JP6689400B2 - チェックポイント阻害剤と組み合わされた腫瘍溶解性ウイルスによるがん療法 - Google Patents

Description

本発明は、チェックポイント阻害剤が腫瘍溶解性ウイルスと組み合わされた医薬組成物、およびがんの治療のための前記組合せの使用に関する。

がんは全世界で第２位の死亡原因である。男性の半数、および女性の３人に１人が一生のうちに何らかの形態のがんと診断されると推定されている。さらに、がんは主に加齢疾患であるため、全世界のがん死亡者数は、高齢者の割合が増加することにより２００７年から２０３０年に約４５％増加する（死者７９０万人から１，１５０万人）と予測される（ＷＨＯ推計値、２００８）。がんはまた、最も費用のかかる疾患でもある。国立癌研究所からの最新の推計値は、２００７年の米国におけるがんの全体的な経済的費用は２，２６８億ドルであり、より功を奏する予防的介入、早期発見、およびより効率的な治療が開発されなければ、この既に巨額の経済的負担は次の２０年間でさらに増大すると予想されることを示した。ここ３０年にわたる米国および欧州のがん５年生存パーセンテージの増加によって証明される、多くの形態のがんの予防、発見、診断、および治療における著しい進歩にもかかわらず、膵臓、肝臓、肺、脳などのいくつかの腫瘍型は、有効な治療がほとんどないままであり、新たな治療選択肢の開発を必要としている。がん特異的脆弱性を利用して、正常な細胞を温存しながらがん細胞を死滅させる腫瘍溶解性ウイルスは、がんと闘う有望なツールとして急速に浮上している（Ｂｒｅｉｔｂａｃｈら、２０１１年；Ｒｕｓｓｅｌｌら、２０１２年）。１２種類もの異なる腫瘍溶解性ウイルスが、現在、単独でまたは他の抗がん剤と組み合わせて使用される、様々な悪性腫瘍に対する第Ｉ〜ＩＩＩ相臨床試験を受けている（Ｒｕｓｓｅｌｌら、２０１２年）。それらの中で、腫瘍溶解性ラットパルボウイルスＨ−１ＰＶは、再発性多形性神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）を有する患者における第Ｉ／ＩＩａ相臨床試験で、安全性および有効性の最初の徴候について現在評価されている（Ｇｅｉｅｔｎｅｋｖら、２０１２年）。

Ｈ−１ＰＶは、５．１ｋｂ長の一本鎖ＤＮＡゲノムを含有する小さな（直径約２５ｎｍ）非エンベロープ正二十面体粒子である（Ｃｏｔｍｏｒｅ＆Ｔａｆｔｅｒｓａｌｌ、２００７年）。Ｈ−１ＰＶのゲノム構成は、２つのプロモーター、Ｐ４初期プロモーターおよびＰ３８後期プロモーターの制御下の２つの転写ユニットからなる。Ｐ４は、非構造（ＮＳ）タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）をコードする遺伝子の発現を制御し、Ｐ３８は、カプシド（ＶＰ）タンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）をコードする遺伝子の発現を制御する（Ｃｏｔｍｏｒｅ＆Ｔａｔｔｅｒｓａｌｌ、２００７年）。該ウイルスは、急速に分裂中のがん細胞で優先的に増殖する。この腫瘍選択性は、がん細胞によって該ウイルスがよりよく取り込まれることに基づくものではなく、むしろ、ウイルスＤＮＡ複製に必要とされるサイクリンＡ、Ｅ２Ｆ、またはＣＲＥＢ／ＡＴＦなどの因子をがん細胞が過剰発現するという事実に起因する。さらに、がん細胞は、効率的な抗ウイルス免疫応答を開始する能力にしばしば欠けており、ウイルスの増殖に好都合である（Ｎｕｅｓｃｈら、２０１２年）。該ウイルスは、複数の細胞死経路を活性化することが知られている。細胞型および増殖条件に応じて、Ｈ−１ＰＶは、アポトーシス（Ｈｒｉｓｔｏｖら、２０１０年：Ｏｈｓｈｉｍａら、１９９８年；Ｒａｙｅｔら、１９９８年：Ｕｅｎｏら、２００１年）、壊死（Ｒａｎら、１９９９年）、またはカテプシンＢ依存性細胞死（Ｄｉ Ｐｉａｚｚａら、２００７年）を誘導し得る。該ウイルスは、ＴＲＡＩＬ（腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｌａｔｅｄ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｌｉｇａｎｄ））、シスプラチンに耐性のがん細胞であっても、またＢｃｌ−２が過剰発現されていても、腫瘍溶解を誘導することができた（Ｄｉ Ｐｉａｚｚａら、２００７年）。後者の結果は、Ｂｃｌ−２がパルボウイルス細胞傷害性の負の調節因子ではないことを示唆している。パルボウイルスを用いるがん療法、および化学療法またはＨＤＡＣ阻害剤との組合せが、最近記載されている（ＷＯ２００９／０８３２３２Ａ１；ＷＯ２０１１／１１３６００Ａ１）。

主な非構造タンパク質ＮＳ１は、ウイルスＤＮＡ複製、ウイルス遺伝子発現および細胞傷害性のマスター制御因子である。ウイルス全体と同様に、ＮＳ１の単独発現は、反応性酸素種の蓄積およびＤＮＡ損傷による細胞周期停止、アポトーシス、および細胞溶解を誘導するのに十分である（Ｈｒｉｓｔｏｖら、２０１０年）。その腫瘍溶解活性の結果、ウイルスは、ＧＢＭに対する臨床試験を開始する基盤となったいくつかの動物モデルで示された腫瘍抑制特性を有することが示されている（Ｇｅｌｅｔｎｅｋｙら、２０１２年）。

ここ数年の間に、腫瘍溶解性ウイルスに基づく治療概念に加えて、免疫腫瘍学の分野ががんに対する闘いの貴重なアプローチになっている。治療的抗腫瘍免疫を活性化するための直近の有望なアプローチの１つが、免疫チェックポイントの遮断である。免疫チェックポイントとは、付帯的組織損傷を最小限にするために、末梢組織の自己寛容を維持し、生理的免疫応答の持続時間および大きさを調節するのに重要な、免疫系に備わっている大量の阻害経路を指す。腫瘍は、特に腫瘍抗原に特異的なＴ細胞に対する免疫耐性の主な機構として、特定の免疫チェックポイント経路を利用することが今や明らかになっている。免疫チェックポイントの多くはリガンド−受容体相互作用により開始されるため、これらは抗体により容易にブロックされ、またはリガンドもしくは受容体の組み換え形態により調節され得る。

ほとんどのがん細胞につきものの膨大な数の遺伝子変化およびエピジェネティックな変化は、宿主免疫系が認識することができる多くの腫瘍関連抗原をもたらし、そのため、腫瘍は特異的免疫耐性機構を発達させる必要がある。重要な免疫耐性機構は、通常は免疫寛容を媒介し付帯的組織損傷を緩和する、免疫チェックポイントと呼ばれる免疫阻害経路を必要とする。特に重要な免疫チェックポイント受容体は、Ｔ細胞活性化の大きさを下方制御する細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）である。正常な生理機能においてＴ細胞は、２つのシグナル、すなわち、抗原−ＭＨＣ複合体に結合するＴ細胞受容体、ならびに抗原提示細胞の表面のＣＤ８０およびＣＤ８６に結合するＴ細胞受容体ＣＤ２８により活性化される。ＣＴＬＡ４はＣＤ８０またはＣＤ８６に結合し、これらの表面タンパク質へのＣＤ２８の結合を妨げ、それ故にＴ細胞の活性化を負に制御する。活性な細胞傷害性Ｔ細胞は、免疫系ががん細胞を攻撃するのに必要とされるのに対し、制御性Ｔ細胞は他のＴ細胞を阻害し、腫瘍に利益をもたらし得る。がんにおけるＣＴＬＡ４の抗体遮断は、制御性Ｔ細胞対細胞傷害性Ｔ細胞の比の移行を考慮すると、抗腫瘍免疫を誘導した。故に、細胞傷害性Ｔ細胞の量の増加および制御性Ｔ細胞の減少は、抗腫瘍応答を増加させる。アンタゴニストＣＴＬＡ４抗体を用いた臨床研究は、メラノーマにおいて活性を示した。高頻度の免疫関連毒性にもかかわらず、この療法は２つのランダム化第ＩＩＩ相試験で生存率を高めた。抗ＣＴＬＡ４療法は、進行性メラノーマ患者における延命効果を示した初めての薬剤であり、２０１０年に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により承認された（Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ、１２巻、２５２〜２６４頁、（２０１２年））。承認された抗ＣＴＬＡ４抗体は、「イピリムマブ」という名前で知られ、商標名「Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）」でＢｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ（ＢＭＳ）より販売されている。

プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）などのいくつかの免疫チェックポイント受容体は、組織内のＴ細胞エフェクター機能を制限する。ＰＤ１に対するリガンドを上方制御することにより、腫瘍細胞は腫瘍微小環境の抗腫瘍免疫応答をブロックする。プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）などの追加の免疫チェックポイントタンパク質の遮断薬による臨床所見は、抗腫瘍免疫を高め、持続的臨床応答を生じさせる可能性がある幅広い多様な機会があることを示している。臨床試験は、ＰＤ１経路の遮断が様々な腫瘍型において持続的腫瘍退縮を誘導することを示唆している。ＰＤ１遮断に対する応答は、腫瘍細胞によるＰＤ１リガンドの発現と相関している可能性がある。

２０１５年９月４日、ＦＤＡは、ＦＤＡ Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔプログラムの下に標的ＰＤ−１に対するヒト化モノクローナル抗体ペンブロリズマブ（ＭＫ−３５７５またはＫｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）としても知られ、Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ Ｄｏｈｍｅ；ＭＳＤより販売されている）を承認した。ペンブロリズマブは、イピリムマブ（ＣＴＬＡ４に対する）による治療後、またはＢＲＡＦ変異を有する進行メラノーマ患者におけるイピリムマブおよびＢＲＡＦ阻害剤による治療後の使用に承認されている。

２０１５年９月３０日、ＦＤＡは、ＢＲＡＦ Ｖ６００野生型切除不能または転移性メラノーマ患者の治療のために、抗ＣＴＬＡ４抗体イピリムマブと組み合わせた別の抗ＰＤ１抗体（ニボルマブ；Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ；ＢＭＳより販売されているＯｐｄｉｖｏ（登録商標）注入）に対して迅速に承認を与えた。

複数の追加の免疫チェックポイント受容体およびリガンド（このうちのいくつかは、様々な腫瘍細胞型において選択的に上方制御される）は、遮断の主な標的であり、特にワクチンなどの抗腫瘍免疫応答の活性化を高めるアプローチと組み合わせて使用される。

抗ＰＤ−Ｌ１抗体およびこれを製造する方法は、当技術分野で周知である。ＰＤ−Ｌ１に対するそのような抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル、および／または組み換え、および／またはヒト化であってもよい。ＰＤ−Ｌ１に対する抗体の例は、米国特許第８，２１７，１４９号、米国特許出願第１３／５１１，５３８号、米国特許出願第１３／４７８，５１１号に開示されている。

免疫チェックポイント経路を標的とする例示的な薬剤は、以下の表１に示されている（Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ、１２巻、２５２〜２６４頁、（２０１２年）から改変）：

いくつかの腫瘍型（例えば、メラノーマ、肺）に関して、チェックポイント阻害剤による治療は有望な結果を示しているが、いくつかの他の腫瘍（例えば、結腸、膵臓）を有する患者は、そのような治療から恩恵を受けないことが認識されている。

それ故に、改善されたがん療法のための手段を提供すること、およびより広範囲の腫瘍をチェックポイント阻害剤治療に感受性にすることが本発明の目的である。

本発明によれば、これは、特許請求の範囲に定義される主題により達成される。

本発明に至る研究において、チェックポイント阻害剤、例えば、ペンブロリズマブのような抗ＰＤ１抗体は、がん細胞を死滅させる上で腫瘍溶解性ウイルス、例えば、Ｈ−１ＰＶまたは関連するげっ歯類パルボウイルスのようなパルボウイルスと相乗的に働くかどうかが問われた。ペンブロリズマブの投与は、数名の患者においてウイルスの腫瘍溶解活性を相乗的に増強することが示された。

本発明は、（ａ）腫瘍溶解性ウイルスを（ｂ）チェックポイント阻害剤と組み合わせて含有する医薬組成物を提供する。本発明はまた、がんを治療するための前記組合せ医薬（薬学的組合せ）の使用も提供する。

好ましくは、前記医薬組成物において腫瘍溶解性ウイルスおよびチェックポイント阻害剤は、有効な用量で存在し、薬学的に許容可能な担体と組み合わされる。

本明細書で使用される場合、用語「薬剤」は、組織、器官、動物、哺乳動物、ヒト、または他の対象に所望の効果をもたらす物質を意味すると理解される。

したがって、用語「抗腫瘍性薬剤」は、組織、器官、動物、哺乳動物、ヒト、または他の対象に抗腫瘍効果をもたらす物質を意味すると理解される。「薬剤」は、単一の化合物、または２つ以上の化合物の組合せもしくは組成物であってもよいことも理解されるべきである。

本明細書で使用される場合、用語「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」およびその派生語は、治療的処置を意図する。特定の状態に関して、治療は、（１）状態または状態の生物学的徴候の１つもしくは複数を回復させる、（２）（ａ）状態に至る、もしくは状態に関与する生物学的カスケードの１つもしくは複数の時点、または（ｂ）状態の生物学的徴候の１つもしくは複数を妨げる、（３）状態に関連する症状、作用、または副作用の１つまたは複数を軽減する、あるいは（４）状態または状態の生物学的徴候の１つもしくは複数の進行を遅らせることを意味する。

本明細書で使用される場合、「予防」とは、状態もしくはその生物学的徴候の可能性もしくは重症度を実質的に減少させる、またはそのような状態もしくはその生物学的徴候の発症を遅延させる薬物の予防的投与を指すと理解される。当業者は、「予防」が絶対的な用語でないことを理解するであろう。予防的療法は、例えば、対象ががんの強い家族歴を有する場合、または対象が発癌物質に暴露されている場合など、対象ががんを発症するリスクが高いと考えられる場合に適切である。

本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、例えば研究者または臨床医によって探求されている組織、器官、動物またはヒトの、生物学的または医学的応答を誘発するであろう薬物または医薬剤の量を意味する。さらに、用語「治療的に有効な量」は、そのような量を受け取っていない対応する対象と比較した場合、疾患、障害、または副作用の治療、治癒、予防、または回復の改善をもたらす任意の量を意味する。該用語は、正常な生理的機能を高めるのに有効な量もその範囲内に含む。これらの疾患または障害を治療および／または予防するのに有用な「有効用量」は、当業者に周知の方法を用いて決定することができる。

本発明の組合せの治療的に有効な量の投与は、治療的に有効な量の成分化合物の個々の投与と比較した場合、組合せが、以下の改善された特性の１つまたは複数を提供するという点で、個々の成分化合物より有利である：ｉ）最も活性な単剤より大きな抗がん効果、ｉｉ）相乗的もしくは非常に相乗的な抗がん活性、ｉｉｉ）抗がん活性を高め、副作用プロファイルを低減する投薬プロトコル、ｉｖ）毒性作用、プロファイルの低減、ｖ）治療ウィンドウの増加、またはｖｉ）成分化合物の１つもしくは両方のバイオアベイラビリティの向上。

「薬学的に許容可能な」は、有効成分の生物学的活性の有効性を妨げず、投与される患者にとって毒性でない任意の担体を包含することを意図する。適切な薬学的担体の例は、当技術分野でよく知られており、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、滅菌溶液等を含む。そのような担体は、従来の方法により製剤化することができ、有効用量で対象に投与することができる。追加の薬学的に適合する担体には、ゲル、生体吸収性マトリックス材料、治療剤を含有する移植要素、または任意の他の適切なビヒクル、送達もしくは分注手段もしくは材料が挙げられ得る。

本明細書で使用される場合、用語「がん」とは、細胞または組織の異常な増殖を指し、悪性腫瘍増殖を含むと理解される。用語「腫瘍性（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）」は、新生物を意味し、または新生物に関連する。いくつかの実施形態においてがんは、固形腫瘍、すなわち脳がん（特に神経膠腫：上衣腫、星状細胞腫［例えば多形性神経膠芽細胞腫］、乏突起神経膠腫、脳幹神経膠腫、乏突起星状細胞腫）；結腸がん（特に非ＭＳＩ ＣＲＣ）、膀胱がん、肝臓がん、乳がん（特にダブルネガティブまたはトリプルネガティブ乳がん）、腎臓がん、頭部／頚部扁平上皮細胞癌、肺がん（特に肺扁平上皮細胞癌、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＳ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ））、悪性メラノーマ、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎細胞がん、または胃がんである。用語「がん」は、様々な臓器における言及された腫瘍の転移も包含する。好ましい実施形態においてこれらの腫瘍は、パルボウイルス毒性に耐性である。さらに好ましい実施形態において、治療されるこれらの腫瘍は再発腫瘍である。本発明の医薬組成物の特別な利点は、がん幹細胞でさえ成功裏に治療できることである。これは、腫瘍の再発および転移形成の回避に関してプラスの効果をもたらす。

他の実施形態においてがんは、ヘム悪性腫瘍、すなわち、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、びまん性大Ｂ細胞型リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ＥＢＶ陽性ＤＬＢＣＬ、原発性縦隔大Ｂ細胞型リンパ腫、Ｔ細胞（組織球）豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄細胞白血病−１タンパク質（Ｍｃｌ−１）、骨髄形成異常症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、または小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）である。

「チェックポイント阻害剤」は、免疫系阻害チェックポイントの遮断を引き起こす任意の薬剤を意味する。阻害性免疫チェックポイントの遮断は、免疫系機能を活性化する。適切な標的および薬剤は、表１に言及されており、参照されたい。好ましい実施形態において、がん治療の標的としてのリガンド−受容体相互作用は、膜貫通型プログラム細胞死１タンパク質（ＣＤ２７９としても知られるＰＤＣＤ１、ＰＤ−１）とそのリガンド、ＰＤ−１リガンド（ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２７４）の間の相互作用である。正常な生理機能において細胞表面のＰＤ−Ｌ１は、免疫細胞表面のＰＤ−１に結合し、免疫細胞活性を阻害する。

がん細胞表面のＰＤ−Ｌ１の上方制御は、さもなければ腫瘍細胞を攻撃し得るＴ細胞を抑制して、患者の免疫系からがん細胞を逃れさせることができる。ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１のどちらかに結合し、それ故に相互作用をブロックする抗体は、Ｔ細胞が腫瘍を攻撃できるようにする。故に、好ましい実施形態において、ＰＤ−１アンタゴニストはチェックポイント阻害剤として使用される。

「ＰＤ−１アンタゴニスト」は、免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫＴ細胞）で発現されるＰＤ−１への、がん細胞で発現されるＰＤ−Ｌ１の結合をブロックし、免疫細胞発現ＰＤ−１への、がん細胞で発現されるＰＤ−Ｌ２の結合も好ましくはブロックする、任意の化学化合物または生体分子を意味する。ＰＤ−１およびそのリガンドの代替名または同義語には：ＰＤ−１についてはＰＤＣＤ１、ＰＤ１、ＣＤ２７９、ＳＬＥＢ２；ＰＤ−Ｌ１についてはＰＤＣＤ１Ｌ１、ＰＤＬ１、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７−４、ＣＤ２７４、およびＢ７−Ｈ；ならびにＰＤ−Ｌ２についてはＰＤＣＤ１Ｌ２、ＰＤＬ２、Ｂ７−ＤＣ、Ｂｔｄｃ、およびＣＤ２７３が挙げられる。ヒト個体が治療される本発明の治療方法、医薬品、および使用のいずれかにおいて、ＰＤ−１アンタゴニストは、ヒトＰＤ−１へのヒトＰＤ−Ｌ１の結合をブロックし、好ましくはヒトＰＤ−１へのヒトＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方の結合をブロックする。ヒトＰＤ−１アミノ酸配列は、それぞれ、ＮＣＢＩ遺伝子座番号：ＮＰ＿０５４８６２およびＮＰ＿０７９５１５に見出すことができる。

本発明の治療方法、医薬品、および使用のいずれかにおいて有用なＰＤ−１アンタゴニストには、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、好ましくはヒトＰＤ−１またはヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、またはその抗原結合断片が挙げられる。ｍＡｂは、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であってもよく、ヒト定常領域を含んでもよい。いくつかの実施形態においてヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４定常領域からなる群から選択され、好ましい実施形態において、ヒト定常領域はＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域である。いくつかの実施形態において、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、およびＦｖ断片からなる群から選択される。

ヒトＰＤ−１に結合し、本発明の治療方法、医薬品、および使用において有用なｍＡｂの例は、米国特許７，５２１，０５１号、米国特許８，００８，４４９号、および米国特許８，３５４，５０９号に記載されている。本発明の治療方法、医薬品、および使用においてＰＤ−１アンタゴニストとして有用な特異的抗ヒトＰＤ−１ ｍＡｂには、ＷＨＯ Ｄｒｕｇ情報、２７巻、２号、１６１〜１６２頁（２０１３年）に記載されている構造を有するヒト化ＩｇＧ４ ｍＡｂ、ＭＫ−３４７５（ペンブロリズマブ）；ＷＨＯ Ｄｒｕｇ情報、２７巻、１号、６８〜６９頁（２０１３年）に記載されている構造を有するヒトＩｇＧ４ ｍＡｂ、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８）；ＷＯ２００８／１５６７１２Ａ１に記載されているヒト化抗体ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６、およびＨ４０９Ａ１７が挙げられる。

腫瘍細胞に対して細胞傷害性である可能性のある任意の種類のウイルスは、本発明の組合せにおいて使用できることが当業者によって実現されるであろう。本発明において使用される複製コンピテントな毒性ウイルスは、溶解により腫瘍を死滅させる、すなわち腫瘍溶解性であってもよく、または異なる機構により腫瘍細胞を死滅させてもよい。本発明の実施において使用するためのウイルスの特定の例には、アデノウイルス、レトロウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ポリオーマウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、およびパルボウイルスが挙げられる。好ましくは、腫瘍溶解性ウイルスはパルボウイルスであり、より好ましくは、パルボウイルスＨ−１、またはＬｕＩＩＩ、マウス微小ウイルス（ＭＭＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＰＶ）、ラット微小ウイルス（ＲＭＶ）、ラットパルボウイルス（ＲＰＶ）、もしくはラットウイルス（ＲＶ）から選択される、関連するげっ歯類パルボウイルスである。

用語「腫瘍溶解性ウイルス」および特に「パルボウイルス」または「パルボウイルスＨ−１」は、本明細書で使用される場合、野生型またはその修飾された複製コンピテントな誘導体、およびそのようなウイルスまたは誘導体に基づく関連するウイルスまたはベクターを含む。適切な腫瘍溶解性ウイルス、誘導体等、ならびに前記ウイルスを活発に産生するのに使用することができ、および治療に有用な細胞は、過度の実験努力なしに本明細書の開示に基づき当業者の技能の範囲内で容易に決定できる。

化合物の投与は、種々の方法、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、腫瘍内、または皮内投与により達成することができる。投与経路は、当然のことながら、治療の種類、および医薬組成物に含有される化合物の種類に依存する。ウイルスおよびチェックポイント阻害剤の投与計画は、例えば、患者の体格、体表面積、年齢、性別、投与される特定のウイルス、特定の阻害剤等、投与時間および経路、腫瘍型および特性、患者の全般的健康、ならびに患者が受けている他の薬物療法を含む、患者データ、観察、および他の臨床要因に基づき、主治医によって当業者の技能の範囲内で容易に決定できる。チェックポイント阻害剤に関して、本明細書に参照により組み込まれる添付文書および患者情報シートを参照されたい。本発明の併用療法のための投与計画（ｄｏｓａｇｅ ｒｅｇｉｍｅｎ）（本明細書では投与計画（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｒｅｇｉｍｅｎ）とも呼ばれる）の選択は、実体の血清または組織代謝回転速度、症状のレベル、免疫原性、および治療を受けている個体の標的細胞、組織または臓器の利用しやすさを含むいくつかの要因に依存する。好ましくは、投与計画は、副作用の許容可能なレベルと合致した患者に送達される各治療剤の量を最大化する。したがって、組合せにおける各治療剤の用量および投与頻度は、特定の治療剤、治療下のがんの重症度、および患者特性に一部依存する。抗体、サイトカイン、および小分子の適切な用量を選択する上での手引きが利用可能である。例えば、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ（１９９６年）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂ．Ｌｔｄ． Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、ＵＫ；Ｋｒｅｓｉｎａ（編）（１９９１年）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｂａｃｈ（編）（１１９３年）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｍａｒｃｅｋ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｂｅａｒｔら、（２００３年）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：６０１〜６０８頁；Ｍｉｌｇｒｏｍら（１９９９年）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１：１９６６〜１９７３頁；Ｓｌａｍｏｎら（２００１年）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：７８３〜７９２頁；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚら．（２０００年）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：６１３〜６１９頁；Ｇｈｏｓｈら（２００３年）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：２４〜３２；Ｌｉｐｓｋｙら（２０００年）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３；１５９４〜１６０２頁；Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ２００３（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、第５７版）；Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ；ＩＳＢＮ；１５６３６３４４５７；第５７版（２００２年１１月）参照のこと。適切な投与計画の決定は、例えば、治療に影響を与えることが当技術分野で知られている、もしくは疑われる、または治療に影響を与えることが予測されるパラメーターもしくは要因を用いて臨床医によって行われてもよく、例えば、患者の病歴（例えば、以前の治療）、治療されるがんの種類および病期、ならびに併用療法の治療剤の１つまたは複数に対する応答のバイオマーカーに依存するであろう。

本発明によるチェックポイント阻害剤と組み合わせるウイルスは、血液系を通じて侵入する能力を有する感染性ウイルス粒子を含むため、治療は、ウイルスの静脈内注射により行われ、または少なくとも開始されてもよい。しかし、好ましい投与経路は腫瘍内投与である。

長期静脈内治療は、ウイルスに対する中和抗体の形成の結果、非効率的になりやすいため、異なる投与方法が初期投与計画の静脈内ウイルス投与後に採用されてもよく、またはそのような異なる投与法、例えば腫瘍内ウイルス投与が、ウイルス治療の全過程を通じて交互に使用されてもよい。

別の特定の投与法として、ウイルス（ウイルス、ベクター、および／または細胞剤）は、患者に埋め込まれた供給源から患者に投与されてもよい。例えばシリコンまたは他の生体適合材料の例えばカテーテルは、腫瘍除去中または別々の手順により患者に取り付けられた小型の皮下リザーバー（Ｒｉｃｋｈａｍリザーバー）に連結して、さらなる外科的介入なしに様々な時点でパルボウイルス組成物が局所注射されるようにすることができる。ウイルスまたは由来のベクターは、定位手術法またはナビゲーションターゲティング法により腫瘍に注射することもできる。

ウイルスの投与は、適切なポンプシステム、例えば、蠕動輸液ポンプまたは対流強化送達（ＣＥＤ）ポンプを用いて、ウイルス粒子またはウイルス粒子を含有する流体の、低流速の埋め込まれたカテーテルを通じた持続注入により行うこともできる。

ウイルス併用部分の投与のさらに別の方法は、所望のがん組織にパルボウイルスを分注するように構築および配置される埋め込まれた物品からである。例えば、ウイルス、特にパルボウイルスＨ−１を含浸されたウエハーが使用されてもよく、ウエハーは外科的腫瘍除去の終わりに切除腔の端に取り付けられる。複数のウエハーが、そのような治療的介入で使用されてもよい。ウイルス、またはウイルスベースのベクターを活発に産生する細胞が、腫瘍または腫瘍除去後の腫瘍腔に注射されてもよい。

ウエハーは、安全性を向上させ、ならびに副作用を低減および／または回避する一方、抗がん効果を保ちまたはさらには増強する、より低い治療用量のウイルスおよび／またはチェックポイント阻害剤の臨床使用も可能にし得る。ウイルスとチェックポイント阻害剤の間の強い相乗効果を考えると、治療用量の低減、例えば、以前に使用された単一成分用量の半分または三分の一が所望の治療効果を保っていることを予見することができる。用量の低減を考えると、（重度の）副作用が低減またはさらには回避され得る。

パルボウイルスの場合、感染効果は腫瘍細胞を死滅させるが、正常な細胞を害さず、そのような感染は、例えば、適切なパルボウイルス、例えばパルボウイルスＨ−１、またはそのようなウイルスに基づく関連するウイルスもしくはベクターの腫瘍内使用により実行されて、有害な神経学的作用または他の副作用なしで腫瘍特異的療法を達成することができる。

本発明の併用療法は、腫瘍を除去するための手術の前または後に使用されてもよく、放射線療法の前、放射線療法中、または放射線療法後に使用されてもよい。

本発明の併用療法は、触診、またはＭＲＩ、超音波、もしくはＣＡＴスキャンなどの当技術分野で周知の画像診断法により見出されるのに十分な大きさの腫瘍を治療するのに典型的には使用される。いくつかの好ましい実施形態において、本発明の併用療法は、少なくとも約２００ｍｍ^３、３００ｍｍ^３、４００ｍｍ^３、５００ｍｍ^３、７５０ｍｍ^３、または最大１０００ｍｍ^３の直径を有する進行期腫瘍を治療するのに使用される。

組合せ医薬は、１つまたは複数の追加の治療剤も含むことができる。追加の治療剤は、例えば、化学療法剤、生物治療剤（ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＶＥＧＦ受容体、他の増殖因子受容体、ＣＤ２０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＴＬＡ−４、ＯＸ−４０、４−１ＢＢ、およびＩＣＯＳに対する抗体を含むが、これらに限定されない）、免疫原性剤（例えば、減弱がん細胞、腫瘍抗原、腫瘍由来抗原または核酸でパルスされた樹状細胞などの抗原提示細胞）、免疫刺激サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮα２、ＧＭ−ＣＳＦ）、および免疫刺激サイトカイン（ＧＭ−ＣＳＦなど。ただし、これに限定されない）をコードする遺伝子をトランスフェクトされた細胞であってもよい。

化学療法剤の例には、アルキル化剤（シクロホスファミドなど）、ブスルファン、カンプトテシン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、抗生物質、ブレオマイシン、カルミノマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、イダルビシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキサート、シタラビン、白金アナログ（シスプラチンおよびカルボプラチンなど）；ビンブラスチン、白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド、ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン、ゼローダ；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、タモキシフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、またはアロマターゼ阻害剤が挙げられる。

本発明はまた、がんの治療のための（ａ）医薬組成物または組合せの調製のための、（ａ）パルボウイルスＨ−１および（ｂ）チェックポイント阻害剤の使用にも関する。

（ａ）および（ｂ）の投与方法は、同時または連続的であってもよく、好ましくは、（ａ）および（ｂ）は連続的に（または別々に）投与される。これは、（ａ）および（ｂ）が、一緒に服用されるための単一の単位剤形で、または同時にもしくは一定の時間差で投与される別々の実体として（例えば別々の容器で）提供され得ることを意味する。この時間差は、１時間から１週間の間、好ましくは１２時間から３日の間であってもよい。さらに、チェックポイント阻害剤とは別の投与方法によりウイルスを投与することができる。これに関して、ウイルスまたはチェックポイント阻害剤のどちらかを腫瘍内に投与し、他方を全身または経口投与することが有利となり得る。特定の好ましい実施形態において、ウイルスは腫瘍内に投与され、チェックポイント阻害剤は静脈内に投与される。好ましくは、ウイルスおよびチェックポイント阻害剤は、別々の化合物として投与される。２つの薬剤との併用治療も可能である。

本発明の併用療法における各治療剤は、単独で、または治療剤ならびに１つもしくは複数の薬学的に許容可能な担体、賦形剤、および希釈剤を含む医薬品（本明細書では医薬組成物とも呼ばれる）のどちらかで、標準的な薬学的慣例に従って投与されてもよい。本発明の併用療法における各治療剤は、同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）（すなわち、同じ医薬品で）、同時に（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）（すなわち、任意の順番で一方の直後に他方が投与される別々の医薬品で）、または任意の順番で連続的に投与されてもよい。連続投与は、併用療法における治療剤が異なる剤形であり（１つの薬剤が錠剤またはカプセル、別の薬剤が滅菌液である）、ならびに／または異なる投与スケジュール、例えば、少なくとも毎日投与される化学療法薬、および１週間に１回、２週間ごとに１回、もしくは３週間ごとに１回などのより少ない頻度で投与される生物治療薬で投与される場合に、特に有用である。

いくつかの実施形態において、併用療法における治療剤の少なくとも１つは、同じ投与計画（用量、頻度、および治療の持続時間）を用いて投与される。該投与計画は、同じがんを治療するための単剤療法として薬剤が使用される場合に、典型的には使用される。他の実施形態において、患者は、併用療法における治療剤の少なくとも１つの、単剤療法として使用される場合より低い合計量（例えば、より少量の投与、より低頻度の投与、および／またはより短い治療持続時間）を受け取る。本明細書に記載されたチェックポイント阻害剤および腫瘍溶解性ウイルスは、第１の容器および第２の容器および添付文書を含むキットとして提供されてもよい。第１の容器は、チェックポイント阻害剤、好ましくは抗ＰＤ−１アンタゴニストを含む医薬品の少なくとも１つの用量を含有し、第２の容器は、腫瘍溶解性ウイルスを含む医薬品の少なくとも１つの用量、および該医薬品を用いてがんに関して患者を治療するための指示を含む添付文書、またはラベルを含有する。第１および第２の容器は、同じまたは異なる形状（例えば、バイアル、シリンジ、およびブール（ｂｏｏｌｅｓ））および／または材料（例えばプラスチックまたはガラス）からなってもよい。キットは、希釈剤、フィルター、ＩＶバッグおよびライン、針およびシリンジなどの医薬品を投与する上で有用となり得る他の材料をさらに含んでもよい。キットのいくつかの好ましい実施形態において、抗ＰＤ−１アンタゴニストは抗ＰＤ−１抗体であり、指示には、医薬品は、ＩＨＣアッセイによりＰＤ−Ｌ１発現の陽性反応が出るがんを有する患者の治療において使用するためのものであることが述べられる。

本発明において、腫瘍溶解性ウイルス、特にパルボウイルスＨ−１ＰＶ、およびチェックポイント阻害剤、特にペンブロリズマブの組合せ使用は、がん、特に脳腫瘍、結腸癌、および膵臓癌に対する妥当なアプローチとなり得ることが初めて示された。実施例の中でより詳細に概説されているように、驚くべきことに、通常はチェックポイント阻害剤治療に応答しない腫瘍型（ＣＲＣ）で転移サイズを低減することができた。さらにより驚くべきことに、かなりの腫瘍サイズ低減が手術不能の原発性多形性神経膠芽細胞腫で得られた。

理論に拘束される意図ではないが、前述の通り腫瘍は、免疫チェックポイント経路を使用することにより、例えば、Ｔ細胞側のＰＤ−１受容体への腫瘍側のＰＤ−Ｌ１の結合を通じて、免疫系による攻撃から身を隠す。これは、腫瘍に対する身体の免疫寛容をもたらす。免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイント経路（例えば抗ＰＤ−Ｌ１または抗ＰＤ１抗体）をブロックする抗体である。その結果、免疫寛容が壊れ、免疫細胞は腫瘍を認識し、攻撃することができる。しかし、これは、腫瘍が、活性化免疫細胞が腫瘍に侵入することを不可能にする微小環境をしばしば有することから、全ての腫瘍型に機能するわけではない。腫瘍へのこの侵入は、腫瘍を攻撃し、その微小環境を変化させる腫瘍溶解性ウイルス、特にパルボウイルス、より詳細にはパルボウイルスＨ−１を使用することにより今や可能になる。言い換えれば、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解を通じて腫瘍を「裸」にすることができ、チェックポイント阻害剤を使用することにより「武装」された免疫細胞は、腫瘍への侵入を開始することができる。腫瘍溶解性ウイルスは、成功する免疫応答のドアオープナーと見なすことができる。この概念では、腫瘍溶解性ウイルス治療は、非免疫原性腫瘍を免疫原性腫瘍に変換することから、いずれの腫瘍型も、また、チェックポイント阻害剤治療が過去に失敗したものも治療することができるはずである。一般原則に照らして、これは、腫瘍微小環境を変化させる限り、いずれの腫瘍溶解性ウイルス、およびいずれのチェックポイント阻害剤でも機能する。これは、潜在的に最初の腫瘍溶解に加えて、疾患再発の予防において長期効果をもたらす可能性がある。この効果の組合せは、特にウイルスによる以前の療法の後、腫瘍を免疫系に対してより感受性にする。患者の例は、この併用療法が、寛解または疾患安定のどちらかをもたらすことを示している。

がんの進行を検査する場合、特にがん細胞および免疫細胞を含む、異なる細胞間の進化するクロストークが利用されることが明らかになっている。がん細胞は、免疫微小環境、ならびに免疫抑制および免疫回避をもたらす免疫細胞の機能を変えることができる（Ｆｒｉｄｍａｎら、２０１２年；Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈら、２０１２年；Ｈａｌａｍａら、２０１１年（ａ）、２０１１年（ｂ））。例えば、結腸直腸がん（ＣＲＣ）の肝転移の場合、結腸直腸がん肝転移の浸潤縁は、浸潤縁自身の大きさの免疫学的微小環境であることが示されている。この環境は、明らかなケモカイン勾配に従って、Ｔリンパ球の浸潤縁への遊走を誘導する。浸潤Ｔリンパ球は、ＣＣＬ５を自身で産生することにより腫瘍刺激作用を発揮する。結腸直腸がんの肝転移の微小環境は、Ｔｈ１、Ｔｈ２、またはＴｈ１７環境を示さないが、代わりにケモカインおよびＶＥＧＦ、ＨＧＦ、およびＭＩＦのような増殖因子を伴う腫瘍促進性炎症に関して最適化される（Ｈａｌａｍａら、２０１６年）。この論文では、ａ）免疫抑制の背景、ｂ）結腸直腸がん転移の腫瘍防御機構の可能性、ならびにｃ）腫瘍および転移における特定の免疫細胞サブセットの腫瘍促進特性が明らかにされた。この発表の中で、腫瘍細胞は浸潤縁ではＰＤ−Ｌ１陰性であることも示された。これは、チェックポイント阻害剤による治療が、それまでいくつかの腫瘍実体で成功しなかった理由の説明になる可能性がある。前述の通り、免疫細胞が腫瘍にうまく進入し、これを攻撃する前に、微小環境は、腫瘍溶解性ウイルスにより変更されなければならない。これに関して、パルボウイルスＨ−１およびＰＤ１抗体による治療後、Ｔ細胞密度の著しい増加が腫瘍で観察されたこと、およびほとんどのＴ細胞はＰＤ１陽性であることを示す実施例２および図１〜９を参照されたい。

本発明は、以下の非限定的実施例、方法、および図を参照して、例示としてのみこれより記載される。

重要な腫瘍面積、ＣＤ３陽性細胞の明白な浸潤を示す、肝転移（ＣＤ３）の生検１の免疫蛍光の図である。浸潤物は不均一である。 エフェクターＴ細胞の明白な浸潤を示す、肝転移（ＣＤ８）の生検１の免疫蛍光の図である。この場合もやはり不均一である。興味深いことに、めったに観察されないＣＤ８^＋Ｔ細胞と腫瘍上皮との近接が見られる。 間質コンパートメントは大部分がＴ細胞リッチであることを示す、肝転移（ＰＤ−１）の生検１の免疫蛍光の図である。それらのほとんどはＰＤ１陽性である。 Ｈ−１ＰＶ＋ＰＤ−１抗体の初回注入後、Ｔ細胞密度の著しい増加が観察されたことを示す、肝転移（ＣＤ３）の生検２の免疫蛍光の図である（約＋３０〜５０％）。この場合もやはり不均一なパターン。 ＣＤ８^＋Ｔ細胞密度の著しい増加を示す、肝転移（ＣＤ８）の生検２の免疫蛍光の図である。極めて不均一である。ＣＤ８^＋Ｔ細胞と腫瘍細胞との密接な接触。 ほとんどのＴ細胞がＰＤ−１陽性であることを示す、肝転移（ＰＤ−１）の生検２の免疫蛍光の図である。 Ｈ−１ＰＶ＋ＰＤ−１抗体による２回目の注入後、Ｔ細胞密度の増加が依然として見られることを示す、肝転移（ＣＤ３）の生検３の免疫蛍光の図である。この場合もやはり極めて不均一。 生検２と類似した高密度なＴ細胞浸潤物を示す、肝転移（ＣＤ８）の生検３の免疫蛍光の図である。 依然としてほとんどのＴ細胞がＰＤ−１陽性であることを示す、肝転移（ＰＤ−１）の生検３の免疫蛍光の図である。 サイトカインプロファイルを示す図である。 マルチプレックスサイトカイン定量化からのデータ。 タンパク質定量化の参照。 生検ごとに等しいタンパク質量。 比が示されている（点の付いたカラムは、タンパク質量が低すぎて堅固ではない）。 増加／上方制御されたタンパク質：ＣＴＡＣＫ−ＣＣＬ２７、ＩＬ−１６、ＳＤＦ−１アルファ、ＩＰ−１０、ＭＩＰ−１ｂ サイトカインプロファイルを示す図である。 減少／下方制御されたタンパク質：Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−１３、ＩＬ−１２ｐ４０、塩基性ＦＧＦ、ＭＩＦ、ＳＣＧＦ−β、ＩＬ−１アルファ サイトカインプロファイルを示す図である。 サイトカインプロファイルを示す図である。 サイトカインプロファイルを示す図である。 サイトカインプロファイルを示す図である。 治療前および治療中（Ｈ−１ ＰＶ＋ペンブロリズマブの投与５５日および１０１日後）の進行再発性多形性神経膠芽細胞腫のＭＲＩである。上の列：Ｈ−１ＰＶ＋ペンブロリズマブによる治療前真ん中の列：Ｈ−１ＰＶ＋ペンブロリズマブの投与５５日後下の列：Ｈ−１ＰＶ＋ペンブロリズマブの投与１０１日後

一般的方法
（ａ）蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
ＦＩＳＨアッセイ：方法手順は、基本的にＳｉｌａｈｔａｒｏｇｌｕら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒプローブス．２００３年；１７：１６５〜１６９頁）およびＮｅｈｍｅら（Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１１年；１９６：２８１〜２８８頁）により記載されているように行った。ＦＩＳＨアッセイは、インビトロで培養したヒトＮＢＫ細胞で最初に確立し、免疫不全ラットのヒト神経膠腫異種移植片に由来するパラフィン包埋腫瘍組織に拡大した。次いでアッセイプロトコルを、患者由来パラフィン包埋または凍結保存腫瘍材料のＨ−１ＰＶ ＤＮＡおよびＲＮＡ配列の検出に適用した。

陽性および陰性対照：各ＦＩＳＨアッセイでは、ラットのＨ−１ＰＶ処理または模擬処理ヒト神経膠腫異種移植片に由来するパラフィン包埋腫瘍組織を、それぞれ陽性または陰性対照として使用した。プローブなし（試薬置換陰性対照；標的特異的ハイブリダイゼーションプローブを除外）およびミスマッチ（３〜５個のヌクレオチドを有する標的特異的ハイブリダイゼーションプローブを交換）対照も含めた。

ハイブリダイゼーションプローブ：標的特異的ハイブリダイゼーションプローブを、Ｈ−１ＰＶ非構造（ＮＳ）および構造（ＶＰ）タンパク質コード配列、ならびに増加した標的特異性および強力な結合を有する表示されたロックド核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチドを認識するように、Ｅｘｉｑｏｎ（Ｖｅｄｂａｅｋ、デンマーク）によりカスタムデザインした（参照までに、ｗｗｗ．ｅｘｉｑｏｎ．ｃｏｍ参照のこと）。プローブをＨ−１ＰＶ陰性（センス）または陽性（アンチセンス）鎖ＤＮＡのどちらかに対する逆相補性により合成し、それらの３’および５’末端で二重ジゴキシン（ＤＩＧＮ）標識した。ＮＳおよびＶＰ特異的プローブの両方を、ハイブリダイゼーションシグナルを増加させるために等量の混合物として適用した。
ＮＳ１−アンチセンス：
５ＤＩＧＮ／ＴＣＡＧＣＡＣＡＣＡＡＣＡＧＡＴＧＧＣＡＴ／３ＤＩＧＮ
ＶＰ−アンチセンス：
５ＤＩＧＮ／ＴＡＣＴＡＴＣＣＡＧＡＧＣＡＡＣＣＡＴＣＡＴ／３ＤＩＧＮ
ＮＳ１−センス：
５ＤＩＧＮ／ＡＡＴＴＣＧＣＴＡＧＧＴＴＣＡＡＴＧＣＧＣＴ／３ＤＩＧＮ
ＶＰ−センス：
５ＤＩＧＮ／ＴＧＡＣＣＴＡＣＣＡＡＣＡＴＣＡＧＡＴＡＣＡ／３ＤＩＧＮ

シグナル可視化：シグナル可視化は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｒｏｃｈｅ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミュンヘン、ドイツ）、およびチラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）／シアニン（Ｃｙ）３試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ドイツ）とコンジュゲートした抗ＤＩＧＮ抗体との連続インキュベーションにより達成した。画像取得は、Ｚｅｉｓｓ Ｃｅｌｌ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ顕微鏡およびＺＥＮソフトウェアを使用することにより行った。

シグナル定量：陽性シグナルの定量分析にはＦｉｊｉ画像Ｊソフトウェアを使用し、目的開発カスタムマクロ（Ｄｒ．Ｄ．Ｋｒｕｎｉｃ、Ｇｅｒｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、ハイデルベルク、ドイツ）および定常処理設定を用いた自動分析を行った。結果は、顕微鏡観察野当たりの陽性シグナルの平均強度（ｄＦＯＶ＝１．０００μｍ）、および／または標識細胞当たりの陽性シグナルの平均強度として表した。バックグラウンド蛍光（ミスマッチプローブにより生成された偽陽性シグナル）の値は、陽性シグナルと陰性シグナルの間のカットオフを規定した。シグナル強度は、任意の単位（ａ．ｕ．）で表した。

（ｂ）細胞培養および増殖アッセイ
Ｔ細胞を健康なドナーから採取し、短時間の静置後、ＣＤ３／ＣＤ２８被覆９６ウェルプレート（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ製の抗ＣＤ３、ＢＤ、ドイツ製の抗ＣＤ８）で一晩刺激した。Ｔ細胞培養培地は、ＲＰＭＩ１６４０（ＰＡＡ、ＵＳＡ）、１０％ヒト血清（５６℃で３０分間、加熱不活性化した）、１％グルタミン（ＰＡＡ、ＵＳＡ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＡＡ、ＵＳＡ）、１％非必須アミノ酸（ＰＡＡ、ＵＳＡ）、および１％ＨＥＰＥＳ（ＰＡＡ、ＵＳＡ）を含有した。市販の腫瘍細胞株を、供給者の指示に従って培養した。細胞の定量化は、特に播種直後（すなわち、増殖アッセイのための０．５×１０^５細胞／ｍｌ、細胞をプレートに均等に播種）、およびインキュベーション／処理後に、自動細胞カウンターＴＣ１０（ＢｉｏＲａｄ、ドイツ）による二重測定により３回ずつ行った。初代細胞株を、最近記載されているように（Ｃａｓｔｒｏら、２０１３年）、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｏｎ（ハイデルベルク、ドイツ）によるＭｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｃｅｌｌ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｉｏｎを用いて確認した。ＳＮＰプロファイルがマッチした既知のプロファイルは固有であり、ヒト上皮腫瘍細胞株と一致した。全ての細胞株を、ＰＣＲによりマイコプラズマ汚染についてテストした。

腹水（結腸直腸がん患者由来）の調製、ならびにマクロファージおよびリンパ球の抽出は、以下の通りに行った。以前の報告から適応させ、腹水を滅菌プラスチックバッグに回収した。各バッグの出口ノズルを７０％アルコールによる消毒により準備し、腹水の最初の画分は廃棄する一方、残りの腹水は５０ｍｌファルコン管に分配する。１５００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。上清をＲＰＭＩ培地（１：２）と混合し、馴化培地（ＣＭ）として使用した。マクロファージ集団（ａ）については、次いでペレットをＲＰＭＩ培地に再懸濁し、フィコール勾配を通過させる（室温、２０００ｒｐｍで３０分間）。次いで中間相をＲＰＭＩに回収し、洗浄し、遠心分離した（１８００ｒｐｍ、１０分間）。得られたペレットを、次いでＲＰＭＩを含む細胞フラスコに播種する。マクロファージ集団については、１．５時間（３７℃）の接着工程後、次いで上清を収集し、残りの接着細胞をＰＢＳで洗浄し（３回）、次いでＣＭを補充した。リンパ球（ｂ）については、次いでペレットをＲＰＭＩ培地に再懸濁し、再び遠心分離し、次いでペレットを、ＲＰＭＩを含む細胞フラスコに播種した。接着後、上清を使用してリンパ球を抽出した。マクロファージまたはリンパ球のどちらかによる実験後、上清をサイトカインについて測定し、細胞を収集し、染色（マクロファージについては二重染色ＣＤ１６３およびＣＤ６８、腫瘍細胞についてはＣＥＡ、およびリンパ球についてはＣＤＳ）により分析し、細胞内容物の純度をコントロールした（＞９５％）。腫瘍細胞の抽出は、腫瘍組織の分離および接着工程後に行った。

（ｃ）サイトカインおよびケモカイン定量化
２レーザーアレイリーダーは、目的とする全てのサイトカインおよびケモカインを同時に定量化する。標準曲線および濃度を、５パラメーターロジスティックプロット回帰式に基づいてＢｉｏ−Ｐｉｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ４．１．１で計算した。簡単には、切断した凍結組織の小片を１５０μｌ冷溶解緩衝液に移し、ボルテックスし、−８０℃（１０分間）で凍結し、氷上で解凍した。冷超音波浴でインキュベーション（１０分間）後、試料を−８０℃で再び凍結し、氷上で解凍し、遠心分離した（１３，０００ｒｐｍ、２０分間、４℃）。上清のタンパク質濃度を判定し、溶解物の濃度を、ヒト血清希釈液（ＢｉｏＲａｄ）を用いて１０００μｇ／ｍｌ（生検用には３００μｇ／ｍｌ）に調整し、組織溶解物中のサイトカイン／ケモカイン濃度を、製造者の指示（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ハーキュリーズ、ＣＡ、ＵＳＡ）に従ってマルチプレックスタンパク質アレイにより定量化した。分析物の検出感度は１ｐｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌに及んだ。プラットフォームにより「範囲外」として認定された値は、分析物ごとに生成した単一標準曲線に基づき外挿した。標準曲線が最小標準偏差を示したことから、最高濃縮標準濃度を外挿に使用した。サイトカインのクラス（降順、例えばＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ１７等の）を形成するために、特定の用語（例えばＧＯ：００４３０３０：マクロファージ活性化の制御、ＧＯ：００４２１０４：活性化Ｔ細胞増殖の正の制御、またはＧＯ：０００６９３５：走化性）または文献検索の評価においてＡＭＩＧＯデータベースを使用した（ｈｔｔｐ：／／ａｍｉｇｏ．ｑｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｖ．ｏｒｇ／）。ＴＨ１、ＴＨ２またはＴＨ１７優位サイトカインを含む試料由来陽性対照を分析に使用した。

連続切片におけるマルチプレックスタンパク質定量化アプローチの全体的な再現性（精度）は、優れた再現性を示した（スピアマンの順位相関ｒ＝０．９７５およびｐ＝０．０００１、中央値の差７０ｐｇ／ｍｌ）。確度は、サイトカインの既知の濃度、例えば２５．０００ｐｇ／ｍｌのＣＣＬ５（期待値から２．５％に対応する、６２８．９２ｐｇ／ｍｌの標準偏差を示した）および１００ｐｇ／ｍｌのＣＣＬ５（期待値から２．７％に対応する、２．７ｐｇ／ｍｌの標準偏差を示した）での溶液の測定において評価した。調査分析物の校正は、製造者（ＢｉｏＲａｄ、ドイツ）によって推奨されている通りに行う。本発明者らは、確度および精度に関して追加の参照材料については製造者のホームページを参照する（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏ−ｒａｄ．ｃｏｍ／ｗｅｂｒｏｏｔ／ｗｅｂ／ｐｄｆ／ｌｓｒ／ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ／Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５８０３Ａ．ｐｄｆ）。

異なる連続切片浸潤縁タンパク質定量化間の比較も、優れた再現性（スピアマンの順位相関ｒｈｏ＝０．９２２、ｐ＝０．０００１）を明らかにした。最後に、レーザー支援マイクロダイセクション材料対マクロダイセクション材料の比の比較は、実際に浸潤縁が、再現可能な明白なサイトカインプロファイルを有する、正確に分離された領域であることを明らかにした。また、周囲の隣接する肝臓または肝転移との差も、マクロダイセクション標本がマイクロダイセクション標本で見出されるパターンと完全に類似するほど顕著である。

生検材料からのサイトカインおよびケモカインデータの生成は、上記に概説されているように行った。利用可能な材料の量に限界があるため、アッセイに使用するタンパク質濃度を３００ｍｇに設定した。組織学的には患者の隣接する肝臓は、形態および免疫細胞の存在に関して、治療前と比較した場合、治療下で変わらないままであった。それ故に、サイトカイン測定の精度に関する（および希釈等の効果を評価するための）対照として、治療前および治療下の隣接する肝臓のサイトカインレベルが使用され、優れた一致を示した（スピアマンの順位相関ｒｈｏ＝０．９９１およびｐ＝０．０００１、中央値の差５ｐｇ／ｍｌ）。これは、ＣＣＲ５阻害の効果を妨げる可能性が低い創傷治癒の効果（生検後８日目の後にもはや存在しているはずがない）をももたらす。アポトーシス腫瘍細胞のパーセンテージは、以前に記載されているように（Ｄｕａｎら、２００３年）、ヘマラウンおよび／またはＨ＆Ｅで染色した切片中のアポトーシス核（核の形態に基づく）およびインタクトな腫瘍細胞をカウントして判定した。

（ｄ）免疫組織化学および免疫蛍光
ＦＦＰＥ組織を脱パラフィンし、再水和した（ＢＯＮＤ Ｄｅｗａｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｌｅｉｃａ、ドイツ）。１００℃で熱誘導エピトープ回収（ＨＩＥＲ）（ＢＯＮＤ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １または２、Ｌｅｉｃａ、ドイツ）後、内因性ペルオキシダーゼ活性を、３％過酸化物ブロックと２０分間インキュベーションしてブロックした（ＢＯＮＤ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌｅｉｃａ、ドイツ）。切片を１０％正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ、ＵＳＡ）でブロックした。使用抗体および希釈のリストは以下に見い出すことができる。これらを、一次抗体として室温で３０分間適用した。スライドを、二次抗体（ウサギ抗マウスＩｇＧ、Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌｅｉｃａ、ドイツ）と室温で８分間インキュベートした。シグナルのさらなる増幅は、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートし、多数のデキストラン分子に結合した三次抗体との室温で８分間のインキュベーションにより達成した（Ｐｏｌｙ−ＨＲＰ−マウス抗ウサギＩｇＧ、Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌｅｉｃａ、ドイツ）。抗原検出は、３，３−ジ−アミノ−ベンジジン（ＤＡＢクロモゲン、Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌｅｉｃａ、ドイツ）による呈色反応により行った。切片をヘマトキシリン（Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌｅｉｃａ、ドイツ）で対比染色し、Ａｑｕａｔｅｘ（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）でマウントした。マッチしたアイソタイプ対照を陰性対照として使用し、隣接する正常組織または既知の陽性細胞を陽性対照として使用した。

免疫蛍光二重染色を、ケモカイン二重染色に関して赤色蛍光Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４色素標識ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ドイツ）および緑色蛍光Ａｌｅｘａ４８８色素標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ドイツ）を連続的に用いて凍結切片で行った（または緑色蛍光Ａｌｅｘａ４８８色素標識ヤギ抗マウスＩｇＧの場合、第２の一次抗体を対照用に除外した）。ＣＤ６８、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＣＬ５の分析には、赤色蛍光Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４色素標識ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ドイツ）および緑色蛍光Ａｌｅｘａ ４８８色素標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ドイツ）を同時に使用した。ＣＤ３およびＣＣＬ５の分析には、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）分子プローブＡ２１４２２およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧを使用した。凍結切片を、抗体推奨に従って染色の前に、メタノール中４％ＰＦＡまたは３３％アセトンのどちらかで固定した。第１の一次抗体を４℃で一晩インキュベーション後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４（１：１００希釈）を１時間適用した。第２の一次抗体は室温で３時間適用し、連続二重染色中に１時間、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（１：１００希釈）で検出した。同時染色には、両方のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ抗体（それぞれ１：１００希釈）を１時間インキュベーションした後、両方の一次抗体を一晩インキュベートした。対比染色のために、ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（ベクター、ＵＳＡ）を用いて切片をマウントした。共焦点画像は、Ｎｉｋｏｎ Ｃ２ Ｐｌｕｓ共焦点顕微鏡システムで得た。

ヒトＣＤ３イプシロン（ＦＦＰＥには１：１００希釈およびＨＩＥＲ１、凍結切片には４％ＰＦＡ固定およびＨＩＥＲ２、クローンＰＳ１、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ、ＵＫ、およびウサギモノクローナル抗ＣＤ３、Ａｂｃａｍ製クローンＳｐ７）、ＣＤ８（ＦＦＰＥには１：５０希釈およびＨＩＥＲ２、凍結切片には１：１００希釈および４％ＰＦＡ固定、クローン４Ｂ１１、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ、ＵＫ）、ＣＣＲ５（ＦＦＰＥには１：５０希釈およびＨＩＥＲ１、凍結切片には１：１００希釈、４％ＰＦＡ固定およびＨＩＥＲ１、クローンＭＭ００６５−６Ｈ２０、ａｂｃａｍ、ＵＫ）、ＣＣＬ５（凍結切片には１：５０希釈および４％ＰＦＡ固定、クローンＶＬ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ）、ＰＤ１（ＦＦＰＥには１：５０希釈およびＨＩＥＲ１、凍結切片にはメタノール中３３％アセトン固定、クローンＮＡＴ、ａｂｃａｍ、ＵＫ）、ＣＤ６８（ＦＦＰＥには１：２００希釈およびＨＩＥＲ１、凍結切片には１：７００希釈およびメタノール中３３％アセトン固定、クローンＫＰ１、ａｂｃａｍ、ＵＫ）、ＣＤ１６３（ＦＦＰＥには１：５００希釈およびＨＩＥＲ２、凍結切片にはメタノール中３３％アセトン固定、クローンＥＤＨｕ−１、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、ＵＫ）、ＣＤ４４（ＦＦＰＥには１：９０００希釈およびＨＩＥＲ１、凍結切片には１：５０００希釈、４％ＰＦＡ固定およびＨＩＥＲ２、クローン１５６−３Ｃ１１、ａｂｃａｍ、ＵＫ）、ＣＤ７４（ＦＦＰＥには１：５０希釈およびＨＩＥＲ１、凍結切片には１：７５希釈、４％ＰＦＡ固定およびＨＩＥＲ２、クローンＬＮ２、ａｂｃａｍ、ＵＫ）、Ｋｉ６７（１：２００希釈、ＰＦＡ固定、クローンＭＩＢ−１、ＤＡＫＯ、ＵＳＡ）、ＣＣＲ１（ＦＦＰＥには１：５０希釈およびＨＩＥＲ１、凍結切片には４％ＰＦＡ固定およびＨＩＥＲ１、クローンＭＭ００６１−７Ｂ１７、ａｂｃａｍ、ＵＳＡ）、ＣＸＣＬ９（凍結切片には１：１００希釈およびメタノール中３３％アセトン固定、クローン ＭＭ０２２０−７Ｆ１１、ａｂｃａｍ、ＵＫ）、ＣＤ１１ｂ（凍結切片には１：５０希釈およびメタノール中３３％アセトン固定、クローン２Ｑ９０２、ａｂｃａｍ、ＵＫ）およびＣＸＣＬ１０（凍結切片には１：５０希釈およびメタノール中３３％アセトン固定、クローン６Ｄ４、ａｂｃａｍ、ＵＫ）、インターフェロン−アルファ２（１：５０希釈、クローンＥＢＩ−１、ｅＢｉｏｓｃｔｅｎｃｅ）およびインターフェロン−ガンマ（１：００希釈、クローンＢ２７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を認識するマウスモノクローナル抗体。ヒトＰＤ−Ｌ１（ＦＦＰＥには１：５０希釈およびＨＩＥＲ２、凍結切片には１：１５０希釈および４％ＰＦＡ固定、ポリクローナル、ａｂｃａｍ、ＵＫ）、ＣＣＲ３（凍結切片には１：８００希釈、ＨＩＥＲ１および４％ＰＦＡ固定、クローンＹ３１、ａｂｃａｍ、ＵＫ）、ＣＤ４（凍結切片には１：１５０希釈および４％ＰＦＡ固定、クローンＳＰ３５、Ｚｙｔｏｍｅｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ）、ＣＤ１１ｂ（１：５００希釈および４％ＰＦＡ固定、クローンＥＰ１３４５Ｙ、ａｂｃａｍ、ＵＫ）、ＣＤ８（凍結切片には１：１５０希釈および４％ＰＦＡ固定、クローンＳＰ１６、Ｚｙｔｏｍｅｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ）およびＣＥＡＣＡＭ５（１：１００希釈、クローン３２７、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を認識するウサギ抗体。古典的なＨ＆ＥおよびＴＵＮＥＬ染色は、製造者の記載に従って行い（Ｉｎ ｓｉｔｕ細胞死検出キット、Ｒｏｃｈｅ、ドイツ）、連続切片を使用して、ＴＵＮＥＬ対形態学的分析の比較により死腫瘍細胞を定量化した。以前に発表されているように（Ｄｕａら、２００３年）、組織切片のサイドバイサイドでの比較が形態学的分析の優れた診断値を確認したことから、形態学的分析は評価のための好ましい方法であった。

（ｅ）スライド全体の（免疫）細胞定量化
染色免疫細胞の数を、パーソナルコンピューターに接続されたＮＯＰ Ｎａｎｏｚｏｏｍｅｒ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ、日本）からなるコンピューター画像解析システムを用いてカウントした。全組織切片の完全な顕微鏡画像を自動的に取得し（バーチャル顕微鏡法）、測定領域にわたる平均細胞密度を分析に使用した。細胞数は、以前に報告されているように（Ｈａｌａｍａら、２０１１ｂ；Ｈａｌａｍａら、２０１０：Ｈａｌａｍａら、２００９ｂ）、目的とする任意の領域（平均１０ｍｍ２、最大４０ｍｍ２）にわたって、特別に開発されたソフトウェアプログラム（ＶＩＳソフトウェアスイート、Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ、デンマーク）により生成した。全ての評価を生合成について目視でチェックした。

（ｆ）フローサイトメトリー
実験ごとに、結腸直腸がん肝転移の浸潤縁由来の組織（最大１０ｇ）を、カッティング工程ならびに４０μｍ細胞ストレーナおよびＲＰＭＩ培地を用いる複数回の洗浄工程により分離した。次いで抽出細胞を、ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＣＳにより補充した）を含む２４ウェルプレートに一晩入れ、次いで場合によりモネンシン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ドイツ）で３時間ブロックした。次いで細胞を収集し、遠心分離し、フローサイトメトリー標準プロトコルを用いてＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４およびＣＣＬ５について分析した。

表面染色を以下の通りに行った：各１００μｌ ＦＡＣＳ緩衝液に対して、２．５μｌ ＣＤ３−Ｖ４５０（５６０３６５、ＢＤ、ドイツ）、１．２５μｌ ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（５６０６５０、ＢＤ、ドイツ）、および２．５μｌ ＣＤ８−ＡＰＣ−Ｈ７（６４１４００、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ドイツ）を使用し、その後（光から保護して）氷上で２０分間インキュベーションし、遠心分離した。次いで細胞内染色を、細胞の１％ＰＦＡへの取り込み、１５分間のインキュベーションと、その後の０．１％サポニン緩衝液による３回の洗浄工程（および遠心分離）により行った。ＣＣＬ５の染色は、次の通りに行った：各１００μｌ ０．１％サポニン緩衝液に対して、５μｌ抗ヒトＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）−ｅＦｌｕｏｒ６６０（ＡＦ６４７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＫ）、または１．２５μｌでのアイソタイプ対照マウスＩｇＧ２ｂｋ−ｅＦｌｕｏｒ６６０（ＡＦ６４７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＫ）を使用し、その後（光から保護して）室温で１５分間インキュベーションし、０．１％サポニン緩衝液による２回の洗浄工程を行った。次いで標識細胞を、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩサイトメーター（Ｈａｒｖａｒｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用いてＦＡＣＳにかけ、陰性対照に対してゲーティングした。

腫瘍組織を測定し、リンパ球集団を同定する前に陽性対照を確立するために、健康なドナーリンパ球を上記に概説されているように処理した。

転移性ＣＲＣ（結腸直腸がん）を有する患者におけるパルボウイルスＨ−１およびチェックポイント阻害剤による集学的治療（併用療法）
進行肝転移（サイズおよび数の進行）を伴う結腸直腸がん（横行結腸の低分化腺癌；変異状態：ＫＲＡＳ ＷＴ、ＮＲＡＳ ＷＴ、ＭＳＳ；初回手術２０１３年）に罹患している患者を、３日連続注入（４×１０^８ｐｆｕ；１〜３日目）で適用した１．２×１０^９ＰＦＵパルボウイルスＨ−１の累積用量で治療し、その後、製造者の薬量（適正な処方についての薬理的決定）（２ｍｇ／Ｋｇ／ＢＷ、１日目）に従って、免疫チェックポイント阻害剤ペンブロリズマブ（キイトルーダ（登録商標））により治療した。同じ投与計画によるこの治療を、５週間後に繰り返した。

転移した肝臓で行った生検を治療前および治療中の様々な時点で採取し、以下の驚くべき発見があった：Ｈ−１ＰＶ＋ペンブロリズマブ治療の前であった第１回生検と比較して、後の生検（第２回および第３回生検）では増加したリンパ球浸潤が観察された。さらに、画像解析（超音波、ＣＴ、ＭＲＩ）は、肝転移の質量低減を明らかにした。

治療中、ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団優位なＴ細胞密度の著しい増加が観察されたことを示す図１〜９を参照のこと。Ｔ細胞浸潤物は不均一であり、Ｔ細胞が腫瘍細胞と著しく近接している。ほとんどのＴ細胞はＰＤ１陽性である。

サイトカインおよびケモカイン定量化は、上記の実施例１に記載されている方法を用いて行った。プロファイルを図１０から１５に示す。ＩＰ１０およびＣＣＬ５の増加が優勢であるように見える。ｌＬ−２の増加はなく、インターフェロンガンマの軽度の増加のみが見られた。

ＦＩＳＨ分析を、上記の実施例１（ａ）に記載されているように行った。ＦＩＳＨ分析は、活性ウイルス（Ｈ−１ＰＶ）が生検２で判定できることを示す。これは、ウイルスが腫瘍／転移に移動したことを明確に示すものである。

原発性手術不能ＧＢ（多形性神経膠芽細胞腫）患者におけるパルボウイルスＨ−１およびチェックポイント阻害剤による集学的治療
手術不能の多形性神経膠芽細胞腫に罹患している患者を、３日連続注入で適用した１．２×１０^９ＰＦＵパルボウイルスＨ−１の累積用量で治療し、その後、製造者の薬量（２ｍｇ／Ｋｇ／ＢＷ、Ｈ１−ＰＶ投与の３日後）に従って、ペンブロリズマブ（キイトルーダ（登録商標））により治療した。

ＭＲＩを、Ｈ−１ＰＶ＋チェックポイント阻害剤ペンブロリズマブによる療法前および治療中に撮影した。ＭＲＩは、治療の５５日後の３０％を超える腫瘍のサイズ低減、および１０１日目のほぼ完全寛解を明らかにした。患者は健康が回復しており、追加の薬物療法を必要としていない。ＭＲＩを図１６に示す。

（参考文献リスト）

Claims (10)

1. （ａ）パルボウイルスＨ−１および（ｂ）抗ＰＤ１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含有し、固形がんを治療する方法に使用するための組合せ医薬。
2. 固形がんが、脳がん、結腸がん、膀胱がん、肝臓がん、乳がん、腎臓がん、頭部／頚部扁平上皮細胞癌、肺がん、悪性メラノーマ、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎細胞がん、または胃がんである、請求項１に記載の組合せ医薬。
3. 抗ＰＤ１抗体がペンブロリズマブまたはニボルマブである、請求項１または２に記載の組合せ医薬。
4. 化学療法剤、生物治療剤、免疫原性剤、免疫刺激サイトカイン、および免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子をトランスフェクトされた細胞から選択される、１つまたは複数の追加の治療剤をさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の組合せ医薬。
5. （ａ）パルボウイルスＨ−１および（ｂ）抗ＰＤ１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体が連続的に投与される、請求項１に記載の使用のための組合せ医薬。
6. 脳がんが多形性神経膠芽細胞腫である、請求項２に記載の使用のための組合せ医薬。
7. （ａ）パルボウイルスＨ−１および／または（ｂ）抗ＰＤ１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、腫瘍内または静脈内投与により投与される、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用のための組合せ医薬。
8. 第１の容器、第２の容器、および添付文書を含むキットであって、第１の容器が、パルボウイルスＨ−１を含有する医薬組成物の少なくとも１つの用量を含み、第２の容器が、抗ＰＤ１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む医薬組成物の少なくとも１つの用量を含み、および添付文書が、医薬組成物を用いて固形がんを有する個体を治療するための指示を含む、キット。
9. 固形かんが、脳がん、結腸がん、膀胱がん、肝臓がん、乳がん、腎臓がん、頭部／頚部扁平上皮細胞癌、肺がん、悪性メラノーマ、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎細胞がん、または胃がんである、請求項８に記載のキット。
10. 脳がんが多形性神経膠芽細胞腫である、請求項９に記載のキット。