CN109061001A - 人参皂苷的检测方法 - Google Patents

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CN109061001A CN201811078565.6A CN201811078565A CN109061001A CN 109061001 A CN109061001 A CN 109061001A CN 201811078565 A CN201811078565 A CN 201811078565A CN 109061001 A CN109061001 A CN 109061001A
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冉黎灵
周玲
梁琪
唐智
吴峰
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Abstract

本发明提供了人参皂苷的检测方法，属于生物检验和蛋白质技术领域。本发明提供的人参皂苷的检测方法，该方法检测样本中的人参皂苷，检测结果精确可靠，通过本方法的处理，建立的处理流程，液相色谱‑质谱系统的峰型较好，响应稳定；检测结果准确可靠。

Description

人参皂苷的检测方法
技术领域
本发明涉及化学分析测试领域，具体而言，涉及人参皂苷的检测方法。
背景技术
人参皂苷(Ginsenoside)是一种固醇类化合物，三萜皂苷。主要存在于人参属药材中。人参皂苷被视为是人参中的活性成分，因而成为研究的目标。因为人参皂苷影响了多重的代谢通路，所以其效能也是复杂的，而且各种人参皂苷的单体成分是难以分离出来的。
现有技术中检测内标物质有用紫杉醇、地高辛。以紫杉醇或地高辛作为内标响应变化大，导致批间精密度无法通过；双氯芬酸钠导致检测的峰型不好，因此检测效果均不理想。
发明内容
本发明的目的在于提供人参皂苷的检测方法，通过本检测方法，能建立对人参皂苷精确检测方法，检测的结果较为准确可靠。
为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：
人参皂苷的检测方法，检测方法包括以下步骤：
配制人参皂苷的标准曲线工作液和内标工作液；
将标准曲线工作液进行液相色谱-质谱分析，建立并得到人参皂苷的标准曲线；
将待检样本与内标工作液混合后进行液相色谱-质谱分析，根据数据计算得到待检样本中人参皂苷的含量数据；
其中，液相色谱的条件为Waters ACQUITY UPLC CSH C18 1.7μm(2.1×100mm)，柱温40℃，流速0.4mL/min，进样量8μL，流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为10mM的乙酸铵溶液，流动相B为乙腈溶液；流动相的梯度为(体积百分数)：
0min，A：50％、B：50％；
0.5min，A：50％、B：50％；
2.5min，A：5％、B：95％；
3.0min，A：50％、B：50％；
0.5min，A：5％、B：95％；
4.0min，A：50％、B：50％。
本发明的有益效果为：本发明提供的人参皂苷的检测方法，该方法检测样本中的人参皂苷，检测结果精确可靠，通过本方法的处理，建立的处理流程，液相色谱-质谱系统的峰型较好，响应稳定；检测结果准确可靠。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实验例提供的线性关系实验结果图；
图2为本发明实验例提供的氯唑沙宗实验结果图；
图3为本发明实验例提供的地高辛实验结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的人参皂苷的检测方法进行具体说明。
人参皂苷的检测方法，检测方法包括以下步骤：
配制人参皂苷的标准曲线工作液和内标工作液；
将标准曲线工作液进行液相色谱-质谱分析，建立并得到人参皂苷的标准曲线；
将待检样本与内标工作液混合后进行液相色谱-质谱分析，根据数据计算得到待检样本中人参皂苷的含量数据；
其中，液相色谱的条件为Waters ACQUITY UPLC CSH C18 1.7μm(2.1×100mm)，柱温40℃，流速0.4mL/min，进样量8μL，流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为10mM的乙酸铵溶液，流动相B为乙腈溶液；流动相的梯度为(体积百分数)：
0min，A：50％、B：50％；
0.5min，A：50％、B：50％；
2.5min，A：5％、B：95％；
3.0min，A：50％、B：50％；
0.5min，A：5％、B：95％；
4.0min，A：50％、B：50％。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，质谱的条件为离子源为电喷离子源，离子源的温度为450℃，喷射电压4500v。
通过液相色谱-质谱系统的连用，建立检测样本人参皂苷的体系，能快速精密的测定样本中的人参皂苷的含量。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，标准曲线工作液由标准曲线储备液稀释得到，标准曲线储备液的浓度为0.388mg/mL。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，内标工作液为氯唑沙宗内标工作液，氯唑沙宗内标工作液的浓度为20ng/mL，氯唑沙宗内标工作液由内标储备液与甲醇溶液混合制得。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，甲醇溶液的浓度为45％-55％。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，通过制备空白血浆样品、零浓度血浆样品和标准血浆样品对液相色谱-质谱系统进行测试。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，空白血浆样品的制备包括取空白血浆加入磷酸盐缓冲液和甲基叔丁基醚振荡并离心，取上清并用氮气吹干后用复溶液复溶。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，复溶液由乙酸铵水溶液与乙腈混合制备得到。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，零浓度血浆样品由空白血浆加内标工作液、磷酸盐缓冲液和甲基叔丁基醚混合振荡、离心，取上清并氮气吹干后用复溶液复溶得到。
标准血浆是按照一定浓度标准配制而成的血浆样品。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，氮气的温度为40-50℃。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供人参皂苷的检测方法，包括该检测方法包括相关工作液的配制以及检测。
工作液的配制：人参皂苷储备液的配制，称量人参皂苷对照品约10mg置于称量皿中，用甲醇少量多次冲洗转移至25mL容量瓶中定容，摇匀，即得人参皂苷储备液，置于4℃冰箱保存。
浓度计算公式：10mg×97.0％÷25mL＝0.388mg/mL。
取人参皂苷储备液，用甲醇稀释，得到含人参皂苷浓度分别为100ngemL、200ng/mL、600ng/mL、1800ng/mL、5400ng/mL、16200ng/mL、40000ng/mL、80000ng/mL、100000ng/mL的系列对照品标准曲线工作液
本实施例中内标物质选用氯唑沙宗，内标储备液为氯唑沙宗内标储备液，其配制方法为：称量氯唑沙宗对照品约10mg置于称量皿中，用甲醇少量多次冲洗转移至25mL容量瓶中，用50％甲醇水定容至25mL，即得氯唑沙宗内标储备液置于4℃冰箱保存。
浓度计算公式：10mg×99.9％÷25mL＝0.400mg/mL。
将配制的氯唑沙宗内标储备液用浓度为45％的甲醇溶液稀释成浓度为20ng/mL的内标工作液。
复溶液，量取200mL，浓度为10mM乙酸铵水溶液置500mL玻璃瓶中，加入200mL乙腈，混匀，超声5min即得。
标准曲线标准血浆样品
质控标准血浆样品配制
工作液ID 工作液(μL) 血浆(μL) 终浓度(ng·mL<sup>-1</sup>e 标准血浆样品ID
SLLOQ 10 190 5 LLOQ
SQCL 10 190 15 L
SQCM1 10 190 300 M1
SQCM2 10 190 800 M2
SQCH 10 190 3750 H
空白血浆样品的制备，取空白血浆200μL，加入100μL磷酸盐缓冲盐，加入2mL甲基叔丁基醚，振荡10min，离心(4300rpm，10min)，取上清1500μL，40℃氮气挥干，加入复溶液500μL复溶。
零浓度血浆样品的制备，取空白血浆200μL，加入50μL内标工作液(20ng/mL氯唑沙宗)，加入100μL磷酸盐缓冲盐，加入2mL甲基叔丁基醚，振荡10min，离心(4300rpm，10min)，取上清1500μL，40℃氮气挥干，加入复溶液500μL复溶。
标准血浆样品的制备，取标准血浆样品200μL，加入50μL内标工作液(20ng/mL氯唑沙宗)，加入100μL磷酸盐缓冲盐，加入2mL甲基叔丁基醚，振荡10min，离心(4300rpm，10min)，取上清1500μL，40℃氮气挥干，加入复溶液500μL复溶。
以空白血浆样品、零浓度血浆样品和标准血浆样品对液相色谱-质谱系统进行测试。
具体检测方法包括以下步骤：
将人参皂苷的标准曲线工作液进行液相色谱-质谱分析，建立并得到人参皂苷的标准曲线。
将待检样本与内标工作液混合后进行液相色谱-质谱分析，根据数据计算得到待检样本中人参皂苷的含量数据。
其中，液相色谱的条件为Waters ACQUITY UPLC CSH C18 1.7μm(2.1×100mm)，柱温40℃，流速0.4mL/min，进样量8μL，流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为10mM的乙酸铵溶液，流动相B为乙腈溶液；流动相的梯度为(体积百分数)：0min，A：50％、B：50％；0.5min，A：50％、B：50％；2.5min，A：5％、B：95％；3.0min，A：50％、B：50％；0.5min，A：5％、B：95％；4.0min，A：50％、B：50％。
质谱分析的条件：
实施例2
本实施例提供人参皂苷的检测方法，包括该检测方法包括相关工作液的配制以及检测。
工作液的配制：
人参皂苷储备液的配制，称量人参皂苷对照品约10mg置于称量皿中，用甲醇少量多次冲洗转移至25mL容量瓶中定容，摇匀，即得人参皂苷储备液，置于4℃冰箱保存。
浓度计算公式：10mg×97.0％÷25mL＝0.388mg/mL。
取人参皂苷储备液，用甲醇稀释，得到含人参皂苷浓度分别为100ng/mL、200ng/mL、600ng/mL、1800ng/mL、5400ng/mL、16200ng/mL、40000ng/mL、80000ng/mL、100000ng/mL的系列对照品标准曲线工作液
本实施例中内标物质选用氯唑沙宗，内标储备液为氯唑沙宗内标储备液，其配制方法为：称量氯唑沙宗对照品约10mg置于称量皿中，用甲醇少量多次冲洗转移至25mL容量瓶中，用50％甲醇水定容至25mL，即得氯唑沙宗内标储备液置于4℃冰箱保存。
浓度计算公式：10mg×99.9％÷25mL＝0.400mg/mL。
将配制的氯唑沙宗内标储备液用浓度为55％的甲醇溶液稀释成浓度为20ng/mL的内标工作液。
复溶液，量取200mL，浓度为10mM乙酸铵水溶液置500mL玻璃瓶中，加入200mL乙腈，混匀，超声5min即得。
标准曲线标准血浆样品
工作液ID 工作液(μL) 血浆(μL) 终浓度(ng·mL<sup>-1</sup>) 标准血浆样品ID
SSTD1 10 190 5 STD1
SSTD2 10 190 10 STD2
SSTD3 10 190 30 STD3
SSTD4 10 190 90 STD4
SSTD5 10 190 270 STD5
SSTD6 10 190 810 STD6
SSTD7 10 190 2000 STD7
SSTD8 10 190 4000 STD8
SSTD9 10 190 5000 STD9
质控标准血浆样品配制
工作液ID 工作液(μL) 血浆(μL) 终浓度(e) 标准血浆样品ID
SLLOQ 10 190 5 LLOQ
SQCL 10 190 15 L
SQCM1 10 190 300 M1
SQCM2 10 190 800 M2
SQCH 10 190 3750 H
空白血浆样品的制备，取空白血浆200μL，加入100μL磷酸盐缓冲盐，加入2mL甲基叔丁基醚，振荡10min，离心(4300rpm，10min)，取上清1500μL，50℃氮气挥干，加入复溶液500μL复溶。
零浓度血浆样品的制备，取空白血浆200μL，加入50μL内标工作液(20ng/mL氯唑沙宗)，加入100μL磷酸盐缓冲盐，加入2mL甲基叔丁基醚，振荡10min，离心(4300rpm，10min)，取上清1500μL，50℃氮气挥干，加入复溶液500μL复溶。
标准血浆样品的制备，取标准血浆样品200μL，加入50μL内标工作液(20ng/mL氯唑沙宗)，加入100μL磷酸盐缓冲盐，加入2mL甲基叔丁基醚，振荡10min，离心(4300rpm，10min)，取上清1500μL，50℃氮气挥干，加入复溶液500μL复溶。
以空白血浆样品、零浓度血浆样品和标准血浆样品对液相色谱-质谱系统进行测试。
具体检测方法包括以下步骤：
将人参皂苷的标准曲线工作液进行液相色谱-质谱分析，建立并得到人参皂苷的标准曲线。
将待检样本与内标工作液混合后进行液相色谱-质谱分析，根据数据计算得到待检样本中人参皂苷的含量数据。
其中，液相色谱的条件为Waters ACQUITY UPLC CSH C18 1.7μm(2.1×100mm)，柱温40℃，流速0.4mL/min，进样量8μL，流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为10mM的乙酸铵溶液，流动相B为乙腈溶液；流动相的梯度为(体积百分数)：0min，A：50％、B：50％；0.5min，A：50％、B：50％；2.5min，A：5％、B：95％；3.0min，A：50％、B：50％；0.5min，A：5％、B：95％；4.0min，A：50％、B：50％。
质谱分析的条件：
实施例3
本实施例提供人参皂苷的检测方法，包括该检测方法包括相关工作液的配制以及检测。
工作液的配制：
人参皂苷储备液的配制，称量人参皂苷对照品约10mg置于称量皿中，用甲醇少量多次冲洗转移至25mL容量瓶中定容，摇匀，即得人参皂苷储备液，置于4℃冰箱保存。
浓度计算公式：10mg×97.0％÷25mL＝0.388mg/mL。
取人参皂苷储备液，用甲醇稀释，得到含人参皂苷浓度分别为100ng/mL、200ng/mL、600ng/mL、1800ng/mL、5400ng/mL、16200ng/mL、40000ng/mL、80000ng/mL、100000ng/mL的系列对照品标准曲线工作液
本实施例中内标物质选用氯唑沙宗，内标储备液为氯唑沙宗内标储备液，其配制方法为：称量氯唑沙宗对照品约10mg置于称量皿中，用甲醇少量多次冲洗转移至25mL容量瓶中，用50％甲醇水定容至25mL，即得氯唑沙宗内标储备液置于4℃冰箱保存。
浓度计算公式：10mg×99.9％÷25mL＝0.400mg/mL。
将配制的氯唑沙宗内标储备液用浓度为50％的甲醇溶液稀释成浓度为20ng/mL的内标工作液。
复溶液，量取200mL，浓度为10mM乙酸铵水溶液置500mL玻璃瓶中，加入200mL乙腈，混匀，超声5min即得。
标准曲线标准血浆样品
工作液ID 工作液(μL) 血浆(μL) 终浓度(ng·mL<sup>-1</sup>) 标准血浆样品ID
SSTD1 10 190 5 STD1
SSTD2 10 190 10 STD2
SSTD3 10 190 30 STD3
SSTD4 10 190 90 STD4
SSTD5 10 190 270 STD5
SSTD6 10 190 810 STD6
SSTD7 10 190 2000 STD7
SSTD8 10 190 4000 STD8
SSTD9 10 190 5000 STD9
质控标准血浆样品配制
工作液ID 工作液(μL) 血浆(μL) 终浓度(ng·mL<sup>-1</sup>) 标准血浆样品ID
SLLOQ 10 190 5 LLOQ
SQCL 10 190 15 L
SQCM1 10 190 300 M1
SQCM2 10 190 800 M2
SQCH 10 190 3750 H
空白血浆样品的制备，取空白血浆200μL，加入100μL磷酸盐缓冲盐，加入2mL甲基叔丁基醚，振荡10min，离心(4300rpm，10min)，取上清1500μL，45℃氮气挥干，加入复溶液500μL复溶。
零浓度血浆样品的制备，取空白血浆200μL，加入50μL内标工作液(20ng/mL氯唑沙宗)，加入100μL磷酸盐缓冲盐，加入2mL甲基叔丁基醚，振荡10min，离心(4300rpm，10min)，取上清1500μL，45℃氮气挥干，加入复溶液500μL复溶。
标准血浆样品的制备，取标准血浆样品200μL，加入50μL内标工作液(20ng/mL氯唑沙宗)，加入100μL磷酸盐缓冲盐，加入2mL甲基叔丁基醚，振荡10min，离心(4300rpm，10min)，取上清1500μL，45℃氮气挥干，加入复溶液500μL复溶。
以空白血浆样品、零浓度血浆样品和标准血浆样品对液相色谱-质谱系统进行测试。
具体检测方法包括以下步骤：
将人参皂苷的标准曲线工作液进行液相色谱-质谱分析，建立并得到人参皂苷的标准曲线。
将待检样本与内标工作液混合后进行液相色谱-质谱分析，根据数据计算得到待检样本中人参皂苷的含量数据。
其中，液相色谱的条件为Waters ACQUITY UPLC CSH C18 1.7μm(2.1×100mm)，柱温40℃，流速0.4mL/min，进样量8μL，流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为10mM的乙酸铵溶液，流动相B为乙腈溶液；流动相的梯度为(体积百分数)：0min，A：50％、B：50％；0.5min，A：50％、B：50％；2.5min，A：5％、B：95％；3.0min，A：50％、B：50％；0.5min，A：5％、B：95％；4.0min，A：50％、B：50％。
质谱分析的条件：
实验例
本实验例根据实施例3提供的方法检测样本中的人参皂苷含量，通过气相色谱-质谱的检测，分析得到检测结果。
对检测方法进行验证
选择性：取6份来自不同个体的空白血浆各200μL，按空白血浆样品制备方法进行操作处理。进样8μL到色谱-质谱系统分析。
取6份来自不同个体的空白血浆配制6份含人参皂苷浓度为定量下限(5ng/mL)标准血浆样品，按标准血浆样品制备方法进行处理。进样8μL到色谱-质谱系统分析。
接受标准：在空白血浆样品中，待测物的保留时间窗内干扰组分的响应低于LLOQ样品中的响应的20％，内标的保留时间窗内干扰组分的响应低于LLOQ样品中的内标响应的5％；6份LLOQ浓度水平标准血浆样品色谱图中待测物与内标色谱峰的信噪比均不小于5；而且峰面积比值变异系数不得超过20％。
残留检测，取含人参皂苷浓度为STD1和STD9浓度水平的标准血浆样品各1份，按“标准血浆样品制备方法处理定量上限和定量下限样品各1份。
取空白血浆样品按空白血浆样品制备方法处理空白样品1份。
将上述处理的样品按定量上限、空白样品、定量下限的顺序进样，记录待测物与内标的色谱峰面积值，至少考察三批。
接受标准：空白样品内标保留时间窗内，内标峰面积不得超过符合接受标准的定量下限的内标的平均峰面积的5％；待测物保留时间窗内，待测物的峰面积不得超过符合接受标准的定量下限的平均峰面积的20％。
线性关系的验证，配制标准曲线血浆系列浓度样品，按标准血浆样品制备方法处理，另取2份空白血浆，分别按空白血浆样品、零浓度血浆样品的制备方法处理，用于评价空白血浆的干扰情况。进样8μL到色谱-质谱系统分析，记录待测物与内标的色谱峰面积值，并计算待测药物与内标的色谱峰面积比值。以人参皂苷与内标的色谱峰面积比值(Y)为纵坐标，以系列标准血浆样品浓度(X)为横坐标，进行线性回归，得到线性回归方程及相关系数。将系列标准血浆样品中待测物与内标的色谱峰面积比值，代入线性回归方程计算，标准曲线系列浓度样品测试得到的浓度值与标示浓度值比较。
接受标准：相关系数r≥0.99；标准标样回算的浓度应该在标示值的85％～115％范围内，定量下限应该在标示值的80％～120％范围内；至少包含75％的标曲浓度点，最少7个浓度点满足以上要求；如果某个标曲标样结果不符合这些标准，应拒绝该标样(不准剔除定量下限和定量上限浓度点)，并重新评价，包括回归分析。通过验证，得到如图1所示的结果。结果如图1所示，可以看出，通过本方法制备的试剂建立的标准曲线，线性关系良好；通过该标准曲线就能准确的计算人参皂苷的浓度。
检测精密度和准确度，配制浓度为LLOQ、L、M1、M2、H(5、15、300、800、3750ng/mL)的质控标准血浆样品各6份，按标准血浆样品制备方法处理。进样8μL到色谱-质谱系统分析。记录待测物与内标的色谱峰面积值，并计算待测物与内标的色谱峰面积比值。将待测物与内标的色谱峰面积比值代入前述线性关系中所得线性回归方程，计算各样品浓度，将其与样品标示值比较，并据此计算批内精密度和准确度。按照上述步骤连续分析3批浓度为LLOQ、L、M1、M2、H(5、15、300、800、3750ng/mL)的标准血浆样品，并代入相应线性回归方程计算各样品浓度测定值，据此计算3批样品在各个浓度水平上的批间准确度与精密度。
精密度和准确度的结果如表1所示。
表1精密度和准确度实验
可以看出，本发明提供的服务得的精确度和准确度，具有较好的利用价值。
计算人参皂苷和内标氯唑沙宗的回收率：取6份不同来源的空白血浆，按质控标准血浆样品制备方法配制浓度为L、M1、M2、H(15、300、800、3750ng/mL)的质控标准血浆样品各6份按以下方法处理：取200μL血浆样品，加入50μL内标工作液，加入100μL磷酸盐缓冲盐，加入2mL甲基叔丁基醚，振荡10min，离心(4300rpm，10min)，取上清1500μL，氮气挥干，加入复溶液500μL复溶，进样8μL到色谱/质谱系统分析。记录人参皂苷的峰面积(A1′)和氯唑沙宗的峰面积(A2′)。
取6份不同来源的空白血浆200μL，各取4份，加入100μL磷酸盐缓冲盐，加入2mL甲基叔丁基醚，振荡10min，离心(4300rpm，10min)，取上清1500μL，氮气挥干，得到6份不同来源的空白基质。取质控工作溶液(SQCL、SQCM1、SQCM2、SQCH)分别用6份不同来源的基质配制1份样品，配制方法如下：加质控工作液10μL、内标工作液50μL、复溶液440μL于挥干的基质中复溶。进样8μL到色谱/质谱系统分析。分别得到人参皂苷C-K的色谱峰面积(A1′)和氯唑沙宗的色谱峰面积(A2′)。
标准血浆样品中人参皂苷C-K的回收率为R1＝A1′/A1′×100％，氯唑沙宗的回收率为R2＝A2′/A2′×100％。
接受标准：相同基质中同一浓度样品峰面积的变异系数不得超过15％；各浓度水平标准血浆样品中待测物、内标回收率的总体变异系数不得超过20％。
样本的基质效应的验证，取6份不同来源的空白血浆200μL，各取4份，加入100μL磷酸盐缓冲盐，加入2mL甲基叔丁基醚，振荡10min，离心(4300rpm，10min)，取上清1500μL，氮气挥干，得到6份不同来源的空白基质。取质控工作溶液(SQCL、SQCM1、SQCM2、SQCH)分别用6份不同来源的基质配制1份样品，配制方法如下：加质控工作液10μL、内标工作液50μL、复溶液440μL于挥干的基质中复溶。进样8μL到色谱/质谱系统分析。分别得到人参皂苷的色谱峰面积(B1′)和氯唑沙宗的色谱峰面积(B2′)。分别考察空白血浆、空白溶血血浆、空白高脂血血浆基质效应。
取质控工作液(SQCL、SQCM1、SQCM2、SQCH)各10μL，分别加入50μL内标工作液，加入复溶液440μL混匀，进样8μL到色谱/质谱系统分析，各浓度平行6份。分别得到人参皂苷的色谱峰面积(B1)和氯唑沙宗的色谱峰面积(B2)。
计算待测物的基质因子B1′/B1，计算内标的基质因子B2′/B2。
空白血浆作为基质的经内标归一化的基质因子(B1′/B1)/(B2′/B2)。
接受标准：同一浓度的样品，经内标归一化的基质因子的变异系数不得超过15％。
接受标准：定量下限测得浓度的均值应该在标示值的80％～120％范围内，其它质控浓度标准血浆样品测得浓度的均值应该在标示值的85％～115％范围内；定量下限的批内、批间变异系数不得超过20％，其它质控浓度的批内、批间变异系数不得超过15％。
样品稳定性的验证
制备后样品的稳定性，取进样后的精密度考察合格的质控样品(低浓度和高浓度各6份)，作为处理液介质稳定性考察样品，处理后溶液在进样条件下存放24±5h后和新处理的标准曲线和质控系列样品一同进样到色谱-质谱系统分析。
接受标准：各浓度水平标准血浆样品测得值的均值应该在标示值的85％～115％范围内，变异系数不得超过15％。
制备后样品再进样的稳定性，取进样后的精密度考察合格的标准曲线样品、质控样品(低浓度和高浓度各6份)，作为处理液介质稳定性考察样品。处理后溶液在进样条件下存放24±5h后，将上述样品再进样。
接受标准：各浓度水平标准血浆样品测得值的均值应该在标示值的85％～115％范围内，变异系数不得超过15％。
生物样品前处理过程中的稳定性，按照质控标准血浆样品配制方法平行配制低、高浓度血浆样品各6份，室温放置约24±5h。考察血浆样品在室温条件下放置的稳定性；稳定性考察样品和新配标准曲线和质控系列样品按标准血浆样品制备方法进行处理。进样8μL到色谱/质谱系统分析。
接受标准：各浓度水平标准血浆样品测得值的均值应在标示值的85％～115％范围内，变异系数不得超过15％。
生物样品冻存稳定性，按照质控标准血浆样品配制方法平行配制低、高浓度血浆样品各12份，-70℃冻存。第一次冻存时间不小于24h，第二、三、四次冻存时间不小于12h，样品融化过程需维持室温环境。样品最后一次融化后将被处理进行分析。稳定性考察样品和新配标准曲线与质控系列样品按标准血浆样品配制方法进行处理。进样8μL到色谱/质谱系统分析。
接受标准：稳定性样品浓度均值的偏差应在标示值的±15％范围内，各浓度水平的浓度变异系数不得超过15％。
离心分离前待测物稳定性，用空白全血基质制备质控低、高浓度样品，在室温放置约0h、1h、2h后，4℃，3000rpm离心10min，得到血浆基质，按“11.2.3标准血浆样品”方法进行处理。进样8μL到色谱/质谱系统分析，记录待测物的色谱峰面积值。
接受标准：质控低、高浓度样品在放置0h离心和放置约1h、2h后离心进样得到的待测物与内标峰面积比值进行比对，峰面积比值的均值偏差不得超过20％，同一条件下相同浓度待测物/内标的比值变异系数不得超过15％。若在1h下不稳定，则考察冰浴条件下的稳定性。
稀释验证，取人参皂苷储备液配置浓度为200,000ng/mL的工作液，取工作液10μL，加入空白血浆190μL，得浓度为10000ng/mL的血浆样品，平行6份。取上述血浆样品，分别用空白血浆稀释10倍，得到浓度为1000ng/mL的血浆样品，稀释验证考察样品和新配标准曲线、质控系列样品按标准血浆样品配制方法处理。进样8μL到色谱/质谱系统分析。
接受标准：各浓度水平标准血浆样品测得值的均值应该在标示值的85％～115％范围内，变异系数不得超过15％。
溶液稳定性
待测物储备液短期稳定性，配制人参皂苷对照品储备液，分别于4℃(对照样品)和室温(稳定性样品)条件下保存，考察室温条件下24±5h稳定性。存放到期后将4℃和室温条件下保存的人参皂苷对照品储备液稀释到浓度为6000ng/mL的对照品溶液，分别按以下方法处理：取10μL待测物工作液(6000ng/mL)，加入50μL内标工作液，加入440μL复溶液，混匀，各平行处理6份。进样8μL到色谱-质谱系统分析，记录待测物与内标色谱峰面积的比值。
接受标准：稳定性样品和对照样品进行比对，待测物与内标色谱峰面积比值的均值的偏差不得超过10％；相同条件下待测物与内标峰面积比值的变异系数不得超过10％。
内标储备液短期稳定性，配制氯唑沙宗对照品储备液，于室温条件下保存，考察室温条件下24±5h稳定性。存放到期后将室温条件下保存的氯唑沙宗对照品储备液稀释到浓度为20ng/mL的内标工作液，按以下方法处理：取50μL内标工作液，加入10μL待测物工作液(SQCM1)，加入440μL复溶液，混匀，取平行处理6份。进样8μL到色谱-质谱系统分析，记录内标色谱峰面积。
接受标准：稳定性样品和对照样品进行比对，内标与待测物色谱峰面积比值的均值的偏差不得超过10％；相同条件下内标与待测物色谱峰面积比值的变异系数不得超过10％。
待测物长期稳定性，配制人参皂苷对照品储备液，于4℃条件下保存，考察4℃条件下15±5天、30±5天、60±5天稳定性。存放到期后与现配对照品储备液稀释到浓度为6000ng/mL的对照品溶液，分别按以下方法处理：取10μL待测物工作液(6000ng/mL)，加入50μL内标工作液，加入440μL复溶液，混匀。进样8μL到色谱-质谱系统分析，记录待测物与内标色谱峰面积的比值。
接受标准：稳定性样品和对照样品进行比对，待测物与内标色谱峰面积比值的均值的偏差不得超过10％；相同条件下待测物与内标峰面积比值的变异系数不得超过10％。
内标储备液长期稳定性，氯唑沙宗对照品储备液于4℃条件下保存，考察4℃条件下15±5天、30±5、60±5天稳定性。存放到期后稀释到浓度为20ng/mL的内标工作液，按以下方法处理：取50μL内标工作液，加入10μL待测物工作液(SQCM1)，加入440μL复溶液，平行处理6份。进样8μL到色谱-质谱系统分析，记录内标色谱峰面积。
接受标准：稳定性样品和对照样品进行比对，内标与待测物色谱峰面积比值的均值的偏差不得超过10％；相同条件下内标与待测物色谱峰面积比值的变异系数不得超过10％。
使用氯唑沙宗作为内标和使用地高辛作为内标，分别进行检测，检测结果如图2和图3所示。从图中可以看出，氯唑沙宗作为内标稳定性良好，而选用地高辛作为内标，响应不稳定，提取回收率不均一，效果明显不如氯唑沙宗好。
待测物工作液短期稳定性，配制人参皂苷SLLOQ、SULOQ工作液，分别于4℃和室温条件下保存，考察室温条件下24±5h稳定性。存放到期后，分别按以下方法处理：取10μL工作液(SLLOQ、SULOQ)，加入50μL内标工作液，加入440μL复溶液，混匀。进样8μL到色谱-质谱系统分析，记录待测物与内标色谱峰面积的比值。
接受标准：稳定性样品和对照样品进行比对，待测物与内标色谱峰面积的比值的均值的偏差不得超过10％；相同条件下待测物与内标峰面积比值的变异系数不得超过10％。
内标工作液短期稳定性，配制20ng/mL氯唑沙宗工作液，分别于4℃和室温条件下保存，考察室温条件下24±5h稳定性。存放到期后分别按以下方法处理：取50μL内标工作液，加入10μL待测物工作液(SQCM1)，加入440μL复溶液，混匀。进样8μL到色谱-质谱系统分析，记录内标色谱峰面积。
接受标准：稳定性样品和对照样品进行比对，内标与待测物色谱峰面积比值的均值的偏差不得超过10％；相同条件下内标与待测物色谱峰面积比值的变异系数不得超过10％。
待测物工作液长期稳定性，配制人参皂苷SLLOQ、SULOQ工作液，于4℃条件下保存，考察4℃条件下15±5天稳定性。存放到期后与现配工作液，分别按以下方法处理：取10μL工作液(SLLOQ、SULOQ)，加入50μL内标工作液，加入440μL复溶液，混匀。进样8μL到色谱-质谱系统分析，记录待测物与内标色谱峰面积的比值。
接受标准：稳定性样品和对照样品进行比对，待测物与内标色谱峰面积的比值的均值的偏差不得超过10％；相同条件下待测物与内标峰面积比值的变异系数不得超过10％。
内标工作液长期稳定性，配制20ng/mL氯唑沙宗工作液，于4℃条件下保存，考察4℃条件下15±5天的稳定性。存放到期后分别按以下方法处理：取50μL内标工作液，加入10μL待测物工作液(SQCM1)，加入440μL复溶液，混匀。进样8μL到色谱-质谱系统分析，记录内标色谱峰面积。
接受标准：稳定性样品和对照样品进行比对，内标与待测物色谱峰面积比值的均值的偏差不得超过10％；相同条件下内标与待测物色谱峰面积比值的变异系数不得超过10％。
溶液稳定性实验包括工作液和储备液的稳定性实验，人参皂苷C-K和内标氯唑沙宗的储备液、工作液均有良好的稳定性。人参皂苷C-K储备液和工作液制备溶剂均为甲醇，氯唑沙宗储备液和工作液制备溶剂均为50％甲醇。结果如表2和表3所示。
表2工作液稳定性实验结果
表3储备液稳定性实验结果
如表2所示，工作液：人参皂苷C-K工作液室温条件下至少26h稳定，4℃条件下至少9d稳定；氯唑沙宗工作液室温条件下至少30h稳定，4℃条件下至少18d稳定。
如表3所示，人参皂苷C-K储备液室温条件下至少28h稳定，4℃条件下至少28d稳定；氯唑沙宗储备液室温条件下至少28h稳定，4℃条件下至少28d稳定。
分析批长度考察，选取考察合格的标准曲线和质控样品，质控样品之间均匀插入样品，样品的数量至少超过160份。
接受标准：相关系数r≥0.99；标准标样回算的浓度应该在标示值的85％～115％范围内，定量下限应该在标示值的80％～120％范围内；至少包含75％的标曲浓度点，最少7个浓度点满足以上要求；如果某个标曲标样结果不符合这些标准，应拒绝该标样(不准剔除定量下限和定量上限浓度点)，并重新评价，包括回归分析。
至少67％质控样品测得值应该在标示值的85％～115％范围内，且每一浓度水平至少50％样品应符合这—标准。
综上所述，本发明实施例提供的人参皂苷的检测方法，能较好的实现对样本中的人参皂苷的坚持，通过对监测过程中的各个步骤以及试剂的稳定性的验证，可以为方法提供可靠保障。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.人参皂苷的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
配制人参皂苷的标准曲线工作液和内标工作液；
将所述标准曲线工作液进行液相色谱-质谱分析，建立并得到人参皂苷的标准曲线；
将待检样本与所述内标工作液混合后进行液相色谱-质谱分析，根据数据计算得到待检样本中人参皂苷的含量数据；
其中，液相色谱的条件为Waters ACQUITY UPLC CSH C18 1.7μm(2.1×100mm)，柱温40℃，流速0.4mL/min，进样量8μL，流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为10mM的乙酸铵溶液，所述流动相B为乙腈溶液；流动相的梯度为(体积百分数)：
0min，A：50％、B：50％；
0.5min，A：50％、B：50％；
2.5min，A：5％、B：95％；
3.0min，A：50％、B：50％；
0.5min，A：5％、B：95％；
4.0min，A：50％、B：50％。
2.根据权利要求1所述的人参皂苷的检测方法，其特征在于，所述质谱的条件为离子源为电喷离子源，所述离子源的温度为450℃，喷射电压4500v。
3.根据权利要求1所述的人参皂苷的检测方法，其特征在于，所述标准曲线工作液由标准曲线储备液稀释得到，所述标准曲线储备液的浓度为0.388mg/mL。
4.根据权利要求1所述的人参皂苷的检测方法，其特征在于，所述内标工作液为氯唑沙宗内标工作液，所述氯唑沙宗内标工作液的浓度为20ng/mL，所述氯唑沙宗内标工作液由内标储备液与甲醇溶液混合制得。
5.根据权利要求4所述的人参皂苷的检测方法，其特征在于，所述甲醇溶液的浓度为45％-55％。
6.根据权利要求1所述的人参皂苷的检测方法，其特征在于，还包括通过制备空白血浆样品、零浓度血浆样品和标准血浆样品对液相色谱-质谱系统进行测试。
7.根据权利要求6所述的人参皂苷的检测方法，其特征在于，所述空白血浆样品的制备包括取空白血浆加入磷酸盐缓冲液和甲基叔丁基醚振荡并离心，取上清并用氮气吹干后用复溶液复溶。
8.根据权利要求7所述的人参皂苷的检测方法，其特征在于，所述复溶液由乙酸铵水溶液与乙腈混合制备得到。
9.根据权利要求8所述的人参皂苷的检测方法，其特征在于，所述零浓度血浆样品由空白血浆加内标工作液、磷酸盐缓冲液和甲基叔丁基醚混合振荡、离心，取上清并氮气吹干后用复溶液复溶得到。
10.根据权利要求9所述的人参皂苷的检测方法，其特征在于，所述氮气的温度为40-50℃。
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