CN109090238A - 一种酮香型酸奶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酮香型酸奶的制备方法，属于乳制品发酵技术领域。本发明所述方法以脱脂乳为原料，经均质、杀菌后冷却，嗜热链球菌CGMCC NO.15148和干酪乳杆菌CGMCC NO.15149按1:1接入灭菌后的脱脂乳中进行发酵。本发明制备方法以嗜热链球菌CGMCC NO.15148和干酪乳杆菌CGMCC NO.15149为发酵剂，该发酵剂发酵6h后，酸奶中酮类化合物的含量为629.78μg/kg，赋予酸奶怡人的奶香味和果香味。
Description
技术领域
本发明涉及一种酮香型酸奶的制备方法，属于乳制品发酵技术领域。
背景技术
酸奶是以鲜牛奶或奶粉为原料，经过预处理后，接入纯种发酵剂，在保温一段时间后，发酵产生的乳酸会使酪蛋白结成凝乳，进而成为酸奶。酸奶具有独特的风味和口感，且营养丰富。
研究表明酮类化合物是促进酸奶风味形成的一类物质，其中2,3-丁二酮(又称双乙酰)、乙偶姻、丙酮、2-丁酮等是酸奶的主要风味物质(Cheng H F.Volatile flavorcompounds in yogurt:a review[J].Critical Reviews in Food Science&Nutrition,2010,50(10):938-950)。2,3-丁二酮的含量大约在0.1-1.0mg/kg，其能赋予酸奶浓郁的奶香味，文献“酸奶中风味物质与酶活及感官特性关系的初探”(康欢.东北农业大学,2013)发现丙酮和2-丁酮也是酸奶中重要的风味化合物，丙酮有一种愉快的水果香味。酸奶中的丙酮一部分来源于原料乳本身，但绝大部分是来自于乳酸菌的代谢，2-丁酮的风味类似于丙酮，呈水果香味。因此，研究一种酮类化合物含量高，奶香味和果香味浓郁的酸奶，具有重要的意义。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种酮香型酸奶及其制备方法。
具体地，本发明提供了一种酮香型酸奶的制备方法，所述方法以脱脂乳为原料，经均质、杀菌后冷却，按1:1(菌数量比)接入嗜热链球菌CGMCC NO.15148和干酪乳杆菌CGMCCNO.15149进行发酵。
本发明利用嗜热链球菌CGMCC NO.15148和干酪乳杆菌CGMCC NO.15149作为发酵剂进行发酵。本发明人研究发现，该发酵剂在脱脂乳中发酵6h的pH为4.63；该发酵剂在脱脂乳中发酵6h的滴定酸度为81.9°T；
该发酵剂发酵的酸奶中酮类化合物的含量多，6h采用固相微萃取方法测定其含量为629.78μg/kg。
进一步的，所述脱脂乳通过将质量比为10-12％的脱脂乳粉溶于水中配制得到。
进一步的，所述均质的压力为14-21MPa，温度为40-85℃。
进一步的，所述杀菌为74-82℃下巴氏杀菌30min或85℃下高温短时杀菌25-60s。
优选的，将嗜热链球菌CGMCC NO.15148和干酪乳杆菌CGMCC NO.15149菌株在改良MRS培养基中活化，然后按2-5％的总体积比加入到杀菌后的含糖脱脂牛乳中。
或者优选的，将嗜热链球菌CGMCC NO.15148和干酪乳杆菌CGMCC NO.15149直投式发酵剂按0.05-0.2％的总重量比加入到杀菌后的含糖脱脂牛乳中。
其中，直投式发酵剂是将嗜热链球菌CGMCC NO.15148和干酪乳杆菌CGMCCNO.15149的浓度调整至109cfu/mL以上，经冷冻干燥处理后得到。
进一步的，所述发酵的温度为40-42℃，时间为4-6h。
本发明还提供了所述制备方法制得的酮香型酸奶。由于所用发酵剂高产2,3-丁二酮、乙偶姻、丙酮、2-丁酮，使得制备得到的酸奶具有突出的奶香味和果香味。
本发明的有益效果为：
本发明制备方法以嗜热链球菌CGMCC NO.15148和干酪乳杆菌CGMCC NO.15149为发酵剂，产2,3-丁二酮、乙偶姻、丙酮、2-丁酮高，增香快，且含量可维持较长时间不变，赋予酸奶怡人的奶香味和果香味。
生物材料保藏：
本发明提供的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)，分类命名为嗜热链球菌Streptococcus thermophilus，已于2018年1月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.15148，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，分类命名为干酪乳杆菌Lactobacilluscasei，已于2018年1月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.15149，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
图1为本发明酮香型酸奶发酵6h酮类化合物的含量；
图2为本发明酮香型酸奶发酵过程中的pH变化；
图3为本发明酮香型酸奶发酵过程中的可滴定酸度变化；
图4为不同发酵剂制得的酸奶的感官评定结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
实施例1嗜热链球菌CGMCC No.15148的菌种分离鉴定方法
(1)获得合适的稀释梯度并培养
从四川阿坝自治州传统发酵乳样品中称取0.5mL，加入到装有4.5mL无菌水中，然后依次取0.5mL菌液稀释在4.5mL无菌水，使该样品浓度梯度稀释至10-4，取4个稀释度分别为10～104的菌悬液各50μL分别涂布于MRS固体培养基上，在温度37℃下培养46～48h。
(2)分离纯化
用平板划线法，挑选典型单菌落，重复这种培养挑选操作后得到优良性状的菌株。
(3)革兰氏染色及过氧化氢酶实验
挑取单菌落，做革兰氏染色及过氧化氢酶实验，在光学显微镜下观察革兰氏染色结果并记录，将革兰氏阳性、过氧化氢阴性菌平板纯化四代，接种于MRS培养三代后，4000rpm离心5min，于30％甘油管内贮藏，得到菌株CGMCC NO.15148。
(4)PCR扩增16S rDNA
吸取1mL震荡混匀后的液体培养基，离心后弃去上清液，并用1mL无菌水吹打清洗2次后，离心弃去上清液，用作菌落PCR的模板。
1)PCR体系50μL，其中Mix为25μL，27F为1μL，1492R为1μL，ddH2O为23μL。
所用引物为27F:AGA GTT TGA TCC TGG CCT CA 20(SEQ ID NO:1)和1492R:GGTTAC CTT GTT ACG ACT T 19(SEQ ID NO:2)。
2)PCR条件：
Lid：105℃MBY-16s V：20μL
DNA双链在94℃，10min的条件下变性，94℃，30s后冷却50℃，30s，快速升温至72℃时80s，并循环29次，最后72℃下保持7min。
(5)琼脂凝胶电泳(80mL)
在三角瓶中加入0.8g琼脂糖和80mL 1×TAE，用微波加热，直至澄清后，待稍凉后添加EB染料8μL；加入电泳板冷却半小时，待其凝结成固体胶状；用移液枪将3-5μL的样品打入胶板的小孔内，并在每行末端加一个Marker；插上电极，调电压120V，运行半小时；取出胶板，在UV下曝光10s，保存电泳条带的图像；将得到清晰电泳条带的样品测序。
(6)16S rRNA序列分析鉴定
根据北京六合华大基因科技股份有限公司给出的测序报告，结合BLAST分析工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)将所分离的乳酸菌16S rRNA序列(SEQ ID NO:3)与GenBank/EMBL/DDBJ)数据库中已知菌株的对应序列进行比较鉴定，经分析鉴定为嗜热链球菌CGMCC NO.15148(Streptococcus thermophilus CGMCC NO.15148)，嗜热链球菌的形态米黄色菌落、扁平、边缘不整齐、球形或卵圆形、排列成对或形成长短不等的链状。
实施例2干酪乳杆菌CGMCC NO.15149的菌种分离鉴定方法
(1)获得合适的稀释梯度并培养
从四川阿坝自治州传统发酵曲拉样品中称取0.5mL，加入到装有4.5mL无菌水中，然后依次取0.5mL菌液稀释在4.5mL无菌水，使该样品浓度梯度稀释至10-4，取4个稀释度分别为10～104的菌悬液各50μL分别涂布于MRS固体培养基上，在温度37℃下培养46～48h。
(2)分离纯化
用平板划线法，挑选典型单菌落，重复这种培养挑选操作后得到优良性状的菌株。
(3)革兰氏染色及过氧化氢酶实验
挑取单菌落，做革兰氏染色及过氧化氢酶实验，在光学显微镜下观察革兰氏染色结果并记录，将革兰氏阳性、过氧化氢阴性菌平板纯化四代，接种于MRS培养三代后，4000rpm离心5min，于30％甘油管内贮藏，得到菌株CGMCC NO.15149。
(4)PCR扩增16S rDNA
吸取1mL震荡混匀后的液体培养基，离心后弃去上清液，并用1mL无菌水吹打清洗2次后，离心弃去上清液，用作菌落PCR的模板。
1)PCR体系50μL，其中Mix为25μL，27F为1μL，1492R为1μL，ddH2O为23μL。
所用引物为27F:AGAgTT TGA TCC TGG CCT CA(SEQ ID NO:1)和1492R:gGT TACCTTgTT ACG ACT T(SEQ ID NO:2)。扩增片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，长度为1500bp。
2)PCR条件：
Lid：105℃mBY-16s V：20μL
DNA双链在94℃，10min的条件下变性，94℃，30s后冷却50℃，30s，快速升温至72℃时80s，并循环29次，最后72℃下保持7min。
(5)琼脂凝胶电泳(80mL)
在三角瓶中加入0.8g琼脂糖和80mL 1×TAE，用微波加热，直至澄清后，待稍凉后添加EB染料8μL；加入电泳板冷却半小时，待其凝结成固体胶状；用移液枪将3-5μL的样品打入胶板的小孔内，并在每行末端加一个Marker；插上电极，调电压120V，运行半小时；取出胶板，在UV下曝光10s，保存电泳条带的图像；将得到清晰电泳条带的样品测序。
(6)16S rRNA序列分析鉴定
根据北京六合华大基因科技股份有限公司给出的测序报告，结合BLAST分析工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)将所分离的乳酸菌16S rRNA序列与GenBank/EMBL/DDBJ)数据库中已知菌株的对应序列进行比较鉴定，分析鉴定为干酪乳杆菌CGMCCNO.15149(Lactobacillus casei)。干酪乳杆菌CGMCC No.15149的形态特征：呈杆状，白色，表面光滑湿润，边缘整齐，凸起的菌落。
实施例3嗜热链球菌CGMCC NO.15148和干酪乳杆菌CGMCC No.15149发酵酸奶
嗜热链球菌CGMCC NO.15148和干酪乳杆菌CGMCC NO.15149应用于酸奶发酵时可提高酮类化合物的含量。
1、该发酵剂在发酵过程中酮类化合物的含量
(1)GC-MS测酸奶中酮类化合物含量
气谱条件：Rtx-WAX毛细管(30m×0.25mm，0.25mm)；进样口温度225℃，分流比10，流速1mL/min，载气为氦气；程序升温：初始温度30℃，保持3min；15℃/min升温至225℃，保持5min。
质谱条件：离子化方式EI，发射能量70eV，发射电流200μA，检测器电压1.4kV，离子源温度240℃，接口温度230℃，四级杆温度150℃，质量扫描范围m/z 30-500。在NIST 2001标准谱库的检索及标准品比对进行物质定性，用峰面积归一化法定量。
(2)酸奶的模拟发酵
将-80℃保存的本发明嗜热链球菌CGMCC NO.15148和干酪乳杆菌CGMCC NO.15149分别接种于MRS液体培养基中，在37℃下培养24h，传代培养2-3次，至108-109cfu/mL。分别取菌液60μL接种于顶空气相瓶内(含6mL 11％脱脂乳中)，置于42℃下培养6h，测其挥发性风味物质含量。
(3)发酵6h酸奶酮类化合物的含量
发酵6h酸奶酮类化合物的含量如表1和图1所示。由表1可知，嗜热链球菌CGMCCNO.15148和干酪乳杆菌CGMCC NO.15149按数量比1:1接入灭菌后的脱脂乳中进行发酵，产生的酮类化合物含量较高为629.78μg/kg，而单独添加CGMCC NO.15148和单独添加CGMCCNO.15149产生的酮类化合物含量分别为172.12μg/kg、293.73μg/kg(控制不同实验组的发酵剂总量基本一致)。发酵剂CGMCC NO.15148-CGMCC NO.15149产生的酮类化合物的含量远高于单菌CGMCC NO.15148和CGMCC NO.15149发酵的酮类化合物的含量。
表1发酵6h酸奶酮类化合物的含量(μg/kg)
注：不同字母表示同一列间的差异性(P﹤0.05)
2、酮香型酸奶发酵过程中的pH变化
将-80℃保存的本发明嗜热链球菌CGMCC NO.15148和干酪乳杆菌CGMCC NO.15149接种于MRS液体培养基中，在37℃下培养24h，传代培养2-3次，至108-109cfu/mL。分别取菌液60μL接种于6mL 11％脱脂乳的小烧杯中，置于42℃下培养6h，每隔2h取一瓶样品，测其pH变化。实验结果如表2及图2所示。由表2可知，同时添加CGMCC NO.15148-CGMCC NO.15149在6h内pH降到4.63，单独采用CGMCC NO.15148发酵剂pH降低到4.61，而单独采用CGMCCNO.15149pH才降到6.12(控制不同实验组的发酵剂总量基本一致)。发酵6hCGMCCNO.15148-CGMCC NO.15149和CGMCC NO.15148发酵剂达到了发酵终点，而CGMCC NO.15149的产酸能力弱。
表2酮香型酸奶发酵过程中的pH变化
注：不同字母表示同一列间的差异性(P﹤0.05)
3、酮香型酸奶发酵过程中可滴定酸度变化
将-80℃保存的本发明嗜热链球菌CGMCC NO.15148和干酪乳杆菌CGMCC NO.15149接种于MRS液体培养基中，在37℃下培养24h，传代培养2-3次，至108-109cfu/mL。分别取菌液60μL接种于6mL11％脱脂乳的小烧杯中，置于42℃下培养6h，每隔2h取一瓶样品，测其滴定酸度的变化。实验结果如表3及图3所示。由表3可知，同时添加CGMCC NO.15148-CGMCCNO.15149在6h内滴定酸度为80.91°T，单独采用CGMCC NO.15148滴定酸度为77.53°T，单独采用CGMCC NO.15149滴定酸度为28.79°T(控制不同实验组的发酵剂总量基本一致)。由此可见，发酵6h CGMCC NO.15148-CGMCC NO.15149和CGMCC NO.15148达到发酵终点，CGMCCNO.15148-CGMCC NO.15149发酵剂产酸能力最强。
表3不同发酵时间段的滴定酸度变化(°T)
注：不同字母表示同一列间的差异性(P﹤0.05)
实施例4发酵剂CGMCC NO.15148-CGMCC NO.15149在酸奶中的应用方法
本发明酮香型酸奶的制备方法包括以下步骤：
(1)脱脂乳制备：将脱脂乳粉溶于水中配置成质量含量11％的脱脂乳；
(2)均质：均质的压力为14MPa，温度为85℃；
(3)巴氏杀菌：在74℃下巴氏杀菌30min；
(4)接种：酸奶冷却到21℃，投入重量比为0.05％的CGMCC NO.15148-CGMCCNO.15149直投式发酵剂，搅拌均匀，在42℃下发酵6h；直投式发酵剂是将嗜热链球菌CGMCCNO.15148和干酪乳杆菌CGMCC NO.15149的浓度调整至109cfu/mL以上，经冷冻干燥处理后得到，搅拌均匀，在42℃下发酵6h；
(5)发酵至终点时酸度值为60°T以上，pH为4.50，凝乳后在3℃下过夜放置，并保持24h。
上述制备方法制得的酮香型酸奶的酮类化合物的含量为629.78μg/kg，奶香味和果香味浓郁
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种酮香型酸奶的制备方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
agagtttgat cctggcctca 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 1412
<212> DNA
<213> Streptococcus thermophilus 16S rDNA
<400> 3
cggctggctc caaaggttac ctcaccgact tcgggtgtta caaactctcg tggtgtgacg 60
ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcggcg tgctgatccg cgattactag 120
cgattccgac ttcatgtagg cgagttgcag cctacaatcc gaactgagat tggctttaag 180
agattagctc gccgtcaccg actcgcaact cgttgtacca accattgtag cacgtgtgta 240
gcccaggtca taaggggcat gatgatttga cgtcatcccc accttcctcc ggtttattac 300
cggcagtctc gctagagtgc ccaactgaat gatggcaact aacaataggg gttgcgctcg 360
ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acaaccatgc accacctgtc 420
accgatgtac cgaagtaact ttctatctct agaaatagca tcgggatgtc aagacctggt 480
aaggttcttc gcgttgcttc gaattaaacc acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt 540
caattccttt gagtttcaac cttgcggtcg tactccccag gcggagtgct taatgcgtta 600
gctgcggcac tgaatcccgg aaaggatcca acacctagca ctcatcgttt acggcgtgga 660
ctaccagggt atctaatcct gttcgctccc cacgctttcg agcctcagcg tcagttacag 720
accagagagc cgctttcgcc accggtgttc ctccatatat ctacgcattt caccgctaca 780
catggaattc cactctcccc ttctgcactc aagtttgaca gtttccaaag cgaactatgg 840
ttgagccaca gcctttaact tcagacttat caaaccgcct gcgctcgctt tacgcccaat 900
aaatccggac aacgctcggg acctacgtat taccgcggct gctggcacgt agttagccgt 960
ccctttctgg taagctaccg tcacagtgtg aactttccac tctcacaccc gttcttgact 1020
tacaacagag ctttacgatc cgaaaacctt cttcactcac gcggcgttgc tcggtcaggg 1080
ttgcccccat tgccgaagat tccctactgc tgcctcccgt aggagtctgg gccgtgtctc 1140
agtcccagtg tggccgatca ccctctcagg tcggctatgt atcgtcgcct aggtgagcca 1200
ttacctcacc tactagctaa tacaacgcag gtccatcttg tagtggagca attgcccctt 1260
tcaaataaat gacatgtgtc atccattgtt atgcggtatt agctatcgtt tccaatagtt 1320
atcccccgct acaaggcagg ttacctacgc gttactcacc cgttcgcaac tcatccaaga 1380
agagcaagct cctctcttca gcgttctact gc 1412
<210> 4
<211> 429
<212> DNA
<213> Lactobacillus casei 16S rDNA
<400> 4
ctctgccgac cattcttctc caacaacaga gttttacgac ccgaaagcct tcttcactca 60
cgcggcgttg ctccatcaga cttgcgtcca ttgtggaaga ttccctactg ctgcctcccg 120
taggagtttg ggccgtgtct cagtcccaat gtggccgatc aacctctcag ttcggctacg 180
tatcatcgcc ttggtgagcc attacctcac caactagcta atacgccgcg ggtccatcca 240
aaagcgatag cttacgccat ctttcagcca agaaccatgc ggttcttgga tctatgcggt 300
attagcatct gtttccaaat gttatccccc acttaagggc aggttaccca cgtgttactc 360
acccgtccgc cactcgttcc atgttgaatc tcggtgcaag caccgatcat caacgagaac 420
tcgttcgac 429
Claims (9)
1.一种酮香型酸奶的制备方法，其特征在于，所述方法以脱脂乳为原料，经均质、杀菌后冷却，嗜热链球菌CGMCC NO.15148和干酪乳杆菌CGMCC NO.15149按1:1接入灭菌后的脱脂乳中进行发酵。
2.根据权利要求1所述的酮香型酸奶的制备方法，其特征在于，所述脱脂乳通过将质量比为10-12％的脱脂乳粉溶于水中配制得到。
3.根据权利要求1所述的酮香型酸奶的制备方法，其特征在于，所述均质的压力为14-21MPa，温度为40-85℃。
4.根据权利要求1所述的酮香型酸奶的制备方法，其特征在于，所述杀菌为74-82℃下巴氏杀菌30min或85℃下高温短时杀菌25-60s。
5.根据权利要求1所述的酮香型酸奶的制备方法，其特征在于，将嗜热链球菌CGMCCNO.15148和干酪乳杆菌CGMCC NO.15149菌株在改良MRS培养基中活化，然后按2-5％的总体积比加入到杀菌后的含糖脱脂牛乳中。
6.根据权利要求1所述的酮香型酸奶的制备方法，其特征在于，将嗜热链球菌CGMCCNO.15148和干酪乳杆菌CGMCC NO.15149直投式发酵剂按0.05-0.2％的总重量比加入到杀菌后的含糖脱脂牛乳中。
7.根据权利要求7所述的酮香型酸奶的制备方法，其特征在于，直投式发酵剂是将嗜热链球菌CGMCC NO.15148和干酪乳杆菌CGMCC NO.15149的浓度调整至109cfu/mL以上，经冷冻干燥处理后得到。
8.根据权利要求1所述的酮香型酸奶的制备方法，其特征在于，所述发酵的温度为40-42℃，时间为4-6h。
9.权利要求1-8任一项所述的制备方法制得的酮香型酸奶。
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| CN103749714A (zh) * | 2011-10-19 | 2014-04-30 | 刘念 | 益生乳酸菌作为发酵剂的食品制作方法 |
| CN108148775A (zh) * | 2017-12-26 | 2018-06-12 | 光明乳业股份有限公司 | 一株高产胞外多糖的嗜热链球菌、保存培养方法及利用该嗜热链球菌制备发酵乳的方法 |
| CN108157504A (zh) * | 2017-12-22 | 2018-06-15 | 光明乳业股份有限公司 | 一种零脂肪高蛋白发酵乳及其生产方法 |
-
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
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| 寇晓虹等: "酮香型羊酸奶的研制及与牛酸奶风味物质的比较", 《食品工业科技》 * |
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