CN109097355A - 一种漆酶固载材料及其固定漆酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种漆酶固载材料及其固定漆酶的方法，漆酶固载材料的制备是通过与六水氯化铁、七水硫酸亚铁的反应使埃洛石纳米管上负载上四氧化三铁，具备一定的磁性。然后将具有磁性的埃洛石纳米管与硅烷偶联剂反应引入氨基，在表面上提供多个活性位点，使其固定化作用更加稳定。本发明制备的m‑HNTs‑Fe3O4，在表面引入了氨基，为交联剂提供了多个活性位点，能够让被固定化的酶的数量增多，在处理染料废水、农药废水以及养殖场废水时的效率更高、速度更快。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶学技术及吸附领域，具体涉及一种漆酶固载材料及其固定漆酶的方法。
背景技术
随着现代社会城市化、工业化的迅速发展，工业污染问题也日趋严重，工业废水的生产和排放严重威胁到了人类的身体健康和正常生产生活。其中，工业废水的治理已经得到了广泛的重视。传统意义上处理工业废水的处理方法大致分为两类：分离法和转化法，此外，由于废水中污染物的存在形态的不同，可以选择离子交换法、电解法、吸附法、离心分离法等，其中，吸附法被人们广泛的采用，在吸附作用过程中，吸附材料的选择对吸附效果起关键作用。目前，广泛采用的吸附材料如活性炭、活性淤泥、硅藻土等。这些吸附材料在去除污染物的同时，也存在吸附效果、回收利用、重复使用性能不足等缺陷。开发新型吸附材料一直是热点和前沿。染料废水是常见的废水之一，在处理染料废水时，目前的新技术中，利用了酶降解法，具有处理效果高效、清洁、安全等优点，但游离的酶也存在催化效果较差、重复利用性能等不足。埃洛石本身具有较大的比表面积，强吸附能力，因此其在负载微粒方面具有显著的优势，能够在一定程度上吸附废水中的某些污染物分子/离子，其次，埃洛石纳米管具有内外两个不同电负性的表面，可以吸附不同种类的酶，在理论上能够实现多种酶促反应降解废水中的污染物质。但是，由于埃洛石纳米管对于吸附的稳定性不强，使用后不易被回收，得到的固定化产物的重复使用性能较弱。
发明内容
本发明要解决的问题是针对现有技术不足，提供一种漆酶固载材料及其固定漆酶的方法。
本发明采用如下技术方案：一种漆酶固载材料，通过以下步骤制备得到：
(1)埃洛石的纯化：用盐酸对埃洛石进行纯化，在8.0～20.0g埃洛石中加入100～200mL 0.5mol·L-1的HCl，室温搅拌10h，去离子水洗涤，直至上清液为中性，离心分离，50℃烘干12h后备用。
(2)氮气保护下，将5.0～10.0g纯化后的埃洛石、1.47～2.91g六水氯化铁和0.8～1.5g七水硫酸亚铁加入到100～200mL去离子水中，搅拌均匀，逐滴滴加2.0mol·L-1的氨水调节pH至9.0～10.0，70℃下冷凝回流3h，磁铁分离得到黑色沉淀物，去离子水洗涤黑色沉淀物，60℃真空干燥12h，得到HNTs-Fe3O4。
(3)将1.5～3.0g的HNTs-Fe3O4分散于去离子水中，加入0.64～1.45g无水碳酸钠并升温至80℃，搅拌反应2h；再加入一定量盐酸溶液至溶液的pH值为8，加入3.0～6.0g的KH-550反应3～4h；磁力分离得到产物，用去离子水和无水乙醇多次洗涤产物；80℃条件下干燥后，研磨得m-HNTs-Fe3O4。
(4)向50mL或100mL锥形瓶中加入0.05～0.1g的m-HNTs-Fe3O4、10～20mL 0.2mol·L-1pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液、8.0％的戊二醛12～20mL，室温下放入摇床，转速150～200r·min-1，反应10～12h，磁铁分离，去离子水充分洗涤磁性产物，得到漆酶固载材料。
上述材料固定漆酶的方法为：将25.0～35.0mg醛基化的载体、10～20mL pH＝7.0磷酸盐缓冲液、0.0015～0.0030g的漆酶混合，摇床中振荡反应6～8h，转速150～200r·min-1，磁铁分离，缓冲液反复洗涤磁性产物，直至上清液中检测不到蛋白质为止。
本发明的有益效果在于：本发明以埃洛石纳米管为原料，经化学改性，与KH-550反应制备的改性HNTs，在表面上引入了氨基，通过交联剂将酶牢固地结合在一起，具有优异的稳定性，并且，为交联剂提供了多个活性位点，使得交联剂可以固定更多的酶，由于其内外表面的电负性不同，交联剂还能够固定多种类的酶。并且比利用静电力结合酶的稳定性更优异，同时，对埃洛石纳米管的磁化作用能够有效地提高该固定化酶的分离和回收性能，提高重复使用性能。相比于传统的固定化漆酶的载体或者埃洛石，改性磁性埃洛石的磁性能够使固定化酶更容易与废水分离，能够通过较为简便的方式来实现分离效果，重新获得该固定化酶，实现重复使用性能的大幅度提高。并且，改性后的埃洛石不易失活，在多次使用后仍能保持较高的活性，降低了成本和提高了使用效率。此外，对埃洛石纳米管进行磁性反应，使其具有一定的磁性，易于分离和回收，大大提高了该固定化酶的回收利用。而且，埃洛石本身就是天然黏土的一种，价格较为便宜，成本较低。
附图说明
图1为埃洛石纳米管的磁性改性流程图；
图2为KH-550改性埃洛石流程图；
图3为m-HNTs-Fe3O4通过戊二醛交联漆流程图；
图4为实施例1HNTs红外谱图和m-HNTs-Fe3O4(即KH550-HNTs-Fe3O4)红外谱图；
图5为实施例1埃洛石和磁性埃洛石(HNTs-Fe3O4)的XRD谱图；
图6为实施例2HNTs红外谱图和m-HNTs-Fe3O4(即KH550-HNTs-Fe3O4)红外谱图；
图7为实施例2埃洛石和磁性埃洛石(HNTs-Fe3O4)的XRD谱图；
图8为实施例3HNTs红外谱图和m-HNTs-Fe3O4(即KH550-HNTs-Fe3O4)红外谱图；
图9为实施例3埃洛石和磁性埃洛石(HNTs-Fe3O4)的XRD谱图。
具体实施方式
实施例一：
(1)埃洛石的纯化：取20.0g高纯度的埃洛石放入烧杯，加入200mL 0.5mol·L-1的HCl，室温搅拌10h，去离子水洗涤，直至上清液为中性，离心分离，50℃烘干12h后备用。
(2)氮气保护下，将10.0g埃洛石、2.91g六水氯化铁和1.50g七水硫酸亚铁快速加入到200mL去离子水中，搅拌均匀，逐滴滴加2.0mol·L-1的氨水调节pH至9.0～10.0，70℃下冷凝回流3h，强磁铁分离得到黑色沉淀物，去离子水洗涤，60℃真空干燥12h，得到HNTs-Fe3O4。
(3)将3.0g的HNTs-Fe3O4分散于去50mL离子水中，加入1.0461g无水碳酸钠并升温至80℃，搅拌反应2h；再加入一定量酸溶液至溶液的pH值为8，加入6.0g的KH-550反应4h；磁力分离得到产物，用去离子水和无水乙醇多次洗涤；80℃条件下干燥后，研磨得m-HNTs-Fe3O4。图4是HNTs和m-HNTs-Fe3O4(即KH550-HNTs-Fe3O4)的红外光谱图。HNTs的特征吸收峰在改性前后均表现出来。这些峰包括3620cm-1与3696cm-1处HNTs表面O-H的伸缩振动峰，1639cm-1处的峰为O-H的弯曲振动峰，909cm-1处为HNTs内部O-H的特征峰，799cm-1处的Si-O-Si的对称伸缩振动。改性后的m-HNTs-Fe3O4在2900cm-1出现新的吸收峰，为N-H的伸缩振动峰，也就是KH550的特征峰，表明KH550已成功接在HNTs的表面。图5是HNTs与HNTs-Fe3O4的XRD衍射图谱。在2θ为12.1°、20.1°、24.6°、26.2°处。两条曲线均出现了HNTs的特征衍射峰。在2θ为30.3°、35.5°、43.2°、57.2°处，HNTs-Fe3O4的XRD图谱上出现了Fe3O4的特征衍射峰，表明Fe3O4纳米粒子成功复合到了HNTs上。
(4)向50mL锥形瓶中加入0.0531g的埃洛石纳米管、10mL 0.2mol·L-1pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液、8.0％的戊二醛20mL，室温下放入摇床，转速150r·min-1，反应12h，去离子水充分洗涤，得到醛基化的载体备用。
(5)向50mL锥形瓶中加入25.0mg醛基化的载体、10mL pH＝7.0磷酸盐缓冲液、0.0015g的漆酶，摇床中振荡反应6h，转速150r·min-1，磁铁分离固定在载体上的漆酶，缓冲液反复洗涤，直至上清液中检测不到蛋白质为止。固定化漆酶在缓冲液中保存于4℃的冰箱中备用。
实施例二：
(1)埃洛石的纯化：取8.0g高纯度的埃洛石放入烧杯，加入100mL 0.5mol·L-1的HCl，室温搅拌10h，去离子水洗涤，直至上清液为中性，离心分离，50℃烘干12h后备用。
(2)氮气保护下，将5.0g埃洛石、1.47g六水氯化铁和0.80g七水硫酸亚铁快速加入到100mL去离子水中，搅拌均匀，逐滴滴加2.0mol·L-1的氨水调节pH至9.0～10.0，70℃下冷凝回流3h，强磁铁分离得到黑色沉淀物，去离子水洗涤，60℃真空干燥12h，得到HNTs-Fe3O4。
(3)将1.5g的HNTs-Fe3O4分散于去25mL离子水中，加入0.6374g无水碳酸钠并升温至80℃，搅拌反应2h；再加入一定量盐酸溶液至溶液的pH值为8，加入3.0g的KH-550反应3h；磁力分离得到产物，用去离子水和无水乙醇多次洗涤；80℃条件下干燥后，研磨得m-HNTs-Fe3O4。图6是HNTs和m-HNTs-Fe3O4的红外光谱图。HNTs的特征吸收峰在改性前后均表现出来。这些峰包括3620cm-1与3696cm-1处HNTs表面O-H的伸缩振动峰，1639cm-1处的峰为O-H的弯曲振动峰，909cm-1处为HNTs内部O-H的特征峰，799cm-1处的Si-O-Si的对称伸缩振动。改性后的m-HNTs-Fe3O4在2900cm-1出现新的吸收峰，为N-H的伸缩振动峰，也就是KH550的特征峰，表明KH550已成功接在HNTs的表面。图7是HNTs与HNTs-Fe3O4的XRD衍射图谱。在2θ为12.1°、20.1°、24.6°、26.2°处。两条曲线均出现了HNTs的特征衍射峰。在2θ为30.3°、35.5°、43.2°、57.2°处，HNTs-Fe3O4的XRD图谱上出现了Fe3O4的特征衍射峰，表明Fe3O4纳米粒子成功复合到了HNTs上。
(4)向100mL锥形瓶中加入0.1013g的埃洛石纳米管、20mL 0.2mol·L-1pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液、8.0％的戊二醛40mL，室温下放入摇床，转速150r·min-1，反应12h，去离子水充分洗涤，得到醛基化的载体备用。
(5)向50mL锥形瓶中加入35.0mg醛基化的载体、20mL pH＝7.0磷酸盐缓冲液、0.0030g的漆酶，摇床中振荡反应8h，转速150r·min-1，磁铁分离固定在载体上的漆酶，缓冲液反复洗涤，直至上清液中检测不到蛋白质为止。固定化漆酶在缓冲液中保存于4℃的冰箱中备用。
实施例三：
(1)埃洛石的纯化：取15.0g高纯度的埃洛石放入烧杯，加入150mL 0.5mol·L-1的HCl，室温搅拌10h，去离子水洗涤，直至上清液为中性，离心分离，50℃烘干12h后备用。
(2)氮气保护下，将8.0g埃洛石、2.21g六水氯化铁和1.25g七水硫酸亚铁快速加入到150mL去离子水中，搅拌均匀，逐滴滴加2mol·L-1的氨水调节pH至9.0～10.0，70℃下冷凝回流4h，强磁铁分离得到黑色沉淀物，去离子水洗涤，60℃真空干燥12h，得到HNTs-Fe3O4。
(3)将1.5g的HNTs-Fe3O4分散于去50mL离子水中，加入0.8397g无水碳酸钠并升温至80℃，搅拌反应2h；再加入一定量盐酸溶液至溶液的pH值为8，加入5g的KH-550反应4h；磁力分离得到产物，用去离子水和无水乙醇多次洗涤；80℃条件下干燥后，研磨得m-HNTs-Fe3O4。图8是HNTs和m-HNTs-Fe3O4的红外光谱图。HNTs的特征吸收峰在改性前后均表现出来。这些峰包括3620cm-1与3696cm-1处HNTs表面O-H的伸缩振动峰，1639cm-1处的峰为O-H的弯曲振动峰，909cm-1处为HNTs内部O-H的特征峰，799cm-1处的Si-O-Si的对称伸缩振动。改性后的m-HNTs-Fe3O4在2900cm-1出现新的吸收峰，为N-H的伸缩振动峰，也就是KH550的特征峰，表明KH550已成功接在HNTs的表面。图9是HNTs与HNTs-Fe3O4的XRD衍射图谱。在2θ为12.1°、20.1°、24.6°、26.2°处。两条曲线均出现了HNTs的特征衍射峰。在2θ为30.3°、35.5°、43.2°、57.2°处，HNTs-Fe3O4的XRD图谱上出现了Fe3O4的特征衍射峰，表明Fe3O4纳米粒子成功复合到了HNTs上。
(4)向50mL锥形瓶中加入0.0531g的埃洛石纳米管、10mL 0.2mol·L-1pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液、8.0％的戊二醛20mL，室温下放入摇床，转速200r·min-1，反应10h，去离子水充分洗涤，得到醛基化的载体备用。
(5)向50mL锥形瓶中加入25.0mg醛基化的载体、10mL pH＝7.0磷酸盐缓冲液、0.0020g的漆酶，摇床中振荡反应6h，转速200r·min-1，磁铁分离固定在载体上的漆酶，缓冲液反复洗涤，直至上清液中检测不到酶蛋白质为止。固定化漆酶在缓冲液中保存于4℃的冰箱中备用。
在温度、pH值以及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应速度有很大的影响。底物浓度很低时，酶促反应的速度随底物浓度的增加迅速增加，随反应底物浓度继续增加，反应速度的增加开始减慢，当底物浓度增加到一定值时，反应速度达到最大极限。底物浓度[S]与酶反应速率v间的定量关系由米氏方程给出：
式中：v为反应出速率，V为最大反应速率，[S]为底物浓度，Km为米氏常数，Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度，Km是酶的特性常数之一，可以表示酶与底物的亲和力。测得游离的漆酶的米氏常数是1.207mmol·L-1，而通过m-HNTs-Fe3O4固载的漆酶的米氏常数是1.338～1.450mmol·L-1，表明固载酶与底物的亲和力较游离酶有所减小。固定化漆酶的最适温度是20℃，最适pH为4，在4℃下保存14天仍保持约80％的酶活力。
| 酶 | 方程 | R<sup>2</sup> | K<sub>m</sub>/mmol·L<sup>-1</sup> |
| 游离漆酶 | y＝57.425x+47.577 | 0.9936 | 1.207 |
| 固定化漆酶(实施例1) | y＝71.817x+55.662 | 0.9971 | 1.416 |
| 固定化漆酶(实施例2) | y＝75.878x+56.710 | 0.9965 | 1.338 |
| 固定化漆酶(实施例3) | y＝77.102x+53.174 | 0.9942 | 1.450 |
Claims (5)
1.一种漆酶固载材料，其特征在于，通过以下步骤制备得到：
(1)埃洛石的纯化：用盐酸对埃洛石进行纯化，在8.0～20.0g埃洛石中加入100～200mL0.5mol·L-1的HCl，室温搅拌10h，去离子水洗涤，直至上清液为中性，离心分离，50℃烘干12h后备用。
(2)氮气保护下，将5.0～10.0g纯化后的埃洛石、1.47～2.91g六水氯化铁和0.8～1.5g七水硫酸亚铁加入到100～200mL去离子水中，搅拌均匀，逐滴滴加氨水调节pH至9.0～10.0，70℃冷凝回流3h，磁铁分离得到黑色沉淀物，去离子水洗涤黑色沉淀物，60℃真空干燥12h，得到HNTs-Fe3O4。
(3)将1.5～3.0g的HNTs-Fe3O4分散于去离子水中，加入0.64～1.45g无水碳酸钠并升温至80℃，搅拌反应2h；再加入一定量盐酸溶液至溶液的pH值为8，加入3.0～6.0g的KH-550反应3～4h；磁力分离得到产物，用去离子水和无水乙醇多次洗涤产物；80℃条件下干燥后，研磨得m-HNTs-Fe3O4。
(4)向50mL或100mL锥形瓶中加入0.05～0.1g的m-HNTs-Fe3O4、10～20mL磷酸盐缓冲溶液、8.0％的戊二醛12～20mL，室温下放入摇床反应10～12h，磁铁分离，去离子水充分洗涤磁性产物，得到漆酶固载材料。
2.根据权利要求1所述的漆酶固载材料，其特征在于，步骤4中磷酸盐缓冲溶液的溶度为0.2mol·L-1，pH＝7.0。
3.根据权利要求1所述的漆酶固载材料，其特征在于，步骤4中氨水的浓度为2.0mol·L-1。
4.根据权利要求1所述的漆酶固载材料，其特征在于，步骤4中摇床转速150～200r·min-1。
5.如权利要求1所述的材料固定漆酶的方法，其特征在于，该方法为：将25.0～35.0mg醛基化的载体、10～20mL pH＝7.0磷酸盐缓冲液、0.0015～0.0030g的漆酶混合，摇床中振荡反应6～8h，转速150～200r·min-1，磁铁分离，缓冲液反复洗涤磁性产物，直至上清液中检测不到蛋白质为止。
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