KR102195055B1 - 체크포인트 저해제와 조합된 종양용해 바이러스에 의한 암 요법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 체크포인트 저해제가 종양용해 바이러스와 조합된 약학적 조성물 및 암을 치료하기 위한 상기 조합물의 용도에 관한 것이다.

Description

체크포인트 저해제와 조합된 종양용해 바이러스에 의한 암 요법
본 발명은 체크포인트 저해제 (checkpoint inhibitor)가 종양용해 바이러스 (oncolytic virus)와 조합된 약학적 조성물 및 암을 치료하기 위한 상기 조합물의 용도에 관한 것이다.
암은 전세계적으로 두번째로 높은 사망 원인이다. 남성 중 ½ 및 여성 중 ⅓이 그의 일생 동안 일부 형태의 암 진단을 받게 될 것으로 추정된다. 더욱이, 암은 대개 노화로 인한 질병이기 때문에, 노인 비율 증가에 기인하여 전세계 암에 의한 사망 수는 2007년부터 2030년까지 약 45% 증가 (사망 건이 790만 건에서 1,150만 건으로 증가)할 것으로 예측된다 (WHO estimates, 2008). 암은 또한 비용이 가장 많이 드는 질병이다. 국립 암 연구소 (National Cancer Institute)의 최근 추산에 따르면, 미국에서 암으로 인한 전체 경제적 비용은 2007년에 2,268억 달러였고, 보다 성공적인 예방적 개입, 조기 검출, 및 보다 효과적인 치료법이 개발되지 않는 한, 이러한 거대한 경제적 부담은 다음 20년 동안 더욱 증가할 것으로 예상된다. 지난 30년간 미국 및 유럽에서 5년 암 생존율의 증가로 증명된 다수의 암 형태에 대한 예방, 검출, 진단 및 치료의 상당한 진보에도 불구하고, 일부 종양 타입, 예컨대, 췌장암, 간암, 폐암, 뇌암에 대해서는 효과적인 치료법이 없어 새로운 치료적 옵션의 개발이 요구되고 있다. 정상 세포는 손상시키지 않으면서 동시에 암 세포는 사멸시키기 위해 암-특이적 취약성 (cancer-specific vulnerabilities)을 이용하는 종양용해 바이러스는 암 퇴치를 위한 유망한 도구로서 빠르게 대두되고 있다 ( Breitbach et al, 2011; Russell et al, 2012). 다양한 악성종양에 대해, 단독으로 또는 다른 항암제와 조합하여 사용되는 12종 이상의 상이한 종양용해 바이러스는 현재 I-III상 임상 시험이 진행되고 있다 (Russell et al, 2012). 그 중, 종양용해 래트 (rat) 파르보바이러스 (parvovirus) H-1PV는 재발 다형성 아교모세포종 (glioblastoma multiforme: GBM) 환자에서 I/IIa상 임상 시험에서 안전성 및 효능의 제1 징후에 대해서 현재 평가되고 있다 ( Geletnekv et al, 2012).
H-1PV는 5.1 kb 길이의 단일-가닥 DNA 게놈을 포함하는 작은 (직경 ~25 nm), 비-외피성 20면체 입자이다 ( Cotmore & Tattersall, 2007). H-1PV의 게놈 구조는 2개의 프로모터, P4 초기 프로모터 및 P38 후기 프로모터의 제어하에 있는 2개의 전사 유닛으로 구성된다. P4는 비-구조 (non-structural: NS) 단백질 (NS1 및 NS2)을 코딩하는 유전자의 발현을 조절하고, P38은 캡시드 (VP) 단백질 (VP1, VP2, VP3)을 코딩하는 유전자의 발현을 조절한다 ( Cotmore & Tattersall, 2007). 상기 바이러스는 우선적으로 빠르게 분열하는 암 세포에서 증식한다. 이러한 종양-선택성 (onco-selectivity)은 암성 세포가 바이러스를 더 잘 흡수하는 것에 기초하는 것이 아니라, 암 세포가 바이러스 DNA 복제에 필요한 인자, 예컨대, 시클린 (cyclin) A, E2F, 또는 CREB/ATF를 과다발현한다는 사실에 기인하는 것이다. 또한, 암 세포는 종종 바이러스 증식에 유리한 효율적인 항바이러스 면역 반응을 일으키는 능력이 부족한 경우가 많다 ( Nuesch et al. 2012). 상기 바이러스는 다수의 세포 사멸 경로를 활성화시키는 것이 알려져 있다. 세포 타입 및 성장 조건에 따라, H-1PV는 아폽토시스 (apoptosis) ( Hristov et al, 2010: Ohshima et al, 1998; Rayet et al. 1998: Ueno et al, 2001), 괴사 (Ran et al, 1999), 또는 카텝신 (cathepsin) B-의존성 세포 사멸 ( Di Piazza et al, 2007)를 유도할 수 있다. 상기 바이러스는 TRAIL (Tumor Necrosis Factor Related Apoptosis Inducing Ligand), 시스플라틴 (cisplatin)에 저항하고 및 심지어 Bcl-2가 과발현된 암세포에서도 종양용해 (oncolysis)를 유도할 수 있다 ( di Piazza et al., 2007). 후자의 결과로 Bcl-2는 파르보바이러스 세포독성의 네가티브 조절인자는 아니라는 것을 시사하였다. 파르보바이러스 및 그의 화학요법과의 조합 또는 HDAC 저해제를 이용한 암 요법이 최근 개시되었다 (WO 2009/083232 A1; WO 2011/113600 A1).
주요 비-구조 단백질 NS1은 바이러스 DNA 복제, 바이러스 유전자 발현 및 세포독성의 주된 조절인자이다. NS1의 단독 발현은, 전체 바이러스와 유사하게, 반응성 산소 종의 축적 및 DNA 손상에 의한 세포 주기 정지, 아폽토시스 및 세포 용해를 유도하기에 충분하다 ( Hristov et al, 2010). 그의 종양용해 활성의 결과로서, 상기 바이러스는 GBM에 대한 임상 시험 개시를 위해 기초가 되는 수 많은 동물 모델에서 입증된 종양억제 특성을 보유하는 것으로 나타났다 ( Geletneky et al, 2012).
지난 몇 년 동안, 종양용해 바이러스에 기반을 둔 치료 개념 외에도, 면역-종양학 (immuno-oncology) 분야는 암 퇴치에서 가치있는 접근법이 되었다. 치료적 항종양 (antitumor) 면역을 활성화시키는 최신의 유망한 접근법들 중 하나는 면역 체크포인트의 차단이다. 면역 체크포인트는 자기-관용성 (self-tolerance)을 유지하고 또한 말초 조직에서 생리적 면역 반응의 지속시간 및 진폭을 조절하여 부수적인 조직 손상을 최소화하는데 중요한 면역계에 고정되어 있는 과다한 저해 경로를 나타낸다. 종양은 면역 저항의 주요 기전으로서, 구체적으로 종양 항원에 특이적인 T 세포에 대한 특정 면역-체크포인트 경로를 사용하는 (co-opt) 것이 분명하다. 많은 면역 체크포인트가 리간드-수용체 상호작용에 의해 개시되기 때문에, 이들은 항체에 의해 쉽게 차단될 수 있거나 또는 리간드 또는 수용체의 재조합 형태에 의해 조절될 수 있다.
대부분의 암 세포에 고유한 수 많은 유전적 및 후생적 (epigenetic) 변화는 숙주 면역계가 인식할 수 있는 수 많은 종양-관련된 항원을 제공하므로, 종양은 특정 면역 저항 기전을 발생시키는 것이 필요하다. 중요한 면역 저항 기전은 면역-저해 경로를 포함하고, 이를 면역 체크포인트라고 하며, 이는 통상적으로 면역 관용성을 매개하고 또한 부수적인 조직 손상을 완화시킨다. 특히 중요한 면역-체크포인트 수용체는 세포독성 T-림프구-관련된 항원 4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4: CTLA4)이고, 이는 T 세포 활성화의 폭 (amplitude)을 하향조절한다. 정상적인 생리학에서 T-세포는, 항원-MHC 복합체에 결합하는 T-세포 수용체 및 항원 제시 세포의 표면에서 CD80 및 CD 86에 결합하는 T-세포 수용체 CD 28과 같은, 2개의 시그날에 의해 활성화된다. CTLA4는 CD80 또는 CD86에 결합하여 CD28의 상기 표면 단백질로의 결합을 방해함으로써 T-세포의 활성화를 네가티브로 조절한다. 활성인 세포독성 T-세포는 면역계가 암 세포를 공격하기 위해 필요한 반면에 조절 (regulatory) T-세포는 종양에 유익할 수 있는 다른 T-세포를 저해한다. 암에서 CTLA4의 항체 차단은 조절 T-세포 대 세포독성 T-세포의 비율에서의 변화를 고려하여 항종양 면역을 유도하였다. 그러므로, 세포독성 T-세포의 양을 증가시키고 및 조절 T-세포를 감소시킴으로써 항-종양 반응을 증가시켰다. 길항적 CTLA4 항체를 사용한 임상 연구로 흑색종 (melanoma)에서의 활성을 입증하였다. 면역-관련된 독성의 빈도가 높았음에도 불구하고, 상기 요법은 2개의 무작위 3상 임상 시험에서 생존율을 향상시켰다. 항-CTLA4 요법은 진행성 흑색종 환자에서 생존율 편익을 입증하는 최초 제제였고 또한 미국 FDA (US Food and Drug Administration)에 의해 2010년에 승인되었다 (Pardoll, D., Nature Reviews Cancer, Vol. 12, pp. 252-264, (2012)). 상기 승인된 항-CTLA4 항체는 "이필리무맙 (ipilimumab)"이라는 이름으로 알려져 있고 또한 Bristol Myers Squibb (BMS)에 의해 "Yervoy®"의 브랜드명으로 시판되었다.
일부 면역-체크포인트 수용체들, 예컨대 프로그램된 세포 사멸 단백질 1 (PD1)은 조직내에서 T 세포 이펙터 (effector) 기능을 제한한다. PD1에 대한 리간드를 상향조절하여, 종양 세포는 종양 미세환경에서 항종양 면역 반응을 차단한다. 부가의 면역-체크포인트 단백질들, 예컨대 프로그램된 세포 사멸 단백질 1 (PD1)의 차단제 (blockers)에 의한 임상적 발견은 지속성있는 임상 반응을 발휘할 수 있는 가능성과 함께 항종양 면역을 향상시킬 수 있는 광범위하고 다양한 기회를 보여준다. 임상 시험에서 PD1 경로의 차단으로 다양한 종양 타입에서 지속되는 종양 억제를 유도하는 것을 제시하였다. PD1 차단에 대한 반응은 종양 세포에 의한 PD1 리간드의 발현과 상관관계가 있을 수 있다.
2015년 9월 4일에, FDA는 FDA Fast Track Development Program에 따라 표적 PD-1에 대한 인간화 (humanized) 모노클로날 항체 펨브롤리주맙 (pembrolizumab) (또한 Merck Sharp Dohme; MSD가 판매하는 MK-3575 또는 Keytruda®로 알려져 있음)을 승인하였다. (CTLA4에 대한) 이필리무맙에 의한 치료 후에, 또는 BRAF 돌연변이를 가진 진행성 흑색종 환자에서 이필리무맙 및 BRAF 저해제에 의한 치료 후에 사용이 승인되었다.
2015년 9월 30일에, FDA는 BRAF V 600 야생형, 절제불가능한 (unresectable) 또는 전이 흑색종 환자의 치료를 위해 항-CTLA4 항체 이필리무맙과 조합된 또다른 항-PD1 항체 (니볼루맙 (nivolumab); Bristol Myers Squibb; BMS에 의해 판매되는 Opdivo ® 주사제)에 대한 신속 승인을 부여하였다.
다수의 부가의 면역-체크포인트 수용체 및 리간드의 일부가 다양한 종양 세포 타입에서 선별적으로 상향조절되는, 상기 다수의 부가의 면역-체크포인트 수용체 및 리간드는 특히 백신과 같이 항종양 면역 반응의 활성화를 향상시키는 접근법과 함께 차단을 위한 주요 표적이다.
항-PD-L1 항체 및 그의 제조 방법은 당 분야에 알려져 있다. PD-L1에 대한 이러한 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날, 및/또는 재조합, 및/또는 인간화일 수 있다. PD-L1에 대한 항체의 예는 US 특허 제8,217,149호, US 출원 제13/511,538호, US 출원 제13/478,511호에 개시되어 있다.
면역-체크포인트 경로를 표적으로 하는 예시되는 작용제는 하기 표 1에 개시되어 있다 (modified from Pardoll, D., Nature Reviews Cancer, Vol. 12, pp. 252-264, (2012):
표적 생물학적 기능 항체 또는 Ig 융합 단백질
표면 단백질 CTLA4 저해 수용체 이필리무맙
(브랜드명: Yervoy®, BMS 판매)

트레멜리무맙
(또한 티실리무맙 또는 CP-675,206으로 알려져 있음)
프로그램된 세포 사멸 1 (PD-1) 수용체 저해 수용체 MDX-1106 (또한 BMS-936558 또는 니볼루맙으로 알려져 있음, 브랜드명: Opdivo®, BMS 판매)

MK 3475 (펨브롤리주맙 또는 람브롤리주맙으로 알려져 있음, 브랜드명: Keytruda®, MSD 판매)

CT-011

AMP-224
PDL1 PD1에 대한 리간드 MDX-1105
LAG3 저해 수용체 IMP321
B7-H3 저해 리간드 MGA271
일부 종양 타입 (예컨대 흑색종, 폐 종양)에 대해 체크포인트 저해제에 의한 치료가 유망한 결과를 보였음에도 불구하고, 일부 다른 종양 (예컨대 결장, 췌장)의 환자는 이러한 치료로부터 편익을 얻지 못한다는 것이 인식되어 왔다.
그러므로, 본 발명의 목적은 개선된 암 요법을 위한 수단을 제공하고 또한 보다 넓은 범위의 종양들을 체크포인트 저해제 치료에 대해 감수성이 있도록 하는데 있다.
본 발명에 따르면, 이는 청구범위에 정의된 주제 (subject matters)에 의해 달성된다.
본 발명에 따른 연구에서, 체크포인트 저해제, 예컨대 펨브롤리주맙과 같은 항-PD1 항체가 종양용해 바이러스, 예컨대 H-1PV와 같은 파르보바이러스 또는 관련된 설치류 (rodent) 파르보바이러스와 암 세포를 사멸시키는데 시너지 효과를 발휘하는지 여부를 알아보았다. 펨브롤리주맙의 투여는 몇몇 환자에서 시너지 방식으로 상기 바이러스의 종양용해 활성을 가능하게 하는 것으로 나타났다.
본 발명은 (a) 종양용해 바이러스를 (b) 체크포인트 저해제와 조합하여 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 암을 치료하기 위한 상기 약학적 조합물의 용도를 제공한다.
바람직하게, 상기 약학적 조성물에서 상기 종양용해 바이러스 및 상기 체크포인트 저해제는 유효한 용량으로 존재하고 및 약학적으로 허용가능한 담체와 조합된다.
본원에서 사용되는 용어 "작용제 (agent)"는 조직, 시스템, 동물, 포유동물, 인간, 또는 다른 피험체에서 원하는 효과를 발휘하는 물질을 의미하는 것으로 이해한다.
따라서, 용어 "항-신생물 작용제 (anti-neoplastic agent)"는 조직, 시스템, 동물, 포유동물, 인간, 또는 다른 피험체에서 항-신생물 효과를 발휘하는 물질을 의미하는 것으로 이해한다. 또한 "작용제"는 단일 화합물 또는 둘 이상의 화합물들의 조합물 또는 조성물일 수 있음을 이해해야 한다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하는 (treating)" 및 그의 파생어 (derivates)는 치료적 요법을 의미한다. 특정 병태와 관련하여, 치료하는 것은: (1) 병태 또는 병태의 생물학적 징후의 하나 이상을 개선시키는 것, (2) (a) 병태를 유도하거나 또는 병태와 관련된 생물학적 캐스케이드 (biological cascade)에서 하나 이상의 포인트 또는 (b) 병태의 생물학적 징후의 하나 이상을 방해하는 것, (3) 병태와 관련된 증상, 효과 또는 부작용의 하나 이상을 완화시키는 것, 또는 (4) 병태의 진행 또는 병태의 생물학적 징후의 하나 이상을 지연시키는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는, "예방 (prevention)"은 병태 또는 그의 생물학적 징후의 가능성 또는 중증도를 실질적으로 줄이거나, 또는 상기 병태 또는 그의 생물학적 징후의 발병을 지연시키기 위한 약물의 예방적 투여를 나타내는 것을 의미한다. 당업자라면 "예방"은 절대적인 용어가 아님을 이해할 것이다. 예방적 요법은, 예를 들어, 피험체가 암 발생 위험이 높은 것으로 사료되는 경우, 예컨대 피험체가 암에 대해 강한 가족력을 갖거나 또는 피험체가 발암물질 (carcinogen)에 노출되었을 때 적합하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유효한 양 (effective amount)"은 예를 들면 연구원 또는 임상의에 의해 추구되는 조직, 시스템, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 이끌어 낼 약물 또는 약학적 작용제의 양을 의미한다. 또한, 용어 "치료적으로 유효한 양 (therapeutically effective amount)"은, 이러한 양을 수용하지 않은 해당하는 피험체와 비교하여, 질환, 장애 또는 부작용의 치료, 치유, 예방, 또는 개선을 향상시키는 양을 의미한다. 상기 용어는 또한 정상적인 생리적 기능을 향상시키는데 유효한 양을 그의 범위 내에서 포함한다. 질환 또는 장애를 치료 및/또는 예방하는데 유용한 "유효한 양"은 당업자에게 알려져 있는 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 조합물은 성분 화합물의 치료적으로 유효한 양의 개별 투여와 비교할 때 하기의 향상된 특성들 중 하나 이상을 제공한다는 점에서, 본 발명의 조합물의 치료적으로 유효한 양의 투여는 개별 성분 화합물들보다 유익하다: i) 가장 활성인 단일 작용제보다 항암 효과가 더 큼, ii) 시너지 또는 높은 시너지 항암 활성, iii) 부작용 프로파일은 감소시키면서 증강된 항암 활성을 제공하는 투여 프로토콜 (dosing protocol), iv) 독성 효과, 프로파일에서의 감소, v) 치료 창 (therapeutics window)에서의 증가, 또는 vi) 성분 화합물들 중 하나 또는 둘 다의 생체이용률 (bioavailability)에서의 증가.
"약학적으로 허용가능한 (pharmaceutically acceptable)"은 활성 성분들의 생물학적 활성의 유효성을 방해하지 않고, 이를 투여한 환자에게 독성이 아닌, 임의의 담체를 포함하는 것을 의미한다. 적합한 약학적 담체의 예는 당 분야에 잘 알려져 있고, 포스페이트 완충된 식염수 용액, 물, 에멀젼, 예컨대 유/수 에멀젼 (oil/water emulsions), 다양한 타입의 습윤제, 멸균 용액 등을 포함한다. 이러한 담체는 기존의 방법으로 제제화될 수 있고 또한 피험체에게 유효한 용량으로 투여될 수 있다. 부가의 약학적으로 적합한 담체는 겔, 생흡착성 매트릭스 물질 (bioadsorbable matrix materials), 치료제를 포함하는 이식 요소 (implantation elements), 또는 임의의 다른 적합한 비히클 (vehicle), 전달 또는 분배 수단 또는 물질(들)을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "암 (cancer)"은 세포 또는 조직의 비정상적인 성장을 나타내고 또한 악성 신생물 성장을 포함하는 것으로 이해된다. 용어 "신생물 (neoplastic)"은 신생물 (neoplasm)을 포함하거나 또는 이와 관련된 것을 의미한다. 일부 구체예에서 상기 암은 고형 종양, 즉 뇌암 (구체적으로 신경아교종 (gliomas): 뇌실막종 (ependymomas), 별아교세포종 (astrocytomas) [예컨대 다형성 아교모세포종], 희소돌기아교세포종 (oligodendrogliomas), 뇌줄기 신경아교종 (brainstem glioma), 희돌기교별세포종 (oligoastrocytomas); 결장암 (구체적으로 비-MSI CRC), 방광암, 간암, 유방암 (구체적으로 이중 또는 삼중 네가티브 유방암), 신장암, 두/경부 편평세포 암종, 폐암 (구체적으로 폐 편평세포 암종, 비-소세포 폐암 (non-small-cell lung cancer: NSCLS), 소세포 폐암 (small-cell lung cancer: SCLC), 악성 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장 세포 암 (renal cell cancer) 또는 위암이다. 용어 "암"은 또한 언급된 종양의 다양한 장기에서의 전이를 포함한다. 바람직한 구체예에서 상기 종양은 파르보바이러스 독성에 대해 내성이다. 부가의 바람직한 구체예에서 상기 치료될 종양은 재발 종양이다. 본 발명의 약학적 조성물의 특별한 이점은 암 개시 줄기 세포 (cancer initiating stem cells) 조차도 성공적으로 치료될 수 있다는 것이다. 이는 종양의 재발 및 전이 형성의 회피와 관련하여 긍정적인 효과를 갖는다.
다른 구체예에서 상기 암은 헴 악성종양 (heme malignancy), 즉 급성 림프모구 백혈병 (acute lymphoblastic leukemia: ALL), 급성 골수성 백혈병 (acute myeloid leukemia: AML), 만성 림프구 백혈병 (chronic lymphocytic leukemia: CLL), 만성 골수성 백혈병 (chronic myeloid leukemia: CML), 광범위 큰 B-세포 림프종 (diffuse large B-cell lymphoma: DLBCL), EBV-포지티브 DLBCL (EBV-positive DLBCL), 1차 종격 큰 B-세포 림프종 (primary mediasinal large B-cell lymphoma), T-세포(조직구)-풍부 큰 B-세포 림프종 (T-cell(histiocyte)-rich large B-cell lymphoma), 소포 림프종 (follicular lymphoma), 호지킨 림프종 (Hodgkin's lymphoma: HL), 외투 세포 림프종 (mantle cell lymphoma: MCL), 다발 골수종 (multiple myeloma: MM), 골수성 세포 백혈병-1 단백질 (myeloid cell leukemia-1 protein: Mcl-1), 척수형성이상 증후군 (myelodysplasia syndrome: MDS), 비-호지킨 림프종 (non-Hodgkin's lymphoma: NHL), 또는 작은 림프구 림프종 (small lymphocytic lymphoma: SLL)이다.
"체크포인트 저해제 (checkpoint inhibitor)"는 면역계 저해 체크포인트의 차단을 유발하는 임의의 작용제를 의미한다. 저해 면역 체크포인트의 차단은 면역계 기능을 활성화한다. 적합한 표적 및 작용제는 표 1에 언급된 것을 참조한다. 바람직한 구체예에서 암 치료를 위한 표적으로 리간드-수용체 상호작용은 막횡단 (transmembrane) 프로그램된 세포 사멸 1 단백질 (PDCD1, PD-1, 또한 CD279로 알려져 있음)과 그의 리간드, PD-1 리간드 (PD-L1, CD274) 사이의 상호작용이다. 정상적인 생리학에서 세포 표면상의 PD-L1은 면역 세포 표면상의 PD-1에 결합하고, 이는 면역 세포 활성을 저해한다.
암 세포 표면상에서 PD-L1의 상향조절로 종양 세포를 공격할 수 있는 T 세포를 저해함으로써 환자의 면역계를 회피하도록 할 수 있다. PD-1 또는 PD-L1에 결합하여 상호작용을 차단하는 항체는 T-세포가 종양을 공격하도록 한다. 그러므로, 바람직한 일 구체예에서, PD-1 길항제는 체크포인트 저해제로 사용된다.
"PD-1 길항제 (PD-1 antagonist)"는 암 세포에서 발현된 PD-L1의 면역 세포 (T 세포, B 세포 또는 NKT 세포)에서 발현된 PD-1로의 결합을 차단하고, 또한 바람직하게 암세포에서 발현된 PD-L2의 면역-세포 발현된 PD-1로의 결합을 차단하는 임의의 화학적 화합물 또는 생물학적 분자를 의미한다. PD-1 및 그의 리간드에 대한 대체명 또는 동의어는 하기를 포함한다: PD-1에 대해 PDCD1, PD1, CD279 및 SLEB2; PD-L1에 대해 PDCD1L1, PDL1, B7H1, B7-4, CD274 및 B7-H; 및 PD-L2에 대해 PDCD1L2, PDL2, B7-DC, Btdc 및 CD273. 인간 개체가 치료되는 본 발명의 치료 방법, 약제 및 용도에서, 상기 PD-1 길항제는 인간 PD-L1의 인간 PD-1로의 결합을 차단하고, 또한 바람직하게 인간 PD-L1과 PD-L2 둘 다의 인간 PD-1로의 결합을 차단한다. 인간 PD-1 아미노산 서열은 NCBI Locus N.에서: 각각 NP_054862 및 NP_079515로 찾을 수 있다.
본 발명의 치료 방법, 약제 및 용도에서 유용한 PD-1 길항제는 모노클로날 항체 (monoclonal antibody: mAb), 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하고, 이는 PD-1 또는 PD-L1에 특이적으로 결합하고, 또한 바람직하게 인간 PD-1 또는 인간 PD-L1에 특이적으로 결합한다. 상기 mAb는 인간 항체, 인간화된 항체 또는 키메라 항체 (chimeric antibody)일 수 있고, 또한 인간 불변 영역 (constant region)을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서 인간 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 불변 영역으로 구성된 군으로부터 선택되고, 및 바람직한 구체예에서, 상기 인간 불변 영역은 IgG1 또는 IgG4 불변 영역이다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단편은 Fab, Fab'-SH, F(ab')2, scFv 및 Fv 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다.
인간 PD-1에 결합하고, 또한 본 발명의 치료 방법, 약제 및 용도에서 유용한 mAbs의 예는 US 7,521,051, US 8,008,449, 및 US 8,354,509에 개시되어 있다. 본 발명의 치료 방법, 약제 및 용도에서 PD-1 길항제로서 유용한 특정 항-인간 PD-1 mAbs는 하기를 포함한다: WHO Drug Information, Vol. 27, No. 2, pages 161-162 (2013)에 개시된 구조를 갖는 인간화된 lgG4 mAb인, MK-3475 (펨브롤리주맙); WHO Drug Information, Vol. 27, No.1, pages 68-69 (2013)에 개시된 구조를 갖는 인간 lgG4 mAb인, 니볼루맙 (BMS-936558); WO2008/156712 A1에 개시된, 인간화된 항체 h409A11, h409A16 및 H409A17.
종양 세포에 대해 잠재적으로 세포독성이 있는 임의의 바이러스 타입을 본 발명의 조합물에서 사용할 수 있다는 것을 당업자는 알 것이다. 본 발명에서 사용된 복제 적격 독성 바이러스는 종양을 용해 (lysis)에 의해 사멸시키는데 영향을 줄 수 있고, 즉 종양용해성이거나, 또는 종양 세포를 다른 기전을 통해 사멸시킬 수 있다. 본 발명의 실시에서 사용하기 위한 바이러스의 특정 예로는 아데노바이러스 (adenovirus), 레트로바이러스 (retrovirus), 소수포 구내염 바이러스 (vesicular stomatitis virus), 뉴캐슬 병 바이러스 (Newcastle Disease virus), 폴리오마 바이러스 (polyoma virus), 우두증 바이러스 (vaccinia virus), 단순 헤르페스 바이러스 (herpes simplex virus) 및 파르보바이러스 (parvovirus)를 포함한다. 바람직하게 상기 종양용해 바이러스는 파르보바이러스, 더 바람직하게는 파르보바이러스 H-1, 또는 LuIII, 마우스 미세 바이러스 (Mouse minute virus: MMV), 마우스 파르보바이러스 (Mouse parvovirus: MPV), 래트 미세 바이러스 (Rat minute virus: RMV), 래트 파르보바이러스 (Rat parvovirus: RPV) 또는 래트 바이러스 (Rat virus: RV)로부터 선택된 관련된 설치류 파르보바이러스이다.
본원에서 사용되는 용어 "종양용해 바이러스 (oncolytic virus)" 및 구체적으로 "파르보바이러스 (parvovirus)" 또는 "파르보바이러스 H-1 (parvovirus H-1)"은 야생형 또는 그의 변형된 복제-적격 유도체, 뿐만 아니라 이러한 바이러스 또는 유도체에 기반한 관련된 바이러스 또는 벡터를 포함한다. 적합한 종양용해 바이러스, 유도체 등뿐만 아니라 상기 바이러스를 활발하게 생산하는데 사용될 수 있고 또한 치료에 유용한 세포는 본원의 개시내용에 기반하여 과도한 실험적 노력 없이 당분야의 기술안에서 용이하게 결정할 수 있다.
화합물들의 투여는 다양한 방법, 예컨대 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 국소, 종양내 또는 피부내 투여에 의해 실시될 수 있다. 투여 경로는 물론 요법의 종류 및 약학적 조성물내에 함유된 화합물의 종류에 따라 다르다. 상기 바이러스 및 체크포인트 저해제의 용량 용법 (dosage regimen)은 당분야의 기술내에서, 환자 데이터, 관찰 및 다른 임상 요인으로, 예를 들어 환자 크기, 체표면적, 연령, 성별, 투여되는 특정 바이러스, 특정 저해제 등, 투여 시간 및 경로, 종양 타입 및 특성, 환자의 일반적 건강 상태, 및 환자가 투여받고 있는 다른 약물 요법을 포함하는 임상 요인에 기반하여 전문의에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 체크포인트 저해제에 관해서는 본원에 참고로 포함된 패키지 설명서 (package insert) 및 환자 정보 시트를 참고한다. 본 발명의 조합 요법에 대한 용량 용법 (또한 본원에서 투여 용법으로 지칭됨)의 선택은, 실재물 (entity)의 혈청 또는 조직 전환율 (turnover rate), 증상의 수준, 실재물의 면역원성 (immunogenicity), 및 치료되는 개체에서 표적 세포, 조직 또는 장기의 접근성 (accessibility)을 포함하는 몇가지 요인에 따라 다르다. 바람직하게, 용량 용법은 부작용의 허용가능한 수준과 일치하는 환자에게 전달되는 각 치료제의 양을 최대화한다. 따라서, 상기 조합물에서 각 치료제의 투여량 및 투여 빈도는 특정 치료제, 치료되는 암의 중증도, 및 환자 특성에 일부 의존한다. 적합한 용량의 항체, 시토킨 및 소 분자를 선택하는 지침이 이용가능하다. 예컨대, Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd. Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY; Bach (ed.)(1193) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcek Dekker, New York, NY; Beart et al, (2003) New Engl . J. Med . 348:601-608; Milgrom et al. (1999) New Engl .J. Med 341 :1966-1973; Slamon et al. (2001) New Engl . J. Med . 344:783-792; Beniaminovitz et al. (2000) New Engl . J. Med . 342:613-619; Ghosh et al. (2003) New Engl . J. Med . 348:24-32; Lipsky et al. (2000) New Engl . J. Med . 343; 1594-1602; Physicians'Desk Reference 2003 (Physicians'Desk Reference, 57th ed); Medical Economics Company; ISBN; 1563634457; 57th edition (November 2002)을 참조한다. 적합한 용량 용법의 결정은 임상의에 의해서, 예컨대, 치료에 영향을 미치거나 또는 치료에 영향을 미치는 것으로 예측된 당 분야에 알려져 있거나 또는 의심되는 파라미터 또는 요인을 사용하여 이루어질 수 있고, 또한 예를 들어 환자의 임상 병력 (예컨대, 이전 치료), 치료되는 암의 유형 및 단계 및 조합 요법에서 치료제들의 하나 이상과 반응하는 바이오마커에 따라 다를 것이다.
본 발명에 따른 체크포인트 저해제와 조합되는 바이러스는 혈액 계통 (blood system)을 통해 침투할 수 있는 역량을 갖는 감염성 바이러스 입자를 포함하기 때문에, 치료는 상기 바이러스의 정맥내 주사에 의해 수행되거나 또는 적어도 개시될 수 있다. 그러나, 바람직한 투여 경로는 종양내 투여이다.
장기적인 정맥내 치료는 바이러스에 대한 중화 항체 (neutralizing antibodies) 형성의 결과로 비효율적이 되기 쉽기 때문에, 초기 용법인 정맥내 바이러스 투여 후에 다양한 투여 모드가 채택될 수 있거나, 또는 종양내 바이러스 투여와 같은 다른 투여 기술이 바이러스 치료의 전체 과정에 걸쳐 대안으로 사용될 수 있다.
다른 특정 투여 기술로서, 바이러스 (바이러스, 벡터 및/또는 세포 작용제)는 환자에게 이식된 소스 (source)로부터 상기 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 카테터 (catheter), 예컨대, 실리콘 또는 다른 생체적합성 물질의 카테터를 종양 제거 동안 또는 별도의 절차에 의해 환자에게 설치된 작은 피하 저장소 (Rickham reservoir)에 연결하여 상기 파르보바이러스 조성물을 다양한 시간들에서 추가의 외과적 개입 없이 주사되도록 할 수 있다. 상기 바이러스 또는 유래된 벡터는 또한 상기 종양에 정위 수술 기술 (stereotactic surgical techniques) 또는 네비게이션 표적화 기술 (navigation targeting techniques)에 의해 주입될 수 있다.
상기 바이러스의 투여는 또한 바이러스 입자 또는 바이러스 입자를 함유하는 유액을 이식된 카테터를 통해 적합한 펌프 시스템, 예컨대, 연동 인퓨젼 펌프 (peristaltic infusion pumps) 또는 대류 증강된 전달 (convection enhanced delivery: CED) 펌프를 사용하여 저유속으로 연속 인퓨젼에 의해 수행될 수 있다.
바이러스 조합 부분의 또 다른 투여 방법은 원하는 암 조직에 상기 파르보바이러스를 분배하도록 구성되고 배열된 이식된 물품으로부터이다. 예를 들어, 상기 바이러스, 구체적으로 파르보바이러스 H-1이 함침되어 있는 웨이퍼 (wafers)를 사용할 수 있고, 상기 웨이퍼는 외과적 종양 제거의 마지막에 절제 캐비티 (resection cavity)의 에지에 부착된다. 다수의 웨이퍼가 이러한 치료적 개입에서 사용될 수 있다. 상기 바이러스, 또는 바이러스-기반 벡터를 활발하게 생산하는 세포를 상기 종양 또는 종양 제거 후에 종양 캐비티로 주입할 수 있다.
또한 더 적은 치료적 용량으로 바이러스 및/또는 체크포인트 저해제의 임상적 사용으로 안전성을 높이고 및 부작용을 감소 및/또는 회피하면서 항암 효능을 유지 또는 심지어 향상시킬 수 있다. 상기 바이러스와 체크포인트 저해제 사이의 강한 시너지 효과의 관점에서, 치료적 용량의 감소를 예견할 수 있고, 예컨대 이전에 사용된 단일 성분 용량의 1/2 또는 1/3로 원하는 치료 효과를 유지한다. 감소된 용량의 측면에서 (심각한) 부작용을 감소 또는 심지어 회피할 수 있다.
파르보바이러스의 사례에서 감염 효과는 종양 세포를 사멸시키지만, 정상 세포에 해를 끼치지 않았고 또한 이러한 감염은, 예를 들어, 적합한 파르보바이러스, 예컨대, 파르보바이러스 H-1, 또는 이러한 바이러스에 기반한 관련 바이러스 또는 벡터의 종양내 사용으로 수행되어, 유해한 신경학적 또는 다른 부작용 없이 종양-특이적 요법을 수행할 수 있다.
본 발명의 조합 요법은 종양을 제거하기 위해 수술 이전 또는 이후에 사용될 수 있고, 또한 방사선 요법 이전, 도중 또는 이후에 사용될 수 있다.
본 발명의 조합 요법은 통상적으로 촉진 (palpation) 또는 MRI, 초음파, 또는 CAT 스캔과 같은 당분야에 잘 알려져 있는 영상화 기술에 의해 발견될 정도로 충분히 큰 종양을 치료하는데 사용된다. 일부 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조합 요법은 적어도 약 200 mm3, 300mm3, 400mm3, 500mm3, 750mm3, 또는 최대 1000mm3의 치수를 갖는 진행성 단계 종양을 치료하는데 사용된다.
상기 약학적 조합물은 또한 하나 이상의 부가의 치료제를 포함할 수 있다. 상기 부가의 치료제는, 예컨대, 화학요법제, 생물요법제 (VEGF에 대한 항체, EGFR, Her2/neu, VEGF 수용체, 다른 성장 인자 수용체, CD20, CD40, CD40L, CTLA-4, OX-40 4-1BB, 및 ICOS를 포함하지만, 이에 한정되지 않음), 면역원성 작용제 (immunogenic agent) (예를 들어, 약독화된 (attenuated) 암성 세포, 종양 항원, 항원 제시 세포 예컨대 종양 유래된 항원 또는 핵산으로 펄스된 수지상 세포 (dendritic cells), 면역 자극 시토킨 (immune stimulating cytokines) (예를 들어, IL-2, IFNα2, GM-CSF), 및 면역 자극 시토킨을 코딩하는 유전자로 형질감염된 세포 (예컨대 GM-CSF로, 이에 한정되지 않음)일 수 있다.
화학요법제의 예로는 알킬화제 예컨대 시클로스포스파미드 (cyclosphosphamide), 부술판 (busulfan), 캄프토테신 (camptothecin), 클로로조토신 (chlorozotocin), 포테무스틴 (fotemustine), 로무스틴 (lomustine), 니무스틴 (nimustine), 라니무스틴 (ranimustine), 항생제 (antibiotics), 블레오마이신 (bleomycins), 카미노마이신 (caminomycin), 닥티노마이신 (dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 이다루비신 (idarubicin), 5-플루오로우라실 (5-flourouracil: 5-FU), 메토트렉세이트 (methotrexate), 시타라빈 (cytarabine), 백금 유사체 (platinum analog) 예컨대 시스플라틴 (cisplatin) 및 카르보플라틴 (carboplatin); 빈블라스틴 (vinblastine), 백금 (platinum); 에토포시드 (etoposide) (VP-16); 이포스파미드 (ifosfamide), 미톡산트론 (mitoxantrone); 빈크리스틴 (vincristine); 비노렐빈 (vinorelbine); 노반트론 (novantrone); 테니포시드 (teniposide); 에다트렉세이트 (edatrexate); 다우노마이신 (daunomycin); 아미노프테린 (aminopterin), 젤로다 (xeloda); 이반드로네이트 (ibandronate); 토포이소머라제 저해제 (topoisomerase inhibitors); 디플루오로메틸로르니틴 (difluoromethylornithine: DMFO); 레티노이드 (retinoids), 타목시펜 (tamoxifen), 랄록시펜 (raloxifene), 드롤록시펜 (droloxifene), 4-히드록시타목시펜 (4-hydroxytamoxifen), 트리옥시펜 (trioxifene), 케옥시펜 (keoxifene) 또는 아로마타제 저해제 (aromatase inhibitors)를 포함한다.
본 발명은 또한 암을 치료하기 위한 (a) 약학적 조성물(들) 또는 조합물의 제조를 위한 (a) 파르보바이러스 H-1 및 (b) 체크포인트 저해제의 용도에 관한 것이다.
상기 (a) 및 (b)의 투여 방식은 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있고, 바람직하게 상기 (a) 및 (b)는 순차적으로 (또는 개별적으로) 투여된다. 이는 (a) 및 (b)를 함께 취하기 위한 단일의 단위 투여 형태 (unit dosage form)로 또는 동시에 또는 특정 시간 차이를 두고 투여되기 위한 개별 실재물 (예컨대, 개별 용기)로 제공할 수 있다는 것을 의미한다. 상기 시간 차이는 1시간 내지 1주, 바람직하게 12시간 내지 3일이다. 또한, 상기 바이러스는 상기 체크포인트 저해제와는 다른 투여 방법을 통해 투여할 수 있다. 이와 관련하여, 상기 바이러스 또는 체크포인트 저해제를 종양내로 및 다른 것은 전신 또는 경구로 투여하는 것이 유익할 수 있다. 특정 바람직한 일 구체예에서, 상기 바이러스는 종양내로 투여되고 및 상기 체크포인트 저해제는 정맥내로 투여된다. 바람직하게, 상기 바이러스 및 체크포인트 저해제는 개별 화합물로 투여된다. 상기 2개의 작용제에 의한 수반 치료 (concomitant treatment)가 또한 가능하다.
본 발명의 조합 요법에서 각 치료제는 단독으로 또는 표준 약제학 관행에 따라, 상기 치료제와 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제를 포함하는 약제 (또한 본원에서 약학적 조성물로 지칭함)로 투여될 수 있다. 본 발명의 조합 요법에서 각 치료제는 동시에 (즉, 동일한 약제 중에), 병행하여 (즉, 임의의 순서로 하나를 투여하고 바로 다른 것을 투여하는 개별 약제 중에) 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여될 수 있다. 순차적 투여는, 상기 조합 요법에서 치료제가 다른 투여 형태 (하나의 작용제는 정제 또는 캡슐이고 다른 작용제는 멸균액임)이고 및/또는 다른 투여 스케쥴, 예컨대 화학요법제는 적어도 매일 투여되고 생물요법제는 보다 덜 빈번하게, 예컨대 1주일에 한번, 2주일에 한번, 또는 3주일에 한번 투여되는 경우에 특히 유용하다.
일부 구체예에서, 상기 조합 요법에서 치료제들 중 적어도 하나는, 상기 작용제가 동일한 암을 치료하기 위한 단일요법으로 사용되는 경우에 통상적으로 사용되는 동일한 용량 용법 (용량, 빈도 및 치료 기간)을 사용하여 투여된다. 다른 구체예에서, 환자는 조합 요법에서 상기 치료제들 중 적어도 하나의 전체 양을 상기 작용제가 단일요법으로 사용되는 경우보다 더 적게 받고, 예컨대, 더 적은 용량, 덜 빈번한 투여, 및/또는 더 짧은 치료 기간을 받는다. 본원에 개시된 체크포인트 저해제 및 종양용해 바이러스는 키트 (kit)로서 제공될 수 있고, 상기는 제1 용기 및 제2 용기 및 패키지 설명서를 포함한다. 상기 제1 용기는 체크포인트 저해제, 바람직하게 항-PD-1 길항제를 포함하는 약제의 적어도 하나의 용량을 포함하고, 상기 제2 용기는 종양용해 바이러스를 포함하는 약제의 적어도 하나의 용량을 포함하며, 및 패키지 설명서, 또는 레이블 (label)은 상기 약제들을 사용하여 암 환자를 치료하기 위한 지침을 포함한다. 상기 제1 및 제2 용기들은 동일하거나 또는 상이한 형태 (예컨대, 바이알, 주사기 및 보틀) 및/또는 재료 (예컨대 플라스틱 또는 유리)로 이루어질 수 있다. 상기 키트는 상기 약제들을 투여하는데 유용할 수 있는 다른 재료들, 예컨대 희석제, 필터, IV 백 (bags) 및 라인 (lines), 바늘 (needles) 및 주사기 (syringes)를 더 포함할 수 있다. 상기 키트의 일부 바람직한 구체예에서, 상기 항-PD-1 길항제는 항-PD-1 항체이고 및 상기 지침은 상기 약제가 IHC 분석에 의해 PD-L1 발현에 대해 포지티브로 검사된 암 환자를 치료하는데 사용하기 위한 것임을 명시하고 있다.
본 발명에서 종양용해 바이러스, 구체적으로 파르보바이러스 H-1PV, 및 체크포인트 저해제, 구체적으로 펨브롤리주맙의 조합 사용이 암, 구체적으로 뇌 종양, 결장 암종 및 췌장 암종에 대한 유효한 접근법일 수 있다는 것을 처음으로 개시하였다. 실시예에서 더 자세하게 설명되는 바와 같이, 체크포인트 저해제 치료에 통상적으로 반응하지 않는 종양 타입 (CRC)에서 전이 크기를 감소시키는 것이 놀랍게도 가능했다. 더욱 놀랍게도, 수술이 불가능한 원발성 다형성 아교모세포종에서 상당한 종양 크기 감소가 얻어졌다.
이론에 구속되지 않고, 전술한 바와 같이 종양은 면역 체크포인트 경로를 사용하여, 예컨대 종양 쪽 PD-L1의 T-세포 쪽 PD-1 수용체로의 결합을 통해, 면역계에 의한 공격으로부터 종양 그 자신을 숨긴다. 이는 상기 종양에 대한 신체의 면역 관용성을 유도한다. 면역 체크포인트 저해제는 면역 체크포인트 경로를 차단하는 항체 (예컨대 항-PD-L1 또는 항-PD1 항체들)이다. 결과적으로 상기 면역 관용성은 파괴되고 및 면역 세포는 종양을 인식하고 이를 공격할 수 있다. 그러나, 이는 모든 종양 타입에 대해 작동하는 것은 아니며, 이는 활성화된 면역 세포가 상기 종양으로 침입하는 것을 불가능하게 하는 미세환경을 종양들이 종종 갖기 때문이다. 상기 종양으로의 이러한 침입은 현재 종양용해 바이러스, 구체적으로 파르보바이러스, 더 구체적으로 파르보바이러스 H-1을 사용하여 가능하게 하였고, 이는 상기 종양을 공격하고 이의 미세환경을 변경시켰다. 즉, 상기 종양용해 바이러스는 종양용해를 통해 상기 종양을 "네이키드 (naked)"로 만들 수 있고 및 상기 체크포인트 저해제를 사용하여 "무장된 (armed)" 면역 세포들이 상기 종양으로의 침입을 시작할 수 있다. 상기 종양용해 바이러스는 성공적인 면역 반응을 위한 열쇠 (door opener)로 볼 수 있다. 이러한 개념으로, 임의의 종양 타입, 또한 과거에 체크포인트 저해제 치료가 실패했던 종양 타입을, 상기 종양용해 바이러스 치료로 면역원성 종양 중에 비-면역원성 종양으로 형질전환하기 때문에, 치료할 수 있다. 일반적인 원리에 비추어, 상기는 종양 미세환경을 변경하는 한 임의의 종양용해 바이러스 및 임의의 체크포인트 저해제로 작동한다. 이는 질병 재발 예방에서 장기적인 효과를 유도할 수 있어서, 잠재적으로 초기 종양용해에 추가된다. 이러한 효과들의 조합은, 특히 바이러스에 의한 사전 요법 이후에, 상기 종양을 면역계에 더 감수성이 있게 만들었다. 환자의 예들은 상기 조합 요법으로 완화 또는 안정된 질환으로 유도되는 것을 보여준다.
암 진행을 검사할 때, 특히 암 세포 및 면역 세포를 포함하는 상이한 세포들 사이의 서서히 전개되는 누화 (evolving crosstalk)가 이용되는 것으로 밝혀졌다. 암 세포는 면역 미세환경 및 면역 세포의 기능을 변경하여 면역억제 및 면역 회피를 유도할 수 있다 (Fridman et al., 2012; Gabrilovich et al., 2012; Halama et al., 2011 (a), 2011 (b)). 예를 들어, 결장직장 암 (colorectal cancer: CRC)의 간 전이 사례에서, 결장직장 암 간 전이의 침습 경계 (invasive margin)는 그 자체 치수의 면역학적 미세환경이라는 것이 밝혀졌다. 이러한 환경은 별개의 케모킨 구배 (chemokine gradient)에 따라 T 림프구를 침습 경계로 이동시키는 것을 유도하였다. T 림프구에 침투하면 CCL5의 자체 생산을 통해 종양 자극 효과를 발휘한다. 결장직장 암의 간 전이에서 미세환경은 Th1, Th2 또는 Th17 환경 (milieu)을 나타내지 않지만, 대신에 케모킨 및 성장 인자 예컨대 VEGF, HGF 및 MIF를 포함하는 종양-촉진 염증에 최적화되어 있다 (Halama et al., 2016). 상기 논문에서 a) 면역억제 랜드스케이프 (landscape), b) 결장직장 암 전이의 가능한 종양-방어 기전 및 c) 종양 및 전이에서 특정 면역 세포 서브세트의 종양-촉진 특성이 강조되었다. 상기 공개에서, 이는 또한 종양 세포는 침습 경계에서 PD-L1 네가티브인 것으로 개시되었다. 이는 체크포인트 저해제들에 의한 치료가 몇가지 종양 실재물에서 그렇게 성공하지 못한 이유에 대한 설명일 수 있다. 전술한 바와 같이, 상기 미세환경은 상기 종양용해 바이러스에 의해 변경되고 그 후 면역 세포는 상기 종양에 성공적으로 진입하고 이를 공격할 수 있다. 이와 관련하여, 파르보바이러스 H-1 및 PD1 항체에 의한 치료 후에 T 세포 밀도의 유의한 증가가 상기 종양에서 관찰되었고 또한 대부분의 T 세포는 PD 1 포지티브라는 것을 보여주는 실시예 2 및 도 1-9를 참조한다.
본 발명은 하기 비-제한적인 실시예, 방법 및 도면을 참조로 하여 단지 예시로서 개시될 것이다.
도 1: 간 전이 (CD3)의 생검 1의 면역형광은 중요한 종양 부위인, CD3 포지티브 세포의 명확한 침윤물을 보여준다. 침윤물들은 이질성 (heterogenous)이다.
도 2: 간 전이 (CD8)의 생검 1의 면역형광은 이질성인 이펙터 T 세포의 명확한 침윤물을 보여준다. 흥미롭게도, 관찰되기 드문 종양 상피를 갖는 CD8+ T 세포가 가까이에 있다.
도 3: 간 전이 (PD-1)의 생검 1의 면역형광은 주로 간질 구획 (stromal compartment)에 T 세포가 풍부한 것을 보여준다. 이들 대부분은 PD1 포지티브이다.
도 4: 간 전이 (CD3)의 생검 2의 면역형광은 H-1 PV + PD-1 항체의 첫 번째 주입 후에 T 세포 밀도의 유의한 증가가 관찰된 것을 보여준다 (약 + 30-50%). 또한 이질성 패턴.
도 5: 간 전이 (CD8)의 생검 2의 면역형광은 CD8+ T 세포 밀도에서 유의한 증가를 보였다. 매우 이질성. CD8+ T 세포와 종양 세포의 밀접한 접촉.
도 6: 간 전이 (PD-1)의 생검 2의 면역형광은 대부분의 T 세포가 PD-1 포지티브인 것을 보여준다.
도 7: 간 전이 (CD3)의 생검 3의 면역형광은 H-1 PV + PD-1 항체에 의한 두번째 주입 후에 여전히 T 세포 밀도의 증가를 보였다. 또한 매우 이질성.
도 8: 간 전이 (CD8)의 생검 3의 면역형광은, 생검 2와 유사하게, 조밀한 T 세포 침윤물을 보였다.
도 9: 간 전이 (PD-1)의 생검 3의 면역형광은 여전히 대부분의 T 세포가 PD-1 포지티브임을 보였다.
도 10-15: 시토킨 프로파일
Multiplex-Cytokine 정량화로부터의 데이터
단백질 정량화 참조
각 생검에 대해 동일한 단백질 양
비율로 나타냄 (점으로 표시된 컬럼은 단백질 양이 너무 적어서 로부스트되지 않음)
도 10: 증가/상향조절된 단백질들:
CTACK-CCL27, IL-16, SDF-1 알파, IP-10, MIP-1b
도 11: 감소/하향조절된 단백질들:
G-CSF, IL-5, IL-7, IL-13, IL-12p40, FGP basic, MIF, SCGF-β, IL-1 알파
도 16: 진행성 재발 다형성 아교모세포종의 치료 전 및 치료 (H-1 PV + 펨브롤리주맙을 투여하고 55일 및 101일에) 중의 MRI
상단 열: H-1 PV + 펨브롤리주맙에 의한 치료 전
중간 열: H-1 PV + 펨브롤리주맙을 투여하고 55일
하단 열: H-1 PV + 펨브롤리주맙을 투여하고 101일
실시예
실시예 1: 일반적인 방법
(a) FISH (Fluorescence in situ hybridization)
FISH 분석: 방법 절차는 본질적으로 Silahtaroglu et al (Molecular and Cellular Probes. 2003; 17:165-169) 및 Nehme et al (J Neurosci Methods. 2011; 196:281-288)에 개시된 바와 같이 수행하였다. 상기 FISH 분석은 인 비트로에서 배양된 인간 NBK 세포에서 먼저 확립되었고 및 면역결핍 래트에서 인간 신경아교종 이종이식편 (xenografts)으로부터 유래된 파라핀-포매된 (paraffin-embedded) 종양 조직으로 확장되었다. 그 다음에 상기 분석 프로토콜은 환자-유래된 파라핀-포매되거나 또는 저온보존된 (cryopreserved) 종양 물질에서 H-1PV DNA 및 RNA 서열의 검출에 적용하였다.
포지티브 및 네가티브 대조군들: 각 FISH 분석에서, 래트에서 H-1PV- 또는 모의-치료된 (mock-treated) 인간 신경아교종 이종이식편으로부터 유래된 파라핀-포매된 종양 조직을 각각 포지티브 또는 네가티브 대조군들로 사용하였다. 프로브 (probe) (시약 대체 네가티브 대조군; 표적-특이적 혼성화 프로브 생략) 및 미스매치 (mismatch) (3-5개의 뉴클레오티드가 스왑된 표적-특이적 혼성화 프로브) 대조군은 또한 포함되지 않았다.
혼성화 프로브 : 표적-특이적 혼성화 프로브는 Exiqon (Vedbaek , Denmark)에 의해 주문-디자인되어 H-1PV 비-구조적 (NS) 및 구조적 (VP) 단백질 코딩 서열을 인식하였고 및 증가된 표적 특이성 및 높은-역가의 결합을 갖는 잠긴 핵산 (locked nucleic acid: LNA) 올리고뉴클레오티드를 나타내었다 (참고를 위해, www.exiqon.com 참조). 상기 프로브들은 H-1PV 네가티브 (센스) 또는 포지티브 (안티센스) 가닥 DNA에 역 상보성 (reverse complementation)에 의해 합성되었고 또한 그의 3' 및 5' 말단에서 이중 디곡신 (double digoxin: DIGN)-표지되었다. NS- 및 VP-특이적 프로브 모두는 동일한 양의 혼합으로 적용되어, 혼성화 시그날을 증가시켰다.
NS1- 안티센스 :
5DIGN/TCAGCACACAACAGATGGCAT/3DIGN
VP- 안티센스 :
5DIGN/TACTATCCAGAGCAACCATCAT/3DIGN
NS1-센스:
5DIGN/AATTCGCTAGGTTCAATGCGCT/3DIGN
VP-센스:
5DIGN/TGACCTACCAACATCAGATACA/3DIGN
시그날 시각화: 시그날 시각화는 호스래디쉬 (horseradish) 퍼옥시다제 (Roche, Sigma-Aldrich, Munich, Germany)로 콘쥬게이트된 항-DIGN 항체, 및 티라미드 시그날 증폭 (Tyramide Signal Amplification: TSA)/시아닌 (cyanine: Cy) 3 시약 (Perkin Elmer, Germany)과 순차적 인큐베이션에 의해 달성되었다. 영상 수집은 Zeiss Cell Observer 현미경 및 ZEN 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.
시그날 정량화: 포지티브 시그날의 정량화 분석을 위해 Fiji ImageJ 소프트웨어를 사용하였고, 및 목적에 따라 개발된 커스톰 매크로 (purpose-developed custom macros) (Dr. D. Krunic, German Cancer Research Center, Heidelberg, Germany) 및 일정한 프로세싱 세팅 (constant processing settings)을 사용한 자동 분석으로 수행하였다. 결과는 현미경 관찰 필드 (dFOV=1.000 μm)당 포지티브 시그날의 평균 세기 및/또는 표지된 세포 당 포지티브 시그날의 평균 세기로 나타내었다. 배경 형광 값 (미스매치 프로브에 의해 발생된 거짓 (false)-포지티브 시그날)은 포지티브 시그날과 네가티브 시그날 사이의 컷오프 (cut-off)를 정의하였다. 시그날 세기는 임의 단위 (arbitrary units: a.u.)로 표시하였다.
(b) 세포 배양 및 증식 분석
T 세포를 건강한 공여체 (donors)로부터 추출하고 및 짧은 휴지 (rest) 후에 CD3/CD28 코팅된 96 웰 플레이트 (미국 BioLegend로부터의 항-CD3, 독일 BD로부터의 항-CD8)에서 밤새 자극시켰다. T 세포 배양 배지는 RPMI 1640 (PAA, USA), 10% 인간 혈청 (56 ℃에서 30분 동안 열-불활성화), 1% 글루타민 (PAA, USA), 1% 페니실린/스트렙토마이신 (PAA, USA), 1% 비-필수 아미노산 (PAA, USA) 및 1% HEPES (PAA, USA)를 포함하였다. 시판되는 종양 세포주들을 공급자의 지침에 따라 배양하였다. 세포들의 정량화는 자동화된 세포 계수기 TC10 (BioRad, Germany)에 의해 2번 측정으로, 구체적으로 시딩 직후 (즉 증식 분석을 위해 플레이트에서 동일하게 시딩된 세포의 ml에 대해 0.5 * 105개의 세포) 및 인큐베이션/처리 후에 3중으로 수행하였다. 1차 세포주는 최근에 개시된 바와 같이 Multiplexion에 의한 Multiplex Cell Authentication (Heidelberg, Germany)를 사용하여 인증되었다 (Castro et al., 2013). 공지된 프로파일과 매치된 SNP 프로파일은 독특했고, 인간 상피 종양 세포주와 일치하였다. 모든 세포주는 PCR에 의해 미코플라스마 (Mycoplasma) 오염 여부에 대해 검사하였다.
(결장직장 암 환자로부터의) 복수 (ascites)의 제조 및 마크로파지 (macrophages) 및 림프구의 추출은 하기와 같이 수행하였다. 이전의 보고로부터 조정하여 복수를 멸균 플라스틱 백에 수집하였다. 각 백의 출구 노즐 (outlet nozzle)은 70% 알콜로 소독하여 준비하였고 및 복수의 제1 분획물을 버리고, 남은 복수를 50 ml Falcon 튜브 중에 분배하였다. 1500 rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 RPMI 배지와 (1:2)로 혼합하였고 및 조건 배지 (conditioned medium: CM)로 사용하였다. 마크로파지 집단 (a)의 경우, 그 다음에 펠렛 (pellets)을 RPMI 배지에 현탁시켰고 및 Ficoll 구배 (실온에서 2000 rpm에서 30분)를 통해 실행하였다. 그 다음에 인터페이스 (interphase)를 RPMI에서 수집하였고, 세척하였고, 및 원심분리하였고 (1800 rpm에서 10분) 및 그 다음에 결과의 (resulting) 펠렛을 RPMI를 갖는 셀 플라스크 (cell flasks)로 시딩하였다. 마크로파지 집단의 경우 그 다음에 상층액을 1.5시간 (37℃)의 부착 단계 (adherence step) 후에 수확하였고, 나머지 부착 세포를 PBS로 (3회) 세척하였고, 그 다음에 CM을 보충하였다. 림프구 (b)의 경우, 그 다음에 펠렛을 RPMI 배지에 재현탁시켰고, 다시 원심분리하였고, 그 다음에 펠렛을 RPMI를 갖는 셀 플라스크로 시딩하였다. 부착 후에, 상층액을 사용하여 림프구를 추출하였다. 마크로파지 또는 림프구에 의한 실험 후에, 상층액을 시토킨에 대해 측정하였고 및 세포를 염색 (마크로파지에 대해 CD163 및 CD68, 종양 세포에 대해 CEA 및 림프구에 대해 CD3 이중 염색)으로 수확 및 분석하였고 및 세포 콘텐트의 순도를 조절하였다 (>95%). 종양 세포의 추출은 종양 조직의 해리 및 부착 단계들 후에 수행하였다.
(c) 시토킨 & 케모킨 정량화
2개의-레이저 어레이 판독기 (two-laser array reader)는 관심있는 모든 시토킨 및 케모킨을 동시에 정량화하였다. 5-파라미터 로지스틱 플롯 회귀 공식 (5-parameter logistic plot regression formula)을 기반으로 하는 Bio-Plex Manager 4.1.1에 의해 표준 곡선 및 농도를 산출하였다. 간단하게, 절제된 동결 조직의 작은 조각을 150 μl의 냉 (cold) 용해 버퍼로 옮기고, 와동시키고, - 80℃로 동결시키고 (10분) 및 얼음 상에서 해동시켰다. 냉 초음파 배스 (ultrasonic bath)에서 인큐베이션 후에 (10분), 시료들을 다시 -80℃에서 동결시켰고, 얼음 상에서 해동시켰고 및 원심분리하였다 (13,000 rpm, 20분, 4℃). 상기 상층액의 단백질 농도를 결정하였고 및 용해물 (lysates)의 농도를 인간 혈청 희석제 (BioRad)를 사용하여 1000 μg/ml (생검에 경우 300 μg/ml)로 조정하였고 및 조직 용해물 중 시토킨/케모킨 농도는 제조자의 지침에 따라 다중 단백질 어레이 (multiplex protein arrays)에 의해 정량화하였다 (BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA). 분석물의 검출 감도는 1 pg / ml 내지 100 ng / ml의 범위이다. 플랫폼에 의해 "범위 밖 (Out of range)"으로 확인된 값들은 각 분석물에 대해 생성되는 단일 표준 곡선을 기반으로 외삽하였다. 표준 곡선은 최소 표준 편차를 보였기 때문에, 가장 농축된 표준 농도를 외삽에 사용하였다. 시토킨의 부류들을 형성하기 위해서 (내림차순으로 예컨대 TH1, TH2, TH17 등) AMIGO 데이터베이스를 특정 항목들을 평가할 때 (예컨대 GO:0043030: 마크로파지 활성화의 조절, GO:0042104: 활성화된 T 세포 증식의 포지티브 조절 또는 GO:0006935: 화학주성 (chemotaxis)) 또는 문헌 검색에 사용하였다 (http://amigo.geneontology.org/). TH1, TH2 또는 TH17을 지배하는 시토킨을 갖는 시료로부터의 포지티브 대조군이 분석을 위해 사용되었다.
일련의 절편들에서 다중 단백질 정량화 접근법의 일반적 재현성 (정밀도)은 우수한 재현성을 보였다 (r=0.975 및 p=0.0001을 갖는 Spearman 순위 상관관계, 중간값 차이 70 pg/ml). 정확도가 시토킨의 알려져 있는 농도를 갖는 용액들의 측정에서 평가되었고, 예컨대 25.000 pg/ml의 CCL5는 표준 편차 628.92 pg/ml을 나타내었고, 기대값으로부터 2.5%에 해당하고, 또한 100 pg/ml의 CCL5는 표준 편차 2.7 pg/ml을 나타내었고, 기대값으로부터 2.7%에 해당한다. 조사된 분석물의 검정 (calibration)은 제조자에 의해 권장되는 바와 같이 수행되었고 (BioRad, Germany) 및 제조자의 홈페이지에서 정확도 및 정밀도에 대한 추가 참고 자료를 참조하였다 (http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin 5803A. pdf).
다양한 일련의 절편 침습 경계 단백질 정량화들 사이의 비교에서도 우수한 재현성을 나타내었다 (spearman 순위 상관관계 rho=0.922, p=0.0001). 마지막으로 레이저-보조 미세절제된 물질 (microdissected material) 대 거대절제된 물질 (macrodissected material)의 비율을 비교하여 상기 침습 경계는 실제로 재현가능하고 별개의 시토킨 프로파일을 갖는 정확하게 분리되는 영역임을 나타내었다. 또한 주변에 인접한 간 또는 간 전이와의 차이가 너무 현저하여 거대절제된 검체는 미세절제된 검체에서 발견된 패턴과 완전히 유사함을 알 수 있다.
생검 물질로부터 시토킨 및 케모킨 데이터의 생성은 상기한 바와 같이 수행되었다. 이용가능한 물질의 양의 한계 때문에, 상기 분석에 사용된 단백질 농도는 300 mg으로 설정되었다. 조직학적으로 환자의 인접한 간은, 형태 및 면역 세포 존재와 관련하여, 치료 전과 비교하여 치료 중에 변경되지 않고 남아 있다. 그러므로, 시토킨 측정의 정밀도 (및 희석 효과 등을 평가하기 위한)에 대한 대조군으로서, 치료 전 및 치료 중에 인접한 간의 시토킨 수준을 사용하였고 및 우수한 일치 (spearman 순위 상관관계 rho=0.991 및 p=0.0001, 중간값 차이 5 pg/ml)를 보였다. 상기는 또한 CCR5 저해의 효과를 방해하는 것과 달리 상처 치유의 효과 (생검 8일 후에 더이상 존재하지 않음)를 나타낸다. 아폽토틱 (apoptotic) 종양 세포의 퍼센트는 이전에 개시된 바와 같이 헤말라운 (hemalaun) 및/또는 H&E에 의해 염색된 절편에서 아폽토틱 핵 (핵 형태에 기반함) 및 온전한 종양 세포를 계수함으로써 결정되었다 (Duan et al., 2003).
(d) 면역조직화학 & 면역형광
FFPE 조직들을 탈파라핀화 (deparaffinized)하였고 및 재수화시켰다 (BOND Dewax Solution, Leica, Germany). 100 ℃에서 열-유도된 에피토프 회수 (heat-induced epitope retrieval: HIER) 후에 (BOND Epitope Retrieval Solution 1 or 2, Leica, Germany), 내인성 퍼옥시다제 활성을 3% 퍼옥시드 차단제와 20분 동안 인큐베이션하여 차단시켰다 (BOND Polymer Refine Detection System, Leica, Germany). 상기 절편들을 10%의 정상 염소 (goat) 혈청 (Vector, USA)으로 차단시켰다. 사용된 항체들 및 희석의 목록은 하기에서 찾을 수 있다. 이들을 실온에서 30분 동안 1차 항체로 적용하였다. 상기 슬라이드들은 2차 항체 (토끼-항-마우스 IgG, Bond Polymer Refine Detection System, Leica, Germany)와 8분 동안 실온에서 인큐베이트하였다. 시그날의 추가의 증폭은, 호스래디쉬 퍼옥시다제와 콘쥬게이트되고 또한 다수의 덱스트란 분자에 커플링된 3차 항체와 8분 동안 실온에서 인큐베이션 (Poly-HRP-마우스-항-토끼 IgG, Bond Polymer Refine Detection System, Leica, Germany)을 통해 달성되었다. 항원 검출은 3,3-디-아미노-벤지딘 (DAB chromogen, Bond Polymer Refine Detection System, Leica, Germany)에 의한 발색 반응에 의해 수행되었다. 상기 절편들을 헤마톡실린 (hematoxylin) (Bond Polymer Refine Detection System, Leica, Germany)에 의해 대조염색하였고 및 Aquatex (Merck, Germany)로 고정시켰다. 매치된 이소타입 대조군은 네가티브 대조군으로 사용하였고 및 인접한 정상 조직 또는 알려져 있는 포지티브 세포는 포지티브 대조군으로 사용하였다.
면역형광 이중 염색은 케모킨 이중 염색을 위해 순차적으로 적색 형광 Alexa Fluor 594 염료-표지된 당나귀 (donkey)-항-마우스 IgG (Life Technologies, Germany) 및 녹색 형광 Alexa 488 염료-표지된 염소-항-토끼 IgG (Life Technologies, Germany)를 사용하여 (또는 녹색 형광 Alexa 488 염료-표지된 염소-항-마우스 IgG의 사례에서 제2 1차 항체는 대조군으로 생략되었음) 냉동절편 (cryosections)에서 수행되었다. CD68, PD-L1, CD4, CD8 및 CCL5의 분석에 있어서, 적색 형광 Alexa Fluor 594 염료-표지된 당나귀 항-토끼 IgG (Invitrogen, Germany) 및 녹색 형광 Alexa 488 염료-표지된 염소-항-마우스 IgG (Life Technologies, Germany)를 동시에 사용하였다. CD3 및 CCL5의 분석에 있어서 Alexa Fluor555 염소 항-마우스 IgG (H+L) 분자 프로브 A21422 및 Alexa Fluor 488 염소 항-토끼 IgG를 사용하였다. 냉동절편을 항체 권고에 따른 염색 전에 4% PFA 또는 메탄올 중 33% 아세톤으로 고정시켰다. 4 ℃에서 밤새 제1 1차 항체의 인큐베이션 후에, Alexa Fluor 594 (1:100 희석)를 1시간 동안 적용하였다. 제2 1차 항체를 3시간 동안 실온에서 적용하였고 및 Alexa Fluor 488 (1:100 희석)으로 1시간 동안 순차적 2중 염색 중에 검출하였다. 동시 염색에 있어서 1차 항체들 둘다를 밤새 인큐베이트하였고 그 후 Alexa Fluor 항체들 (각각 1:100 희석) 둘 다를 1시간 동안 인큐베이트하였다. 절편들은 카운터염색을 위해 DAPI를 갖는 Vectashield (Vector, USA)를 사용하여 고정되었다. 공초점 영상은 Nikon C2 Plus 공초점 현미경 시스템에서 입수되었다.
마우스 모노클로날 항체들은 인간 CD3엡실론 (epsilon) (FFPE에 대해 1:100 희석 및 HIER1, 냉동절편에 대해 4% PFA 고정 및 HIER2, 클론 PS1, Novocastra, UK 및 토끼 모노클로날 항-CD3, 클론 Sp7, Abcam), CD8 (FFPE에 대해 1:50 희석 및 HIER2, 냉동절편에 대해 1:100 희석 및 4% PFA 고정, 클론 4B11, Novocastra, UK), CCR5 (FFPE에 대해 1:50 희석 및 HIER1, 냉동절편에 대해 1:100 희석, 4% PFA 고정 및 HIER1, 클론 MM0065-6H20, abcam, UK), CCL5 (냉동절편에 대해 1:50 희석 및 4% PFA 고정, 클론 VL1, BioLegend, USA), PD1 (FFPE에 대해 1:50 희석 및 HIER1, 냉동절편에 대해 메탄올 중 33% 아세톤 고정, 클론 NAT, abcam, UK), CD68 (FFPE에 대해 1:200 희석 및 HIER1, 냉동절편에 대해 1:700 희석 및 메탄올 중 33% 아세톤 고정, 클론 KP1, abcam, UK), CD163 (FFPE에 대해 1:500 희석 및 HIER2, 냉동절편에 대해 메탄올 중 33% 아세톤 고정, 클론 EDHu-1, AbD Serotec, UK), CD44 (FFPE에 대해 1:9000 희석 및 HIER1, 냉동절편에 대해 1:5000 희석, 4% PFA 고정 및 HIER2, 클론 156-3C11, abcam, UK), CD74 (FFPE에 대해 1:50 희석 및 HIER 1, 냉동 절편에 대해 1:75 희석, 4% PFA 고정 및 HIER2, 클론 LN2, abcam, UK), Ki67 (1:200 희석, PFA 고정, 클론 MIB-1, DAKO, USA). CCR1 (FFPE에 대해 1:50 희석 및 HIER1, 냉동절편에 대해 4% PFA 고정 및 HIER1, 클론 MM0061-7B17, abcam, USA), CXCL9 (냉동절편에 대해 1:100 희석 및 메탄올 중 33% 아세톤 고정, 클론 MM0220-7F11, abcam, UK), CD11b (냉동절편에 대해 1:50 희석 및 메탄올 중 33% 아세톤 고정, 클론 2Q902, abcam, UK) 및 CXCL10 (냉동절편에 대해 1:50 희석 및 메탄올 중 33% 아세톤 고정, 클론 6D4, abcam, UK), 인터페론-알파2 (1:50 희석, 클론 EBI-1, eBioscience) 및 인터페론-감마 (1:00 희석, 클론 B27, BioLegend)를 인식한다. 토끼 항체들은 인간 PD-L1 (FFPE에 대해 1:50 희석 및 HIER2, 냉동절편에 대해 1:150 희석 및 4% PFA 고정, 폴리클로날, abcam, UK), CCR3 (냉동절편에 대해 1:800 희석, HIER1 및 4% PFA 고정, 클론 Y31, abcam, UK), CD4 (냉동절편에 대해 1:150 희석 및 4% PFA 고정, 클론 SP35, Zytomed Systems, Germany), CD11b (1:500 희석 및 4% PFA 고정, 클론 EP1345Y, abcam, UK), CD8 (냉동절편에 대해 1:150 희석 및 4% PFA 고정, 클론 SP16, Zytomed Systems, Germany) 및 CEACAM5 (1:100 희석, 클론 327, Sino Biological)를 인식한다. 고전적인 H&E 및 TUNEL 염색은 제조자의 설명에 따라 수행되었고 (In situ cell death detection kit, Roche, Germany) 및 일련의 절편들을 사용하여 죽은 종양 세포를 TUNEL 대 형태 분석을 비교하여 정량화하였다. 조직 절편들의 병렬 비교로 이전에 공개된 바와 같은 형태 분석의 우수한 진단적 가치를 확인하였기 때문에 (Duan et al., 2003), 형태 분석은 바람직한 평가 방법이었다.
(e) 전체 슬라이드 (면역) 세포 정량화
염색된 면역 세포의 수는 개인 컴퓨터에 부착된 NDP 나노주머 (Nanozoomer) (Hamamatsu Photonics, Japan)로 구성된 컴퓨터화된 영상 분석 시스템을 사용하여 계수하였다. 전체 조직 절편의 완전한 현미경 영상은 자동적으로 입수되었고 (가상 현미경) 또한 측정된 영역의 평균 세포 밀도가 분석을 위해 사용되었다. 세포 계수는 이전에 보고된 바와 같이 주어진 관심 영역 (평균 10 mm2, 최대 40 mm2)에 대해 특별히 개발된 소프트웨어 프로그램 (VIS software suite, Visiopharm, Denmark)으로 생성되었다 (Halama et al., 2011b; Halama et al., 2010: Halama et al., 2009b). 모든 평가들은 일관성에 대해 육안으로 확인되었다.
(f) 유세포분석
각 실험에 있어서, 결장직장 암 간 전이의 침습 경계로부터의 조직 (최대 10g)을 40μm 세포 스트레이너 (cell strainer) 및 RPMI 배지를 사용하여 절단 및 다수 세척 단계에 의해 해리시켰다. 그 다음에 추출된 세포들을 밤새 RPMI 배지 (10% FCS가 보충됨)를 갖는 24-웰 플레이트에 넣었고 그 다음에 선택적으로 모넨신 (Monensin) (BD Biosciences, Germany)으로 3시간 동안 차단시켰다. 그 다음에 세포들을 수확하였고, 원심분리하였고, 유세포분석 표준 프로토콜을 사용하여 CD3, CD8, CD4 및 CCL5에 대해 분석하였다.
표면 염색은 하기와 같이 수행하였다: 각 100 μl FACS 버퍼에 있어서 2.5 μl CD3-V450 (560365, BD, Germany), 1.25 μl CD4-PerCP-Cy5.5 (560650, BD, Germany) 및 2.5 μl CD8-APC-H7 (641400, BD Biosciences, Germany)을 사용하였고, 그 다음에 20분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였고 (빛으로부터 보호됨) 및 원심분리하였다. 그 다음에 세포내 염색을 세포에 1% PFA를 흡수시켰고 및 15분 동안 인큐베이션하였고 그 다음에 0.1% 사포닌 버퍼 (Saponin buffer)로 3회 세척 단계 (및 원심분리)를 수행하였다. CCL5의 염색은 하기와 같이 수행하였다: 각 100 μl에 있어서 0.1% 사포닌 버퍼 5 μl 항-인간-RANTES (CCL5)-eFluor660 (AF647, eBioscience, UK) 또는 이소타입 대조군 마우스 lgG2bk-eFluor660과 1.25 μl (AF647, eBioscience, UK)를 사용하였고, 그 다음에 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였고 (빛으로부터 보호됨) 및 0.1% 사포닌 버퍼로 2회 세척 단계를 수행하였다. 그 다음에 표지된 세포들을 BD Biosciences FACS Canto II 세포계측기 (Harvard Stem Cell Institute)를 사용하여 FACS로 처리하였고, 네가티브 대조군에 대해 게이팅시켰다.
종양 조직을 측정하기 전에 포지티브 대조군을 확립하고 및 림프구 집단을 동정하기 위해, 건강한 공여체 림프구를 상기에 개시된 바와 같이 처리하였다.
실시예 2: 전이 CRC (결장직장 암) 환자에서 파르보바이러스 H-1 및 체크포인트 저해제에 의한 조합 방식 치료
진행성 간 전이 (크기 및 수에서 진행)를 갖는 결장직장 암을 앓고 있는 환자 (횡행 결장 (colon transversum)의 저분화 선암종 (poorly differentiated adenocarcinoma); 돌연변이화 상태: KRAS WT, NRAS WT, MSS; first surgery 2013)에게 누적 용량 1.2 x 109 PFU 파르보바이러스 H-1을 3회 연속 매일 인퓨젼 (4 x 108 pfu; 일 1-3)한 후, 그 다음에 제조자의 약량학 (posology)에 따라 면역 체크포인트 저해제 펨브롤리주맙 (Keytruda®) (2mg/Kg/BW, 일 1)으로 치료하였다. 동일한 용량 용법에 의한 치료를 5주 후에 반복하였다.
간 전이에서 수행된 생검을 치료 전에 및 치료 중에 다양한 시점에서 취하였고 하기의 놀라운 결과를 보였다: H-1PV + 펨브롤리주맙 치료 전이었던 제1 생검과 비교하여, 림프구 침윤이 이후 생검 (제2 및 제3 생검)에서 증가하는 것이 관찰되었다. 또한, 영상화 분석 (초음파, CT, MRI)으로 간 전이의 크기 감소가 나타났다.
도 1-9를 참조하면, 치료 중에 우세한 CD8+ T 세포 집단을 갖는 T 세포 밀도의 유의한 증가가 관찰되었음을 보여주었다. 상기 T 세포 침윤물은 종양 세포로 T 세포의 부근을 공격하는 이질성이다. 대부분의 T 세포는 PD1 포지티브이다.
시토킨 및 케모킨 정량화는 상기 실시예 1에 개시된 바와 같은 방법을 사용하여 수행되었다. 프로파일은 도 10 내지 15에 개시하였다. IP10 및 CCL5의 증가가 우세한 것으로 보였다. IL-2의 증가는 없었고 또한 인터페론 감마에서만 경미한 증가가 있었다.
FISH 분석은 상기 실시예 1 (a)에 개시된 바와 같이 수행되었다. 활성 바이러스 (H-1 PV)는 생검 2에서 결정될 수 있음을 보여주었다. 이는 상기 바이러스가 종양/전이로 이동했다는 명확한 증거이다.
실시예 3: 원발성 수술불가능한 GBM (다형성 아교모세포종 ) 환자에서 파르 보바이러스 H-1 및 체크포인트 저해제에 의한 조합 방식 치료
수술불가능한 다형성 아교모세포종을 앓고 있는 환자에게 누적 용량 1.2 x 1O9 PFU 파르보바이러스 H-1을 3회 연속 매일 인퓨젼으로 적용하여 치료하였고, 그 다음에 제조자의 약량학에 따라 펨브롤리주맙 (Keytruda®) (2 mg/Kg/BW, H1-PV 투여하고 3일 후)으로 치료하였다.
MRI는 치료 전 및 H-1 PV + 체크포인트 저해제 펨브롤리주맙에 의한 치료 중에 얻어졌다. 이는 치료하고 55일 후에 종양 크기가 30% 초과 감소하였고 101일에 거의 완전히 감소되는 것으로 나타났다. 상기 환자는 잘 지내고 있고 또한 임의의 부가의 약제를 필요로 하지 않았다. MRI는 도 16에 개시되어 있다.
Figure 112018107396616-pct00001
Figure 112018107396616-pct00002
Figure 112018107396616-pct00003
SEQUENCE LISTING <110> Deutsches Krebsforschungszentrum <120> Camcer therapy with an oncolytic virus combined with a checkpoint inhibitor <130> K 3612EP <140> EP16020193.58 <141> 2016-05-27 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> probe NS1 antisense <400> 1 tcagcacaca acagatggca t 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> VP antisense <400> 2 tactatccag agcaaccatc at 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> probe NS-1 sense <400> 3 aattcgctag gttcaatgcg ct 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> VP sense <400> 4 tgacctacca acatcagata ca 22

Claims (14)

  1. (a) 파르보바이러스 (parvovirus) H-1 및 (b) 항-PD1 항체 또는 항-PD-L1 항체를 포함하는, 암 치료용 약학적 조합물 (pharmaceutical combination).
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 항-PD1-항체는 펨브롤리주맙 (pembrolizumab) 또는 니볼루맙 (nivolumab)인 것인 약학적 조합물.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 화학요법제, 생물요법제, 면역원성 작용제 (immunogenic agents), 면역 자극 시토킨 (immune stimulating cytokines) 및 면역 자극 시토킨을 코딩하는 유전자로 형질감염된 세포로부터 선택된 하나 이상의 부가의 치료제를 더 포함하는 것인 약학적 조합물.
  4. 삭제
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 (a) 파르보바이러스 H-1 및 (b) 항-PD1 항체 또는 항-PD-L1 항체를 순차적으로 투여하는 것인 약학적 조합물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 사용은 고형 종양, 혈액 암 (haematological cancer) 및/또는 암 개시 줄기 세포 (cancer initiating stem cells)를 치료하기 위한 것인 약학적 조합물.
  7. 청구항 5 또는 6에 있어서, 상기 암은 뇌암, 결장암, 방광암, 간암, 유방암, 신장암, 두/경부 편평세포 암종, 폐암, 악성 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장 세포 암 또는 위암인 것인 약학적 조합물.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 뇌암은 다형성 아교모세포종 (glioblastoma multiforme)인 것인 약학적 조합물.
  9. 청구항 5 또는 6에 있어서, 상기 (a) 파르보바이러스 H-1 및/또는 (b) 항-PD1 항체 또는 항-PD-L1 항체는 종양내 또는 정맥내 투여에 의해 투여되는 것인 약학적 조합물.
  10. 제1 용기, 제2 용기 및 패키지 설명서 (package insert)를 포함하는 키트 (kit)로서, 상기 제1 용기는 파르보바이러스 H-1을 포함하는 약학적 조성물의 적어도 하나의 용량을 포함하고, 상기 제2 용기는 항-PD1 항체 또는 항-PD-L1 항체를 포함하는 약학적 조성물의 적어도 하나의 용량을 포함하며, 및 상기 패키지 설명서는 상기 약학적 조성물(들)을 사용하여 암을 갖는 개체를 치료하기 위한 지침을 포함하는 것인 키트.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 암은 뇌암, 결장암, 방광암, 간암, 유방암, 신장암, 두/경부 편평세포 암종, 폐암, 악성 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장 세포 암 또는 위암인 것인 키트.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 뇌암은 다형성 아교모세포종인 것인 키트.
  13. 삭제
  14. 삭제
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