CN109078014A - 3,4-二甲氧基苯亚甲基哌啶酮类似物在制备抗肺癌药物中的应用 - Google Patents

3,4-二甲氧基苯亚甲基哌啶酮类似物在制备抗肺癌药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属药物化学领域，具体涉及一类3，4‑二甲氧基苯亚甲基哌啶酮类似物在抗肺癌药物的应用。这些化合物能通过诱导ROS的产生从而激活JNK信号通路并同时抑制NF‑κB通路发挥抗肺癌作用。此外，这些化合物具有良好的化疗増敏作用，与抗肺癌用药顺铂或5‑氟尿嘧啶联用，能明显增强它们的疗效。

Description

3，4-二甲氧基苯亚甲基哌啶酮类似物在制备抗肺癌药物中的 应用
技术领域
本发明属药物化学领域，具体而言，本发明涉及一类3，4-二甲氧基苯亚甲基 哌啶酮类似物在制备抗肺癌药物的应用，它们通过诱导ROS的产生从而激活 JNK及抑制NF-κB信号通路达到很好的抗肺癌作用，且这些化合物具有较好的 化疗增敏作用。
背景技术
化疗仍然是目前治疗肺癌的主要方式，但由于化疗药物具有毒副作用和耐受 性差等原因，限制了它们对于肺癌患者的使用。因此，寻找高效低毒的、未开发 的化疗药物，仍然是一个巨大的挑战。含哌啶酮结构的类似物，由于具有较好的 药理学活性，受到越来越多学者的青睐。例如，中国专利申请CN201610045908.3 号发现含哌啶酮结构的药物具有高效广谱的抗炎作用。
EF24是一种含哌啶酮结构的类似物，也是目前用于抗肿瘤研究的“明星药 物”。但EF24具有较大的毒性，这可能是EF24临床发展受限的因素之一。通过本 发明人的不懈努力，在没有结构-功能定向启示的情况下，从大量的化合物中获 得了特定的化合物，发现了多个毒性明显低于EF24的3，4-二甲氧基苯亚甲基哌啶 酮类似物，具有很好的抗肺癌的作用。
此外，通过对活性化合物5B的抗肺癌机制进行研究，本发明人发现5B能通 过诱导ROS的产生以激活JNK信号通路并同时抑制NF-κB通路发挥抗肺癌作用， 该机制目前在哌啶酮类似物中尚无报道，也无相关的中国专利。并且，化合物5B 与抗肺癌临床一线药物顺铂或5-氟尿嘧啶联用，表现出很好的化疗增敏作用。因 而，化合物5B有望成为高效低毒的抗肺癌治疗药物。
发明内容
本发明目的在于提供高效低毒的3，4-二甲氧基苯亚甲基哌啶酮类似物用于 抗肺癌药物的应用，并以此提供一种用于治疗肺癌的药物组合物，其含有治疗有 效量的作为活性成分的所述的3，4-二甲氧基苯亚甲基哌啶酮类似物中的任何一 种或多种或其可药用盐及其药用辅料。
本发明的第一方面，发明人从多个哌啶酮类似物中筛选出了高效低毒的3，4- 二甲氧基苯亚甲基哌啶酮类似物。
本发明的第二方面，发明人研究了活性化合物发挥抗肺癌作用的分子机制。 活性化合物能诱导ROS的产生从而激活JNK信号通路并同时抑制NF-κB通路发挥 抗肺癌作用。
本发明的第三方面，发明人研究了活性化合物在抗肺癌应用中的化疗增敏 作用。化合物与抗肺癌用药顺铂或5-氟尿嘧啶联用，能明显增强它们的疗效。
具体而言，本发明设计合成所述3个哌啶酮类似物(5B、6B、13B)，及其 它对照化合物结构如下(实施例1)：
其中3A的分子式为C25H29NO7，化学名称为：3，5-bis((E)-3，4，5-trimethoxybenzylidene)piperidin-4-one。4A的分子式为C23H25NO5，化学名称为： 3，5-bis((E)-3，4-dimethoxybenzylidene)piperidin-4-one。5B的分子式为C28H31NO7， 化学名称为：1-methyl-3，5-bis((E)-3，4，5-trimethoxybenzylidene)piperidin-4-one。6B 的分子式为C24H27NO5，化学名称为：3，5-bis((E)-3，4-dimethoxybenzylidene)-1-methylpiperidin-4-one。7B的分子式为C27H33NO7，化学名称为：1-ethyl-3，5-bis((E)- 3，4，5-trimethoxybenzylidene)piperidin-4-one。8B的分子式为C25H29NO5，化学名 称为：3，5-bis((E)-3，4-dimethoxybenzylidene)-1-ethylpiperidin-4-one。9B的分子式 为C26H31NO5，化学名称为：3，5-bis((E)-3，4-dimethoxybenzylidene)-4-methylene- 1-propylpiperidine。10B的分子式为C28H33NO8，化学名称为：1-propionyl-3，5- bis((E)-3，4，5-trimethoxybenzylidene)piperidin-4-one。11B的分子式为C29H33NO10， 化学名称为：4-oxo-4-(4-oxo-3，5-bis((E)-3，4，5-trimethoxybenzylidene)piperidin- 1-yl)butanoic acid。12B的分子式为C32H32FNO8，化学名称为：1-(2-fluorobenzoyl)- 3，5-bis((E)-3，4，5-trimethoxybenzylidene)piperidin-4-one。13B的分子式为 C29H35NO8，化学名称为：1-isobutyryl-3，5-bis((E)-3，4，5-trimethoxybenzylidene) piperidin-4-one。
实验结果表明，同其它化合物(F35、F36、7B、8B、9B、10B、11B、12B)、 阳性对照药姜黄素(curcumin)和EF24相比，5B、6B和13B对4种肺癌细胞 株H460、A549、H1650和H1975具有较好的体外抑制活性，且在肺癌细胞与正 常细胞HL7702间表现出较好的选择性。尤其5B表现相对最佳的抑制活性和选 择性，分别对H460、A549、H1650和H1975细胞的IC50值的范围在1.0±0.3， 1.7±0.2，1.5±0.1，1.0±0.6μM，选择系数分别为1.42、1.19、1.25、1.42，强于阳 性对照药姜黄素和EF24(实施例2)。
同时，进一步的急毒实验结果表明5B在体内也表现出低于EF24及F35的 毒性(实施例3)。
而且，细胞周期实验发现用5B处理的A549细胞可以使G2/M期的DNA含 量增加，即5B可以阻滞G2/M期(实施例4)。Hoechst 33258染色及流式凋亡实 验发现5B能浓度依赖性的诱导细胞凋亡的形态学变化并增加凋亡的数量。通过 检测凋亡相关蛋白Cle-PARP和Bax的表达，进一步说明5B能诱导凋亡的发生 (实施例5)。
接着，通过流式细胞仪检测发现，A549细胞经5B孵育后能明显升高细胞 内ROS的水平，且在化合物处理9小时后ROS水平达到最高。选用化合物作用 9小时后进行实验，发现5B能浓度依赖性的升高ROS的水平，且ROS的抑制 剂NAC能逆转5B的作用。经NAC处理后，由5B诱导的凋亡同样受到抑制， 这说明5B能通过诱导ROS的产生发挥抗肺癌作用(实施例6)。进一步地，通 过western blot实验发现5B能激活JNK信号通路，且5B的激活作用能同时被JNK信号通路的抑制剂SP600125及NAC逆转。通过流式凋亡实验发现SP600125 同样能逆转5B的促凋亡作用，表明5B能通过上调ROS的产生从而激活JNK 信号通路发挥抗肺癌作用(实施例7)。于此同时，westernblot实验表明5B能浓 度依赖性的抑制IκBα的降解，且5B对转染有高表达IKK质粒细胞的抑制活性 低于仅转染有空载体的细胞，这明显5B能通过抑制NF-κB通路发挥抗肺癌作用。 A549细胞经NAC预处理后，通过western blot实验还发现NAC能逆转5B对IκBα 降解的抑制作用(实施例8)。以上结果表明，5B能通过上调ROS的产生从而 激活JNK并抑制NF-κB通路发挥抗肺癌作用。
最后通过western blot实验发现顺铂在作用浓度为20/3μM时能明显激活 NF-κB通路，而作为具有NF-κB通路抑制作用的5B能明显逆转顺铂的作用。通 过集落形成实验还发现，5B与顺铂联用能明显增强顺铂的疗效。另外，5B与5- 氟尿嘧啶联用也表现出很好的联合作用(实施例9)。
综上所述，我们的研究结果表明，哌啶酮类似物5B不仅毒性较低，且能通 过诱导ROS的产生以激活JNK并抑制NF-κB通路发挥抗肺癌作用，与肺癌一线 用药顺铂或5-氟尿嘧啶联用具有很好的疗效，具有开发为抗肺癌药物的前景。
因此，作为优选，本发明提供了一种高效低毒的哌啶酮类似物5B在制备抗 肺癌药物中的应用，所述的抗肺癌药物通过诱导ROS的产生以激活JNK及抑制NF-κB信号通路而发挥治疗肺癌的作用，通过与肺癌一线用药顺铂或5-氟尿嘧 啶联用而发挥增敏肺癌治疗的作用。
本发明还提供了一种用于治疗肺癌的药物组合物，其含有治疗有效量的活性 成分和药用辅料，所述活性成分至少含有以上所述3个哌啶酮类似物或其可药用 盐及其药用辅料。作为优选，所述的活性成分同时含有所述3个哌啶酮类似物中 的任何一种或多种。
本文中所用“药用辅料”指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂如淀粉、 蔗糖、糊精、乳糖、预胶化淀粉、微晶纤维素、磷酸钙等；润湿剂如蒸馏水、乙 醇；粘合剂如淀粉浆、纤维素衍生物、聚维酮、明胶、聚乙二醇、海藻酸钠溶液 等；崩解剂如干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羌丙基纤维素、泡腾崩解剂等；润 滑剂如硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇类、十二烷基硫酸 钠等；着色剂如二氧化钛、日落黄、亚甲蓝、药用氧化铁红等；另外还可以在组 合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如 使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。所述药物的制剂 形式包括颗粒剂、注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、软膏 剂、控释或缓释剂或纳米制剂。本发明可以组合物的形式通过口服，鼻吸入、直 肠或者肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成 常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或 其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、 水或油性悬浮剂等。
下面将结合实施例及说明书附图详细说明本发明。
附图说明
图1哌啶酮类似物的合成路径和条件。
图2哌啶酮类似物抑制肺癌细胞及正常细胞生长的半数生长抑制浓度(IC50) 值及细胞间的选择系数。
图3化合物5B在体内表现出低于EF24和F35的毒性的比较图。(A)C57BL/6 小鼠通过腹腔给药后15天内体重的变化。药物设置分组为溶剂组(6％的蓖麻油)， 5B给药组，EF24给药组，F35给药组。(B)C57BL/6小鼠通过灌胃方式给药， 在给药后14天内持续观测小鼠体重变化。药物设置分组为溶剂组(0.5％的羧甲 纤维素钠)，5B给药组，EF24给药组。
图4化合物5B对A549细胞中细胞周期进程的影响图。(A)用5B处理细 胞10小时，然后用碘化丙啶染色法分析细胞周期分布，并通过流式细胞术检测 相关细胞周期分布情况。(B)每个数据文件收集8000个细胞的数据。通过使用 (BDBiosciences，CA)计算G1，S和G2/M期细胞群体的百分比。(C)计算经 过不同浓度的5B作用后，G2/M期内DNA含量。*,p<0.05；**,p<0.01；***, p<0.001，vs DMSO。
图5化合物5B促进A549细胞凋亡的说明图。(A-B)5B诱导A549细胞凋 亡形态学的变化及凋亡数量的变化。(C)计算图(B)中经Annexin V/PI双染后 凋亡的数量。(D-E)A549细胞经5B和BMS345541处理24小时后，凋亡相关 蛋白Cle-PARP和Bax的表达变化情况。*,p<0.05，vs DMSO。
图6化合物5B通过上调ROS的产生诱导凋亡的测试图。(A-B)A549细胞 经5B(10μM)作用不同时间后或经不同浓度的5B作用9小时后ROS的水平 变化。(C)A549细胞经/未经NAC(5mM)预孵1小时后给药(5B)处理9小 时。通过流式细胞仪检测ROS的水平。(D)ROS水平的下调对细胞凋亡的影响。 A549细胞经/未经NAC(5mM)预孵1小时后给药(5B)处理24小时。通过流式细胞仪检测细胞凋亡的比例。*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001，vs DMSO。#,p<0.05；##,p<0.01，vs 5B。
图7化合物5B通过上调ROS的产生激活JNK信号通路诱导凋亡的测试图。 (A-B)A549细胞经5B(10μM)作用不同时间后或经不同浓度的5B作用6小 时后，通过western blot检测p-JNK的表达情况。(C-D)A549细胞经/未经 SP600125(10μM)或NAC(5mM)作用1小时后给药(5B)处理6小时，通 过western blot检测p-JNK的表达情况。(E)阻滞JNK信号通路能削弱由5B诱 导的细胞凋亡。A549细胞经/未经SP600125(10μM)作用1小时后给药(5B， 10μM)处理24小时，通过流式细胞仪检测细胞凋亡的比例。(F)计算图(E) 中细胞凋亡的比例。*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001，vs DMSO。#,p<0.05； ##,p<0.01，vs 5B。
图8化合物5B通过上调ROS的产生抑制NF-κB信号通路诱导凋亡的测试 图。(A)A549细胞经过不同浓度的5B或BMS345541(20μM)预处理1小时后， 再加TNFα(1ng/mL)刺激15分钟。通过western blot检测IκBα的表达情况。(B) 通过转染实验将IKK-载体复合物转入A549细胞中，通过western blot检测转染 效价。(C)将转染有IKK-载体复合物的细胞及仅转染有空载体的细胞分别加入 5B(60,20,6.67μM)处理24小时。通过MTT法检测5B对不同细胞生存率的 抑制情况。(D)A549细胞经/未经NAC(5mM)作用1小时后给药(5B，10μM) 处理1小时，通过western blot检测IκBα的表达情况。**,p<0.01，vs DMSO。 #,p<0.05，vs 5B。
图9化合物5B对顺铂或5-氟尿嘧啶的化疗増敏作用的实验图。(A)A549 细胞通过不同浓度的顺铂(Pt)作用24小时，或用TNFα(1ng/mL)刺激15分 钟，通过western blot检测IκBα的表达情况。(B)A549细胞经过不同浓度的5B 或BMS345541(20μM)预处理1小时后，再加Pt(20/3μM)作用24小时。通 过western blot检测p-IKKβ的表达情况。(C)通过集落形成实验分析不同浓度 的5B，Pt和5-氟尿嘧啶(5-Fu)对A549细胞凋亡的影响及它们的联合效果。(D) 分析计算图(C)中化合物相对于DMSO组的抑制效果。*,p<0.05；**,p<0.01， vsDMSO。#,p<0.05；##,p<0.01；###,p<0.001，vs(DMSO+Pt)。
具体实施方式
本发明在以下的实施例中进一步说明。这些实施例只是为了说明的目的，而 不是用来限制本发明的范围。
实施例1化合物的合成
(1)化合物F35，F36的一般合成步骤
在搅拌状态下，将4-哌啶酮盐酸盐水合物(5.0mmol)和芳基醛(10.0mmol 3，4，5-三甲氧基苯甲醛，3，4-二甲氧基苯甲醛)溶于乙醇和水(10∶1)的混合溶剂 中，滴加40％NaOH水溶液催化。在室温下搅拌12小时，期间有沉淀生成。过 滤并用水洗涤后，用乙醇重结晶，得到所需产物。
(2)化合物5B-13B的一般合成步骤
在搅拌状态下，将NaH(60％矿物油分散液，2.0mmol)加入于冰浴中冷却 的F35或F36(2.0mmol)的无水THF(10.0mL)溶液中。所得混合物在室温 条件下搅拌30分钟后，滴加含不同烷基卤或酰氯(3.0mmol)的无水THF(3.0 mL)溶液。待完全反应后，减压蒸发。粗产物通过硅胶色谱纯化，使用己烷和 乙酸乙酯的流动相梯度洗脱，纯化获得所需产物5B-13B。F35(3A)，F36(4A)和5B-13B的理化性质如下所述：
阳性对比化合物3A：3，5-bis((E)-3，4，5-trimethoxybenzylidene)piperidin-4-one(3A)： yellow powder，68.8％yield，mp 191.7-194.1℃(Lit[24]193.7-194.0℃).1H-NMR (CDCl3)δ：7.751(s，2H，H-α×2)，6.643(s，4H，H-2，H-6×2)，4.220(d，J＝1.2Hz，4H，CH2×2)，3.912(d，J＝5.4Hz，18H，3-OCH3，4-OCH3，5-OCH3×2).LC-MS m/z：456.20， calcdfor C25H29NO7：455.19.
阳性对比化合物4A：3，5-bis((E)-3，4-dimethoxybenzylidene)piperidin-4-one(4A)： yellow powder，78.7％yield，mp 159.2-161.2℃(Lit[24]162.2-165.4℃). 1H-NMR(CDCl3)δ：7.758(s，2H，H-α×2)，7.008(d，J＝8.4Hz，2H，H-2×2)， 6.908-6.933(m，4H，H-5，H-6×2)，4.191(s，4H，CH2×2)，3.895-3.947(m，12H， 4-OCH3，3-OCH3×2).LC-MS m/z：396.29，calcd for C23H25NO5：395.17.
有效化合物5B：1-methyl-3，5-bis((E)-3，4，5-trimethoxybenzylidene)piperidin-4-one (5B)：yellow powder，45.9％yield，mp 143.7-146.0℃ Lit[48].1H-NMR(CDCl3)6： 7.768(s，2H，H-α×2)，6.647(s，4H，H-2，H-6×2)，3.917(d，J＝5.4Hz，18H，3-OCH3， 4-OCH3，5-OCH3×2)，3.818(s，4H，CH2×2)，2.497(s，3H，CH3).LC-MS m/z：470.29，calcd for C28H31NO7：469.21.
有效化合物6B：3，5-bis((E)-3，4-dimethoxybenzylidene)-1-methylpiperidin-4-one (6B)：yellow powder，59.7％yield，mp 158.8-161.8℃(Lit[24]157.3-159.4℃).1H-NMR(CDCl3)6：7.784(s，2H，H-α×2)，7.029(d，J＝8.4Hz，2H，H-6×2)，6.949(t， J＝19.8Hz，4H，H-2，H-5×2)，3.940(d，J＝9.0Hz，12H，3-OCH3，4-OCH3×2)，3.808(s， 4H，CH2×2)，2.506(s，3H，CH3).LC-MS m/z：410.26，calcd for C24H27NO5：409.19.
对比化合物7B：1-ethyl-3，5-bis((E)-3，4，5-trimethoxybenzylidene)piperidin-4-one (7B)：yellow powder，65.9％yield，mp 150.3-153.2℃ Lit[48].1H-NMR(CDCl3)6： 7.762(s，2H，H-α×2)，6.642(s，4H，H-2，H-6×2)，3.892(t，J＝17.4Hz，22H，3-OCH3， 4-OCH3，5-OCH3×2，CH2×2)，2.634(d，J＝7.2Hz，2H，CH2)，1.089(t，J＝13.8Hz，3H，CH3).LC-MS m/z：484.45，calcd for C27H33NO7：483.23.
对比化合物8B：3，5-bis((E)-3，4-dimethoxybenzylidene)-1-ethylpiperidin-4-one(8B)： yellow powder，57.3％yield，mp 186.1-187.4℃(Lit[24]188.7-190.8℃).1H-NMR (CDCl3)δ：7.799(s，2H，H-α×2)，7.035-7.052(m，2H，H-2×2)，6.977(d，J＝1.8Hz，2H， H-6×2)，6.947(d，J＝8.4Hz，2H，H-5×2)，3.944(t，J＝10.2Hz，12H，3-OCH3， 4-OCH3×2)，3.878(s，4H，CH2×2)，2.637-2.673(m，2H，CH2)，1.107(t，J＝14.4Hz，3H， CH3).LC-MSm/z：424.35，calcd for C25H29NO5：423.20.
对比化合物9B：3，5-bis((E)-3，4-dimethoxybenzylidene)-4-methylene-1-propylpiperidine(9B)：yellow powder，58.6％yield，mp 166.5-167.6℃(Lit[24]162.7-165.2℃).1H-NMR(CDCl3)δ：7.769(s，2H，H-α×2)，7.022(dd，J＝1.8，8.4Hz， 2H，H-6×2)，6.955(d，J＝1.2Hz，2H，H-2×2)，6.926(d，J＝8.4Hz，2H，H-5×2)，3.952(s， 6H，3-OCH3×2)，3.924(s，6H，4-OCH3×2)，3.854(s，4H，CH2×2)，2.520(t，J＝18.4Hz， 2H，CH2)，1.502-1.463(m，2H，CH2)，0.884(t，J＝7.2Hz，3H，CH3).LC-MS m/z： 438.25，calcd forC26H31NO5：437.22.
对比化合物10B：1-propionyl-3，5-bis((E)-3，4，5-trimethoxybenzylidene)piperidin-4- one(10B)：yellow powder，55.6％yield，mp 165.9-167.9℃.1H-NMR(CDCl3)δ： 7.800(d，J＝33.0Hz，2H，H-α×2)，6.752(s，2H，H-2×2)，6.625(s，2H，H-6×2)，4.971(s， 2H，CH2)，4.774(s，2H，CH2)，3.937(d，J＝13.2Hz，18H，3-OCH3，4-OCH3， 5-OCH3×2)，2.271-2.234(m，2H，CH2)，1.073(t，J＝15.0Hz，3H，CH3).LC-MS m/z： 512.25，calcd forC28H33NO8：511.22.
阴性对比化合物11B：4-oxo-4-(4-oxo-3，5-bis((E)-3，4，5-trimethoxybenzylidene) piperidin-l-yl)butanoic acid(11B)：yellow powder，60.4％yield，mp 171.5-174.4℃. 1H-NMR(CDCl3)δ：7.689(d，J＝18.6Hz，2H，H-α×2)，6.871(d，J＝9.0Hz，4H，H-2， H-6×2)，4.988(d，J＝22.8Hz，4H，CH2×2)，3.909(d，J＝6.0Hz，12H，3-OCH3， 5-OCH3×2)，3.780(d，J＝16.2Hz，6H，4-OCH3×2)，2.579-2.600(m，2H，CH2)， 2.480-2.527(m，2H，CH2).LC-MS m/z：556.36，calcd for C29H33NO10：555.21.
对比化合物12B：1-(2-fluorobenzoyl)-3，5-bis((E)-3，4，5-trimethoxybenzylidene) piperidin-4-one(12B)：yellow powder，65.6％yield，mp175.6-176.2℃.1H-NMR (CDCl3)δ：7.762(s，1H，H-6’)，7.620(s，1H，H-4’)，7.331-7.369(m，1H，H-α)， 7.263-7.290(m，1H，H-α’)，7.077-7.104(m，1H，H-5’)，7.304(t，J＝18.6Hz，1H，H-3’)， 6.951(s，2H，H-2×2)，6.582(s，2H，H-6×2)，5.162(s，2H，CH2)，4.790(s，2H，CH2)，3.935(s，6H，4-OCH3×2)，3.781(t，J＝34.2Hz，12H，3-OCH3，5-OCH3×2).LC-MS m/z：578.28，calcd for C32H32FNO8：577.21.
有效化合物13B：1-isobutyryl-3，5-bis((E)-3，4，5-trimethoxybenzylidene)piperidin- 4-one(13B)：yellow powder，43.6％yield，mp 152.6-156.0℃.1H-NMR(CDCl3)δ： 7.809(d，J＝33.0Hz，2H，H-α×2)，6.744(s，2H，H-2×2)，6.636(s，2H，H-6×2)，4.971(s， 2H，CH2)，4.832(s，2H，CH2)，3.937(d，J＝13.8Hz，18H，3-OCH3，4-OCH3，5-OCH3×2)，2.626-2.670(m，2H，CH2)，1.043(d，J＝7.2Hz，6H，CH3×2).LC-MS m/z： 526.34，calcd forC29H35NO8：525.24.
实施例2哌啶酮类似物对肺癌细胞和正常细胞的体外抑制活性及选择性
将H460，A549，H1650，H1975和HL7702细胞以每孔4000个细胞接种在 96孔板中24小时。肺癌细胞和正常细胞与不同浓度的化合物(60，20，20/3， 20/9，20/27μM)孵育72小时后，将磷酸盐缓冲溶液(PBS)制备的MTT溶液 (5mg/mL)在37℃下加入各孔中的细胞，再处理4小时。然后吸出MTT，每 孔加入150μL DMSO，震动10分钟，最后在490nm纳米波长下用酶标仪定量 (SpectraMax M2/M2e，Molecular Devices，Sunnyvale，USA)测定OD值。通 过与溶剂组的比较来计算药物生长抑制率的百分比。通过GraphPad Pro 5.0计算 每个化合物的IC50值(San Diego，CA)，并根据选择系数(SI)＝log[IC50(正常 细胞)/IC50(肺癌细胞)]分别计算化合物在四种肺癌细胞中的选择性，结果见 图2。
实施例3 5B在体内表现出低于EF24和F35的毒性
C57BL/6小鼠购买自SHANGHAI SLAC并在标准饲养条件下观察一周。将 老鼠随机分组，并分别通过腹腔注射和灌胃两种方式给药。腹腔注射组给药方式 为：溶剂组(6％的蓖麻油)，5B给药组(1g/kg)，EF24给药组(1g/kg)，F35 给药组(1g/kg)。灌胃组给药方式为：溶剂组(0.5％的羧甲纤维素钠)，5B给药 组(1g/kg)，EF24给药组(1g/kg)。通过两种方式给药后分别观察小鼠的体重 变化，结果见图3，其中(A)表示通过腹腔注射给药的结果，(B)表示通过灌 胃方式给药的结果。
实施例4 5B处理A549细胞使G2/M期阻滞
将A549细胞(6×105个细胞/孔)接种在6孔板中。用5B，BMS345541和 载体(DMSO)处理细胞10小时，用PBS洗涤，固定在75％冰冷的乙醇中4小 时。然后将细胞用含有核糖核酸酶(550825，BD Biosciences 35Clontech，San Jose， CA，USA)的500μL碘化丙啶(PI)在4℃远离光线染色10分钟，并用200 目纱布过滤。在FACS Calibur流式细胞仪(BDBiosciences，CA)中进行细胞周 期分析，结果见图4，其中(A)表示用5B处理细胞10小时，然后用碘化丙啶 染色法分析细胞周期分布，并通过流式细胞术检测相关细胞周期分布情况。(B) 表示每个数据文件收集8000个细胞的数据，通过使用(BDBiosciences，CA)计 算G1，S和G2/M期细胞群体的百分比，其中，最上端表示G2/M期细胞群体的 百分比，中间表示S期细胞群体，最下端表示G1细胞群体的百分比。(C)表示 经过不同浓度的5B作用后，G2/M期内DNA含量。由图4的结果可知，5B处 理的A549细胞可以使G2/M期的DNA含量增加，即5B可以阻滞G2/M期。
实施例5 5B可以诱导A549细胞的凋亡
将A549细胞接种在6孔组织培养板上，用5B，BMS345541和载体(DMSO) 处理细胞24小时，采用不同的方式检测5B对细胞凋亡的影响。结果见图5，其 中，(A)表示细胞作用24小时后，弃培养基，用醋酸-乙醇固定20分钟，用Hoechst 33258工作液在室温下染色15分钟，然后用微观相机系统(Nikon，Tokyo，Japan) 捕获的图像结果。(B)表示细胞作用24小时后，采用无EDTA的胰酶消化，并 在避光条件下用AnnexinV(3μL)和PI(1μL)进行双染15分钟，然后用流式 细胞仪(BD Biosciences，CA)检测的凋亡结果图。(C)表示图(B)中经Annexin V/PI双染后凋亡的数量。(D)和(E)表示药物作用24小时后，Cle-PARP和 Bax的表达结果图。
实施例6 5B可以诱导ROS的产生促进凋亡
将A549细胞以6×105个细胞/孔的密度接种到6孔板中，检测经/未经NAC 预处理后5B对ROS产生及细胞凋亡的影响。在检测ROS水平的试验中，细胞 经药物处理达指定的时间后，在避光条件下采用ROS探针(DCF-DA，10μM， 碧云天)预孵30分钟，然后将细胞消化，采用PBS洗涤并上机，所有试验均采 用流式细胞仪进行检测。结果见图6，其中(A)表示经过不同时间处理后，5B 对ROS产生的影响。(B)表示不同浓度的5B作用6小时后对ROS产生的影响。 (C)表示经过NAC预处理后，5B对ROS产生的影响。(D)表示经过NAC预 处理后，5B对细胞凋亡的影响。
实施例7 5B可以通过上调ROS的产生激活JNK信号通路诱导凋亡
将A549细胞以6×105个细胞/孔的密度接种到6孔板中，检测经/未经 SP600125/NAC预处理后5B对JNK通路激活及细胞凋亡的影响。结果见图7， 其中(A)表示经过不同时间处理后，5B对JNK通路的影响。(B)表示不同浓 度的5B作用6小时后对JNK通路的影响。(C)表示经过SP600125预处理后， 5B对JNK通路的影响。(D)表示经过NAC预处理后，5B对JNK通路的影响。 (E)表示经过SP600125预处理后，5B对细胞凋亡的影响。(F)表示图(E) 中细胞凋亡的比例。
实施例8 5B可以通过上调ROS的产生抑制NF-κB信号通路诱导凋亡
将A549细胞接种在6孔组织培养板上，将转染有IKK-载体复合物及空载体 的A549细胞接种在96孔板中(3000个细胞/孔)，经5B处理后检测5B对NF-κB 信号通路的影响。其中，细胞转染实验过程如下：将A549细胞以3×105个细胞/ 孔的密度接种到6孔板中，在开始转染时，将原培养基弃掉，换成饥饿培养基进 行培养。将IKK质粒及空载体(lipofectamine 2000)分别置于饥饿培养基中静置 5分钟，然后将IKK质粒和空载体混合静置20分钟，最后将IKK-载体复合物及 空载体转入细胞，在37℃含5％CO2的培养箱中培养6小时。6小时后，弃原培 养基，换成正常培养基继续培养12小时。结果见图8，其中(A)表示5B对IκBα 降解的抑制作用。(B)表示IKK质粒的转染效率。(C)表示5B分别对转染有 IKK-载体复合物及空载体的A549细胞生存率的影响。(D)表示经过NAC预处 理后，5B对NF-κB通路的影响。
实施例9 5B对顺铂或5-氟尿嘧啶的化疗增敏作用
将A549细胞接种到6孔板中24小时，用顺铂和空白(DMSO)处理24小 时，用TNFα刺激15分钟，检测顺铂对NF-κB通路的影响。接着，通过5B预 处理检测5B对顺铂诱导的NF-κB通路激活的抑制作用。最后，通过集落形成实 验分析5B与顺铂或5-氟尿嘧啶的联合效果。其中，集落实验步骤如下：将A549 细胞以1000个细胞/孔的密度接种到6孔板中24小时，按指定浓度给予5B，顺 铂，5-氟尿嘧啶及联合给药进行培养。药物作用2天后用新鲜的RPMI1640培养 基代替原培养基，8天后，抽吸培养基，用PBS洗涤两次，用4％多聚甲醛固定 15分钟，用PBS洗涤3次，最后用结晶紫染色15分钟，PBS洗涤两次。结果见 图9，其中(A)表示顺铂对IκBα表达的影响。(B)表示5B对顺铂诱导的IKKβ 磷酸化的抑制作用。(C)表示5B与顺铂或5-氟尿嘧啶联用的效果。(D)表示 图(C)中化合物相对于DMSO组的抑制比例。

Claims (8)

1.如下所示的化合物之任一在制备抗肺癌药物中的应用：
2.根据权利要求1所述的应用，其中化合物优选自如下化合物之任一：
3.根据权利要求2所述的应用，其中化合物优选自如下化合物：
4.根据权利要求1、2或3所述的应用，其特征在于，所述抗肺癌药物具有通过诱导ROS的产生以激活JNK及抑制NF-κB信号通路的抗肿瘤作用。
5.权利要求1、2或3所述的化合物或其可药用盐或其它制剂。
6.一种用于治疗肺癌的药物组合物，其含有治疗有效量的权利要求1、2或3所述的化合物或其可药用盐和药用辅料。
7.根据权利要求4所述的药物组合物，其中权利要求1、2或3所述的化合物或其可药用盐作为唯一的活性成分。
8.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物具有如下制剂形式：注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、软膏剂、控释或缓释剂和纳米制剂。
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