低温保护剂浓度和真正灌流到器官的低温保护剂浓度之间的差最小。
5.可以测量穿越器官的低温保护剂浓度的动脉-静脉差作为器官与低温保护剂平衡的程度指标。
6.可以控制器官的温度而与通过器官的灌注液流基本无关，并可随意地改变该温度。
7.可以控制灌流压，同时可固定灌流压或按需改变它，需要时可使压力波动最小。
8.防止未混合溶液、空气泡、颗粒或病原体灌流入器官，并避免液体接近死角。
9.它用计算机控制灌流，这样提供了对数据的实际时间监测、显示、处理和记录，并对传到传感器和泵标字刻度和指导灌流回路的清扫、消毒和整理，并在需要时指导和警告操作者。
10.能容易地灌流和低温保护各种大小的器官，如从大鼠心到人肝脏，也能使组织或细胞培养物过冷。
附图的简单说明
图1(包括图1A和1B)。图1A显示本发明总的液体回路。图1B显示流出液分布部件(EDB)的结构和流出液被分流以便从图1A中的ΔR.I.泵126取样的装置。
图2A-C依次显示本发明用作贮器R1的两室的梯度形成器的侧视图、顶视图和底视图。
图3A-C依次显示本发明用作贮器R3的三室梯度形成器的侧视图、顶视图和底视图。
图4A-C依次显示用于本发明的热交换器/防泡阀/混合器(HBM)的左视图、前视图和右视图；图4D显示了HBM基部的混合单位区域；图4E显示了HBM基部的顶视图。
图5显示了引入和除去相当稀释的玻璃化溶液的典型方案。用于图5和后面附图中缩写的含义如下：
pH5表示相5；
epH6和7分别表示相6和7的末端；
pH5：250表示在相5时LMW OBA的浓度为250毫摩尔；
epH6：50和epH7：0表示在相6和7末端分别为50和O毫摩尔LMW OBA浓度；
Veh．表示载体；
EC表示Eurocollins溶液；
CPA表示低温保护剂；
回路中的圆卷中的1-7数字是指后面述及的7个相；
P/10表示压力除以10；
M表示目标的摩尔浓度；
F表示流量ml/分钟。
图6显示了两步引入充分浓缩玻璃化溶液的部分方案，这是在标准灌流机中进行的。
图7A-7D包括用于器官低温保护剂灌流的流程图。
图8是用于引入高浓度低温保护剂的两步冷却技术的细节图解。
图9显示用玻璃化溶液在标准填注机器外和-20到-30℃下灌流肾脏的装置。
图l0(包括图10A-l0D)显示大鼠肝脏的典型灌流方案，其中既没有使用HES，也没有使用LMW OBA。
图1lA和11B包括非低温保护剂灌流过程的流程图。
图12显示用已知为V49的玻璃化溶液灌流后被移植的兔子肾脏发挥功能的能力，以它们对血清肌酸酐的控制来度量。
图13显示在预先用7.5M或8M低温保护剂灌流后冷却到-30℃对兔肾脏的影响，并与暴露于-3℃未冷却的肾脏结果作比较。
图14显示在冷却到-23℃后兔肾脏薄切片暴露于高浓度低温保护剂的结果，它显示通过开始在低浓度(6.1M)下冷却可防止冻伤和与高浓度引起的毒害。
图15显示在6.1M低温保护剂中也可成功地避免肾脏的冻伤(100％存活，优秀的极好的最终肌酸酐水平)，证明冻伤可被低浓度消除的学说。
图l6显示在-22℃下引入8M低温保护剂的两步方法的可行性；两周后存活率为7/8，肌酸酐水平是极好的，与只暴露于6.1M低温保护剂肾脏的结果相同。
图17显示用8M低温保护剂并降温至-32℃可避免冻伤的两步方法的可行性(存活率＝100％，最终的肌酸酐水平与只暴露于6.1M低温保护剂肾脏的结果相同)。
图18显示用V55处理并冷却到-46℃经历最大冻伤的肾脏切片，在薄片冷却到玻璃化温度时没有进一步的损伤出现。
图19显示用V55处理并冷却到-46℃完整肾脏中的手术后的血清肌酸酐水平及其后的生命支持功能(存活率：1/1这样处理的肾脏；最终的肌酸酐水平：可接受)。
图20(包括图20A和20B)显示用本发明的方法以V55的玻璃化溶液灌流人体肾脏的数据。特别是，图20A显示对低温保护剂浓度成功的控制。图20B显示阻力和流量数据。这些数据来自同一个232克人体的肾脏。在图20A中，P表示压力(毫米Hg柱)。在图20B中，阻力由重量乘压力除以流速
表示。
图21显示来自与图20相同肾脏的冷冻数据。肾脏浸渍在60％w/v二甲基亚砜和乙酰胺混合物后再冷冻。这些数据是冷冻约15分钟后器官核心温度为0℃再到玻璃化温度时连续记录的数据。这些数据揭示肾脏内没有形成冰。
图22显示了用本发明的方法将V55对小儿肾脏进行灌流(上升部分)和洗去(下降部分)。实线表示V55的预定浓度，虚线表示实际测得的V55在回路中的浓度。由于低温保护剂从该肾脏去除，故没有产生冷却曲线。
图23(包括图23A-23C)显示了兔子肾脏薄切片(图23A)、人肾脏薄切片的存活数据(图23B)和兔子-人体对比的数据(图23C)。人肾脏薄切片对V49的反应与兔子薄切片相同，但冷冻到-30℃后恢复力较低。
定义
为了弄清和理解本说明书和权利要求书，包括其中给出的这类术语的范围，现提供下列定义。这里或本申请其它部分没有定义的任何术语在用于本发明时具有该技术领域人员公知的普通含义。
这里所用的“低温保存”表示离体的组织或器官储存在很低温度下能保持活力。低温保存包括冷冻和玻璃化。
这里所用的“玻璃化”表示一个器官或组织的没有结冰的固化。
这里所用的“低温保护剂”表示一类与没有低温保护剂的冷冻作用相比，器官冷到零下温度时它们能抑制冰晶体形成，升温后因而能提高存活率化学制剂。
除非特别指出，这里所用的温度单位都是℃。
这里所用的“非渗透”表示绝大多数化学制剂分子不渗入组织或器官的细胞，而只留在组织或器官的细胞外体液中。
这里所用的“渗透缓冲剂(OBA)”表示低分子量(LMB)或高分子量(HMB)的非渗透性细胞外溶质，在低温保护剂流出过程中它们能抵销细胞内比细胞外低温保护剂浓度大所产生的渗透作用。
这里所用的LMW OBA的相对分子量(Mr)为1,000道尔顿或更低。LMW OBA包括，但不限于，麦芽糖、果糖1，6-二磷酸钾和钠、乳糖酸钾和钠、甘油磷酸钾和钠、麦芽戊糖、水苏糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、麦芽三糖、葡糖酸钾和钠、葡萄糖6-磷酸钾和钠和棉子糖。在更好的技术方案中，LMW OBA选用甘露醇、蔗糖和棉子糖。
这里所用的HMW OBA的Mr为1,000到500,000道尔顿。HMW OBA包括，但不限于，羟乙基淀粉(HES)(450,000道尔顿及其较低的Mr水解片段，特别是1,000到100,000道尔顿片段)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，棉子糖十一烷乙酸钾(＞1,000道尔顿)和Ficoll(1,000-100,000道尔顿)。在最好的技术方案中，MW OBA是HES，450,000分子量。
这里所用的“近似的渗透平衡”表示动脉和静脉的浓度差约低于50-200mM(4M动脉浓度处差值为200mM表示静脉浓度是动脉浓度的95％。对于下面所述的低温保护剂公式而言，153mM的差别相当于1％w/v浓度差)。
这里所用的“动物”表示哺乳动物，包括，但不限于人。
对较好技术方案和最好模式的详细阐述
1.对灌流装置的说明
在较好的技术方案中，结合了本发明原理和特征的装置位于冰柜100中(图1A中以双虚线显示)。冰柜含有两面，贮器/电池阀面和器官/折射计面。冰柜正面是双层镶嵌透明的玻璃的门，每个在玻璃板之间有约1英寸绝缘空气(这可在需要时降低压力和/或湿度)以避免潮气在门上冷凝并使热向冰柜内泄漏最少。器官面的门被分割开以形成“上下可分别开关的门”。这让器官面的门的上部可被打开和关闭，以便将器官放入系统并取出器官而不改变门上部以下部分(具有器官容器和大多数其它装置)的温度。在冰柜的贮器面处也可用“上下两部分可各自分别开关的门”，使操作者可进行任何所需的调整(如向贮器内加入液体、上部液体管的转移等)而不会干扰冰柜的温度到不需要的程度。
本发明的最初特征和其操作模式如图1A的方块流程图所示。根据三通电磁阀S1、S2和S3的计算机控制行动模式，通过系统循环的所有液体用回路泵102将液体通过管道U1、U2、U3或U4摄入主回路。摄入管道U1-U4或与来自贮器R1-R4的液体输送管道D1-D4分别连接，或与清洗口C1-C4连接，通过标准管快速断开。如弯曲的箭头所示，夹住D1-D4并从摄入管道U1-U4中拔出，管道U1-U4可插入清除口C1-C4。虽然目前由人工完成该项工作，但可加上相关领域中认可的合适的阀、管和控制器来自动地处理大多数这些事务。
在本发明技术方案如现有的构造所示，贮器R1-R4由一厚的透明塑料搁板支撑，悬挂了四个用来搅拌四个贮器的磁性搅拌台(图1未显示)。彻底搅拌贮器R1、R3和R4是正确地产生所需浓度-时间关系曲线所必不可少的。开/关状态和搅拌台的搅拌速度独立地由位于冰柜外的装置控制。
口C1-C4通向无菌(蒸馏)水、空气和消毒剂源。电磁阀S0和S00插入用来输送这些原料的输送管中，并保证痕量的消毒剂也不会偶然进入灌流系统。电磁阀S0控制空气或液体进入灌流回路进行清洗，而电磁阀S00决定所选择的液体是水或是消毒剂。主要清洗管道在冰柜外而不是在到达C1-C4之前分成四个独立的通道(图1没有显示)，这确保了每个通道彼此独立，即来自摄入管道U1-U4进入清洗管道再到清洗口C1-C4的液体不会因未清洗溶液的扩散而产生交叉污染。
通过除菌过滤器F4将蒸馏水和消毒剂摄入系统，通过空气过滤器F5将空气摄入系统。目前选用的消毒剂是临床上可接受的透渗机的冷消毒剂，如ActrilTM(美国明尼苏达州明尼阿波力斯Minntech公司)。清洗的过程是用水然后用消毒剂洗去系统中的灌流液。在下一次灌流前，用水洗去系统中的消毒剂，然后用空气洗去系统中的水。用合适的灌流液代替空气灌流系统。用空气冲洗以避免溶于淋洗水中滞留的痕量消毒剂的长留下去，并避免灌流液体被水稀释的可能性(即，减少了对代替来自系统中水的灌流液体的需求量)，可对灌流的完成情况作肉眼观察，当贮器、过滤器和器官容器清洗后但在灌流前被放进系统中时减少了冰柜中水的溢出。但是需要时可省略空气冲洗。需要时用空气过滤器以防止来自空气的病原体的污染。
电磁阀S9-S12一般让液体流入贮器R1-R4或流入废液管道(LW)。也可通过除去来自贮器R1-R4的再循环管道RL5-RL8使贮器R1-R4与系统脱开，贮器R1-R4(按照弯曲的箭头)分别与废物出口W1-W4接通，让贮器R1-R4从系统中除下进行清洗、消毒和重新填充。当贮器R1-R4被除去后，阀门S9-S12让液体进入废物出口W1-W4。相应于废物出口W1-W4的四个废物管道合并成单个共同的废物管道LW。两通电磁阀门S16位于共同的废物管道上。没有使用废物出口时，共同的废物排出管由关闭阀S16阻断以防止废物或病原体回流进无菌的冰柜内。
接通贮器输送管道D1-D4或清洗口C1-C4使用本系统的摄入管道U1-U4并联合使用接通贮器内部回流管道(图中没有显示)或进入废物出口W1-W4的再循环管道RL5-RL8可使灌流回路完全无菌。在管从一个位置转换到另一个位置时用消毒剂擦试摄入管道U1-U4、输送管道D1-D4、清洗口C1-C4和废物出口W1-W4的钝端来进行消毒。在转换管时同时加手指压力以住塞管子，防止液体渗漏并进一步减少污染的危险。
从贮器R1-R4或口C1-C4抽出的液体根据电磁阀S4-S7的活动状态，通过数个过滤器F1、F2和F3中的一个输走。这些活动样式在下面将作更具体的揭示。但是，经验表明单个过滤器F1或平行的两个过滤器F1、F1’适合大多数的研究(如断线所示使阀门S4-S7处于任选状态)，因为在回路中即使只有一个或两个平行的过滤器也可有效地逐步改变浓度。
需要使回路泵102的头和电磁阀S1-S7间的距离最短，从而使回路的无效区、无效时间最小，并使灌流液粘度的影响最小。短距离和合适的管内径对于S1-S3尤为关键，这可保证从R1-R4中抽出合适的液体。
标准的微孔过滤器(美国马里兰州Bcdford)与我们的低温保护剂相匹配。过滤器能将灌流液除菌，并可被压热消毒。通过如图1A所示的快速断开可将所有的过滤器架子从系统中取出进行清洗和消毒。通风管V1-V3位于冰柜100的冰冻部分外，通向电磁阀门S13-S15。在灌流和清洗系统时，这些通风管在计算机的控制下开启和关闭，让空气逸出，从而防止过滤器被空气阻塞或损伤。给V1-V3提供了的手动旁路(只显示S13的傍路)用作紧急情况下清除来自回路的空气。显然，若回路中存在过滤器F1-F3，则在过滤器F1-F3之外的用空气清洗系统是不可能的；因此若该方法包括空气清洗，则在开始洗出消毒剂前必须拿开过滤器F1-F3。
在目前较好的技术方案中，在每个过滤器架上有一个0.22微米孔径的90mm直径的滤膜。这样大小的滤膜足可通过-6℃下玻璃化的溶液(上铺1.2微米滤膜一张粗的前置滤膜以防止阻塞)使之能成功地灌流兔肾脏。着眼于可操作性的标准离心是使用两个平行的相同的过滤器。这可满足人体器官对液流的需要，防止空气不当心地进入动脉液体是个安全的因子，和使靠近过滤器的压力构成最小。在灌流时这种连续的灌流液过滤器消毒和再消毒可作为后备措施在灌流时由于任何原因发生污染时可用预消毒溶液。(数百次灌流后肾脏的感染发生机会科直为0％。)
一旦来自选择贮器的液体流过合适的过滤器后，它经过在热交换器104中的某种初步温度调节，然后到达尽可能接近器官的位置，在该点遇到了“T”型管连接器T1。液流被动地经过途径L1(“折射计环”)，一后者将液流导向测量液体折射指数的流通过程控制折射计106，因此测得了低温保护剂的浓度。借助于器官泵108使剩余的流体经过器官环L2。用计算机控制器官泵速度尽管器官的血管阻力变化很大的保持所需的器官灌流压。通过改变器官泵头和流经的管直径，可产生宽范围的流体足供成功地灌流各种大小的器官：小到鼠心，大到人肾脏。
回路泵102供给折射计环L1和器官环L2，它输出的流速必须足够大以超过所有时间通过器官的流体速度并保证足够的流体到达折射计106和其它管线中用来测量灌流液的温度、pH和其它所需参数的传感器(一般标为110)，保证准确地测量。流体也应当足够多使贮器浓度的改变和折射计环中传感器测得的浓度和其它参数的变化之间的“无效时间”最小，也使贮器和器官之间的“无效时间”最小。由于需要防止液体以超过过滤的速度到达过滤器或管使液体未经过滤而通过，以及由于对热输出的抑制和对回路泵管的磨损，回路泵的流体受到了限制。在实验中回路泵的速度一般不改变，因此不需要计算机控制，但计算机控制是可以任选的。
灌流液流经器官泵108后，再经过第二热交换器112以完成对灌流液温度的调节。这通过用在热交换器112和浴114、116之间的计算机控制的泵(未显示)分别调节来自冷浴和温浴114、116的流体来达到。
计算机能改变通过冷途径和温途径的流体以调节动脉管中的灌流液温度，因此也控制了器官流出液的温度。动脉和流出液温度指示了真正器官温度。通过控制冷浴和温浴液体的流动速度可不依赖于器官流量来独立地调节器官温度，倘若流量不接近于0。经验显示，用本发明的方法可使动脉和静脉的温度至少冷到-6℃，可高到25℃。一般的冰柜冷却不可替代用作零下温度灌流的热交换系统，因为冰柜冷却到零下温度时会使管线中较稀溶液结冰。器官容器装上特定的夹套和芯加以冷却特别有理论价值，可任选地包括于其中。
经温度调节的灌流液然后除去气泡，在防泡阀/混合器120中混合，再马上进入器官容器122。动脉和静脉温度探头在图1A中一般标为“T”，通过简单的孔穿入器官容器122的壁。压力和任选地温度在防泡阀中测量。虽然为了便于理解附图中分开画出防泡阀和混合器120，但事实上防泡阀和混合器120是热交换器112的组成部分，这样在连续控制热交换的同时完成了脱泡和混合。经验显示由于稀溶液和较浓、稠的溶液趋于分层，故混合很重要。下面揭示了热交换器/防泡阀/混合器(HBM)的特定结构的细节。
在正常情况下，从第二热交换器112流出的冷却液体用来冷却经过初级热交换器104的灌流液。该经冷却的液体然后到达有电磁阀S1-S12的电磁阀支持组件118，这样在回归冷浴前从这些电磁阀中抽去废热。
支持部件118现在由大块铝板构成(但也可为金属或塑料)，它带有其直径足以与被支持的电磁阀外径相配的圆筒形孔。插入电磁阀使含液体的入口和出口的基部面对操作者，和电磁阀头，电导线从头进入或通过了支持部件。电磁阀支持部件装有内部液体途径以排除来自电磁阀的废热。支持部件上装脚使位置固定以防止移动，在支持部件从冰柜里取出时可保护液体的入口和出口。部件装在冰柜中贮器的后方和上方，这样电磁阀入口和出口以及它们与贮器的连接总是易见的。
电磁阀较好的为3-7瓦特(或更少)活塞型3-通电磁阀，其最小的内部液体容积，具有0.156英寸或更大的孔，Cv值≥0.16(如648T033型电磁阀，Neptune Research生产，Maplewood美国新泽西)，耐压力直至500mmHg左右。本发明者目前优选NeptuneResearch(上述)3瓦特电磁阀，用RC下落回路固定以减少操作后产生的热量。因为用于低温保存的溶液有高粘度(经过吸出S1-S3粘稠液体发生困难)，控制无效时间和灌流较大器官需要高流量，堵塞的可能性以及回路泵和S8-S12之间形成的压力，所以有1/16英寸孔，和Cv值为0.01-0.03的电磁阀(如Valcor的20-2-3型电磁阀)不能完全令人满意。下面详细揭示了电磁阀操作的方式。下面更详细地阐述了冰柜内没有夹在电磁阀支持部件上的电磁阀SR1、SR31和SR32。
流出液分布部件(EDB)124(图1A)与器官容器122的输出面相连。EDB被设计成使少量流出液总是存在于部件的底部。该残留的液体被两通道“ΔR.I.泵”126抽出并送到差示折射计(“ΔR.I.计”)130，在此处其折射指数(用来测量浓度)与来自折射计环L1(以张静脉流出样品相同的速度泵出)的灌流液相比较，产生一个差示信号送达计算机。由于在折射计环L1中的液体接近于进入器官动脉的液体的浓度，ΔR.I.输出是对穿越器官的动脉-静脉浓度梯度的估算。当此梯度很大时(正方向或反方向)，器官远没有平衡。当梯度为0时，器官至少大半处于和灌流液的渗透平衡之中。对差示折射计非正统使用所得的非线性基线被储存于软件以运行灌流程序。
所有来自器官的流出液(和由ΔR.I.泵取样的动脉液体)最后由再循环泵128收集，并送达电磁阀S8，此阀控制流出液是否再循环到贮器中或弃置。回归贮器的流出液与流经折射计环L1的液体在T连接T2处合并。如上所述，通过电磁阀S9-S12的启闭来控制其回归到正确的贮器内。
再循环泵128与回路泵102一样不需要流量调节。它正常设置的速度足以超过经过器官泵108的最大流量。由于再循环泵的输出超过器官泵的输出，空气被连续引入通向电磁阀S8，并通常进入贮器R1-R4。下面阐述防止由此引起的管道过量发泡的设备。
虽然可改变ΔR.I.泵速度，但它一般在整个实验中保持恒定。在目前的操作方式中没有计算机控制，但计算机控制可在某些情况下按需选择。ΔR.I.泵使用极小直径的聚乙烯管以减少液体运行时间上的延迟。由于经过ΔR.I.回路的流速被通过器官的最低流速(可能很小)限制，也被市售的差示折射计液流途径的大小所限制，所以小的管子特别重要。
差示折射计输出后回到器官流出管接近于流出液的再循环泵。这样的位置而不是远离泵的位置保证了流体稳定地流过差示折射计，而远端的位置可由于较高的出口压力阻止或改变差示折射计的流量。
液体回路一个重要的部件是通过管道P1与回路相连的梯度泵132(图1A)。梯度泵的功能是让冰柜内合适贮器中的浓度作梯度改变。达到这一点的方法如下述。管道P1放置在梯度泵的T3A位置，这正好在折射计环L1和器官环L2连接点的之后，这提供了一种选择可保证除去器官流出再循环泵128引入的空气，从而帮助减少了贮器液体中的泡沫。
但是，较好的选择也是目前使用的是在管道P1中不引入空气。这可在点T3B处连接P1来作到，结果完全控制了浓度-时间关系曲线。通过将再循环泵128的速度持续调节到刚好稍超过器官泵108和ΔR.I.泵126合并流体的速度以便少量引入空气，这样可克服发泡的问题。S8的再循环输出与P1直接相连但不调节泵128的速度会使浓度控制不良，不值得推荐。
本发明的操作技术方案是在整个系统中使用1/8英寸直径硅橡胶管，它足以接纳所需的流体，为优选的方案。硅橡胶与ActrilTM冷消毒剂(美国明尼苏达州明尼阿波力斯Minntech公司)相配，为半透明的(这对看到流体以观察问题并观察微生物生长的任何迹象是重要的)，对于普通的诸如二甲亚砜的低温保护剂是不可渗透的，并足够软到易于操作。但是，在与聚硅氧烷冷冻液接触的回路中不可使用硅橡胶管，因为聚硅氧烷会使硅橡胶管肿胀和变弱。另外，C-Flex管(Cole Palmer Instrument Co.生产，美国伊利诺斯，芝加哥)由于其冷却时较大的强度(硅橡胶管会崩坏)和较大的弹性可用于泵头部。
贮器R1是梯度形成器(图2)。梯度形成器由两个同心圆筒构成，外圆筒200和内圆筒201。液体途径205是让液体在重力的影响下由于对内圆筒体积下降的反应而从外圆筒200流到内圆筒201。液体室的同心室向很节省空间。液体输送管道204相应于图1A中的管道D1。所显示的单元是市售梯度形成器的改进。用于本发明需作如下必不可少的改进。
1)夹持型两通(开/关)电磁阀202(目前由Bio-Chem Valve Corp.生产100P2WNC型，East Hanover美国新泽西)代替通常用来控制市售装置中从外圆筒到内圆筒流动的旋塞阀(图2C)。由于驱动液流的压力差很小，接着需要大的工作直径的液流途径202b，故夹持型阀比活塞型阀好。也由于当贮器从冰柜中取出贮器进行清洗时，可将电磁阀留下，它可便于从其管202b取下地显得较为优选。梯度形成器的基部在203处已作改进以给电磁阀腾出空间，并由平台对它进行支撑。平台203装有一个垂直的金属柱203b，电磁阀202与该柱用橡皮带捆绑以保持电磁阀方向正确。电磁阀位于离贮器足够的距离以避免贮器液体被过度加热。
2)来自外圆筒200到内圆筒201的液体管道205的直径已被扩大使器官低温保存所需的粘稠溶液以合适的速度流动。内径为1/8-3/16英寸是合适的。
3)带有盖子206(图2B)。该盖子有伸出物207，这可防止盖子放在圆筒上以及井200和201固定其中的同心槽后从一面移向另一面。盖子有内置的具可除去盖子的外部和内部的填充漏斗208a和208b和再循环口209。
4)漏斗208a和208b各自延伸形成内部填充管210a和210b。内部填充管较好的是刚性空心杆，位于内和外圆筒的壁上，具有1-2厘米间隔的孔211a和211b，其孔径约为3毫米。填充管的作用是减少再循环液体冲击贮器中液体表面时产生的泡沫。孔的目的是保证来自管中的空气从孔中逃逸，从而不会迫使空气到达贮器的底部形成泡沫。这些功能对含蛋白质的灌流液尤为重要，因为它们趋于稳定气泡。
5)已提供了填充标记以保证贮器可重复地被填充到同样的预定的体积。操作者可根据使用细节建立自己的填充标记。梯度形成器可以有大致的刻度(在内部和外部圆筒上都有并排的水平线，以避免在任何一个圆筒上读出液体水平会产一视差错误)，对于2升梯度形成器有约0.5厘米的间隔。对于存心使内部和外部圆筒内液体水平稍不相配的情况这些刻度也是重要的，这可防止密度方为不同的溶液，如没有低温保护剂的灌流液和玻璃化溶液的预先混合。这些刻度也可让操作者在计算机屏幕上对梯度进程作出粗略的定量检查。
6)市售的梯度形成器的塑料组成分对于某些推测会侵蚀塑料的低温保护剂会产生问题。因此较好的是使用与低温保护化学品相容的透明材料(如玻璃、有机玻璃等)制成贮器，或使用表面已聚硅氧烷化的贮器或处理过的贮器以防止侵蚀。根据本发明者的经验，丙烯酸型是可接受的材料。
7)贮器R1含有搅拌棒212。搅拌棒处于夹套213中，213与自由旋转的垂直杆214连接，214从贮器的盖子延伸到搅拌棒处来防止夹套和搅拌棒横向运动。这样的改变是必要的。这是为了使没有灌流机时不会发生搅拌棒震颤，从而使混合不良。来自上部而不是下部的支撑可防止灌流液不必要地摩擦发热并磨损贮器的底板。
贮器R3也是梯度形成器构造。贮器R3的细节如图3所示。贮器R3含有外室315(R33)、内室318(R31)和第三中间室316(R32)。中间室316与内室318通过由电磁阀317(SR31)控制的液体通道320相连。中间室316也通过由电磁阀319(SR32)控制的液体通道321与外室319相连。当浓度减少到0或接近0时，由于下面讨论中提到的的梯度泵的功能和梯度形成器的作用，必须使用外室。与有较大体积液体的中间室(没有外室)的情况相比，使用外室更为优选，因为单纯增加中间室的液体体积使因梯度泵132的恒定流速引起液体浓度图形变为非线性。控制浓度-时间关系曲线会变得更复杂。更重要的是，在实际上排空内室和中间室后，与外室所需的液体量相比，会要求中间室内有过量的液体才能使回路中的浓度接近0。
贮器R3的自动化使用中的一些问题部分通过软件、部分通过R3特殊的结构得以解决。特别是，电磁阀SR32让外室(R33)液体首先流入中间室(R32)，然后从该室进入内部圆筒(R31)。这是因为当SR32作用时，R31和R32接近排空，此时存在于R33和R32之间的压力头很大。在该点，R33仍是满的。若R33直接与R31相连，而不是在R33和R31之间用R32作为缓冲，这个大的压力头会使液体太迅速地流入R31。通过调节R33的水平，也可部分地控制流量。但尽管有这两个小心措施，流量的进一步控制也需要使用SR32的适当的工作状态循环。到达R31的流体首先磨碎慢，随着浓度越来越接近于0而变得越来越快，而被动的流体在重力的影响下总是开始最快，到末端最慢，除非流体由某种特制的当前正施加给SR32的循环度量。
对R3的其它改进类似于R1。
贮器R4是以与R1相同的方式构成的梯度形成器。
梯度泵132的目的是从回路中取出一些再循环液体。这样的取出液体导致流回原贮器的流本速度比从该贮器到回路中的流体速度小。这使贮器(R1、R3或R4)的内部圆筒中的水平下降。内部圆筒液体水平的下降接着导致外室或中间室的圆筒中的液体流向内部圆筒以保持两个水平相似。这样两个圆筒中的两个不相同浓度的液体在内部圆筒中混合，产生了浓度梯度，然后送到回路中的其余部分。这就是梯度泵造成到达器官和折射计的浓度的所需梯度改变的方式。计算机可对梯度泵速度作任何必须的调节。
所涉及的原理是，普通线性梯度形成器的原理，其中回路外部到达梯度形成器的部分可粗略地看作内部圆筒的额外体积。尽管存在着回路回路其余部分和液体再循环回到贮器，但以恒定速度从内部圆筒中取出并弃掉液体引起了摩尔浓度随时间的线性改变。但是，不象普通的梯度形成器，在梯度形成器中体积变为0的瞬间离开梯度形成器的液体浓度不等于梯度形成器外部(或中间)圆筒中的液体浓度。因此，为了在用普通的两室梯度形成器洗去低温保护剂时使浓度接近于0，必须向外部圆筒加入附加的液体，同时从内部圆筒内连续弃掉液体。这是R3修改成有第三室的原因。需要持续洗去的额外液体通过计算机比操作人用手能更精确地从第三室中加入。另一方面，在加入低温保护剂时，通过在外室使用明显超过梯度末端回路中的所需的最终浓度，总能达到到所需的最终浓度。由于目前的方法涉及浓度逐步向上改变(参见下面)，方便的是用与R2中所用的相同液体填充R1的外室。
图4A-E显示了HBM热交换系统的细节。
灌流液通过入口403进入HBM，经过中央通道400，并通过出口406离开HBM。中央灌流途径的两面是用来调节温度的独立的室。两个最里面的温度控制室401(在灌流途径的每个面上)用于冷却剂的循环，而外室402是抵销冷却剂的室温流液的通道。(对于特定的实施，例如，常温(normothermic)灌流，这些途径可被翻转。)
冷液体流的方向是任意的。当所有的液体(灌流液、冷却剂和温热液体)以相同的方向(向上)流动时，尽管缺少逆流的热交换，却发现了合适的温度控制。该模式可避免在外室中有空气或二氧化碳的积聚。
灌流液通过入口403进入HBM单元的底部，并以锯齿方式上升。它并入在上方有空气空间的小上部贮器：这是防泡阀区域404。然后灌流液在防泡阀下运行，并经过灌流液混合区域405最终到达动脉出口处。
用作冷液体和热液体的入口407和408在单元的基部各分成两个通道。热液体和冷液体的出口410和411各自接受来自有相同种类液体通道(即各冷通道或各热通道)的液体，通道的长度相同，从开始到结束经受的压力差相同，这样通过每个相同的通道的流速应该大致相等。
所有的冷和热液体途径包括在单元的后部的长弹性管412。这些管段有两个作用。第一通过在四个通道之间引入空气间隙使彼此的热交换最小，这在当所有冷和热液体以与灌流液流向反方向(即以垂直的方向)流动，且与灌流液没有进行热交换时尤为需要。第二，每个管可被夹住。用该方法若偶然一个冷通道或一个热通道应当接受所有输送的冷液体或热液体，而其它通道处于“空气锁定”，这种状态可这样改正：夹住收集所有流体的通道并挤出不工作通道中的空气使每个通道处于完全工作和相等流量的状态。
由于温度调节的液体以垂直的方式由顶部灌注单元的热交换部分，在底部出去，安装时必须开动冷和热泵使之以回退的方式运行以除去冷通道和热通道中的空气。若通向和来自浴的冷管和热管的内径不大于1/8英寸时这一点能最好地做到，因为这样的直径能使液流体代替来自管中的空气而不是让它以与液体流动方向相反的方向向上流动，或残留在管的各部分未除清。这样，当泵方向再从回退式变为笔直式时，管中没有空气，在单的的热交换室内也没有。
为了实施热交换功能，也设计了锯齿方式迫使前述灌流的浓灌流液进行混合，或当灌流液密度上升而不是下降时，清洗来自灌流途径的较稀的灌流液。
当灌流液从锯齿型热交换区域出现后，它在阀进入区418进入防泡阀404。灌流液通过出口区419从防泡阀出去。事实上，锯齿方式也可让任何空气泡从热交换区域中出来并进入防泡区。防泡阀有下列特征。
1.它的体积足够大，可通过在相对大的空气体积上分散每次冲程的震荡将灌流泵的跳动作用减少到最小。这简化了压力控制和测量，并可减少对器官的损伤。
2.它的体积足够低以使阀中存在的液体体积最小，从而使器官泵和器官本身之间的无效时间和无效体积最小。也需要最小体积使较稀的灌流液在浓灌流液上的分层最少。
3.提供了压力传感口413。口413没有与灌流液相连的液体，这样消除了“死胡同”，其中液体不能正确地混合，或其中消毒剂不能渗透或被截留。使用电子压力变频器(给计算机提供信号)和血压计(进行校正和肉眼检查)。
4.阀的盖子414可除去以供清洗。
5.通风口416用来调节阀中的液体水平，从而使防泡阀发挥作用所需的水平最低，压力被动阻尼最大。来自该开口的管通到冰柜外，这样可以不打开冰柜的门进行调节。
6.第三口417穿透防泡阀的盖子以便可注入药品、血管的标记物质、固定剂等。
7.防泡阀的壁与阀靠近进口和出口点418、419分别成一定的角度以便在灌流液进入和离开阀时进行一定量的混合，并打破分层，使较稀的灌流液在浓灌流液上的分层最少。
8.有引入探头的选择，如通过阀盖子中的一个口引入的温度探头可测量灌流液而无需传感器的永久性埋入：所述的口由附于塑料螺纹接口的弹性管构成。探头可自由地进入或抽出，用止血夹或相当的夹子夹住管以压紧封闭。这在HBM需要清洁时可简单地取出并再安装，也可灵活地选择探头并能使用探头在其它地方进行测量。
灌流液离开防泡阀后，下降到混合区域405(参见图4D)。3-单位混合途径的基本单位是狭窄的水平进入区HE，合并进“宽的”基部区BA，它再上升到流量限制区FR，结束在下降的D处结束，到达下一个水平进入区。进入HE的液体被驱动通过开口，该开口太小不能支撑太多的高密度液体上的低密度液体的分层，特别是考虑在HE前有直角转弯。进入BA的液体若较稀，可马上上升向FR，若较浓，则进入壁中并沿壁上升。但是遇到FR时，较浓的液体会向着直接从HE上升的较稀液体被加速，产生搅动和混合。若BA填充了浓灌流液，FR处直接向上流动的液体的速度会再使浓的液体与FR上方任何分层的低密度液体混合。此外，狭窄的下降途径D将分层液体和较浓液体一道拉向转角，再度防止了长时间存在的停滞的分层。实际上，图4B所显示的排成一行的三个这样的混合单位足以混合最初混合很差的灌流液，这在低温保护剂浓度突然上升或突然下降时常常遇到。混合单位的最后作用是作为某种原因没有在防泡阀区除去的任何小泡的防止阀，(但是，混合区域的泡在器官灌流前可由操作者很容易地除去。)
灌流液离开混合区后，下降到直接通往器官的出口406。来自最终混合单位到口406的途径与水平成一角度以提供防止任何气泡进入器官的最后一个机会，因为在该途径中到达器官的气泡必须向下流动和它的向上流动趋势相反。
通过堵塞固定于带有通风开口406的出口管直至在防泡阀中有约1/2英寸液体积聚，可排净混合区和接下来区域的空气。然后关闭通风使压力升达60-120mm Hg。最后，让液体再依次自由通过口406。液体喷发经混合区和出口406清除了从防泡阀到口406液体途径中。若一些空气残留着，可重复该过程来除去所述的空气。在空气已排除后打开通风口，在重力的作用下让防泡阀中不必要的液体从阀出去，达到了最终约1/8英寸的深度。在排除了管道中的空气以前不可使最终的深度达1/8英寸，因为在排除过程中不充足的体积会避免混合区被来自防泡阀的空气再填充。
需要拆下HBM以供非频繁的清扫。消毒和从防泡阀区除去消毒剂可自动地进行，但目前要求操作者小心以保证所有最上部的暴露表面被消毒，并最终洗去消毒剂而不污染出口管。413、416和417处出口管的排列使与之连接的专门的电磁阀可个别地用水、消毒剂和空气自动控制地清洗，这样使操作者无需费力地清洗防泡阀。
灌流液通过口406从HBM出去后进入了器官容器122中的器官(图1)。在较好的技术方案中，器官容器包括一矩形盒子，它带有铰链盖子、盖子门闩、盖子拉手、斜面底(特别是斜面底座)、动脉和静脉热电偶入口、灌流液入口和入口对面的底座上的流出口。底部斜度是右到左、后向前都向下方向，以保证所有流经底座的液体都除去，几乎没有液体积聚于容器中任何地方。一个针状探头直接插入动脉管道的壁。第二个探头放在直接从器官流出的液体中。在典型的结果中，动脉和静脉温度差只有十分之一度，但两者都用于质量控制。器官容器可使用相似于MOX-100DCMTM器官盒子(Waters Instruments Inc.生产，Rochester美国明尼苏打州)使用的软筛网进行支持，或器官可直接放在器官容器的底部，或放在特别设计的可除去的支持物上。后者较好，为目前所用。
器官容器122和器官泵108被尽可能近地放置以减少两者之间的无效时间和无效体积，为了同样的原因选择从器官泵通向器官容器的管内径尽可能地小。
如上所述大多数灌流液不经过器官环L2，而是从过滤器到达管线中的折射计106。本发明较好的技术方案使用了改进的市售折射计(Anacon Inc.生产BurlingtonMars)。特别是，使用小直径管的入口和出口而不是很大的标准Anacon管接口。
适用于本发明的折射计自动监测头的改进也可包括对一般买到的Anacon单位的下列另外的改变：
1.液体途径的内部体积可被进一步变得最小。
2.目前，需要用慢流速的氮气洗涤单位的空气空间以防止由于冰柜里的低温和高湿度而冷凝的潮气。在改进情况下，自动监测装置的电子区域可密封起来里面加有干燥剂以取消对氮气洗涤的需求。
3.本单位必须用垂直向上的液流方向定向。但是，该单位没有取这类定向，可对体形作出改变以使单位形状适合该定向。
本发明允许操作者以任何顺序接近贮器和按规格规划此过程，这可能有意义。操作者甚至可自由地根据他的愿望来开关电磁形状。不论怎样，下列举例说明的标准应用来揭示输送来自和到达每个贮器和过滤器的液体需要的操纵方式。也演示了系统设计来主要进行的器官低温保护剂灌流和清扫系统的“标准方案”。
电磁阀S1关闭时接纳来自R1的液体，作用时接纳来自R2的液体。电磁阀不通电时对R3开启，通电时对R4开启。S1和S2向S3输出，当S3处于休息的状态，它接受来自S1(即来自R1或R2)的液体，作用时接受来自S2(即来自R3或R4)的液体。S3(总是开着)的共同出口通向回路泵102，然后从电磁代的贮器中抽出液体。
若包括了差示过滤器，则回路泵102贮器中是到S4’的共同出口(总是开着)。当S4不通电时其出口冲着过滤器F1。从过滤器F1回归到S5正常的开口并通过S5共同的出口到达折射计环L1和器官回路L2。另一方面，S4通电时，其输出对着S6普通入口。当S6处于休息状态，其输出对着过滤器F2，并从过滤器F2通过其正常的开口进入S7。来自S7的输出液到达S5正常关闭的口，S5必须在通电时才开始接受该输出环。一旦液体进入S5，它流出S5普通的出口，到达折射计环和器官环。最后，若S4电磁阀，S6也电磁阀，液体将通过这二个阀到达过滤器F3。通过通电的S7和通电的S5电磁阀使来自过滤器F3的液体回归，并走向如上的两个环L1和L2。如早先所述，当需要自一种溶液向另一种溶液突然改变时，或当必须除去重颗粒污染物时，可任意地选用过滤器F2和F3，因此也在S4、S5、S6和S7。
来自器官的流出液再回归S8。若S8开启，则弃去液体。若S8没有开启，来自S8的液体与来自折射计环的液体合并，并回归到所需的贮器。
经过折射计环的液体依次流经电磁阀S9、S10、S11和S12，若这些电磁阀都没有通电，则进入废物管道。S9的通电使流体分流到R1再循环管道。S10的开启(S9不开)使液体分流到R2。相似的是，S11或S12选择性的开启分别使液体再循环到R3或R4。
电磁阀操纵来控制液体有两个基本过程，一个是用于真正的灌流，另一个用于清扫和充填系统。灌流方法典型的是从R1到R4，而充填必须以相反的顺序让液体充入贮器R2-R4的液体摄取和液体再循环管道，特别是若使用了过滤器F2和F3以及相关的管道，会在装填(清洁)过程的末尾让来自R1(典型地)(或C1)液体装填了回路。装填(或清洁)整个系统的开启的典型顺序下面以表格形式列出。
标准化的淋洗/装填的电磁阀控制顺序
表1和2列出了电磁阀控制过程。这些控制电磁阀用于：在过程的末尾用滤膜除菌H2O代替灌流液；在灌流之间用化学消毒剂代替清洗用的H2O；用滤膜除菌H2O除去消毒剂；用空气除去水；用贮器液体除去空气，即装填系统。
当只存在F1(没有F2或F3)时，装填(和清洗)可在任何顺序的贮器内进行，条件是装填时，最后的贮器与用于后来灌流的第一贮器相当。申请人现用暂时从R2，然后是从R3、然后R4然后R1吸出的方法，以足够的时间分别装填U2、U3、U4和U1，然后通过计算机/使用者出的方法S12、S11、S10和S9，用退回式注射器经P1用于装填RL8、RL7、RL6和RL5，因为此方法可节约大量灌流液，且很快。
用于从R1-R4抽出液体和让正常灌流液产生梯度的电磁阀操纵的标准方法如下：(假设(1)使用了任选的过滤器F2和F3，(2)直接或典型地使用控制梯度的电磁阀，和(3)有如R2的梯度形成器存在)。从一个贮器到另一个贮器的封闭回路的分阶段的完成以可避免不需要的组分的再循环溶液，在其组份替代来自回路的前面溶液之前进入新的贮器。若前面的溶液可再循环使用，这一延误再循环的小心措施就可以放弃。
表1
| 完成的次级任务 | 电磁阀#(+＝通电的) | ||||||||||||
| 00*0* | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 |
| 1.使液体从R4流到R1 | - | + | + | - | - | - | - | - | - | - | - | - | ** |
| 2.灌流通向W4的R4再循环管 | - | + | + | - | - | - | - | - | - | - | - | + | - |
| 3.使液体从R3流到F3 | - | - | + | + | + | + | + | - | - | - | - | - | ** |
| 4.灌流通向W3的R3再循环管 | - | - | + | + | + | + | + | - | - | - | + | - | - |
| 5.R2、F2 | + | - | - | + | + | - | - | - | - | - | - | - | ** |
| 6.通向W2的R2再循环管 | + | - | - | + | + | - | - | - | - | + | - | - | - |
| 7.R1、F1 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | ** |
| 8.通向W1的R1再循环管 | - | - | - | - | - | - | - | - | + | - | - | - | - |
| 9.器官环弃置管*** | - | - | - | - | - | - | - | + | + | - | - | - | - |
*若对贮器液体进行上述顺序，S0和SS00将是关闭的。若对水进行上述顺序，S0和S00也是关闭的，清扫口C1-C4与摄取管道U1-U4连接。若对消毒剂进行上述顺序，S0是关闭的，S00是开启的。若对空气进行上述顺序，S0是开启的，S00是关闭的。
**S13(任选地还有S14和S15)、过滤器通风电磁阀在该步骤是开启的，对于该步骤的其余部分是关闭的：它只是开启让来自管道的空气足以清洗的时间(在步骤1通常为60秒，对于使用**记号的其余步骤为30秒)。若系统中没有过滤器，则可以设计程序成不发生这些事件。
***当装填系统时可省去该步骤。
注：对于步骤2、4、5、8和9，水控制电磁阀S16是开启的(水管打开以便将液体弃置到废物中)，但对于所有其它的步骤，它是关闭的。
表2
标准灌流的电磁阀控制顺序
| 完成的次级任务 | 电磁阀#(+＝通电的) | |||||||||||
| 00*0* | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| 1.开始再循环到R1 | - | - | - | - | - | - | - | - | + | - | - | - |
| 2.R1梯度 | 与1相司，但开启SR1 | |||||||||||
| 3.从R2到F1，没有再循环** | + | - | - | - | - | - | - | + | - | - | - | - |
| 4.分流R2第一溶液经过F2，没有再循环 | + | - | - | + | + | - | - | + | - | - | - | - |
| 5.使除了来自器官的R2溶液再循环 | + | - | - | + | + | - | - | + | - | + | - | - |
| 6.使所有R2溶液再盾环 | + | - | - | + | + | - | - | - | + | - | - | |
| 7.使来自贮器R2的物质产生梯度≠ | 与6相同，开启SR2 | |||||||||||
| 8.自R3灌流只到S6/F2** | - | - | + | + | + | - | - | + | - | - | - | - |
| 9.自R3灌流到F3，回路打开 | - | - | + | + | + | + | + | + | - | - | - | - |
| 10.经F3再循环到R3，回路部分打开 | - | - | + | + | + | + | + | + | - | - | + | - |
| 11.使所有的R3液体再循环 | - | - | + | + | + | + | + | - | - | - | + | - |
| 12.使第一-部分R3成梯度 | 与11相同，但开启SR31 | |||||||||||
| 13.使第二部分R3成梯度 | 与11相同，加 SR31和SR32 | |||||||||||
| 14.打开回路，从R4经F3灌流 | - | + | + | + | + | + | + | + | - | - | - | - |
| 15.除了器官外，再循环到R4 | - | + | + | + | + | + | + | + | - | - | - | + |
| 16.自二个环再循环到R4 | - | + | + | + | + | + | + | - | - | - | - | + |
| 17.使R4成梯度 | 与16相同，但开启SR4 | |||||||||||
*对于正常的灌流，电磁阀S0、S00和S13-S13总是不被操纵的。
**该步骤防止来自前贮器的液体污染前面平衡的(新的)过滤器，所述的液体存在于新贮器和已经用来自新贮器的液体平衡的过滤器之间的管道内。
***如讨论中指出的，SR32操纵最初必须遵守循环的工作状态，在SR32长久的开启下直至R3使用结束。循环的工作状态涉及在电磁阀方式12和3，之间按照循环的需要向后和向前拨动。
≠步骤7是任选的。
贮器的数量相应于电磁阀数的改变，可少于或多于这里的具体数。此外，R1-R4的层数不必遵从上述说明。限定是最少有一个贮器，最多或许有8个贮器，其中任何贮器可有1-4个室。其上限部分是基于体积和拥挤限制，部分是基于复杂到足以能使控制多于8个贮器成为不可能。
另一个变动是在不同的位置使用不同容量的贮器(如，与这里的较好技术方案不同，一个可有2升贮器，接着是一个1升的贮器，接着是一个3升的贮器，接着是一个1升的贮器，等等)。
原则上，由于多个贮器可由4到20个同轴的圆筒构成，每个由电磁阀或由温度控制区域外的手动杆来开启，由一个中央搅拌台进行所有的搅拌，故已放弃了对单个贮器的使用。若逐步改变不是通过被搅拌的中央区域输送的，浓度突然或按步骤的改变仍是被提供的。也可改变贮器的相对位置。
最后，也可用液体计量系统而不是梯度形成器。在该系统中，泵向混合贮器输送浓的低温保护剂或稀释液体而不是依赖于重力作用。这个泵可用计算机操作以调节背离程序规定的浓度。但是保留梯度泵以控制总的回路体积。
动脉浓度传感器可邻近于，而不是远离回路中的器官环的起端，但不应当邻近于过滤器。
压力传感器自动监测过滤器的回路泵面的压力，可加入做为一个警告装置。
更一般的是，装置可分成两个装置，第一个用来制备用作低温保存的器官，第二用来制备先前低温保存过的，供移植的器官。第一装置可省去R3和R4(和有关的电磁形状)而第二装置可省去R1和R2(和有关的电磁形状)，其它的可基本相同的成一体的装置。若低温保存和低温保存的恢复可在不同地点和在不同入指导下进行，实用时这种变动可能有用处。必要的是除了使用不同的软件和使用用于加入和除去低温保护剂的不同的贮器外，这两个装置应当是相同的。另一个用途涉及只有两个贮器进行装载和卸载的异常使用；例如，若只使用了R3的内室(R3代替R2)，可用R1和R3进行装载，若R1代替R4，可用R1和R3进行卸载。
II.方法的说明
A.制备用于低温保存的器官和接着移植入动物体的方法
用上述装置进行的整个低温保存方法包括几个部分。一个部分是在器官从动物体内取出制备低温保存的器官前对供体动物和/或器官进行预处理。另一个部分是选择低温保护剂。再一个部分是在低温保存前制定给器官灌流低温保护剂的实际方案。再一个部分是用非本发明部分的适当技术对器官进行低温保存、储存和温热。本发明再一个部分是在制备移植入接受体的器官时，器官温热后从中除去低温保护剂的方案。另一个部分是在器官移植时对器官和接受体进行处理。
1.对供体和体内的供给器官的预处理
除了其它标准处理外，在获得器官前10-20分钟让供体接受iloprost(BerlexLaboratories，Inc.，美国新泽西)输液，它是一个较长效的环前列腺素(PGI2)类似物或相似试剂。申请人现已发现，通过静脉输液进入全身循环或直接进行肾动脉给药后可有效地减少接着使用的低温保护剂的毒性。用任一途径给药，但的最好剂量约是25微克/kg，虽然目前直接的动脉内输液是目前推荐的，使大多数器官接触试剂，但同时使iloprost介导的系统性减到最低。15微克/kg也是有效的，但不如25微克/kg有效。，根据物种、器官、输液速度、输液持续时间等，本申请对iloprost浓度认可的范围是5-75微克/kg。典型地是在20分钟内进行iloprost输液；对尸体器官供体输注，认可的输注持续时间是1-60分钟。当血压过低是限制因素时，可用相对低浓度的iloprost在相对长时间(20-60分钟)内进行输注。虽然不希望与任何特定的理论相联系，iloprost的保护作用可能不是直接的低温保护效应。iloprost对低温保护剂诱发损伤的肾脏切片无保护效应表明：iloprost可能只像高效的血管舒张剂起作用，促使低温保护剂均匀分布。因此，其它的血管舒张剂，如乙酰胆碱、硝普盐、氧化氮、高渗的和/或高膨胀压的洗液等以足以使器官产生血管舒张的剂量可以代替iloprost。
为了得到最佳的结果，一个重要的选择是用转化生长因子β1(TGFβ1)对器官进行预处理，在过冷前约24小时以10ng/ml浓度向培养基中加入TGFβ1时，可在用52％(w/v)低温保护剂过冷时防止试管内培养的上皮细胞从它们基底上分离下来。最好的应用模式是在器官经过或没有经过另外的注射前2-4小时进行浓药团式注射0.1-10微克/kg的TGFβ1。本发明者发现，在捐献器官被保护的前3、6和20小时，按每kg人体重给予0.5微克量的TGFβ1，兔肾用8M低温保护剂处理40-50分钟，这样可防止预期由于所述的处理导致的出血，可使动物(处理50分钟)存活到损献时处理后15天时。
在体内预处理后，所需的器官用冷的Euro Collins溶液、修改的UW溶液或相对有效的溶液原位冲洗用避免在多个器官内发生摩擦的方法。这些溶液的组分如表3所示(若对于心脏用常温保存技术代替低温保存，心脏是用温热而不是冷溶液冲洗)。冲洗溶液最初含iloprost(在最好的模式中为1微克/毫升，认可的iloprost的浓度范围是0-10微克/毫升)、抗凝剂(如肝素，在本技术方案中为10,000单位/升，可接受的肝素浓度为500-20,000单位/升)、血管舒张剂(如罂粟碱，最好为40-90毫克/升，认可的范围为0-90毫克/升)和其它所需的试剂。第二种洗涤溶液用来洗去所有的如冷冻剂的试剂，并完全洗去血液。切下的器官(除了诸如心脏最好用常温灌流保持外)应当被转移到冰冷浴的洗涤溶液中，并转运到能以所述的方式引入和除去低温保护剂的灌流机上。
表3
灌流液组成
*pH＝7.4**毫渗透性＝350-365毫渗克分子
| Euro-Collins* | ||
| 化合物 | mM | g/升 |
| 右旋糖 | 194 | 34.96 |
| KH2PO4 | 15 | 2.06 |
| K2HPO4 | 42 | 7.40 |
| KCl | 15 | 1.12 |
| NaHCO3 | 10 | 0.84 |
| RPS-2 | ||
| 化合物 | mM | g/升 |
| 右旋糖 | 180 | 32.43 |
| KH2PO4 | 7.2 | 1.25 |
| KCl | 28.2 | 2.11 |
| NaHCO3 | 10 | 0.84 |
| 谷胱甘肽 | 5 | 1.53 |
| 腺嘌呤HCl | 1 | 0.17 |
| CaCl2 | 1 | 0.111 |
| MgCl2 | 2 | 0.407 |
(注：RPS-2*溶液是没有CaCl2也没有MgCl2的RPS-2溶液)
表3(续)
| 改性UW溶液#1 | 改进的UW溶液#2 | ||||
| 化合物 | mM | g/升 | 化合物 | mM | g/升 |
| NaH2PO4H2O | 25 | 3.45 | NaH2PO4H2O | 25 | 3.45 |
| 葡糖酸钾 | 100 | 23.42 | 葡糖酸钾 | 100 | 23.42 |
| 葡糖酸镁 | 1 | 0.21 | 葡糖酸镁 | 1 | 0.21 |
| 葡萄糖 | 5 | 0.90 | 葡萄糖 | 15 | 2.70 |
| 谷胱甘肽 | 3 | 0.92 | 谷胱甘肽 | 3 | 0.92 |
| 腺嘌呤核苷 | 5 | 1.34 | 腺嘌呤核苷 | 5 | 1.34 |
| HEPES | 10 | 2.38 | HEPES | 10 | 2.38 |
| 腺嘌呤(盐酸盐) | 1 | 0.17 | 腺嘌呤(盐酸盐) | 1 | 0.17 |
| 核糖 | 1 | 0.15 | 核糖 | 1 | 0.15 |
| CaCl2 | 0.05 | 0.0056 | CaCl2 | 0.05 | 0.0056 |
| HES(g) | -- | 50 | ---- | -- | ---- |
(注：改进的UW溶液#2不含HES，但比改进的UW溶液#1含更多的葡萄糖)
2.低温保护剂：玻璃化溶液V49、V52、V55、V49B和V55B的配方
所有的灌流实验用称为V49、V52和V55的溶液进行(V49有时被称为VS4，V55称为VS41A)。低的冷却速度(5-10℃/分钟)时，V49在水压1,000大气压下玻璃化，但常压下不玻璃化。V52在500大气压的压力下玻璃化。V55在1大气压下玻璃化。
V49由二甲亚砜(D)、甲酰胺(F)和1，2-丙二醇(P)构成，其中D与F的摩尔比为1∶1，每升的D+F+P的总质量为490克，每升P的总质量为150克。这样，每升D+F＝340克，F＝124.33克，D＝215.67克。根据下面的结果，这个低温保护剂的混合物是优选的。D、F和P比例的可认可范围为，D：F重量比可低达1.4，高达3.5；对于前者，通过另外加入P，P∶(D+F)的比例应升高到18∶34和/或总浓度升到50-51％w/v(克/分升)。
通过使V49的低温保护剂含量乘以52/49，同时保持载体溶液与V49相同而获得V52的配方。通过使V49的低温保护剂含量乘以55/49，含量载体溶液与V49相同可得到V55的配方。这样，相对于V49中溶质浓度为490克/升，V55中溶质的总浓度是550克/升。V49B是V49的变化形式，其中1，2-丙二醇被同样克数的2，3-丁二醇取代(左旋体形式或外消旋混合物，有低于5％w/w中间形式存在)，相似的是，V55B是V55的变化形式，其中2，3-丁二醇代替了同样克数的1，2-丙二醇。V49、V52和V55的总低温保护剂摩尔浓度分别为7.49，7.95和8.41M。由于丁二醇比丙二醇的分子量更大，V49B和V55B的摩尔浓度稍低于V49和V55。
虽然不刻意地与理论相联系，V49和V55尤为良好，由于甲酰胺能很好地渗透进肾脏组织，以及二甲亚砜能减轻甲酰胺毒性，三种要素(最大的玻璃化，而同时毒性和总的溶质浓度最小)之间的良好平衡，缺少胶体(约4-7％(w/v)典型的胶体浓度升高粘度)，在适当压力(分别为1,000大气压和1大气压)下这些溶液去玻璃化的速度极慢，以及在至少6个月储存时于-135℃下V55有良好的稳定性。
用于器官灌流的低温保护剂根据器官受到的压力在V49和V55的范围之间调节。器官对高压的耐受力和对高浓度低温保护剂的耐受力的平衡可使保持玻璃化所需的压力和浓度间的协调最优化。例如，不可耐受1,000大气压，但可耐受500大气压的一个器官可用V52灌流。当冷冻时不均匀的晶核作用是一个显著问题时，可使用超过550克/升最高约600克/升的浓度，因为成核过程和任何有核的冰晶增长在这些较高的浓度下受到抑制。一个发生问题的例子是，在使如人体肝脏那样玻璃化非常大的器官，冷冻必须特别慢地进行。在升高的压力下，随着冷冻速度的降低，要求溶质浓度作相似比例的增加。
肾脏切片实验(参见下面的结果)表明，V49B保证的成活力与用V49的存活率相同。V49B的稳定性比V49大。可根据上述对V49和V55的揭示，V49B和V55B之间的变化是被采用的。
所有的低温保护剂溶液除了低温保护剂本身外，必须含有慢渗透溶质，后者组成低温保护剂的“载体”溶液。典型的例子是修改的UW溶液、Euro Collins溶液或肾保存溶液2(RPS-2)(参见表3)。最好方法用Euro Collins作为肾脏的载体溶液，修改了的UW溶液(如表3所述)用作肝脏的载体溶液，市售的UW溶液(Viaspan)(E.I.Dupontand Nemours)作为心脏的载体溶液。
3.用低温保护剂灌流器官的方案
引入和除去低温保护剂的典型方案显示，兔肾在洗去低温保护剂、移植后得到的可靠的高质量的存活率，长期起作用以及组织学追踪的结果表示在图5和6内，另外用图7A-E表示流程。如图5所示，方案被分成至少7个独立的阶段。第1阶段是引入低温保护剂前器官建立稳定基线特征的平衡阶段。第2阶段是低温保护剂浓度的梯度增加阶段，在第3阶段的浓度平稳段处结束。在第3阶段花去一段时间后，这时A-V低温保护剂浓度梯度常常变为接近0，浓度到达一个新的平稳段，该平稳段阶段为第4阶段。下面将作的更详细阐述，第4阶段不需要达到最高的浓度。例如在图6中，第4阶段浓度为6.7M，但图6实验中的最终浓度为8.4M。不管最终浓度，第一洗净步骤在图5中用第5阶段表示，为另一个浓度平平稳段。第6阶段是低温保护剂洗净阶段，第7阶段是低温保护剂后的平衡阶段。
a)灌流压：器官用足以克服器官临界封闭压，但要低到避免对血管支脉产生不必要损伤的压力进行灌流。例如，兔肾的最好灌流压是没有明显波动的40mmHg。对于除了肝脏以外的不同器官和物种，包括人，认可压力的理想的范围是20-70mmHg。一般在低于10mmHg压力下，通过静脉肝脏正常地接收它们的流体在5mmHg下灌流的小鼠的肝脏在V49灌流20分钟后能得到近似的渗透平衡，没有胶体存在，这些肝脏移植后一半可继续维持生命。结果，对脚肝脏来说，通过门静脉处的压力界限为5-40mmHg，通过肝动脉的压力为5-70mmHg。
b)最初的灌流(第1阶段)：在最好的模式方案中，首先灌流15分钟让血管和毛细管(压力和折射指数)建立基准值；保证血液完全洗去；使器官热平衡，这里是指兔肾或鼠肝。临床上，最初的灌流时间是任选的，可进行调节(从0分钟到1-2天或更多)运输以满足器官获得和运输过程的需要。在申请人的实验室中，这一时期对肾脏的灌流液是Euro Collins溶液或RPS-2，对肝脏的灌流液是修改的UW溶液。但是，这种最初的灌流液也可根据医院或获取器官单位的需要，是临床上建立的另一种稳定的溶液。
c)最初温度：为获取和运输一种器官(如肾脏)所需的最初灌流温度不需要与第1阶段时建立的灌流温度相同。例如，虽然大多数器官可埋在0℃的碎冰内运送，而其它器官可在正常温度(37℃)下运送灌注。但是，当器官准备进行低温使用时，需建立预选的、标准化的灌流温度。在最好的方案中，最初的灌流温度是3.5-4℃，认可的范围为0-15℃。发明者认为，对于最佳长期保存的常温灌流的器官也可冷却到这样的相同温度范围，可以与低温保存器官相似的方法处理，在该方法需要的相对短时间里不会损伤器官。
d)第2阶段：在最初基准灌流后，以恒定的速度升高低温保护剂的浓度直到建立了第一个浓度的平稳段。当使用V49型低温保护剂的混合物时，混合物中不同的低温保护剂比例保持恒定，同时使总浓度改变。对于肾脏最好方法是，V49型溶液总浓度的增加速度为约51mM/分钟(即3M/小时)，认可的变化为31-150mM/分钟。这些速度明显地超过甘油和丙二醇的已知技术使用的30mM/分钟的速度，所述的已知技术被认为对于使用该方法是不必要的和不希望的缓慢。浓度线性的增加促进了平衡，而且不会产生不需要的大的渗透应力。
e)第2阶段中的温度下降：在第2阶段中降低温度以防止肾脏受到低温保护剂的化学毒性。在最好的模式中，在动脉低温保护剂浓度达到1.3M时开始降低温度；认可的范围是0.5-3.5M。在到达第3阶段时结束温度的降低。最好降温时，浓度变化在2.5M左右，但是浓度变化是在1-4.4M范围。
正如上面指出的，最初的灌流温度应当为0-15℃。冷却后的温度处于-13℃到+5℃范围内，冷却时的温度总落差应当在2和25℃之间。冷却不应持续低于器官的冰点。在最佳模式中，最终的动脉温度为-3℃，表示从最初的温度下降6.5℃，其冷却速度约为0.33℃/分钟。为了使低温保护剂扩散有足够的机会，以及为了避免热冲击器官的可能性，总的冷却速度不应超过3℃/分钟。
f)第3阶段：肾脏的最佳模式中的第3阶段平稳段是确立在低温保护剂总量的25％(W/V)(250克/升，或约3.8M)，接着是40-49％低温保护剂，或在接着使用更高浓度(如V55)低温保护剂时为30％w/v，总浓度低温保护剂对肾脏进行低温保存，低温保护剂认可的变化范围为20-40％(w/v或w/w)。第3相当平稳段的水平接近于第4阶段浓度的一半。降低的第3阶段水平会增加移动到第4阶段的渗透胁通，而相当高的第3阶段水平会由于较长时间的在浓低温保护剂中暴露而增加了毒性。根据灌流压(和其器官流速)、血管耐受力、器官对低温保护剂的通透度和毒性反应的快速性，第3阶段的持续时间最好为10分钟，其认可范围为5-30分钟。持续时间应当足够的长，可让器官与动脉灌流液之间至少达到近似的渗透平衡，用动静脉浓度差不大于50-200M检测，以便在接着猛增到更高浓度时将不必要的渗透胁通降到最小值。
g)通过一步、两步或三步方法用玻璃化溶液灌流：从第3阶段到第4阶段在分步改变浓度是控制暴露于高浓度低温保护剂时间是必须的。第4阶段浓度可足以玻璃化(一步引入法)或不足以玻璃化(需要一个或两个附加的步骤达到玻璃化)。
两步(和三步)的方法在图8中作简要说明。在“一步“方法中，所有的低温保护剂在一个连续过程(C1)中加入，并冷却到冷冻的温度也出现在一步法(T1)中。在“两步”法中，部分低温保护剂在第一步(C1)中加入，剩余的低温保护剂在接近第一步所用的溶液的冰点温度下进行的第二步(C2)中加入。在该方法中，冷冻也是分两步骤发生，具有用于制备第二浓度增加量(C2)的第一步，和用于将器官冷却到冷冻的温度的第二步。实践中，第一冷却步骤较好的是将温度稍高于冰点，保证了在引入较高浓度低温保护剂前避免结晶。
在最好的模式中，第4阶段浓度为40％(6.1M)到44％(6.7M)(w/v)V49溶质，一种不足以玻璃化的浓度(图6)。亚玻璃化浓度可接受的变化范围为30％w/v-48％w/vV49溶液或它们的等价物。对于一步加入，第4阶段的V49-或V49B-型溶液的浓度范围为480-600克/升(约7.4-9.2M)(参见图5)。对于非V49/V49B型溶液，第4阶段的方法限制35-60％w/v低温保护剂。
第4阶段浓度在最佳模式中稳定20分钟，认可的变化范围是10-60分钟。应当将浓度保持足够长时间的稳定使器官与上述灌流液达成照上述标准的大致的平衡。
对于两步方法，在第4阶段完成后从灌流机中取出器官，并在用玻璃化溶液灌流前放在预冰冷的玻璃化溶液中冰冷5-30分钟(对于兔肾脏较好的模式是5分钟，更大的器官则时间更长)。在最佳模式中，冷却器官，并在-22±2℃温度下灌流(若预先用6.1M低温保护剂灌流过)或在-25℃±2℃温度下灌流(若预先用6.7M低温保护剂灌流过)。该步骤所选的温度被称为“低温灌流温度”。更一般的是，低温灌流温度的范围为-5℃到-35℃。
图9显示了在低灌流温度下灌流器官(以完成图8中的C2步骤)的设备的技术方案。在另一个技术方案中，在初级灌流机内部进行冷却和低温灌流，没有操作者介入其中。
本发明者在-22℃下用V52灌流或在-25℃下用V55灌流兔肾脏，其灌流压在20-40mm Hg之间波动，但通常不超过30mm Hg，这在接着的移植中产生了优秀的效果。认可的方法中对于非肝脏器官，对灌流压的限制范围是在灌流设备中先前压力的50-150％，对于肝脏，灌流压的限制范围是先前压力的50-400％。
对于肾脏通过收集低温灌流时产生的“尿”来测定低温灌流温度下与玻璃化浓度平衡所需的时间，并在适当稀释后测定其渗透性。当尿的渗透性接近于动脉灌流液的渗透性时可认为肾脏达到平衡。对于其它器官，通过动脉静脉浓度差来测定平衡程度。测定的认可的平衡时间范围约为20-60分钟。
在另一个技术方案中，给不能耐受暴露于低温灌流温度下的可完全玻璃化溶液的器官使用的方法是三步引入方法。这些器官可这样成功地被低温保存：在低温灌流温度下用低于完全玻璃化的浓度的溶液进行灌流(步骤二)，所述的浓度比冷却到灌流温度前的浓度高，这样能使器官的结冰点(即3-20℃)明显地低于低温灌流温度，然后在接近新器官结冰点温度下用全玻璃化浓度灌流，(步骤三)在该温度下完全玻璃化浓度是无毒的，因为可被耐受。该技术方案也可用于需要避免冻伤的器官。
h)两步最佳模式法的基本原理：
虽然不希望为任何理论所约束，最佳模式两步方法的基本原理是避免冻伤。在低温灌流温度下引入低温保护剂被假定也可减少低温保护剂的毒性。
本发明者发现，在-3℃下用V49灌流肾脏，存活率100％(14个灌流的14个都存活)，但当器官冷却到-30℃，温热并用当时已知的最佳技术洗涤，存活率明显下降(参见图13)。在-3℃下用当时的最佳技术用V52进行灌流，存活率为75％，但当将这些肾脏冷却到-30℃时，随着温热和洗涤，存活率为0％。这样，在49％(w/v)的低温保护剂时，冷冻引起伤害，在52％(w/v)低温保护剂时冷冻导致存活力完全丧失。理论上器官在V55中保存(可避免对高压的需求)，该趋势是不好的。然而，浓度低于49％时冻伤可变成轻微的，因而接近-30℃的冷冻温度时为无害的。这提示了相对低浓度的冻伤可能性，为了避免冻伤，于是在较低温下将浓度上升到查玻璃化的水平。该方法有另一个优点，将器官暴露于其次一点是，毒性被减低的温度下和玻璃化溶液中。这样，避免冻伤时，也可避免毒性。
关于上皮细胞和肾脏切片的热冲击现象作了各种实验表明，若首先在-30℃以上防止了冻伤，即使有V55的存在，低于-30℃的冻伤为最少。因此，首先在不会导致冻伤的浓度下冷冻到接近于-30℃，人们推测，当器官用V55在低温的灌流温度下灌流，再冷却到低于-30℃时，即使V55也不会引起致命的冻伤。
如前面一节所述，第一个假设在两步方法因成功地避免了V55在-25℃下冻伤和毒性得以证实。如结果部分所述，第二个假设也因进一步避免冷却到低于-46℃下并未发生致命损伤得以证实。
4.器官的低温保存
任何实用的低温保存过程的下一个步骤如玻璃化是用适当的方案，在加压或不加压前将器官冷却到低温。低温保存步骤也包括储存器官。本发明不涉及器官真正的低温保存和储存，而只涉及用作低温保存的器官的制备和用作移植的预先低温保存的器官的制备。
5.对制备用作移植的器官的灌流
在制备移植用器官时，首先将器官由储存温度温热到适合器官再灌流温度。在本发明的设备中不进行低温保存后温热器官的步骤。然后可将器官放回本发明灌流设备中以恢复在第5阶段(洗去第一低温保护剂平稳段)的开始时图5和6所示的类型的灌流方案。
a)第5阶段的温度：在最佳的模式方法中，将器官温热到约-3.0℃，并放进灌流设备中开始在该温度下洗去低温保护剂。本发明者出乎意料地发现当使用两步最佳模式方法引入低温保护剂时这一方法是优秀的，即使使用V55作为最后玻璃化溶液也获得了成功。假定在接近于-25℃温度下可能引入玻璃化浓度，本发明者预期也是有利的是，在该温度下除去部分低温保护剂以避免预计在接近-3℃、完全玻璃化浓度会出现的高毒性。确实，发现在低温灌流温度下稀释玻璃化溶液是有害的。在方法限度之内，第5阶段的温度范围为-20℃到+5℃。
b)低温保护剂浓度和第5阶段的持续时间：在肾脏和肝脏的最佳模式方案中第5阶段的低温保护剂浓度是30％w/v(300克/升；4.6M)到33％w/vV49溶液(D，F和P在普通的比例中)，认可的变化范围为20-40％(w/v或w/w)低温保护剂(大约为3到6.0M)。在此阶段的浓度应当不低于玻璃化溶液浓度的40％(2/5)以避免渗透损伤；在最佳模式中，第5阶段的浓度是最高灌流浓度的3/5。
第5阶段的终止和第6阶段开始的标准稍不同于前述标准。据发现延长第5阶段的时间有时导致改变，暗示细胞摄入了在此平稳期一般存在且应当留在细胞外以保持器官存活的LMW OBA。因此确定的是第5阶段的持续时间应当受到限制到让A-V的浓度差开始回归到0的时候(按照发明者的经验，从关闭值回归到接近-50mM的值)，而不是延长到A-V浓度差不再迅速改变的点。注意与图5阶段比图6中更短的第5阶段，它反映了图6方案中反映出的方法中使用的更高浓度下成功所需的最优化。也注意，图6A-V浓度梯度恢复的转折点，这与图5中第5阶段期间A-V浓度长时间平衡相反。对于兔肾，最佳时间是9分钟。在该方法限度内，认可的持续时间是0-30分钟。
c)OBA和它们在第5阶段中的应用：在第5中一般存在一种或多种OBA(定义同上)。
如前定义，为了便于讨论，OBA的一种分类方法是低分子量(Mr为100和1000道尔顿之间)OBA和高分子量(Mr为1000和500,000道尔顿之间)OBA。但是，事实上低分子量和高分子量OBA之间没有明显的分界线，不同的Mr范围有独特的不同的性质，因此有不同的实际应用。这些关键性质中的一些可使下述应用的后面有更宽的原理，可综述如下：
| Mr范围 | 膜通透性 | 渗透效应 | 肿胀效应 | 粘度 | 成本 |
| 180-342 | 最高 | 最高 | 没有 | 最低 | 最低 |
| 343-1,000 | 低到中等 | 高到中等 | 没有 | 中等 | 中等到高 |
| 1,000-50,000 | 低到没有 | 低 | 没有到低 | 中等到高 | 中等 |
| ＞50,000 | 没有 | 最低 | 低到高 | 最高 | 中等 |
本发明者出人意料地发现OBA用途的一些新模式。对于在第5和6阶段使用，这些新模式由i)合并低分子量和高分子量OBA(用于最高浓度方案)，ii)单个中等范围OBA(用于高和中等浓度的方案)，iii)极低分子量OBA(用于低浓度方案)和iv)对于肝脏的特定OBA方案所构成。在本节中，对这些用途和它们依据的原理作一般讨论而不参照第6阶段。
i)低分子量和高分子量OBA的合用。对于肾脏和大多数其它的器官，最佳的OBA应用模式被认为是蔗糖，如约300-350mM，或其它低分子量OBA与羟乙基淀粉(HES：相对分子量(Mr)20-500千道尔顿)，如3-8％w/v，或与其它等当量高分子量OBA的合用。下面阐述了两种特定实验实施例，它们在用正常气压玻璃化溶液V55灌流后得到良好的结果，所述的玻璃化溶液涉及350mM蔗糖和3％w/v的Mr为450千道尔顿的HES合用。其它优选的低分子量OBA包括麦芽糖、棉籽糖、果糖1，6-二磷酸钾和钠、乳糖酸钾和钠、甘油磷酸钾和钠、葡糖酸钾和钠、麦芽三糖、麦芽五糖、水苏糖和甘露醇。较好的高分子量OBA、HES是McGaw Corp.(美国加利福尼亚lrvin)出售的200千道尔顿或450千道尔顿链，但易于水解成低分子量形式的物质。最为优选的HES分子量的范围是1-100千道尔顿。其它优选的高分子量OBA包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、棉籽糖乙酸十一碳酯钾盐(Sigma Chemical Co.出售)(美国伊利诺斯)和Ficoll(1-100千道尔顿)。
低分子量OBA的存在是来对抗在穿透性的低温保护剂浓度大步下降时的致命的渗透效应。在低温保护剂浓度大幅度下降的方案中(如第5阶段浓度的下降接近20％w/v低温保护剂)，需要更多的低分子量OBA(达上限750mM)。在使用更高的第5阶段浓度的方案中(如40％w/v低温保护剂)，需要较少的OBA(达下限约150mM)。
在第一洗去低温保护剂平台(第5阶段)期间使用OBA的最佳模式特别适用于采用大于7.5MV49溶质的方案，即用于低于500-1,000大气压的以供玻璃化的静水压的方案。发明者发现仅仅使用低分子量OBA甘露醇和蔗糖和最好情况下用V52代替V49时肾存活率仅有30％(7个被处理者仅有2个存活)，而用V49时有100％存活率(14/14)相符的。但是，在洗去低温保护剂期间加入3％w/v450千道尔顿HES可使存活率上升到75％，此时使用了甘露醇或蔗糖作为低分子量OBA(8个被处理肾脏有6个存活)，并使用了一步玻璃化溶液加入方法。
以前没有预料到会有用高分子量试剂作为OB的概念，至少部分地是，因为这类试剂与低分子量化合物相比渗透作用很小。虽然不希望受任何特定的理论束缚，下列考虑导致发明者使用HES作为高分子量OBA。
(a)在高浓度低温保护剂存在下，高分子材料的浓度比传统的稀水溶液的浓度高。因此，试剂的渗透效应增加。
(b)高分子试剂的肿胀功能在保护血管系统不致由于低温保护剂的突然稀释而破裂是至关重要的，或可能对血管系统有好处。
(c)通过降低孔隙体积(这样可降低低分子量OBA渗透进细胞可利用的的池体积)或通过对低分子量OBA扩散到和/或扩散通过细胞膜起物理屏障的作用，高分子量试剂可减少细胞对低分子量OBA的异常摄入。
(d)高分子量OBA通过肿胀作用扩大或防止血管室破裂，故应当有助于洗去低温保护剂，从而减少延迟洗去低温保护剂时导致的渗透胁迫。
(e)膜通透性的任何异常的增加会导致低分子量OBA对器官细胞的部分渗透，但不会使高分子量OBA渗透，这样使用高分子量OBA会降低所用的每毫渗克分子OBA的异常渗透的净量。
使用高分子量OBA的最佳模式是至少渗透压或肿胀压的3-6％、450千道尔顿HES。但是，较好的是使用比这更低的Mr的试剂，因为50-200kd的相对分子量会产生相等或更大的肿胀压，仍然使试剂不能渗透进活细胞。
较好的是联合使用高分子量和低分子量的OBA，因为前者抵销了后者的摄入，并增加了后者的渗透作用，而低分子量试剂提供了充足的渗透压，从而完成防止在低温保护剂稀释时细胞摄入水分的首要任务。另外，低温保护剂溶液中的高分子量OBA的高粘度可支撑粘度小的低分子量试剂用作初吸渗透剂，对此而言，高分子试剂是作为辅剂加入的。
ii)中等范围OBA。对于肾脏和大多数其它器官来说，另一个较好的OBA使用方法是单独使用分子量范围为360-10,000道尔顿、总浓度为2-15％w/vOBA。本申请中合适的OBA例子包括麦芽糖、棉子糖、果糖1，6-二磷酸钾和钠、乳糖酸钾和钠、麦芽三糖、麦芽戊糖、水苏糖、棉子糖十一烷乙酸钾、在上述分子量范围内的Ficoll和HES。
虽然不希望受任何理论束缚，该分子量范围的单个试剂常常有低分子量和高分子量OBA适当地联合成单个试剂的特性。渗透剂的不可通透性是OBA最重要的特征，该不可通透性在分子量范围为360-10,000道尔顿，或更窄的是约360-2,000道尔顿时可能达到与实际有关的最大值。该分子量范围的溶质有相当大的通透作用，而粘度也相当对低，溶解度相当高。此分子量范围的试剂在没有肿胀作用或成本最为重要时被推定为理想模式。该重量范围的一些试剂对肾脏和肝脏也是不可通透的，这样至少部分消除了这些器官之间的差别。
iii)极低分子量OBA作为唯一OBA的“低”浓度方法。当玻璃化方法涉及使用相对低浓度低温保护剂时，如B49，用甘露醇(Mr＝180道尔顿)作为唯一OBA得到令人满意的结果(参见结果一节的有关数据)，低粘度甘露醇溶液比粘度高的溶液(Mr更高)能更好地维持器官的流量。结果，在使用升高的压力和/或浓度低于V52的玻璃化方法时，最佳模式的另一个技术方案是使用极低分子量OBA作为唯一OBA(0BA的Mr≤400道尔顿)。
虽然不希望受任何理论束缚，较低浓度的低温保护剂的胁迫性更低，能更有效地保持膜的通透性，基于这样的原因，较低的Mr试剂是有效的。因为甘露醇的成本极低，普遍没有毒性，而Mr范围为180-2,000道尔顿或更高道尔顿的OBA成本随Mr急剧升高，故甘露醇和/或相似的低分子量OBA(如蔗糖、麦芽糖)在本方法技术方案中作为“低”浓度试剂的首选药物。
(iv)对肝脏应用的OBA。对于肝脏，OBA最佳的使用模式是完全不用OBA。其它两个优选应用的OBA是单独使用高分子量OBA(如，3-5％HES、Mr10,000-450,000道尔顿，或如上所述的相当物)，和使用中等范围的OBA(Mr约为350-10，000)，特别是在低温保护剂的洗去速度很高时。
(a)完全不用OBA。既不用低温保护剂又不有正常的HES的改性UW溶液灌流4个对照肝脏的实验表明在三个实验中可保持生命支持功能。用包括V49灌流，但不用低分子量渗透剂来重复实验，移植后不仅有约50％肝脏可支持生命，而且在用V49几乎完全平衡后也有同样的结果，这与肝脏用存在有HES的V49灌流后的结果相反，其平衡不良，存活率不比没有HES灌流的肝脏好。因此，无论低分子量或高分子量的渗透剂对于肝脏都不是必须采用的。
虽然不希望受任何理论束缚，省去所有OBA对于肝脏的可接受性和需要性被认为是基于肝脏对低温保护剂和列出的低分子量OBA的高通透性。肝脏的独特性在于它的薄壁细胞对低分子量溶质，包括低温保护剂是极度通透的。这可让低温保护剂的加入和洗出速度比其它器官更快，并且渗透胁迫比其它器官中的小。例如，据发现肝脏切片可耐受低温保护剂浓度的多个摩尔的突然变化，这对其它类型的组织，包括肾脏可能是致命的，在暴露于低温保护剂和洗去后，用较小的浓度变化对肝脏细胞的存活率没有改善。对于完整的肝脏，尽管没有低分子量OBA和高分子量OBA，也洗去来自肝脏的V49期间，图10表示有合理的稳定流速(这提示没有过度的渗透细胞肿胀)。最后，由于肝脏细胞对蔗糖稍可通透，在洗去低温保护剂时蔗糖相对不如OB有效，但它能渗入细胞，这会在移植时确实导致细胞肿胀。
(v)仅仅使用高分子量OBA。上述实验揭示了不用HES的一种困难，即4个对照肝脏有3个(没有低温保护剂)在没有HES存在下作灌流时存活了，反之使用HES时存活率较高。不论低温保护剂是否存在，HES或它的等价物可能必须存在，以支持肝的存活。因为在装载可玻璃化浓度期间，部分由于对粘度的不良效应，不可存在HES(除非以最小的浓度存在)，使HES最大以保持活力的一个方法是在洗去低温保护剂时加入HES，这简单地因为与玻璃化浓度相比低温保护剂浓度很低，且这些浓度下降而不是上升时，用HES灌流从物理角度(低粘度)来看是更可行的。关于这一点HES不必作为真正的OBA，而只作为普通的渗透支持试剂起作用。不管怎样，HES的使用方法基本与用作OBA的相同，从实用角度来看，这相当于使用高分子量OBA作为唯一的OBA。此外，必须记取的是肝脏不只是由肝细胞构成，诸如HES的渗透剂对这些非肝细胞可能一起真正的OBA作用。根据肝脏类型在控制灌流时对没有HES的耐受性和低温保护剂洗去时对没有HES的耐受性来决定在洗去肝脏的低温保护剂时使用HES或其它相当的高分子量OBA。
虽然在上述实验中联合用低温保护剂和HES灌流时肝脏与低温保护剂的平衡不良，但该问题可通过使用足够低Mr渗透剂以适当控制粘度来克服，如相当于Mr＝2-50kd的HES的高分子量OBA。
(c)中等范围OBA用于肝脏的快速流出低温保护剂。Mr范围为350-10,000道尔顿的OBA比蔗糖的渗透性小，比大多数高分子量OBA的粘度更小，(因此灌流速度可以很快)，这可防止肝脏细胞而不是肝细胞受到渗透损伤，特别是在极快速地改变低温保护剂的浓度时。因此，这样一个试剂或两种或多种这类试剂的联合处在对肝脏方法的限度内。
d)第6阶段：低温保护剂浓度梯度逐渐减少到0，同时升高灌流温度：在肾脏的最佳模式方法中，以约-42mM/分钟的恒速(对于肝脏，可接受的范围为-31到-75mM/分钟)使低温保护剂的浓度逐步减少到0或接近0。非恒定的浓度下降表(在高浓度时迅速下降，在较低浓度时缓慢下降)也是可接受的方法，如在第一个1/3洗出时以平均线性速度的1.5倍线性下降，接着的2/3洗去时以平均线性速度的0.86倍线性下降。
在洗出低温保护剂时，升高温度以利于洗出，减少渗透力，并使不含低温保护剂的器官恢复到适合灌流的温度。在对于肾脏的最佳模式方法中，在浓度下落到4.7M并随浓度下降时开始继续作线性升高温度直至达到最初的灌流温度，动脉浓度达1.3-0.8M(浓度每降低0.68-0.78M升高1℃：在温热时有3.4-3.9M的总浓度改变)，如图5和6所示。在温度开始上升时认可的浓度变动认可范围为2.5-5.5M，完成温度上升时的浓度为0.5-4.5M。
e)第6阶段的OB洗去：第6v期间OB洗去的一般方法是不完全地洗去低分子量OBA，同时将高分子量OBA浓度保持恒定或只减少1-2％w/v。更具体的是，随着渗透低温保护剂浓度的下降，低分子量OBA浓度也按比例地下降到达最终的OB非0浓度，此时渗透性的低温保护剂浓度达到0。该低分子量OBA最终的非0浓度在最佳模式方法中为50mM，认可的范围为25-500mM。例如，在最佳模式(图6)中，350mM蔗糖被稀释到50mM，而5.0M低温保护剂以42mM/分钟的速度下降到0.0M，蔗糖浓度的下降速度为2.5mM/分钟。
虽然不希望受任何理论束缚，在降低低温保护剂浓度期间，可归因于低温保护剂跨膜浓度梯度的绝对跨膜渗透力减少了，这样减少了对渗透缓冲的需求。在低温保护剂洗去期间降低OB浓度可使低温保护剂洗去期间和此后的来自OB的渗透损伤最小，这可进一步被设计成细胞对所列出的非渗透OBA的摄入潜力。以前的洗去低温保护剂的灌流技术没有使用该“OB降低原理”。当一道使用低分子量和高分子量OBA时，OB有区分的降低，其中低分子量药剂下降，而高分子量OBA保持不变或基乎不变。
t)OB洗去第7阶段：
i)标准模式。在除去所有低温保护剂后继续方法中的最后步骤是以灌流器官，让它与没有低温保护剂的介质完全平衡，需要时继续或完全洗出OB。在目前肾脏用的最佳模式中，在低温保护剂洗去的最终，还有50mM蔗糖和3％w/vHESMr 450kd，在移植前不再洗去这些OBA。虽然可以在移植前很短的保存时间里在器官中残留这些低浓度的OB，但孔隙中的OB预料在血液回流时导致孔隙空间的渗透扩张，随后暂时减少了体内器官的灌流。该效应在较高OB浓度(≥100-500mM，或≥3-7％w/v)时是不可接受的，因此在移植前必须至少部分洗去OB。在移植前OB长时间留在器官里的再一个问题是OB可能渗入器官细胞，后来移植时细胞肿胀，灌流减少。在用V49进行的实验中，发明者典型情况下在30分钟内完全洗去50mM甘露醇，移植时得到彻底的成功。但是，据一般观察，在移植前在肾脏里留下50mM低分子量OB达很短的时间，某些情况下代表器官生存或死亡之间的差异，较高的低温保护剂浓度是有利的。从未观察到在移植前在肾脏中留下50mM甘露醇或蔗糖比完全除去这最后浓度更为有害，故第7阶段期间最先考虑洗去OBA考虑将低分子量OBA浓度减少到低于100-500mM，高分子量OBA浓度减少到约5-8％w/v以下。
虽然不希望受与任何理论束缚，据信残留40mM低分子量OBA是有利的，因为孔隙的渗透剂会减少细胞和细胞器的肿胀，直到体内的新陈代谢得以恢复，代谢的细胞能作渗透调节以抵御渗入细胞内的甘露醇或蔗糖，倘若细胞外的渗透剂可减慢被动的细胞肿胀，其时间长到足以恢复渗透调节。另外，使用更高的Mr的OBA会排除细胞对OBA的摄取，进一步增加OBA残留的可接受性。
更高浓度的OB(直至500mM)可在更长的时间(30-90分钟)里被洗去，这取决于对OB稀释的灌流耐受性的反应。对于临床使用，洗去后灌流时期的长度包括OB洗去，和OBA洗去的程度，必须被调节到与器官运输和移植所需的暴露时间相配。
ii)三-渗透剂洗去技术。在本发明者早先的经验中包括在-3℃下灌流8.4M低温保护剂(一步加入技术)，在低温保护剂洗去期间一致地控制血管阻力，在移植后40分钟肾脏的外观极好，使用如下方法，并使用这一方法。
用8.4M低温保护剂灌流后，低温保护剂的浓度下降到约5.0M，同时加入250mM蔗糖和4％w/vHES。在第5阶段平台达9分钟后，用标准的线性蔗糖洗去技术，同时将HES浓度保持为4％w/v。但是，一旦除去了低温保护剂，HES的浓度被逐渐降低到3％w/v，同时将HES的浓度逐渐降低到0，同时加入最终浓度为50mM约甘露醇。
这样，涉及三-渗透剂洗去技术的革新是：1)将高分子量OB与两个低分子量OB联合，得到3-OBA方法，和(2)仅在移植前用另一个OB(甘露醇)代替一个OB(蔗糖)。
虽然不希望受任何理论束缚，建立该方法的理由如下。蔗糖比甘露醇更具有渗透效应，即由于它的分子量更高，它可能更不易渗入肾细胞。但是，不象甘露醇，在移植时用血液再灌流器官时它不能淬灭游离基反应。通过使用蔗糖执行最初的渗透缓冲功能，甘露醇在灌流末保持渗透缓冲作用，这样得到了两种试剂的优点，并避免了它们的缺点。其次，在第5阶段和第6阶段期间，对于使粘度降至最小和使渗透和肿胀作用变到最大之间的交替达到平衡虽然是最适的4％HES。最后，在移植前即刻将4％HES降低到3％以使灌流液粘度和孔隙间的高分子种类的数量最小。
尚未得到分析的的是该方法特别依赖于蔗糖、HES或甘露醇。所涉及的主导原理是普遍的。
6.在移植时和此后对器官和接受者的处理
重要的是在松开血管夹和对移植器官再灌流前即刻给接受者服下阿司匹林(乙酰水杨酸，1-3nmg/kg)和肝素(100-250单位/kg)，两种药物的浓度较高或较低都会使血管阻塞和衰竭。最佳浓度分别为2mg/kg和200单位/kg。逐渐地注入能逆转硫氢基氧化作用的试剂(如硫代葡萄糖金或N-乙酰基半胱氨酸，其血清水平为0.1-10mM)、抑制细胞外(如α-2巨球蛋白、阿米洛利、金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP))和细胞内蛋白酶(亮肽素、甘氨酸)或促进内皮细胞粘附的试剂(TGFβ1，每5分钟静注0.1-10微克，持续40-300分钟)。发明者现已发现二甲亚砜降低了肾组织对被消耗光的组织中SH含量的修复能力，在兔肾移植后发现尿激酶大量升高。
III.用非低温保护剂灌流液灌流器官的方法
除了用低温保护剂灌流器官的方案外，这里所述的设备和方法能用于各种常规的低温和正常温度的器官灌流方案。另外，各种正常的药理学、生理学和病理学方案也可用本发明的设备和方法。本发明者早就指出了这些可能性，并在图11A和11B中阐述了这些方案所需的步骤，图中有解释说明。
IV.结果
A.用TGFβ1对上皮细胞保护
当用表4的低温保护剂溶液洗涤时，在培养瓶中TGFβ1使内皮细胞正确地附着于粘连蛋白介质或基底。预计TGFβ1在体内对内皮细胞有相似的作用。
表4
| TGFβ1*对内皮细胞去粘附的保护 | ||
| 处理 | 非去粘附细胞数 | 相对于对照的p值 |
| 37℃对照 | 5.05±0.31×106 | - |
| 2℃对照 | 4.33±0.38×106 | n.s. |
| V52(根据整个肾脏方案过冷：V52本身＝20分钟暴露) | 138±0.10×106 | ＜.00002 |
| V52+TGFβ1(与上述V52相同，但用10ng/mlTGFβ1对培养物预处理22小时 | 4.95±0.21×106 | n.s. |
*通过每次实验后使烧瓶受胰蛋白酶作用，洗去培养的内皮细胞并计数来测定去粘附。在该试验中未见到过冷时去粘附细胞被除去，这导致细胞的计数下落。
B.兔肾
1.V49B-型溶液的适用性。
用V49或V49B处理的兔肾切片的活力数据如表5所示。
表5
| 用V49或V49B处理的兔肾切片的活力 | |
| 处理 | 组织的K/Na比率*(平均+/-SEM) |
| V49 | 3.43+/-0.07+ |
| V49B | 3.27+/-0.12+ |
| +p＞0.05 | |
*在洗去低温保护剂和在25℃下将皮层切片培养90分钟以活化K+和Na+的运输来测量K/Na比率。
2.V49和V52对于完整的肾脏的适用性
图12显示接受了预先用V49在Euro-Collins溶液灌流的肾脏移植的兔子的手术后血清肌酸酐水平。在获取器官前，通过在20分钟内全身静脉输液，0、15或25微克/kg伊洛前列腺素在体内处理肾脏。这三组的肾脏在+2℃、0-2℃和-1到-6℃下分别被暴露于V49(7.5M)。所有情况下的最初和最终灌流温度为2℃。这三组兔子的存活率分别为5/16(31％)，6/10(60％)和10/10(100％)。只有手术后第一夜存活的兔子数据。兔子存活完全取决于移植的肾脏的功能，因为在移植的同时执行了反侧的肾摘除术，没有浓度进行渗析支持。没有伊洛前列腺素处理、用边缘的低剂量伊洛前列腺素处理和用较高剂量的伊洛前列腺和最低灌流温度正常处理后这些兔子的组织学很长时间都不良。用Euro Collins灌流的对照(没有低温保护剂)结果如图8所示(底下的曲线)。虽然最佳V49组的损伤比对照的大，所有的损伤在手术后短时间里看来完全是可逆的。
表6显示了将7.5M低温保护剂扩展到8M低温保护剂时，除非用加了3％HES的溶液洗去8M浓度的低温保护剂，结果几乎一致地衰竭。移植后使用HES使兔子肾脏的存活率为75％。在兔子肾脏内遗留低分子量OBA对移植后的肾脏也是有利的。(表6)。
表6
| 用8M低温保护剂灌流的整个兔肾脏的恢复 | |
| 处 理 | 生命支持功能％ |
| A.用甘露醇或蔗糖洗净的标准方案 | 0 |
| B.具有升到30％的第一平台和升到33％w/v的第三平台以减少渗透胁迫的改进方案 | 8 |
| C.与B相同，但将灌流温度从-1.5℃降低到-3℃ | 29 |
| D.与C相同，但在洗去低温保护剂时用3％HES，在肾脏中遗留50mM甘露醇直到移植为止。 | 75 |
| E.与D相同，但用蔗糖而不是甘露醇 | 75 |
| F.与D相同，但在移植前除去所有的甘露醇 | 0 |
| G.与E相同，但在移植前除去所有的蔗糖 | 33 |
C.克服在-46℃下的冻伤和8.4M的低温保护剂的毒性
当肾脏用7.5M或8M低温保护剂处理，在如表6所示的洗去时用3％HES时，它们仍然不能耐受-30℃的冷冻(图13)。49％低温保护剂的100％存活率由于冷冻而下降到50％，8M组的75％存活率下降到0％。
虽然一些损伤是由于发生冷冻和温热需要更多的时间，组织切片本身表明冷冻的证据本身是自动有害的。从图14可见，将切片暴露于0℃下的8M低温保护剂明显地比暴露于相同温度下的6.1M低温保护剂受伤害更甚(参见第2和4栏)，8M的切片冷却到-23℃，引起另外的损伤(参见第2和3栏)。但是，有意思的是，冷却到-23℃的6.1M切片没有另外的损伤(参见第4和5栏)。更有意思的是，当负载6.1M低温保护剂的切片转到-23℃的8M溶液或甚至是8.4M低温保护剂中，没有与冷却相关的损伤，也没有与暴露于较高浓度相关的损伤(参见第4和5-6和7栏)。事实上，根据两步方法(首先冷却，然后暴露于较高的浓度，第7栏)暴露于-23℃的8.4M的活力比单纯暴露于0℃的8M最低浓度没有冷冻的活力高(第2栏，p＝0.033)。这些结果显示，通过首先在低浓度下冷冻，然后在第二步于更低温度下，如-23℃引入更高的浓度可以防止冻伤和低温保护剂的毒性。
图13的再检查提示完整的肾脏有相同的现象。较低浓度低温保护剂的恢复率较高，若一条线连接8M冷却点和7.5M冷却点，外推得到低于7.5M的浓度有100％存活率。由于这类外推的线性是未知的，发明者通过实验来选择，确证低于7.5M，即在切片实验中的6.1M是合格的浓度。
该实验的结果如图15所示。100％肾脏用6.1M低温保护剂装载，冷却到约-22℃，升温(在插入中指出的方案)维持的生命，在14天后(Cr14)后得到优秀的平均血清肌酸酐和可接受的峰值肌酸酐(pCr)。图16显示结果，是-3℃下装载6.1M低温保护剂，冷却到-23℃，然后用8M低温保护剂灌流肾脏直至达到平衡所得的。如前述实验，8M低温保护剂用3％HES洗去。与冷却到-30℃后再进行一步低温保护剂加入方法适成对照的是(图13)，图16的8M肾脏有7/8极好的存活率，存活的肾脏的Cr14和pCr值与6.1M的肾脏没有不同，与图14的切片结果完全一致。此外，如图17所示，当肾脏在-22℃下用8M低温保护剂灌流时，它们可再下降10℃达到-32℃(比图13内的更冷)，升温时存活率达到100％，Cr14值与仅暴露于6.1M低温保护剂的切片相同，与图14预计的完全一致。
由图18可见在-30到-60℃之间冻伤增加，但在接近玻璃化温度时不进一步增加。图18的主要部分显示在-30到-60℃之间更精确地测定冻伤停止增加的地方。虽然该实验的数量回落稍小，但它显示切片在冷冻到-45℃到-50℃处有最大的冻伤。
用图18的信息作为指导对完整肾脏进行的两个附加实验。在约9个月优化的引入和除去V55程序之后，确定以下最佳方法。两步方法的第一步是在-3℃下灌流44％w/v低温保护剂(6.73M)，然后冷却到-25℃，用V55灌流(55％低温保护剂，8.4M)。再将肾脏温热到-3℃，如上所述用3％w/vHES和350mM蔗糖洗出。该方案迄今得到的结果是3个这样处理的肾脏中有2个存活。这些肾脏在体内血液再流动40分钟后看上去良好，结果如图19所示，它们能将血清的肌酸酐水平恢复到接近或低于2mg/dl的水平，这是很好的结果。此外，用该方法在-25℃下用V55灌流的肾脏在温热前冷却到-46℃，用与非冷冻V55肾脏中所用的相同方法洗涤。该肾脏的结果也在图19中显示(虚线)，它们是相似的：移植后肾脏外观很好，在提交本专利申请时该肾脏血清的肌酸酐水平恢复到接近2mg/dl的值。和在另外两个V55肾脏上看到的没有区别，其恢复特别地延迟，在一段无前例的时间里其肌酸酐值接近15，但在这一长时间延误后血清的肌酸酐峰值回到基线。
综合来看，图18的切片结果和图19完整肾脏所得的数据表明兔肾脏可被冷却到玻璃化温度而不会失去存活性。此外，由于图19采用不施加压力即可玻璃化的低温保护剂的浓度，这表明高压不再是器官玻璃化所必须的。
D.动物数据与人体肾脏低温保存的相关性
1.第一例人肾脏
根据本发明的方法对232克垂的人体肾脏进行灌流，然后玻璃化。用BASIC程序收集来自该方法的数据，用Sigma Plot 5.0图像部件(Jandel Scientific，美国加利福尼亚)编辑和作图重新获得图20A、20B和21内的数据。
图20A内的数据显示，本发明的方法在该人体的肾脏中产生了预期的结果。虽然测得的摩尔量稍大于目标的摩尔量，浓度第一步的改变稍超过目标，遵守该方案的数据仍是合理的。
来自相同人体肾脏的图20B的数据显示其阻力(用mm Hg除以流量表达)和流量(毫升/分钟/肾脏克数)的行为与兔子肾脏的行为相似。
来自人体肾脏玻璃化的数据显示该方法是合适的。图21的数据没有指出肾脏的结冰，这由温度相对快速下降后出现平台来表示。最初的温度滞后在0℃以上代表外部的温度渗入肾脏中部的温度探头处，在这之后温度相当平稳地下落，表示没有冰形成。
2.第二例人的肾脏
该人肾脏是来自四个月龄的提供者的小儿肾脏。该肾脏在收到后但在用V55根据本发明方法灌流前储存79小时。图22的数据显示用V55对该肾脏的灌流(曲线的上升部分)，和从肾脏除去V55低温保护剂(曲线的下降部分)。图22的虚线和实线分别显示了所得的和目标的V55浓度。该实验中的灌流压为35mmHg。
测量的和目标浓度的不一致只是由于计量上的原因，而不是该方法的局限性所致。当迅速达到8.4M浓度或从折射的软件中退出时压力出现尖峰信号，没有特别的设计来防止这些尖峰信号并改正这些信号。这不是该方法的限制。由于该肾脏未经负载，故没有产生冷冻曲线。图22没有显示阻力、流量和温度。
E.肾脏切片存活数据
来自兔肾脏(图23A)和人肾脏(图23B)的存活数据和兔(R)和人(H)肾脏切片正常的数据(图23C)显示，人和兔肾脏切片对V49的响应几乎相同。虽然数据显示，在冷却到-30℃后与兔组织相比人肾脏组织的恢复稍差，但该恢复用兔子肾脏切片时被视为在存活率范围里。在进行实验前对人肾脏放置了数天，而兔肾脏是“新鲜的”。人的绝对K/Na比率的抑制与预计兔子切片储存相似时间所得的大致相同。
在本部分中的与灌流数据结合的这些数据显示，根据本发明的方法人体肾脏可被低温保护剂所装载，并可在冷冻下玻璃化--如，被冷冻到玻璃化温度以下，在器官内有极少或没有冰形成。这些数据也显示可用本发明的方法从人肾脏中除去低温保护剂。最后，兔和人肾脏切片存活数据的相似性，并结合兔肾脏可存活且维持经移植入肾脏的兔子的生命的事实表明，人肾脏用本发明的方法处理也可得到相似的结果。
F.对其它器官的实用性：鼠肝脏模式
鼠肝脏用图10所示的方案进行灌流。灌流液体不含HES或低分子量rOB。表7的数据显示在移植后5、10和15分钟产生的总的胆汁，以及在肝脏移植入鼠体内后7天里的存活数。这些数据显示用溶液灌流的鼠肝脏可支持已移植入经灌流的鼠肝脏的饲养鼠的生命。
表7
| 用载体或V49灌流的鼠肝脏的功能恢复和对生命的支持功能 | |||||
| 实验 | 肝脏重量(变化％) | 移植后5、10和15分钟产生的总胆汁(微升/克±SD) | 移植后7天里鼠的存活 | ||
| 对照Pfn*w/UW1+(HES) | -9.9±2.1 | 1.68±.94 | 5.19±2.33 | 9.32±3.65 | 6/6(100％) |
| 对照Pfn*w/UW2≠(没有HES) | -8.7±0.5 | 2.03±.75 | 4.62±1.50 | 7.67±2.48 | 5/6(83％) |
| V49灌流w/UW1+(HES) | 8.7±0.7 | 0.66±.50 | 1.62±0.82 | 3.14±1.38 | 2/4(50％) |
| V49灌流w/UW2≠(没有HES) | -6.3±3.0 | 1.20±.98 | 2.56±1.92 | 4.43±3.1 8 | 2/4(50％) |
*Pfn＝灌流
+UW1＝修改的UW溶液1(参见表3)
≠UW2＝修改的UW溶液2(参见表3)
综合来看，来自肾脏和肝脏的数据表明这里揭示为了低温保存的器官的制备方法和低温保存后用于移植的器官的制备方法是有广泛用途的。
虽然上面揭示了本发明各种技术方案，应当明白它们只代表实施例而并非作为限制。这样，本发明的覆盖面和范围不被上述的任何列举的技术方案所限制，而应当根据下面的权利要求书和它们的等价物来定义。由于应当明白该技术领域的人员的可对形式和细节作出各种改变而不背离本发明的精神和范围，本申请覆盖了本发明的任何改变、使用或适应性，总之，是覆盖了本发明的原理，并包括背离了本说明书但对本技术领域是已知的或常用的，并可实施得到前述的必不可少的特征和遵从所附权利要求的范围。
Claims (35)
1.一种用于低温保存的生物器官的制备方法，包括：
(a)用梯度增加到第一预定浓度的低温保护剂溶液灌流所述的器官，同时降低所述器官的温度；
(b)让所述低温保护剂浓度保持足以与所述器官达到渗透平衡的时间；和
(c)将所述溶液的低温保护剂浓度增加到较高的第二预定浓度，让所述低温保护剂溶液在第二浓度保持足以与所述器官达到渗透平衡的时间。
2.根据权利要求1所述的方法，它进一步包括在用浓度逐渐增加的低温保护剂灌流所述器官前用没有低温保护剂的物质灌流所述器官。
3.根据权利要求2所述的方法，进一步包括用伊洛前列腺素或转化生长因子β1灌流所述的器官。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述的第二预定浓度不是玻璃化所允许的，步骤(c)进一步包括在向器官引入可玻璃化浓度的低温保护剂前冷冻所述的器官。
5.根据权利要求1-3或4任一所述的方法，其中所述的器官是肾脏或肝脏。
6.根据权利要求1-3或4任一所述的方法，其中所述的低温保存是玻璃化，所述的最终低温保护剂浓度使玻璃化可以进行。
7.一种在器官低温保存后用于移植的器官的制备方法，包括：
(a)将所述的器官温热到允许对所述器官再灌流的温度，其中对所述器官的损伤最小；
(b)用非-玻璃化浓度的低温保护剂灌流一段时间，使之足以与所述器官达成大致的渗透平衡；和
(c)基本将所述器官中所用的低温保护剂灌流出来，同时将所述器官的温度升高到使所述器官适合移植的温度。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述的低温保存是通过玻璃化进行。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述的低温保存是冷冻。
10.根据权利要求7所述的方法，它进一步包括：
在步骤(b)中用非-玻璃化浓度的低温保护剂与渗透缓冲剂的结合灌流所述的器官。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述的渗透缓冲剂是低分子量渗透缓冲剂。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述的低分子量渗透缓冲剂选自：麦芽糖、果糖1，6-二磷酸钾和钠、乳糖酸钾和钠、甘油磷酸钾和钠、棉子糖、麦芽五糖、水苏糖、蔗糖和甘露醇。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述的低分子量缓冲剂是蔗糖。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述的低分子量缓冲剂是甘露醇。
15.根据权利要求10所述的方法其中所述的渗透缓冲剂是高分子量试剂。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述的高分子量渗透缓冲剂选自羟乙基淀粉(≤450,000道尔顿)、聚乙烯吡咯烷酮、棉子糖十一烷基乙酸钾盐和Ficoll(1,000到100,000道尔顿)。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述的高分子量渗透缓冲剂是羟乙基淀粉。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述的羟乙基淀粉的分子量约为450,000。
19.根据权利要求10所述的方法，它进一步包括用所述的非-玻璃化浓度的低温保护剂与一种或多种低分子量和一种或多种高分子量渗透缓冲剂组合灌流所述的器官。
20.根据权利要求10所述的方法，它进一步包括用所述的非-玻璃化浓度的低温保护剂与一种低分子量和一种高分子量渗透缓冲剂结合灌流所述的器官。
21.根据权利要求11所述的方法，其中所述低分子量渗透缓冲剂的浓度逐步减少到非0值，同时所述低温保护剂的浓度也逐步减少到低于200mM。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述的低分子量渗透缓冲剂的浓度被减少到150mM和1,000mM之间。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述的低温保护剂的浓度被减少到0。
24.根据权利要求11所述的方法，其中所述低分子量渗透缓冲剂的浓度在低温保护剂浓度被减少到低于200mM后被逐步减少。
25.根据权利要求19所述的方法，其中所述的低分子量渗透缓冲剂选自甘露醇和蔗糖，所述的高分子量渗透缓冲剂是羟乙基淀粉(HES)。
26.根据权利要求25所述的方法，其中一旦所有的所述低温保护剂从所述器官中除去，HES的浓度被逐渐减少到非0水平，而蔗糖浓度被逐步降低到0，甘露醇被同时灌流入所述的器官。
27.根据权利要求15、16、18、19或20所述的方法，其中所述的器官是肝脏。
28.根据权利要求10、19、20、25或26所述的方法，其中所述的器官是肾脏。
29.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述的器官是肝脏。
30.根据权利要求7所述的方法，其中当器官是肾脏或肝脏时，步骤(a)所述的温度是-3.0℃。
31.根据权利要求7、10、19或20所述的方法，其中所述的低温保护剂的非玻璃化浓度是20-40％(w/v)。
32.一种用于灌流器官的组合物，其中所述的组合物可维持所述器官的存活力，所述的组合物包括：NaH2PO4·H2O；葡糖酸钾；葡糖酸镁；葡萄糖；谷胱甘肽；腺嘌呤苷；HEPES；腺嘌呤；核糖和氯化钙。
33.根据权利要求32所述的组合物，进一步包括羟乙基淀粉。
34.根据权利要求31所述的溶液，其中所述溶液的组份浓度为：NaH2PO4·H2O(3.45g/l)；葡糖酸钾(23.42g/l)；葡糖酸镁(0.21g/l)；谷胱甘肽(0.92g/l)；腺嘌呤苷氢氯化物(1.34g/l)；HEPES(2.38g/l)；腺嘌呤(0.17g/l)；核糖(0.15g/l)和氯化钙(0.0056g/l)。
35.根据权利要求33所述的溶液，其中所述羟乙基淀粉的浓度是50g/l，葡萄糖的浓度是0.90g/l。
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| CN102813559A (zh) * | 2012-08-27 | 2012-12-12 | 山东大学 | 一种全自动灌流装置 |
| CN109221081A (zh) * | 2018-09-07 | 2019-01-18 | 银丰低温医学科技有限公司 | 一种多组织玻璃化原位保存装置和方法 |
| CN110057821A (zh) * | 2019-04-16 | 2019-07-26 | 上海交通大学 | 用于人类配子快速冻融过程观测的低温显微成像系统 |
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1995
- 1995-08-11 CN CN 95195669 patent/CN1162900A/zh active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102692495A (zh) * | 2012-06-14 | 2012-09-26 | 中国科学技术大学 | 灌流显微镜 |
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