CN109069601B - 使用与检查点抑制剂组合的溶瘤病毒的癌症疗法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物组合物，其中，检查点抑制剂与溶瘤病毒组合，并且涉及所述组合用于治疗癌症的用途。

Description

使用与检查点抑制剂组合的溶瘤病毒的癌症疗法
技术领域
本发明涉及药物组合物，其中，检查点抑制剂与溶瘤病毒组合，并且涉及所述组合用于治疗癌症的用途。
背景技术
癌症是全球第二主要死因。据估计，一半的男性和三分之一的女性在其一生中将被诊断出患有某种类型的癌症。此外，由于癌症主要是老化疾病，由于老年人的比例增加，全球癌症死亡人数预计从2007年到2030年将增加约45％(从790万的死亡数到1150万的死亡数)(WHO估计，2008年)。癌症也是最费钱的疾病。美国国家癌症研究所的最新估计显示，2007年美国癌症的总经济成本为2268亿美元，除非有更成功的预防性干预措施，否则将开发早期检测和更有效的治疗，预计这种已经很巨大的经济负担在接下来的二十年中将进一步增加。尽管过去三十年来美国和欧洲5年癌症存活率比例增加证实了在许多形式的癌症的预防、检测、诊断和治疗中有重大进展，但一些肿瘤类型(例如胰腺肿瘤、肝脏肿瘤、肺部肿瘤、脑肿瘤)仍然罕见有效治疗，需要开发新的治疗选择。利用癌症特异性缺陷杀死癌细胞同时不伤害正常细胞的溶瘤病毒迅速成为抗癌的有前途的工具(Breitbach等人，2011；Russell等人，2012)。不少于十二种不同的溶瘤病毒(单独使用或与其他抗癌剂组合使用)目前正在进行针对各种恶性肿瘤的I期至III期临床试验(Russell等人，2012)。其中，溶瘤性大鼠细小病毒H-1PV目前在患有复发性多形性胶质母细胞瘤(GBM)的患者的I/IIa期临床试验中评估安全性和初步的有效性迹象(Geietnekv等人，2012)。
H-1PV是小的(直径～25nm)无包膜二十面体颗粒，含有5.1kb长的单链DNA基因组(Cotmore&Taftersall，2007)。H-1PV的基因组结构由两个启动子(P4早期启动子和P38晚期启动子)控制的两个转录单元组成。P4调控编码非结构化(NS)蛋白(NS1和NS2)的基因的表达，P38调控编码衣壳(VP)蛋白(VP1、VP2、VP3)的表达(Cotmore和Tattersall，2007)。该病毒优选在快速分裂的癌细胞中繁殖。该癌症选择性不是基于癌细胞更好地摄取病毒，而是由于癌细胞过度表达因子(例如病毒DNA复制所需的细胞周期蛋白A、E2F或CREB/ATF)。此外，癌细胞在建立有效的抗病毒免疫应答的能力中通常是有缺陷的，有利于病毒增殖(Nuesch等人，2012)。该病毒已知激活多种细胞死亡途径。根据细胞类型和生长条件，H-1PV可以诱导细胞凋亡(Hristov等人，2010；Ohshima等人，1998；Rayet等人，1998；Ueno等人， 2001)、细胞坏死(Ran等人，1999)、或组织蛋白酶B依赖型细胞死亡(Di Piazza等人，2007)。即使在对TRAIL(肿瘤坏死因子相关的细胞凋亡诱导配体)、顺铂耐受的癌细胞中以及甚至当Bcl-2过度表达时，该病毒也能够诱导溶瘤作用(di Piazza等人，2007)。后者的结果表明，Bcl-2不是细小病毒细胞毒性的负调节剂。近期已经描述了使用细小病毒及其与化学疗法或HDAC抑制剂的组合的癌症疗法(WO 2009/083232 A1；WO 2011/113600 A1)。
主要的非结构蛋白NS1是病毒DNA复制、病毒基因表达和细胞毒性的主要调节剂。与完整的病毒类似，NS1的单独表达足以通过活性氧物质的积累和DNA损伤而诱导细胞周期停滞、细胞凋亡和细胞溶解(Hristov等人，2010)。作为其溶瘤活性的结果，该病毒显示具有在许多动物模型中已证明的癌症抑制特性，这些动物模型为启动针对GBM的临床试验奠定了基础(Geletneky等人，2012)。
在过去的几年中，除了基于溶瘤病毒的治疗概念之外，免疫肿瘤学领域已成为抗癌的有价值的方法。激活治疗性抗肿瘤免疫力的最新的有前途的方法中的一个是阻断免疫检查点。免疫检查点是指根植到免疫系统中的大量抑制性通路，这些通路对于维持自身耐受和调节外周组织中的生理免疫应答的持续时间和强度以便最小化附带的组织损伤是至关重要的。现在明显的是，肿瘤利用某些免疫检查点通路作为免疫抗性(特别是针对肿瘤抗原特异性的T细胞)的主要机制。因为许多免疫检查点是由配体-受体相互作用引发的，所以它们很容易被抗体阻断或被重组形式的配体或受体调节。
大多数癌细胞固有的大量遗传和表观遗传变化提供了宿主免疫系统可以识别的大量肿瘤相关抗原，从而要求肿瘤产生特异性免疫抗性机制。重要的免疫抗性机制涉及免疫抑制途径(称为免疫检查点)，其通常介导免疫耐受并减轻附带组织损伤。特别重要的免疫检查点受体是细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)，其下调T细胞活化的强度。在正常生理中，T细胞被两种信号活化：与抗原-MHC复合物结合的T细胞受体和与抗原呈递细胞表面上的CD80和CD86结合的T细胞受体CD28。CTLA4与CD80或CD86结合，这阻止了CD28与这些表面蛋白结合，因此负调节T细胞的活化。免疫系统攻击癌细胞需要活跃的细胞毒性T细胞，而调节性T细胞抑制可以有益于肿瘤的其他T细胞。鉴于调节性T细胞与细胞毒性T细胞的比例的变化，癌症中CTLA4的抗体阻断诱导了抗肿瘤免疫。因此，增加细胞毒性T细胞的量和减少调节性T细胞增加了抗肿瘤应答。使用拮抗性CTLA4抗体的临床研究在黑素瘤中显示出活性。尽管免疫相关毒性的高频率，但该疗法在两项随机III期临床试验中均提高了存活率。抗CTLA4疗法是第一个在晚期黑色素瘤患者中显示生存获益的药剂，并于2010年获得美国食品药品管理局(FDA)的批准(Pardoll，D.，Nature Reviews Cancer，第12卷，第252-264页，(2012))。经批准的抗CTLA4抗体以名称“伊匹单抗”已知，并由Bristol Myers Squibb(BMS)以商品名
Figure BDA0001822117810000031
销售。
一些免疫检查点受体(例如程序性细胞死亡蛋白1(PD1))限制组织内的T细胞效应子功能。通过上调PD1的配体，肿瘤细胞阻断肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫应答。具有其他免疫检查点蛋白(例如程序性细胞死亡蛋白1(PD1))的阻滞剂的临床发现表明增强抗肿瘤免疫的广泛和多样化机会，可能产生持久的临床反应。临床试验表明，阻断PD1途径诱导各种肿瘤类型的持续肿瘤消退。对PD1阻断的反应可以与肿瘤细胞对PD1配体的表达相关。
2015年9月4日，FDA批准了人源化单克隆抗体派姆单抗(也称为MK-3575或MerckSharp Dohme；MSD销售的
Figure BDA0001822117810000032
)，其针对FDA快速通道开发计划下的靶PD-1。它被批准在携带BRAF突变的晚期黑素瘤患者中用于伊匹单抗治疗(针对CTLA4)后、或者用于伊匹单抗和BRAF抑制剂治疗后。
2015年9月30日，FDA授予加速批准另一种抗PD1抗体(纳武单抗；由Bristol MyersSquibb；BMS销售的
Figure BDA0001822117810000041
注射剂)与抗CTLA4抗体伊匹单抗联合用于治疗具有BRAF V600野生型(不可切除或转移性黑色素瘤)的患者。
多种额外的免疫检查点受体和配体(其中一些在各种类型的肿瘤细胞中被选择性上调)是阻断的主要靶标，特别是与增强抗肿瘤免疫应答活化的方法(例如疫苗)组合。
抗PD-L1抗体及其制备方法是本领域已知的。这种针对PD-L1的抗体可以是多克隆的或单克隆的、和/或重组的、和/或人源化的。PD-L1抗体的实例公开于美国专利号第8217149号、美国申请第13/511538号、美国申请第13/478511中。
靶向免疫检查点途径的示例性药剂显示在下表1中(修改自Pardoll，D.，NatureReviews Cancer，第12卷，第252-264页，(2012)：
Figure BDA0001822117810000042
尽管对于一些肿瘤类型(例如黑色素瘤、肺部肿瘤)，使用检查点抑制剂治疗显示出有希望的结果，但已经认识到患有一些其他肿瘤(例如结肠肿瘤、胰腺肿瘤)的患者不能从这种治疗受益。
发明内容
因此，本发明的目的是提供用于改进的癌症疗法和使更大范围的肿瘤对检查点抑制剂治疗敏感的方法。
根据本发明，这通过权利要求中限定的主题而实现。
在产生本发明的研究中，询问了检查点抑制剂(例如，如派姆单抗的抗PD1抗体)与溶瘤病毒(例如，如H-1PV的细小病毒或相关的啮齿动物细小病毒)协同作用是否可以杀死癌细胞。结果表明，施用派姆单抗在几个患者中以协同方式增强了病毒的溶瘤活性。
本发明提供了药物组合物，该药物组合物含有(a)溶瘤病毒与(b)检查点抑制剂的组合。本发明还提供了所述药物组合用于治疗癌症的用途。
优选地，在所述药物组合物中，溶瘤病毒和检查点抑制剂以有效剂量存在并与药学上可接受的载体组合。
如本文所用，术语“药剂”理解为是指在组织、系统、动物、哺乳动物、人或其他对象中产生所期望效果的物质。
因此，术语“抗肿瘤剂”理解为是指在组织、系统、动物、哺乳动物、人或其他对象中产生抗肿瘤效果的物质。还理解的是，“药剂”可以是单一化合物或两种或多种化合物的组合或组合物。
本文所用的术语“治疗”及其衍生词是指治疗性疗法。关于具体病症，治疗是指：(1)改善病症或该病症的一种或多种生物学表现，(2)干扰(a)导致该病症或对该病症负责的生物学级联中的一个或多个点或(b)该病症的一种或多种生物学表现，(3)减轻与该病症相关的一种或多种症状、影响或副作用，或(4)减缓该病症或该病症的一种或多种生物学表现的进展。
如本文所用，“预防”理解为是指预防性施用药物以显著降低病症或其生物学表现的可能性或严重性，或延缓这种病症或其生物学表现的发生。技术人员将理解“预防”不是绝对的术语。预防性疗法是合适的，例如，当对象被认为具有发展癌症的高风险时，例如当对象具有强烈的癌症家族史时或当对象已经暴露于致癌物时。
如本文所用，术语“有效量”是指将引起例如研究人员或临床医生所寻求的组织、系统、动物或人的生物学应答或医学应答的药物或药物制剂的量。此外，术语“治疗有效量”是指与未接受这种量的相应对象相比，导致疾病、病症或副作用的改进的治疗、愈合、预防或改善的任何量。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量。可以使用本领域技术人员已知的方法测定可用于治疗和/或预防这些疾病或病症的“有效剂量”。
施用治疗有效量的本发明的组合优于单独的组分化合物，因为与单独施用治疗有效量的组分化合物相比，该组合提供以下改进的性质中的一者或多者：i)比最活跃的单一药剂更强的抗癌作用，ii)协同或高度协同的抗癌活性，iii)提供增强的抗癌活性以及减少的副作用特性的剂量方案，iv)毒性作用、特性降低，v)增加治疗窗口，或vi)增加组分化合物中的一者或两者的生物利用度。
“药学上可接受的”是指包括任何载体，该载体不干扰活性成分的生物活性的有效性并且对施用它的患者无毒。合适的药物载体的实例是本领域熟知的，包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水乳液)、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。这些载体可以通过常规方法配制，并且可以以有效剂量施用于对象。另外的药学上相容的载体可以包括凝胶、生物可吸收的基质材料、含有治疗剂的植入元件、或任何其他合适的载体、递送或分配装置或材料。
如本文所用，术语“癌症”是指细胞或组织的异常生长，并且理解为包括恶性肿瘤生长。术语“肿瘤的(neoplastic)”是指肿瘤(neoplasm)的或与肿瘤有关。在一些实施方式中，癌症是实体瘤，即脑癌(特别是神经胶质瘤：室管膜瘤、星形细胞瘤[例如多形性胶质母细胞瘤]、少突神经胶质瘤、脑干胶质瘤、少突细胞瘤)；结肠癌(特别是非MSI CRC)，膀胱癌，肝癌，乳腺癌(特别是双阴乳腺癌或三阴乳腺癌)，肾癌，头颈部鳞状细胞癌，肺癌(特别是肺鳞状细胞癌，非小细胞肺癌(NSCLS)、小细胞肺癌(SCLC))，恶性黑素瘤，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，肾细胞癌或胃癌。术语“癌症”还包括所述肿瘤在各种器官中的转移。在优选的实施方式中，这些肿瘤对细小病毒毒性具有抗性。在还优选的实施方式中，这些待治疗的肿瘤是复发性肿瘤。本发明的药物组合物的具体的优点是甚至可以成功地治疗癌症起始干细胞。这对于避免肿瘤复发和转移形成具有积极效果。
在其他实施方式中，癌症是血红素恶性肿瘤，即急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、EBV-阳性DLBCL、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、富含T细胞(组织细胞)的大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(HL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓细胞白血病-1蛋白(Mcl-1)、骨髓增生异常综合征(MDS)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)或小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)。
“检查点抑制剂”是指导致阻断免疫系统抑制检查点的任何药剂。阻断抑制性免疫检查点激活了免疫系统功能。表1中提到了合适的靶标和药剂，参考表1。在优选的实施方式中，作为癌症治疗靶标的配体-受体相互作用是跨膜程序性细胞死亡1蛋白(PDCD1，PD-1，也称为CD279)与其配体、PD-1配体(PD-L1，CD274)之间的相互作用。在正常生理学中，细胞表面上的PD-L1与免疫细胞表面上的PD-1结合，这抑制了免疫细胞活性。PD-L1在癌细胞表面的上调可以允许它们通过抑制会以其他方式攻击肿瘤细胞的T细胞以逃避患者的免疫系统。与PD-1或PD-L1结合并因此阻断相互作用的抗体允许T细胞攻击肿瘤。因此，在优选的实施方式中，PD-1拮抗剂用作检查点抑制剂。
“PD-1拮抗剂”是指阻断癌细胞上表达的PD-L1与免疫细胞(T细胞、B细胞或NKT细胞)上表达的PD-1结合、优选还阻断在癌细胞上表达的PD-L2与免疫细胞表达的PD-1结合的任何化合物或生物分子。PD-1及其配体的替选名称或同义词，对于PD-1，包括：PDCD1、PD1、CD279和SLEB2；对于PD-L1，包括：PDCD1L1、PDL1、B7H1、B7-4、CD274和B7-H；以及对于PD-L2，包括PDCD1L2、PDL2、B7-DC、Btdc和CD273。在本发明的治疗方法、药物和用途中的任一者(其中人个体正在被治疗)，PD-1拮抗剂阻断人PD-L1与人PD-1的结合、优选阻断人PD-L1和PD-L2两者与人PD-1的结合。人PD-1氨基酸序列可以在NCBI基因座N.中找到：分别是NP_054862和NP_079515。
可用于本发明的治疗方法、药物和用途中的任一者的PD-1拮抗剂包括单克隆抗体(mAb)或其抗原结合片段，该单克隆抗体(mAb)或其抗原结合片段特异性结合PD-1或PD-L1、优选特异性地结合人PD-1或人PD-L1。mAb可以是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体，并且可以包括人恒定区。在一些实施方式中，人恒定区选自由IgG1恒定区、IgG2恒定区、IgG3恒定区和IgG4恒定区组成的组，并且在优选的实施方式中，人恒定区是IgG1恒定区或IgG4恒定区。在一些实施方式中，抗原结合片段选自由Fab、Fab’-SH、F(ab’)2、scFv和Fv片段组成的组。
在US 7521051、US 8008449和US 8354509中描述了结合人PD-1并且可用于本发明的治疗方法、药物和用途的mAb的实例。在本发明的治疗方法、药物和用途中可用作PD-1拮抗剂的特异性抗人PD-1mAb包括：MK-3475(派姆单抗)、人源化lgG4mAb(其结构描述于WHODrug Information，第27卷，第2期，第161页至第162页(2013)；纳武单抗(BMS-936558)，人lgG4mAb(其结构描述于WHO Drug Information，第27卷，第1期，第68-69页(2013)；人源化抗体h409A11、h409A16和H409A17(其描述于WO2008/156712A1中)。
本领域技术人员将认识到，对肿瘤细胞具有潜在细胞毒性的任何类型的病毒都可以用于本发明的组合中。本发明中使用的有复制能力的毒性病毒可以通过裂解影响杀死肿瘤(即溶瘤)，或可以通过不同机制杀死肿瘤细胞。用于本发明实践的病毒的具体实例包括腺病毒、逆转录病毒、水泡性口炎病毒、新城疫病毒、多瘤病毒、痘苗病毒、单纯疱疹病毒和细小病毒。优选地，溶瘤病毒是细小病毒，更优选细小病毒H-1或选自Lulll、小鼠微小(minute)病毒(MMV)、小鼠细小病毒(MPV)、大鼠微小病毒(RMV)、大鼠细小病毒(RPV)、或大鼠病毒(RV)的相关啮齿动物细小病毒。
本文所用的术语“溶瘤病毒”、特别是“细小病毒”或“细小病毒H-1”包括野生型或修饰的有复制能力的其衍生物，以及基于这些病毒或衍生物的相关病毒或载体。合适的溶瘤病毒、衍生物等以及可以用于主动产生所述病毒并且可用于治疗的细胞，基于本文的公开内容，在本领域的技能内容易地确定、而无需过度的经验性努力。
化合物的施用可以通过不同方式(例如通过静脉内施用、腹膜内施用、皮下施用、肌肉内施用、局部施用、瘤内施用或皮内施用)实现。当然，施用途径取决于疗法的种类和药物组合物中含有的化合物的种类。主治医师基于患者数据、观察结果和其他临床因素(包括例如患者的体型、体表面积、年龄、性别、具体病毒，待施用的具体抑制剂等、施用的时间和途径、肿瘤类型和特征、患者的总体健康状况以及患者所经历的其他药物治疗)，在本领域的技能内容易地确定病毒和检查点抑制剂的剂量方案。关于检查点抑制剂，参考包装说明书和患者信息表，其通过引用并入本文。选择用于本发明的组合疗法的剂量方案(在本文中也称为施用方案)取决于若干因素，这些因素包括所治疗个体中实体的血清或组织更新率、症状水平、实体的免疫原性、以及靶细胞、组织或器官的可及性。优选地，剂量方案使递送给患者的每种治疗剂的量最大化，与可接受的副作用水平一致。因此，组合中每种治疗剂的剂量和给药频率部分取决于具体治疗剂、所治疗癌症的严重程度和患者特征。指南是选择适当剂量的抗体、细胞因子和小分子。参见，例如Wawrzynczak(1996)Antibody Therapy，BiosScientific Pub.Ltd.英国牛津郡；Kresina(编著)(1991)Monoclonal Antibodies，Cytokines and Arthritis，Marcel Dekker，纽约州纽约；Bach(编著)(1193)MonoclonalAntibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases，Marcek Dekker，纽约州纽约；Beart等人，(2003)New Engl.J.Med.348:601-608；Milgrom等人，(1999)NewEngl.J.Med 341:1966-1973；Slamon等人.(2001)New Engl.J.Med.344:783-792；Beniaminovitz等人.(2000)New Engl.J.Med.342:613-619；Ghosh等人.(2003)NewEngl.J.Med.348:24-32；Lipsky等人.(2000)New Engl.J.Med.343；1594-1602；Physiciansesk Reference 2003(Physicians’DeskReference，第57版)；Medical EconomicsCompany；ISBN；1563634457；第57版(2002年11月)。合适的剂量方案可以由临床医生确定，例如，使用本领域已知或怀疑的影响治疗或预计影响治疗的参数或因素，并且将取决于例如患者的临床病史(例如，先前的治疗)、待治疗的癌症的类型和阶段以及在组合疗法中对一种或多种治疗剂有应答的生物标志物。
由于与根据本发明的检查点抑制剂组合的病毒包含具有穿透血液系统的能力的感染性病毒颗粒，因此可以通过静脉内注射病毒来进行治疗或至少开始治疗。然而，优选的施用途径是瘤内施用。
因为长期静脉内治疗由于形成针对病毒的中和抗体而容易变得低效，所以在初始方案静脉内病毒施用后可以采用不同的施用方式，或者这些不同的施用技术(例如瘤内病毒施用)在整个病毒治疗过程中可以替选地使用。
作为另一种具体的施用技术，病毒(病毒、载体和/或细胞剂)可以从植入患者体内的源施用于患者。例如，导管(例如硅树脂的导管或其他生物相容性材料的导管)可以在肿瘤切除期间或通过单独的程序连接到安装在患者内的小皮下容器(Rickham容器)，以允许细小病毒组合物在不同时间局部注射而没有进一步的外科手术。还可以通过立体定向手术技术或通过导航靶向技术将病毒或衍生的载体注射到肿瘤中。
还可以使用合适的泵系统(例如蠕动输注泵或对流增强递送(CED)泵)以低流速通过植入导管连续输注病毒颗粒或含有病毒颗粒的流体来进行病毒的施用。
另一种施用病毒组合部分的方法来自植入的制品，该制品构造和设置成将细小病毒分配到所期望的癌组织。例如，可以使用已经用病毒(特别是细小病毒H-1)浸渍的晶片，其中在手术切除肿瘤结束时将晶片附着到切除腔的边缘。在这种治疗干预中可以使用多个晶片。在肿瘤切除后，可以将活跃产生病毒的细胞或基于病毒的载体注射到肿瘤或肿瘤腔中。
它还可以允许以较低治疗剂量临床使用病毒和/或检查点抑制剂，保持或甚至增强抗癌功效，同时增加安全性并减少和/或避免副作用。鉴于病毒和检查点抑制剂之间的强烈协同作用，可以预见治疗剂量的减少，例如，先前使用的单组分剂量的一半或三分之一保留了所期望的治疗效果。鉴于减少的剂量，可以减少甚至避免(严重的)副作用。
在细小病毒的情况下，感染效应杀死肿瘤细胞但不伤害正常细胞，并且这种感染可以例如通过瘤内使用合适的细小病毒(例如细小病毒H-1或相关病毒或基于这些病毒的载体)而进行，以实现肿瘤特异性疗法而没有不良的神经学副作用或其他副作用。
本发明的组合疗法可以在移除肿瘤的手术之前或之后使用，并且可以在放射疗法之前、期间或之后使用。
本发明的组合疗法通常用于治疗肿瘤，该肿瘤足够大以通过触诊或通过本领域熟知的成像技术(例如MRI、超声或CAT扫描)发现。在一些优选的实施方式中，本发明的组合疗法用于治疗尺寸为至少约200mm3、300mm3、400mm3、500mm3、750mm3、或高达1000mm3的晚期肿瘤。
药物组合还可以包含一种或多种另外的治疗剂。该另外的治疗剂可以是，例如化学治疗剂，生物治疗剂(包括但不限于针对VEGF、EGFR、HER2/neu、VEGF受体、其他生长因子受体、CD20、CD40、CD40L、CTLA-4、OX-40 4-1BB和ICOS的抗体)，免疫原性剂(例如，减毒的癌细胞、肿瘤抗原、抗原呈递细胞(例如，用肿瘤衍生的抗原或核酸脉冲的树突细胞)、免疫刺激细胞因子(例如，IL-2、IFNα2、GM-CSF)和用编码免疫刺激细胞因子(例如但不限于GM-CSF)的基因转染的细胞)。
化学治疗剂的实例包括烷化剂，例如环磷酰胺、白消安、喜树碱、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、抗生素、博来霉素、洋红霉素、更生霉素、柔红霉素、伊达比星、5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、铂类似物(例如，顺铂和卡铂)；长春花碱、铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺、米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；米托蒽醌；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基喋呤、卡培他滨；伊班膦酸钠；拓扑异构酶抑制剂；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维生素A、他莫昔芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬，4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、凯奥昔芬或芳香酶抑制剂。
本发明还涉及(a)细小病毒H-1和(b)检查点抑制剂在制备用于治疗癌症的(a)药物组合物或组合中的用途。
(a)和(b)的施用方式可以是同时地或依次地，其中，优选地，(a)和(b)依次(或分别)施用。这意味着(a)和(b)可以以单一单位剂型提供，以便一起服用或作为单独的实体(例如在单独的容器中)同时施用或以一定的时间差施用。该时间差可以在1小时至1周之间，优选在12小时至3天之间。此外，可以通过与检查点抑制剂不同的另一种施用方式施用病毒。在这方面，可以有利地在瘤内和其他的全身地或口服地施用病毒或检查点抑制剂。在特别优选的实施方式中，瘤内地施用病毒，静脉内地施用检查点抑制剂。优选地，病毒和检查点抑制剂作为单独的化合物施用。使用两种药剂的联合治疗也是可以的。
根据标准药物实践，本发明的组合疗法中的每种治疗剂可以单独施用或者在药物(在本文中也称为药物组合物)中施用，该药物包含治疗剂和一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和稀释剂。本发明的组合疗法中的每种治疗剂可以同时地(即，在相同的药物中)施用、并发地施用(即，在以任何顺序一个接一个地施用的单独药物中)或以任何顺序依次地施用。当组合治疗中的治疗剂处于不同剂型(一种药剂是片剂或胶囊，另一种药剂是无菌液体)和/或以不同的剂量方案(例如，至少每天施用的化学治疗剂和较不频繁施用(例如每周一次、每两周一次或每三周一次)的生物治疗剂)施用时，依次施用是特别有用的。
在一些实施方式中，组合疗法中的至少一种治疗剂使用相同的剂量方案(剂量、频率和治疗持续时间)施用，当将该药剂用作治疗相同癌症的单一疗法时，通常使用该相同的剂量方案。在其他实施方式中，患者在组合疗法中接受的治疗剂中的至少一种的总量低于当药剂用作单一疗法时，例如较小剂量、较低频率剂量和/或较短治疗持续时间。本文所描述的检查点抑制剂和溶瘤病毒可以作为试剂盒提供，该试剂盒包含第一容器和第二容器以及包装说明书。第一容器含有至少一剂含有检查点抑制剂、优选抗PD-1拮抗剂的药物，第二容器含有至少一剂含有溶瘤病毒的药物，包装说明书或标签包括使用该药物治疗患者癌症的说明书。第一容器和第二容器可以包括相同或不同的形状(例如，小瓶、注射器和瓶(booles))和/或材料(例如塑料或玻璃)。该试剂盒可以进一步包含可以用于施用药物的其他材料，例如稀释剂、过滤器、IV袋和线、针和注射器。在试剂盒的一些优选实施方式中，抗PD-1拮抗剂是抗PD-1抗体，并且说明书指出该药物旨在用于治疗患有通过IHC测定检测PD-L1表达为阳性的癌症的患者。
在本发明中，首次表明了组合使用溶瘤病毒(特别是细小病毒H-1PV)和检查点抑制剂(特别是派姆单抗)可以是对抗癌症(特别是脑肿瘤、结肠癌和胰腺癌)的有效方法。如在示例中更详细地概述的，出人意料地可以减小通常对检查点抑制剂治疗无应答的肿瘤类型(CRC)中的转移尺寸。更出人意料地，在不能手术的原发性多形性胶质母细胞瘤中获得了相当大的肿瘤尺寸减小。
如前所述，旨在不受理论束缚，通过使用免疫检查点途径(例如，通过肿瘤侧的PD-L1与T细胞侧的PD-1受体的结合)使肿瘤自身免受免疫系统的攻击。这导致身体对肿瘤的免疫耐受。免疫检查点抑制剂是阻断免疫检查点途径的抗体(例如抗PD-L1抗体或抗PD1抗体)。结果，免疫耐受被打破，免疫细胞可以识别肿瘤并攻击它。然而，这不是对所有肿瘤类型都起作用，因为肿瘤通常具有使得活化的免疫细胞不可能侵入肿瘤的微环境。现在通过使用攻击肿瘤并改变其微环境的溶瘤病毒(特别是细小病毒、更特别是细小病毒H-1)使得进到肿瘤中的该侵入是可能的。换句话说，溶瘤病毒能够通过溶瘤使肿瘤“裸露”，并且通过使用检查点抑制剂“武装”的免疫细胞能够开始侵入到肿瘤中。溶瘤病毒可以被视为成功免疫应答的开门器。借助该概念，应该可以治疗任何肿瘤类型，以及过去检查点抑制剂治疗失败的那些，因为溶瘤病毒治疗转变了免疫原性肿瘤中的非免疫原性肿瘤。鉴于一般原理，只要它改变肿瘤微环境并具有任何的检查点抑制剂，这适用于任何溶瘤病毒。这可以导致预防疾病复发的长期效果，可能增加初始的溶瘤。这种效果的组合使得肿瘤更易受到免疫系统的影响，特别是在先前用病毒治疗之后。患者的示例显示该组合疗法导致缓解或稳定的疾病。
当检查癌症进展时，已经发现利用不同细胞(尤其涉及癌细胞和免疫细胞)之间的进化串扰。癌细胞可以改变免疫微环境和免疫细胞的功能，导致免疫抑制和免疫逃避(Fridman等人，2012；Gabrilovich等人，2012：Halama等人，2011(a)，2011(b))。例如，在结肠直肠癌(CRC)的肝转移的情况下，已经显示结肠直肠癌肝转移的侵入性边缘是其自身尺寸的免疫微环境。沿着明显的趋化因子梯度，该环境诱导T淋巴细胞迁移到侵入性边缘中。浸润的T淋巴细胞通过其自身产生的CCL5发挥肿瘤刺激作用。结肠直肠癌肝转移中的微环境显示没有Th1、Th2或Th17环境，而是针对涉及趋化因子和生长因子(例如，VEGF、HGF和MIF)的促瘤炎症而优化。(Halama等人，2016)。在该文章中a)免疫抑制现象，b)结肠直肠癌转移的潜在肿瘤保护机制和c)肿瘤和转移中特定免疫细胞亚群的肿瘤促进特性已被突出。在该公开中，还显示肿瘤细胞在侵入性边缘是PD-L1阴性的。这可能是到目前为止用检查点抑制剂治疗在几种肿瘤实体中不很成功的原因。如前所述，在免疫细胞可以成功进入肿瘤并攻击它之前，必须通过溶瘤病毒改变微环境。在这方面，参考实施例2和图1至图9，图1至图9显示在用细小病毒H-1和PD1抗体治疗后，在肿瘤中观察到T细胞密度显著增加，并且大多数T细胞是PD1阳性的。
现在仅通过参考以下非限制性示例、方法和附图以说明的方式描述本发明。
附图说明
图1：肝转移的活组织检查1(CD3)的免疫荧光显示重要的肿瘤区域，CD3阳性细胞的明显浸润。浸润是异源的。
图2：肝转移的活组织检查1(CD8)的免疫荧光显示效应T细胞的明显浸润，同样是异源的。有趣的是，CD8+T细胞与肿瘤上皮细胞紧密相邻，这很少被观察到。
图3：肝转移的活组织检查1(PD-1)的免疫荧光显示基质区室主要富含T细胞。它们中的大多数是PD1阳性的。
图4：肝转移的活组织检查2(CD3)的免疫荧光显示在首次输注H-1PV+PD-1抗体后，观察到T细胞密度显著增加(约+30％至50％)。同样是异源模式。
图5：肝转移的活组织检查2(CD8)的免疫荧光显示CD8+T细胞密度显著增加。非常异源的。CD8+T细胞与肿瘤细胞紧密接触。
图6：肝转移的活组织检查2(PD-1)的免疫荧光显示大多数T细胞是PD-1阳性的。
图7：肝转移的活组织检查3(CD3)的免疫荧光显示在第二次输注H-1PV+PD-1抗体后，T细胞密度仍然增加。同样是非常异源的。
图8：肝转移的活组织检查3(CD8)的免疫荧光显示致密的T细胞浸润，类似于活组织检查2。
图9：肝转移的活组织检查3(PD-1)的免疫荧光显示仍然大多数T细胞是PD-1阳性的。
图10至图15：细胞因子谱，
来自多重-细胞因子定量的数据，
蛋白质定量的参考，
每个活组织检查的相同蛋白量，
显示了比例(虚线柱具有太低的蛋白质量而是不稳健的)，
图10：增加的/上调的蛋白质：
CTACK-CCL27、IL-16、SDF-1α、IP-10、MIP-1b，
图11：减少的/下调的蛋白质：
G-CSF、IL-5、IL-7、IL-13、IL-12p40、FGP碱性、MIF、SCGF-β、IL-1α。
图16：治疗前和治疗期间(施用H-1PV+派姆单抗后55天和101天)进展的复发性胶质母细胞瘤的MRI，
上排：在用H-1PV+派姆单抗治疗之前，
中排：在施用H-1PV+派姆单抗后55天，
下排：在施用H-1PV+派姆单抗后101天。
具体实施方式
实施例
实施例1：一般方法
(a)荧光原位杂交(FISH)
FISH测定：该方法程序基本上如以下描述地进行：Silahtaroglu等人(Molecularand Cellular Probes.2003；17：165-169)和Nehmé等人(J Neurosci Methods.201 1；196：281-288)。FISH测定首先在体外培养的人NBK细胞中建立，并延伸至来自免疫缺陷大鼠中的人神经胶质瘤异种移植物的石蜡包埋的肿瘤组织。然后应用该测定方案检测患者衍生的石蜡包埋或冷冻保存的肿瘤材料中的H-1PV DNA和RNA序列。
阳性对照和阴性对照：在每次FISH测定中，将来自大鼠中的H-1PV处理的或模拟处理的人神经胶质瘤异种移植物的石蜡包埋的肿瘤组织分别用作阳性对照或阴性对照。还包括无探针对照(试剂取代阴性对照；省略靶特异性杂交探针)和错配对照(具有3个至5个核苷酸交换的靶特异性杂交探针)。
杂交探针：靶特异性杂交探针由Exiqon(Vedbaek，丹麦)定制设计以识别H-1PV非结构化(NS)和结构化(VP)蛋白编码序列，并代表具有增加的靶特异性和高效力的结合的锁核酸(LNA)寡核苷酸(参考，参见www.exiqon.com)。通过与H-1PV阴性(有义)或阳性(反义)链DNA的反向互补合成探针，并在其3’末端和5’末端标记双地高辛(DIGN)。NS-特异性探针和VP-特异性探针两者以等量的混合物使用，以增加杂交信号。
NS1-反义：
5DIGN/TCAGCACACAACAGATGGCAT/3DIGN
VP-反义：
5DIGN/TACTATCCAGAGCAACCATCAT/3DIGN
NS1-有义：
5DIGN/AATTCGCTAGGTTCAATGCGCT/3DIGN
VP-有义：
5DIGN/TGACCTACCAACATCAGATACA/3DIGN
信号可视化：通过与缀合有辣根过氧化物酶(罗氏，Sigma-Aldrich，德国，慕尼黑)的抗DIGN抗体、以及酪胺信号放大(TSA)/花青(Cy)3试剂(Perkin Elmer，德国)连续温育来实现信号可视化。通过使用Zeiss Cell Observer显微镜和ZEN软件进行图像采集。
信号定量：对于阳性信号的定量分析，使用Fiji ImageJ软件，并使用目的开发的定制宏程序(Dr.D.Krunic，德国癌症研究中心，德国，海德堡)和恒定的处理设置进行自动分析。结果表示为每个显微镜观察视野(dFOV＝1.000μm)的阳性信号的平均强度和/或每个标记细胞的阳性信号的平均强度。背景荧光的值(由错配探针产生的假阳性信号)定义了阳性信号和阴性信号之间的截止值。信号强度以任意单位(a.u.)表示。
(b)细胞培养和增殖测定
从健康供体中提取T细胞，并在短暂的休息后在CD3/CD28包被的96孔板(来自美国BioLegend的抗CD3，来自德国BD的抗CD8)中刺激T细胞，过夜。T细胞培养基含有RPMI 1640(PAA，美国)、10％人血清(在56℃下热灭活30分钟)、1％谷氨酰胺(PAA，美国)、1％青霉素/链霉素(PAA，美国)、1％非必需氨基酸(PAA，美国)和1％HEPES(PAA，美国)。根据供应商的说明书培养商业肿瘤细胞系。用自动细胞计数器TC10(BioRad，德国)双重测量一式三份进行细胞的定量，特别是在接种后直接进行(即用于增殖测定的0.5×105个细胞/ml，细胞平分地接种在平板中)和在温育/治疗后进行。如最近所描述的(Castro等人，2013)，使用Multiplexion的Multiplex Cell Authentication(德国，海德堡)验证原代细胞系。与已知的谱相匹配的SNP谱是独特的，与人上皮肿瘤细胞系一致。通过PGR测试所有细胞系的支原体污染。
腹水(来自结肠直肠癌患者)的制备以及巨噬细胞和淋巴细胞的提取如下进行。改编自以前的报道，将腹水收集到无菌塑料袋中。每个袋的出口喷嘴通过用70％乙醇消毒制备，并且丢弃第一部分腹水，同时将剩余的腹水分配在50mlFalcon管中。以1500rpm离心10分钟。将上清液与RPMI培养基混合(1:2)并用作条件培养基(CM)。对于巨噬细胞群(a)，然后将球团重悬于RPMI培养基中并通过Ficoll梯度运行(在室温下2000rpm 30分钟)。然后将中间相收集在RPMI中，洗涤并离心(1800rpm进行10分钟)，然后将得到的球团接种到含有RPMI的细胞培养瓶中。对于巨噬细胞群体，然后在1.5小时的粘附步骤(37℃)后收获上清液，用PBS洗涤剩余的粘附细胞(三次)，然后补充CM。对于淋巴细胞(b)，然后将球团重新悬浮于再次离心的RPMI培养基中，然后将球团接种到含有RPMI的细胞培养瓶中。在粘附后，将上清液用于提取淋巴细胞。在用巨噬细胞或淋巴细胞实验后，测量上清液的细胞因子，收获细胞并用染色法分析(对于巨噬细胞，双染色CD163和CD68；对于肿瘤细胞，双染色CEA；对于淋巴细胞，双染色CD3)并控制细胞内容物的纯度(>95％)。在肿瘤组织解离和粘附步骤后进行肿瘤细胞的提取。
(c)细胞因子和趋化因子定量
双激光阵列阅读器同时定量感兴趣的所有细胞因子和趋化因子。基于5-参数逻辑图回归公式，使用Bio-Piex Manager 4.1.1计算标准曲线和浓度。简而言之，将小块切开的冷冻组织转移到150μl冷裂解缓冲液中，涡旋，在-80℃冷冻(10分钟)并在冰上解冻。在冷超声浴中温育(10分钟)后，将样品在-80℃下再次冷冻，在冰上解冻并离心(13000rpm，20分钟，4℃)。根据制造商的说明书(BioRad Laboratories，Hercules，美国加州)，测定上清液的蛋白质浓度，并使用人血清稀释剂(BioRad)将裂解物的浓度调节至1000pg/ml(活组织检查为300pg/ml)，并通过多重蛋白质阵列定量组织裂解物中的细胞因子/趋化因子浓度。分析物的检测灵敏度范围为1pg/ml至100ng/ml。基于为每种分析物生成的单一标准曲线推断平台识别为“超出范围”的值。由于标准曲线显示最小标准偏差，因此使用最高浓度标准浓度进行外推。为了形成细胞因子类(按降序排列，例如TH1、TH2、TH17等)，使用AMIGO数据库(http://amigo.qeneontologv.org/)评估特定术语(例如GO：0043030：巨噬细胞活化的调节，GO：0042104：活化T细胞增殖的正调节或GO：0006935：趋化性)或文献检索。来自具有TH1、TH2或TH17占主导地位的细胞因子的样品的阳性对照用于分析。
连续切片上多重蛋白质定量方法的一般再现性(精确度)显示出优异的重现性(斯皮尔曼等级相关性，r＝0.975，p＝0.0001，中值差异70pg/ml)。在具有已知浓度的细胞因子的溶液的测量中评估准确度，例如，CCL5为25.000pg/ml时显示标准偏差为628.92pg/ml，相当于偏离预期值2.5％，CCL5为100pg/ml时显示标准偏差为2.7pg/ml，相当于偏离预期值2.7％。所研究的分析物的校准按照制造商(BioRad，德国)的建议进行，我们参考制造商的主页以获得关于准确度和精密度的其他参考材料(http://www.bio-rad.com/webroot/ web/pdf/lsr/literature/Bulletin 5803A.pdf)。
不同连续切片侵入性边缘蛋白定量之间的比较也显示出优异的重复性(斯皮尔曼等级相关性，rho＝0.922，p＝0.0001)。最后，激光辅助显微切割材料与宏观切割材料的比例的比较显示，侵入性边缘确实是具有可重复的且有差异的细胞因子谱的精确分离的区域。此外，与周围相邻肝脏或肝脏转移的差异是如此明显，以致宏观切割的样本完全类似于在显微切割的样本中发现的模式。
如上所述进行来自活组织检查材料的细胞因子和趋化因子数据的产生。由于可用材料的量的限制，用于测定的蛋白质浓度设定为300mg。就形态学和免疫细胞存在而言，在组织学上，与治疗前相比，患者的相邻肝脏在治疗期间保持不变。因此，作为细胞因子测量精密度的对照(以及评估稀释效果等)，使用处理前和处理期间相邻肝脏的细胞因子水平，并显示了极好的一致性(斯皮尔曼等级相关性，rho＝0.991和p＝0.0001，中值差异5pg/ml)。这也使得伤口愈合的效果(在活组织检查后第8天不应该再存在)不太可能干扰CCR5抑制的作用。通过计数凋亡细胞核(基于核形态)和完整的肿瘤细胞在如前所描述的hemalaun和/或H&E染色的切片中确定凋亡肿瘤细胞的百分比(Duan等人.2003)。
(d)免疫化学和免疫荧光
FFPE组织被脱石蜡和再水化(BOND脱石蜡溶液，Leica，德国)。在100℃下热诱导的表位修复(HIER)(BOND表位修复溶液1或2，Leica，德国)后，通过与3％过氧化物块温育20分钟阻断内源性过氧化物酶活性(BOND聚合物精炼检测系统，Leica，德国)。用10％常规山羊血清(Vector，美国)封闭切片。可以在下面找到所用抗体和稀释液的列表。将这些在室温下作为一级抗体应用30分钟。将载玻片与二级抗体(兔抗小鼠IgG，Bond聚合物精炼检测系统，Leica，德国)在室温下温育8分钟。通过与第三抗体在室温下温育8分钟来实现信号的进一步放大，该第三抗体缀合有辣根过氧化物酶并且与大量的葡聚糖分子偶联(聚-HRP-小鼠-抗兔IgG，Bond聚合物精炼检测系统，Leica，德国)。通过与3,3-二氨基-联苯胺(DAB色原，Bond聚合物精炼检测系统，Germany)的显色反应进行抗原检测。将切片用苏木精复染(Bond聚合物精炼检测系统，Leica，德国)，并用Aquatex(Merck，德国)固定。匹配的同种型对照用作阴性对照，并且邻近的正常组织或已知的阳性细胞用作阳性对照。
顺序地使用红色荧光Alexa Fluor 594染料标记的驴抗小鼠IgG(LifeTechnologies，德国)和绿色荧光Alexa 488染料标记的山羊抗兔IgG(Life Technologies，德国)对冷冻切片进行免疫荧光双染色，用于趋化因子双染色(或者在绿色荧光Alexa 488染料标记的山羊抗小鼠IgG的情况下，省略第二个初级抗体用于对照)。为了分析CD68、PD-L1、CD4、CD8和CCL5，同时使用红色荧光Alexa Fluor 594染料标记的驴抗兔IgG(Invitrogen，德国)和绿色荧光Alexa 488染料标记的山羊抗小鼠IgG(LifeTechnologies，德国)。为了分析CDS和CCL5，使用Alexa Fluor555山羊抗小鼠IgG(H+L)分子探针A21422和Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG。根据抗体推荐，在染色之前，用4％PFA或33％丙酮的甲醇固定冷冻切片。在第一个初级抗体在4℃温育过夜后，施加Alexa Fluor 594(1:100稀释)1小时。将第二个初级抗体在室温下施加3小时，并在连续双重染色期间用AlexaFluor 488(1:100稀释)检测1小时。为了同时染色，将两个初级抗体都在Alexa Fluor抗体(各自1:100稀释)1小时后温育过夜。使用用于复染的Vectashield和DAPI(Vector，美国)安装切片。在Nikon C2 Plus共聚焦显微镜系统上获得共聚焦图像。
小鼠单克隆抗体识别人CD3ε(1:100稀释，HIER1用于FFPE，4％PFA固定，HIER2用于冷冻切片，克隆PS1，Novocastra，UK和兔单克隆抗CD3，来自Abeam的克隆Sp7)、CD8(1:50稀释和HIER2用于FFPE，1:100稀释和4％PFA固定，用于冷冻切片，克隆4B11，Novocastra，英国)、CCR5(1:50稀释和HIER1用于FFPE，1:100稀释，4％PFA固定和HIER1用于冷冻切片，克隆MM0065-6H20，abeam，英国)、CCL5(1:50稀释和4％PFA固定用于冷冻切片，克隆VL1，BioLegend，美国)、PD1(1:50稀释和HIER1用于FFPE，33％丙酮在甲醇中固定用于冷冻切片，克隆NAT，abeam，英国)、CD68(1:200稀释和HIER1用于FFPE，1:700稀释和33％丙酮在甲醇中固定用于冷冻切片，克隆KP1，abeam，英国)、CD163(1:500稀释和HIER2用于FFPE，33％丙酮在甲醇中固定用于冷冻切片，克隆EDHu-1，AbD Serotec，英国)、CD44(1:9000稀释度和HIER1用于FFPE，1:5000稀释，4％PFA固定和HIER2用于冷冻切片，克隆156-3C1，abeam，英国)、CD74(1:50稀释和HIER 1用于FFPE，1:75稀释，4％PFA固定和HIER2用于冷冻切片，克隆LN2，abeam，英国)、Ki67(1:200稀释，PFA固定，克隆MIB-1，DAKO，美国)。CCR1(1:50稀释，HIER1用于FFPE，4％PFA固定，HIER1用于冷冻切片，克隆MM0061-7B17，abeam，美国)、CXCL9(1:100稀释和33％丙酮在甲醇中固定用于冷冻切片，克隆M0220-7F11，abeam，英国)、CD11b(1:50稀释和33％丙酮在甲醇中固定用于冷冻切片，克隆2Q902，abeam，英国)和CXCL10(1:50稀释和33％丙酮在甲醇中固定用于冷冻切片，克隆6D4，abeam，英国)、干扰素-α2(1:50稀释，克隆EBI-1，eBiosctence)和干扰素-γ(1:00稀释，克隆B27，BioLegend)。兔抗体识别人PD-L1(1:50稀释，HIER2用于FFPE，1:150稀释，4％PFA固定用于冷冻切片，多克隆，abeam，英国)、CCR3(1:800稀释，HIER1和4％PFA固定用于冷冻切片，克隆Y31，abeam，英国)、CD4(1:150稀释和4％PFA固定用于冷冻切片，克隆SP35，Zytomed Systems，德国)、CD11b(1:500稀释和4％PFA固定，克隆EP1345Y，abeam，英国)、CD8(1:150稀释和4％PFA固定用于冷冻切片，克隆SP16，Zytomed Systems，德国)和CEACAM5(1:100稀释，克隆327，Sino Biological)。根据制造商的描述(原位细胞死亡检测试剂盒，罗氏，德国)进行经典H&E和TUNEL染色，并且通过比较TUNEL与形态学分析，使用连续切片以定量死亡肿瘤细胞。由于组织切片的并列比较证实了如先前所公布的形态学分析的优异诊断价值(Duan等人，2003)，因此形态学分析是用于评价的优选方法。
(e)整个载玻片(免疫)细胞定量
使用计算机化图像分析系统计数染色的免疫细胞的数量，该系统由连接到个人计算机的NDP Nanozoomer(Hamamatsu Photonics，日本)组成。自动获得完整组织切片的完全显微图像(虚拟显微镜)，并将测量区域的平均细胞密度用于分析。如前所报道的(Halama等 人，2011b；Halama等人，2010；Halama等人，2009b)，使用专门开发的软件程序(VIS软件套件，Visiopharm，丹麦)在给定的感兴趣区域(平均10mm2，最多40mm2)产生细胞计数。目视检查所有评估的一致性。
(f)流式细胞术
对于每个实验，使用40μm细胞过滤器和RPMI培养基通过切割和多次洗涤步骤解离来自结肠直肠癌肝转移的侵入性边缘的组织(高达10g)。然后将提取的细胞置于具有RPMI培养基(补充有10％FCS)的24孔板中过夜，然后任选地用莫能菌素(BD Biosciences，德国)封闭3小时。然后收获细胞、离心并使用流式细胞术标准方案分析CD3、CD8、CD4和CCL5。
表面染色如下进行：对于每个，使用100μl的FACS缓冲液、2.5μl的CD3-V450(560365，BD，德国)、1.25μl的CD4-PerCP-Cy5.5(560650，BD，德国)和2.5μl的CD8-APC-H7(641400，BD Biosciences，德国)，然后在冰上温育20分钟(避光)并离心。然后通过将细胞吸收到1％PFA中并温育15分钟然后是用0.1％皂苷缓冲液洗涤三次的步骤(和离心)，来进行细胞内染色。CCL5的染色如下进行：对于每个，使用100μl的0.1％皂苷缓冲液、5μl的抗人RANTES(CCL5)-eFluor660(AF647，eBioscience，英国)或具有1.25μl(AF647，eBioscience，英国)的同种型对照小鼠IgG2bk-eFluor660，然后是在室温下温育15分钟(避光)和用0.1％皂苷缓冲液洗涤两次的步骤。然后使用BD Biosciences FACS Canto II细胞计数器(Harvard Stem Cell Institute)对标记的细胞进行FACS，区别于(gated against)阴性对照。
为了在测量肿瘤组织之前建立阳性对照并鉴定淋巴细胞群，如上所述处理健康的供体淋巴细胞。
实施例2：在患有转移性CRC(结肠直肠癌)的患者中使用细小病毒H-1和检查点抑制剂的联合模式治疗
患有结肠直肠癌(横结肠的低分化腺癌；突变状态：KRAS WT、NRAS WT、MSS；第一次手术2013)和进展性肝转移(尺寸和数量的进展)的患者用累积剂量1.2 x 109PFU的细小病毒H-1连续三次每日输注治疗(4 x 108pfu；第1天至第3天)，然后根据制造商的剂量学使用免疫检查点抑制剂派姆单抗
Figure BDA0001822117810000231
治疗(2mg/Kg/BW，第1天)。5周后重复用相同剂量方案的该治疗。
在治疗前、和治疗期间的不同时间点进行肝转移的活组织检查，出人意料的结果如下：与在H-1PV+派姆单抗治疗前的第一次活组织检查相比，观察到淋巴细胞浸润在后来的活组织检查(第二次和第三次活组织检查)中增加。此外，成像分析(超声、CT、MRI)显示肝转移的质量减少。
参考图1至图9，显示了在治疗期间观察到T细胞密度(主要是CD8+T细胞群)显著增加。T细胞浸润是异源的，T细胞与肿瘤细胞非常邻近。大多数T细胞是PD1阳性的。
使用如上文实施例1中所描述的方法进行细胞因子和趋化因子定量。谱如图10至图15所示。似乎普遍存在1P10和CCL5的增加。lL-2没有增加，干扰素γ仅稍微增加。
如上文实施例1(a)中所描述的进行FISH分析。它表明可以在活组织检查2中确定活的病毒(H-1PV)。这清楚地表明病毒迁移到肿瘤/转移中。
实施例3：在原发性不能手术的GBM(多形性胶质母细胞瘤)患者中使用细小病毒H-1和检查点抑制剂的联合模式治疗
患有不能手术的多形性胶质母细胞瘤的患者用累计剂量1.2×109PFU的细小病毒H-1每日连续三次输注治疗，然后根据制造商的剂量学用派姆单抗
Figure BDA0001822117810000241
治疗(2mg/Kg/BW，在H1-PV施用3天后)。
在治疗前和用H-1PV+检查点抑制剂派姆单抗治疗期间进行MRI。结果显示，治疗55天后肿瘤尺寸减少超过30％，第101天几乎完全缓解。患者表现良好，不需要任何额外的药物。MRI显示在图16中。
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<160> 4
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 NS1 反义
<400> 1
tcagcacaca acagatggca t 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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tactatccag agcaaccatc at 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 NS-1 有义
<400> 3
aattcgctag gttcaatgcg ct 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VP 有义
<400> 4
tgacctacca acatcagata ca 22

Claims (15)

1.一种药物组合，所述药物组合含有(a)细小病毒H-1与(b)抗PD1抗体或抗PD-L1抗体。
2.根据权利要求1所述的药物组合，其中，所述抗PD1抗体是派姆单抗或纳武单抗。
3.根据权利要求1或2所述的药物组合，所述药物组合还包含选自化学治疗剂、生物治疗剂、免疫原性剂、免疫刺激细胞因子和用编码免疫刺激细胞因子的基因转染的细胞的一种或多种另外的治疗剂。
4.根据权利要求3所述的药物组合，其中，所述生物治疗剂选自针对VEGF、EGFR、Her2/neu、VEGF受体、CD20、CD40、CD40L、CTLA-4或ICOS的抗体。
5.根据权利要求3所述的药物组合，其中，所述免疫原性剂选自减毒的癌细胞、肿瘤抗原或抗原呈递细胞。
6.根据权利要求3所述的药物组合，其中，所述免疫刺激细胞因子和用编码免疫刺激细胞因子的基因转染的细胞是IL-2、IFNα2、GM-CSF和编码其的细胞。
7.如权利要求1至3中任一项所定义的药物组合在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其中，依次施用(a)细小病毒H-1和(b)所述抗PD1抗体或所述抗PD-L1抗体。
9.根据权利要求7或8所述的用途，其中，所述用途为在制备用于治疗实体瘤、血液癌症和/或癌症起始干细胞的药物中的用途。
10.根据权利要求7或8所述的用途，其中，所述癌症是脑癌、结肠癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、肾癌、头颈部鳞状细胞癌、肺癌、恶性黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、或胃癌。
11.根据权利要求10所述的用途，其中，所述脑癌是多形性成胶质细胞瘤。
12.根据权利要求7或8所述的用途，其中，(a)细小病毒H-1和/或(b)所述抗PD1抗体或所述抗PD-L1抗体是通过瘤内施用或静脉内施用来施用的。
13.一种包含第一容器、第二容器和包装说明书的试剂盒，其中，所述第一容器包含至少一剂含有细小病毒H-1的药物组合物，所述第二容器包含至少一剂含有抗PD1抗体或抗PD-L1抗体的药物组合物，并且所述包装说明书包括使用所述药物组合物治疗患有癌症的个体的说明书。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中，所述癌症是脑癌、结肠癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、肾癌、头颈部鳞状细胞癌、肺癌、恶性黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、或胃癌。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中，所述脑癌是多形性成胶质细胞瘤。
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