KR20110113228A - 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 효소를 이용한 컴파운드 케이의 제조에 있어서 유도인자의 첨가된 배지를 이용한 균주의 배양물로부터 수득된 효소액을 이용한 고효율의 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법으로, 상기 컴파운드 케이의 제조방법은 프로토파낙사다이올로부터 컴파운드 케이로의 전환 반응에서 반응속도를 빠르게 조절하여 단시간에 진세노사이드 컴파운드 케이가 고수율로 대량생산할 수 있는 장점이 있어, 산업적으로 유용하게 사용될 수 있는 장점이 있다.

Description

진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법{The manufacturing method for ginsenoside compound K}

본 발명은 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 효소를 이용한 컴파운드 케이의 제조에 있어서 유도인자의 첨가된 배지를 이용한 균주의 배양물로부터 수득된 효소액을 이용한 고효율의 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법에 관한 것이다.

인삼은 한국, 중국, 일본 등 국가에서 주로 면역계 증강, 항 피로, 당뇨병 치료, 고혈압 등에 효과를 보이는 성분으로 널리 사용되어왔다. 특히 인삼에 0.5~2.5% 포함되어 있는 사포닌은 인삼의 주된 약효를 나타내는 성분으로 알려져 있다. 인삼 사포닌을 경구 투여할 경우, 활성 성분은 인삼 사포닌 자체가 아니라 장내 대사산물이라는 것이 제시되었는데, 이는 인삼 사포닌을 경구 투여한 다음 혈액에서 검출되는 성분이 경구 투여된 사포닌이 아니라 장내 대사산물이기 때문이다. (H.Hasegawa, Main Ginseng saponin metabolites formed by intestinal bacteria, Planta Med., 62, 453-457 (1996)) 또한 생체막에 대한 친화성을 보더라도 인삼 사포닌보다 이의 대사산물이 더 높고, 대사산물은 종양세포에서 글루코스의 유입을 차단하는 작용을 하는 등 항암 효과까지 얻을 수 있는 장점이 있다.

이런 인삼 사포닌의 장내 대사산물 중 가장 항암효과가 큰 물질이 진세노사이드 컴파운드 케이(Ginsenoside Compound K, 20(S)-프로토파낙사이다이올-20-0-베타-디-글루코피라노사이드)이다.

컴파운드 케이(Compound K)의 알려진 활성으로는 암세포 증식 억제, 항암제의 활성 시너지 효과, 피부 보호 활성, 모발 발모 촉진, 알러지 및 아토피 억제, 항당뇨 작용, 알코올의 혈중 농도 저하, 생식 능력 증진, 항피로, 항스트레스 에 효과가 있다.

종래에 알려진 컴파운드 케이의 제조방법으로는 프로토파낙사다이올 계열 사포닌을 쥐에 경구투여 한 다음 대장에서 분해산물로 생성된 컴파운드 케이를 분리하는 방법이 있다(M. Karikura, Studies on absorption, distribution, excretion and metabolism of ginseng saponins, Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 38(10), 2859 (1990)). 그러나 이 방법은 수율이 매우 낮고, 매우 번거로운 단점이 있다.

또한, 미생물을 배양하여 조배지액을 만든 후, 포함된 효소를 이용하는 컴파운드 케이를 제조하는 방법이 있다(Battaglino, Appl. Microbiol. Biotechnol. 35, 292(1991)), 대한민국 특허 10-2009-0037140).

그러나 이러한 방법들은, 생성수율이 극히 낮을 뿐만 아니라 여러 가지 2차 대사산물이 생성되기 때문에 생산 수율이 낮고, 진세노사이드 컴파운드 케이를 고순도로 제조할 수 없는 단점이 있다.

이에, 본 발명자들은 상기의 문제점을 해결하기 위하여, 세균류가 가지는 성장의 한계특성상 효소를 이용한 반응에 비해 생산역가가 낮은 단점을 극복하기 위한 연구를 진행하던 중 균주의 배양시 유도인자를 이용하여 고효율의 놀라운 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 효소를 이용한 컴파운드 케이의 제조에 있어서, 유도인자의 첨가된 배지를 이용한 균주의 배양물로부터 수득된 효소액을 이용한 고효율의 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 유도인자가 첨가된 배지를 이용한 균주의 배양물로부터 수득된 효소액을 이용한 고효율의 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 컴파운드 케이의 제조방법은 아스퍼질러스 나이저(Aspergillus niger) 또는 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae) 균주의 배양물로부터 수득되는 효소액을 이용하는 것을 특징으로 한다.

보다 상세하게는 상기 아스퍼질러스 나이저 또는 아스퍼질러스 오리제 균주가 락토오스 및 5-아미노레블린 산이 혼합된 배지에서 배양되어 이로부터 수득되는 배양물의 효소액을 이용하는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 락토오스(lactose)는 갈락토오스(galactose)와 글루코스(glucose)로 이루어진 이당류로 주로 포유류의 어미 젖에서 생산되고 구조는 β-D-갈락토실-(1, 4)-D-글루코오스의 구조를 갖는다. 산업계에서 락토오스는 우유로부터 순수하게 정제되어 얻어질 수 있으며, 치즈 제조시 부산물로 나오는 액상물질에 다량의 락토오스가 함유되어 있어 이를 값싸게 이용할 수도 있다.

또한, 본 발명의 5-아미노레블린 산(5-Aminolevulinic acid, ALA)은 질병 예방용 항생제를 대체할 수 있는 천연 아미노산 화합물로 각광을 받고 있는 물질이다. 5-아미노레블린 산은 식물에서는 엽록체(chlorophyll)의 전구체(precursor)로서, 동물에서는 헴(heme)의 전구체로 작용하여 면역력을 높이는 역할을 한다. 미생물에 대해서는 일반적으로 높은 농도에서 항균 작용을 한다고 알려져 있으나 항균 작용에 이르기까지는 상당히 많은 양의 투입을 필요로 한다.

본 발명은 효소를 이용한 컴파운드 케이의 제조에 있어서, 상기 락토오스와 5-아미노레블린 산을 함유한 배지에서 배양된 균주의 배양물로부터 수득한 효소액을 이용하여 제조되는 고효율의 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법을 제공한다.

상기 락토오스와 5-아미노레블린 산은 컴파운드 케이의 컴파운드 케이로의 전환시 유도인자로 작용하여, 프로토파낙사다이올로부터 컴파운드 케이로의 전환 반응에서 반응속도를 빠르게 조절함으로써 고수율의 컴파운드 케이를 수득할 수 있음을 확인하였고, 컴파운드 케이의 제조방법에 근본적인 문제를 해결할 수 있었다.

본 발명은

1) 인삼 추출물로부터 프로토파낙사다이올을 수득하는 단계;

2) 락토오스 및 5-아미노레블린 산의 혼합배지에 아스퍼질러스 나이저(Aspergillus niger) 또는 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae) 균주를 배양하여 효소액을 수득하는 단계;

3) 상기 1) 단계의 프로토파낙사다이올에 상기 2) 단계의 효소액을 첨가하여 반응하는 단계;

4) 상기 반응물에 부탄올을 혼합하고, 컴파운드 케이가 용출된 상층부의 부탄올 층을 수득하는 단계; 및

5) 상기 부탄올 층으로부터 용매를 제거하는 단계;

를 포함하는 화학식 1로 표시되는 컴파운드 케이의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 인삼 추출물은 고려인삼, 삼칠인삼, 미국인삼, 죽절인삼, 히말라야인삼 또는 베트남인삼의 뿌리 또는 지상부로부터 추출 분리하여 수득되는 것을 이용한다.

보다 상세하게는 출발물질로 이용되는 프로토파낙사다이올은 고려인삼, 삼칠인삼, 미국인삼, 죽절인삼, 히말라야인삼 또는 베트남인삼의 뿌리 또는 지상부로부터 추출 분리하여 수득되는 추출물을 이용한다.

본 발명에 있어서, 효소액은 락토오스 및 5-아미노레블린 산이 혼합된 배지에서 배양된 아스퍼질러스 나이저 또는 아스퍼질러스 오리제 균주의 배양물을 이용하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 락토오스는 배지 총 중량에 대하여 0.01 내지 10 중량% 로 첨가되고, 상기 5-아미노레블린 산은 배지 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 ppm으로 첨가되는 것을 특징으로 한다.

보다 상세하게는 상기 효소액은 하기의 방법으로 제조된다.

본 발명의 효소액은 아스퍼질러스 나이저 또는 아스퍼질러스 오리제 균주의 배양물을 원심분리한 후, 수득된 상층액에 에탄올을 첨가하여 효소 침전물을 제조하고, 상기 효소 침전물로부터 순수한 효소액을 수득하여 제조된다.

상기 효소액은 아스퍼질러스 나이저 또는 아스퍼질러스 오리제 균주로부터 생산되는 배양물로부터 수득되는 것으로, 상기 배양물은 락토오스 및 5-아미노레블린 산이 혼합된 배지에서 배양된 아스퍼질러스 나이저 또는 아스퍼질러스 오리제 균주의 배양물을 이용한다.

상기 락토오스 및 5-아미노레블린 산은 프로토파낙사다이올로부터 컴파운드 케이로의 전환 반응에서 반응속도를 빠르게 조절하여 단시간에 진세노사이드 컴파운드 케이가 고수율로 생성되는 효과를 부여한다.

보다 상세하게는, 본 발명의 락토오스 및 5-아미노레블린 산은 컴파운드 케이의 전환을 위한 유도인자로서, 아스퍼질러스 나이저 또는 아스퍼질러스 오리제 균주의 활성을 증가시키고 생산되는 효소 활성도를 증가시킴으로써 컴파운드 케이로의 전환율을 상승시켜 주는 효과가 있으며, 컴파운드 케이의 생산에 따른 비용절감과 수득되는 컴파운드 케이의 고수율에 중요한 의미를 가진다.

본 발명에 있어서, 상기 효소액은 pH 3 내지 7의 범위인 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 pH가 4.5 내지 5.5의 범위인 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 컴파운드 케이는 프로토파낙사다이올 100 중량부에 대하여 효소액 1 내지 500 중량부를 첨가하여 제조되는 것을 특징으로 한다.

상기의 함량은 프로토파낙사다이올과 효소액의 반응시 안정한 활성의 전환 반응을 가능케 하여 전환 반응속도를 향상시킴으로써 단시간에 대량의 진세노사이드 컴파운드 케이를 제조할 수 있게 한다.

보다 상세하게는 본 발명의 컴파운드 케이는 프로토파낙사다이올 100 중량부에 대하여 효소액 1 내지 500 중량부 첨가하여 반응을 시킨 후, 상기 반응물에 부탄올을 혼합하고 상부의 부탄올 층과 하부의 물 층으로 나누어져 있는 용액에서, 당류와 효소가 있는 물층은 버리고, 진세노사이드의 컴파운드 케이가 용출되어 있는 부탄올 층을 수득하고, 상기 수득된 부탄올 층으로부터 황산마그네슘을 이용하여 수분을 제거한 다음 용매를 감압 제거하여 제조될 수 있다.

본 발명의 컴파운드 케이의 제조방법은 프로토파낙사다이올로부터 컴파운드 케이로의 전환 반응에서 반응속도를 빠르게 조절하여 단시간에 진세노사이드 컴파운드 케이가 고수율로 대량생산할 수 있는 장점이 있어, 산업적으로 유용하게 사용될 수 있는 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 제조방법에 따른 컴파운드 케이의 함량을 HPLC로 분석한 결과이다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에서 당업자에게는 명백한 것이다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

[ 제조예 1] 프로토파낙사다이올의 수득

20ℓ 반응기에 인삼 추출물 2 kg을 넣고 5% 수산화나트륨(NaOH)수용액 6ℓ를 넣어 녹인다. 여기에 에틸에테르 6ℓ를 넣어 잘 교반 후, 상층액을 제거하였다. 상기 남은 수용액 층에 부탄올 6ℓ를 이용하여 3회 반복 추출하여 인삼 사포닌 성분 중 프로토파낙아트리올(protopanaxatriol, PPT) 성분을 1차 제거하였다. 상기 프로토파낙아트리올이 제거된 수용액 층에 6N 염산 1.5ℓ를 온도가 급격하게 상승하지 않도록 서서히 투입한 후, n-부탄올 8ℓ를 이용하여 2회 반복 추출하였다.

상기 추출된 n-부탄올 층을 황산마그네슘을 이용하여 수분을 제거한 다음, 용매를 감압 제거하여 780 g의 인삼 사포닌인 프로토파낙사다이올 (protopanaxadiol, PPD)을 분리 정제하여 수득하였다.

[ 제조예 2]

밀기울 400 g, 락토오스 30 g, pH 5.0의 아세테이트 완충용액 370 g을 잘 혼합한 고체 혼합물을 120℃에서 20분 멸균하고 상온 냉각하였다. 5-아미노레블린 산( 5-aminolevulinic acid, ALA) 0.5 g을 멸균된 pH 5.0 아세테이트 완충용액 100 g에 녹인 다음, 상기 고체 혼합물과 잘 혼합하여 배지를 제조하였다.

누룩으로부터 분리 정제한 아스퍼질러스 나이저(Aspergillus niger) 균주를 상기 제조된 배지에 접종한 다음, 균일하게 섞어주고 25℃, 60% 습도에서 5일간 배양하였다. 상기 배양액에 pH 5.0 아세테이트 완충용액 1ℓ를 투입하고 1시간 후, 거즈로 고형분을 1차 걸러준 다음, 6,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 수득하였다.

상기 수득된 상층액에 에탄올 2ℓ를 투입하여 흰색의 효소 침전물을 형성시킨 후, 이를 다시 6,000 rpm, 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 상기 상층액이 제거된 효소 침전물에 pH 5.0 아세테이트 완충용액 500 ㎖를 첨가하여 표소 침전물을 녹여 순수한 효소액을 제조하였다.

[ 제조예 3]

상기 제조예 2와 동일한 방법으로 효소액을 제조하되, 배지를 밀기울 400 g과 pH 5.0의 아세테이트 완충용액 370 g을 잘 혼합한 고체 혼합물을 120℃에서 20분 멸균하고 상온 냉각한 후, 5-아미노레블린 산(5-aminolevulinic acid, ALA) 0.5 g을 멸균된 pH 5.0 아세테이트 완충용액 100 g에 녹인 다음, 상기 고체 혼합물과 잘 혼합한 배지를 사용하였다.

[ 제조예 4]

상기 제조예 2와 동일한 방법으로 효소액을 제조하되, 배지를 두피(콩껍질) 400 g과 pH 5.0의 아세테이트 완충용액 370 g을 잘 혼합한 고체 혼합물을 120℃에서 20분 멸균하고 상온 냉각한 후, 5-아미노레블린 산(5-aminolevulinic acid, ALA) 0.5 g을 멸균된 pH 5.0 아세테이트 완충용액 100 g에 녹인 다음, 상기 고체 혼합물과 잘 혼합한 배지를 사용하였다.

[ 제조예 5]

상기 제조예 2와 동일한 방법으로 효소액을 제조하되, 배지를 인삼 사포닌 400 g과 pH 5.0의 아세테이트 완충용액 370 g을 잘 혼합한 고체 혼합물을 120℃에서 20분 멸균하고 상온 냉각한 후, 5-아미노레블린 산(5-aminolevulinic acid, ALA) 0.5 g을 멸균된 pH 5.0 아세테이트 완충용액 100 g에 녹인 다음, 상기 고체 혼합물과 잘 혼합한 배지를 사용하였다.

[ 실시예 1] 컴파운드 케이의 제조

상기 제조예 1에서 수득된 프로토파낙사다이올 파우더 20 g을 pH 5.0 아세테이트 완충용액 500 ㎖에 녹인 후, 상기 제조예 2에서 제조한 효소액 500 ㎖와 섞고, 35℃에서 교반하여 24시간 반응시켰다.

상기 반응물에 300 ㎖의 부탄올을 투여하여 교반하여 방치한 후, 컴파운드 케이가 용출된 상층부의 부탄올 층을 수득하였다.

상기 수득된 컴파운드 케이가 용출된 상층부의 부탄올 층을 황산마그네슘을 이용하여 수분을 제거한 다음, 용매를 감압 제거 후, 노란색의 컴파운드 케이를 수득하였다.

[ 비교예 1]

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하되, 효소액을 제조예 3에서 제조한 효소액을 이용하여 컴파운드 케이를 제조하였다.

[ 비교예 2]

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하되, 효소액을 제조예 4에서 제조한 효소액을 이용하여 컴파운드 케이를 제조하였다.

[ 비교예 3]

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하되, 효소액을 제조예 5에서 제조한 효소액을 이용하여 컴파운드 케이를 제조하였다.

[ 시험예 1]

(1) 컴파운드 케이에 대한 HPLC 분석

상기 실시예 1 및 비교예 1 내지 3에서 제조된 컴파운드 케이를 메탄올에 용해한 다음, 광산란검출기(Evaporative Light Scattering Detector, ELSD; Alltech사)가 부착된 고성능액체크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC; Waters사 Empower system)로 정량 분석을 실시하였다. 컬럼은 ZORBAX Edipse XDB-C18 (4.6 x 250 mm, 5 micron), 컬럼의 오븐 온도는 30℃, 샘플의 로딩양은 10 ㎕로 하였다. 이동상으로는 100% 물과 100% 아세트니트릴로 농도구배하여 얻었다. 유속은 분당 1.0 ㎖로 하였으며, 검출기는 203nm UV를 사용하였다.

진세노사이드 Rb1(ginsenoside-Rb1), 진세노사이드 Rb2(ginsenoside-Rb2), 진세노사이드 Rc(ginsenoside-Rc), 진세노사이드 Rd(ginsenoside-Rd), 진세노사이드 화합물 K(ginsenoside compound-K) 및 프로토파낙사다이올(20(S)-protopanaxadiol) 표준물질을 (주)인삼공사에서 구입하여 정량에 이용하였다.

그 결과 도 1에서도 확인할 수 있듯이, 본 발명의 제조방법은 비교예의 컴파운드 케이의 제조방법에 비해 고효율의 컴파운드 케이를 생산할 수 있음을 확인할 수 있었다.

(2) 컴파운드 케이로의 전환율 조사

상기 실시예 1 및 비교예 1 내지 3의 제조방법에 따른 컴파운드 케이로의 전환율을 조사하였다.

전환율은 하기 식 1과 같이 계산하였다. 전구체 진세노사이드들이 컴파운드 케이로 변화함에 따라 결합한 당의 숫자가 줄어드는 점을 감안하여 몰수로 환산하여 전환율을 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

그 결과, 상기 표 1의 결과에서도 확인할 수 있듯이, 본 발명의 제조방법은 비교예의 컴파운드 케이의 제조방법에 비해 컴파운드 케이의 전환율(%)이 우수한 것을 확인하였다.

Claims (4)

1) 인삼 추출물로부터 프로토파낙사다이올을 수득하는 단계;
2) 락토오스 및 5-아미노레블린 산의 혼합배지에 아스퍼질러스 나이저(Aspergillus niger) 또는 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae) 균주를 배양하여 효소액을 수득하는 단계;
3) 상기 1) 단계의 프로토파낙사다이올에 상기 2) 단계의 효소액을 첨가하여 반응하는 단계;
4) 상기 반응물에 부탄올을 혼합하고, 컴파운드 케이가 용출된 상층부의 부탄올 층을 수득하는 단계; 및
5) 상기 부탄올 층으로부터 용매를 제거하는 단계;
를 포함하는 화학식 1로 표시되는 컴파운드 케이의 제조방법.

제 1항에 있어서,
상기 락토오스는 배지 총 중량에 대하여 0.01 내지 10 중량% 로 첨가되는 것을 특징으로 하는 컴파운드 케이의 제조방법.

제 1항에 있어서,
상기 5-아미노레블린 산은 배지 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 ppm으로 첨가되는 것을 특징으로 하는 컴파운드 케이의 제조방법.

제 1항에 있어서,
상기 컴파운드 케이는 프로토파낙사다이올 100 중량부에 대하여 효소액 1 내지 500 중량부 첨가시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 컴파운드 케이의 제조방법.

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