CN113109471A - 一种快速同时检测蔬菜水果中百菌清及其代谢物的lcmsms方法 - Google Patents

一种快速同时检测蔬菜水果中百菌清及其代谢物的lcmsms方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种快速同时检测蔬菜水果中百菌清及其代谢物的LCMSMS方法，包括：步骤（1）试样的称取；步骤（2）试样的提取；步骤（3）标准曲线的配制；步骤（4）测定和结果计算。通过本发明的技术方案，克服了百菌清标准品容易降解的问题；建立了采用硫酸酸化——乙腈提取或者磷酸酸化——乙腈提取的分散固相萃取前处理方法，以及大气压化学离子化液相色谱‑三重四极杆串联质谱检测方法，可以同时检测蔬菜水果中百菌清和代谢物4‑羟基百菌清。回收率和相对标准偏差均符合GB 27404的相关规定，方法的回收率和精密度均满足痕量分析的要求，该方法简单快速，适合蔬菜水果中百菌清和4‑羟基百菌清的快速同时分析。

Description

一种快速同时检测蔬菜水果中百菌清及其代谢物的LCMSMS 方法
技术领域
本发明涉及农残检测技术领域，具体而言，特别涉及一种快速同时检测蔬菜水果中百菌清及其代谢物的LCMSMS方法。
背景技术
百菌清( chlorothalonil) ，化学名2，4，5，6－四氯－1，3－二氰基苯，是美国Diamond Shamrock Chem.Co.于1963 年开发的一种广谱高效保护性杀菌剂，是目前国内外在农业生产上使用最为广泛的一种杀菌剂。百菌清主要代谢物是4-羟基百菌清（chlorothalonil-4-hydroxy），又称SDS-3701，化学名：4-羟基-2,5,6-三氯-1,3-苯二腈，与百菌清母体相比，代谢物4-羟基百菌清的毒性更强。近年来，百菌清对环境和水生生物的危害日益受到关注。
2020年5月，欧盟正式禁用百菌清。FAO/WHO规定，在对植物源性食品进行膳食摄入量评估时，百菌清的残留物定义为：百菌清，SDS-3701，分别评估。2020年10月15日，我国农业农村厅发布了《农药登记残留试验待测残留物和植物源性食品膳食风险评估残留物目录（2020版）》，百菌清农药登记残留试验待测残留物为百菌清和SDS-3701，植物源性食品膳食风险评估残留物定义为百菌清，SDS-3701，分别评估。
百菌清为非极性农药，通常采用气相色谱法和气相色谱质谱法进行检测，而4-羟基百菌清分子结构中具有羟基极性基团，通常采用液相色谱-电喷雾串联质谱法进行检测，母体和代谢物分别检测，工作量大，效率低；因此，建立同时检测百菌清母体和代谢物的检测方法非常必要。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种可快速同时检测蔬菜水果中百菌清及其代谢物的LCMSMS方法。
本发明是通过如下技术方案实现的：一种快速同时检测蔬菜水果中百菌清及其代谢物的LCMSMS方法，具体步骤如下：
步骤（1）试样的称取：称取样品，置于离心管中，加入酸度调节剂和10 mL乙腈；
步骤（2）试样的提取：将步骤（1）中装有样品的离心管置振荡器上剧烈振荡，依次加入1 g氯化钠和4 g无水硫酸镁，立即摇散，再置振荡器上剧烈振荡后离心，得到基质溶液，通过尼龙滤膜过滤至进样小瓶中等待进样分析；
步骤（3）标准曲线的配制：准确称取百菌清标准物质，用乙酸乙酯溶解并且定容，配成百菌清标准储备液；准确称取4-羟基百菌清标准物质，用甲醇溶解并且定容，配成4-羟基百菌清标准储备液；移取百菌清标准储备液和4-羟基百菌清标准储备液，用乙腈或者含1%硫酸的乙腈溶液或者含1%磷酸的乙腈溶液配制成混合标准溶液；用步骤（2）的基质溶液对稀释混合标准溶液定容，得到5 µg/L-200µg/L的一系列校准溶液，至进样小瓶中等待进样分析；
步骤（4）测定和结果计算：将步骤（3）系列校准溶液分别进行LC-MS/MS测定，以分析物的峰面积为纵坐标y，质量浓度为横坐标x，绘制基质匹配标准曲线；在相同条件下将步骤（2）中的待测液分别进行LC-MS/MS测定，测得样品液中百菌清和4-羟基百菌清的色谱峰面积，代入标准工作曲线，得到样品液中百菌清和4-羟基百菌清含量，根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中百菌清和4-羟基百菌清含量。
作为优选方案，步骤（1）试样的称取中称取10 g试样，置50 mL聚苯乙烯具塞离心管中，加入酸度调节剂和10 mL乙腈。
进一步地，步骤（1）试样的称取中的酸度调节剂为10%硫酸或10%磷酸中的一种，加入的体积为0mL-1.0mL。
进一步地，步骤（1）试样的称取中的酸度调节剂为10%硫酸或10%磷酸，加入的体积为1.0mL。
作为优选方案，步骤（1）试样的称取中样品为结球甘蓝、黄瓜、苹果、葡萄中的一种。
作为优选方案，步骤（2）试样的提取将步骤（1）中装有样品的离心管置振荡器上1000次/分剧烈振荡1分钟，依次加入1 g氯化钠和4 g无水硫酸镁，立即摇散，再置振荡器上1000次/分剧烈振荡1分钟后3500 r/min转速下离心5 min，得到基质溶液，通过尼龙滤膜过滤至进样小瓶中等待进样分析。
作为优选方案，步骤（3）标准曲线的配制的具体步骤如下：
步骤（31）百菌清标准储备溶液：准确称取25 mg百菌清标准物质，用乙酸乙酯溶解并且定容至25 mL，配成质量浓度1000 mg/L的标准储备液，于-18℃避光存储；
步骤（32）4-羟基百菌清标准储备溶液：准确称取10 mg 4-羟基百菌清标准物质，用甲醇溶解并且定容至10 mL，配成质量浓度1000 mg/L的标准储备液，于-18℃避光存储；
步骤（33）混合标准溶液：移取适量单标储备溶液，用乙腈或者含1%硫酸的乙腈溶液或者含1%磷酸的乙腈溶液配制成质量浓度为5 mg/L的混合标准溶液，于4 ℃避光保存，有效期三周；
步骤（34）系列校准溶液：用步骤（2）的基质溶液对稀释混合标准溶液定容，得到5µg/L、10µg/L、20µg/L、50µg/L、100µg/L、200µg/L的一系列校准溶液，至进样小瓶中等待进样分析，该溶液现用现配。
作为优选方案，步骤（4）中液相色谱-三重四极杆质谱联用仪的色谱条件如下：配有大气压化学离子源（APCI）；色谱柱：Phenomenex Kinetex C18 色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；柱温：40℃；流速：0.7 mL/min；进样体积：1µL；流动相： A：乙腈，B：5 mmol/L甲酸铵水溶液；梯度洗脱程序：0～0.5 min，10%A；0.5～6.3 min，10%A～95%A；6.3～8.2 min，95%A；8.2～8.7 min，95%A～10%A；8.7～10.0 min，10%A。
进一步地，步骤（4）中液相色谱-三重四极杆质谱联用仪的质谱条件如下：APCI源负离子模式；多反应监测模式（MRM）；电晕针电流：-3 µA；蒸发温度550℃；百菌清的母离子为244.9m/z，子离子为181.9m/z，174.9m/z，209.9m/z，146.9m/z，其中181.9m/z为定量离子；4-羟基百菌清的母离子为244.9 m/z，子离子为181.9 m/z，174.9 m/z，209.9 m/z，146.9 m/z，其中181.9 m/z为定量离子。
本发明由于采用了以上技术方案，与现有技术相比使其具有以下有益效果：
本发明采用含1%硫酸的乙腈或者含1%磷酸的乙腈溶液配制百菌清及4-羟基百菌清混合标准溶液，建立了百菌清及4-羟基百菌清混合标准溶液的制备方法，克服了百菌清标准品容易降解的问题；建立了采用硫酸酸化——乙腈提取或者磷酸酸化——乙腈提取的分散固相萃取前处理方法，以及大气压化学离子化液相色谱-三重四极杆串联质谱检测方法，可以同时检测蔬菜水果中百菌清和代谢物4-羟基百菌清。百菌清的平均回收率为83.28%~104.23%，相对标准偏差（RSD）为0.97%~11.58%，4-羟基百菌清的平均回收率为81.56%~104.15%，相对标准偏差（RSD）为0.73%~8.60%，回收率和相对标准偏差均符合GB27404的相关规定，方法的回收率和精密度均满足痕量分析的要求，该方法简单快速，适合蔬菜水果中百菌清和4-羟基百菌清的快速同时分析。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述部分中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为百菌清和4-羟基百菌清的分子结构式；
图2为百菌清的二级质谱图；
图3为4-羟基百菌清的二级质谱图；
图4为结球甘蓝空白基质MRM色谱图；
图5为结球甘蓝空白基质加标10 µg/kg水平MRM色谱图；
图6为黄瓜空白基质MRM色谱图；
图7为黄瓜空白基质加标10 µg/kg水平MRM色谱图；
图8为苹果空白基质MRM色谱图；
图9为苹果空白基质加标10 µg/kg水平MRM色谱图；
图10为葡萄空白基质MRM色谱图；
图11为葡萄空白基质加标10 µg/kg水平MRM色谱图；
图12为5 mg/L百菌清标准品（乙腈配制）冷藏存放36小时的色谱图；
图13为酸度调节剂对目标分析物回收率的影响结果；
图14为APCI蒸发温度为300℃时百菌清和4-羟基百菌清的MRM色谱图(200 µg/L)；
图15为APCI蒸发温度为550℃时百菌清和4-羟基百菌清的MRM色谱图(200 µg/L)；
图16为APCI离子源中百菌清可能发生的化学反应。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。
实施例中使用的仪器：
AB Sciex 6500 QTRAP型液相色谱—三重四极杆串联质谱仪（美国应用生物系统公司）、电子天平、旋涡混合器、振荡器、离心机、50 mL聚苯乙烯离心管、尼龙针头过滤器。
标准物质：百菌清、4-羟基百菌清标准品（德国Dr. Ehrenstorfer公司）
试剂：乙腈、甲醇、甲酸、乙酸、浓硫酸、磷酸、乙酸钠、无水硫酸镁、氯化钠、超纯水。
实施例1
一种快速同时检测蔬菜水果中百菌清及其代谢物的LCMSMS方法，具体步骤如下：
步骤（1）试样的称取：称取10g 结球甘蓝样品，置50 mL聚苯乙烯离心管中，加入酸度调节剂和10 mL乙腈，酸度调节剂为1.0mL 的10%硫酸；
步骤（2）试样的提取：将步骤（1）中装有样品的离心管置振荡器上1000次/分剧烈振荡1分钟，依次加入1 g氯化钠和4 g无水硫酸镁，立即摇散，再置振荡器上1000次/分剧烈振荡1分钟后3500 r/min转速下离心5 min，得到基质溶液，通过尼龙滤膜过滤至进样小瓶中等待进样分析；
步骤（3）标准曲线的配制：具体步骤如下；
步骤（31）百菌清标准储备溶液：准确称取25 mg百菌清标准物质，用乙酸乙酯溶解并且定容至25 mL，配成质量浓度1000 mg/L的标准储备液，于-18℃避光存储；
步骤（32）4-羟基百菌清标准储备溶液：准确称取10 mg 4-羟基百菌清标准物质，用甲醇溶解并且定容至10 mL，配成质量浓度1000 mg/L的标准储备液，于-18℃避光存储；
步骤（33）混合标准溶液：移取适量单标储备溶液，用含1%硫酸的乙腈溶液或者含1%磷酸的乙腈溶液配制成质量浓度为5 mg/L的混合标准溶液，于4 ℃避光保存，有效期三周；
步骤（34）系列校准溶液：用步骤（2）的基质溶液对稀释混合标准溶液定容，得到5µg/L、10µg/L、20µg/L、50µg/L、100µg/L、200µg/L的一系列校准溶液，至进样小瓶中等待进样分析，该溶液现用现配。
步骤（4）测定和结果计算：将步骤（3）系列校准溶液分别进行LC-MS/MS测定，以分析物的峰面积为纵坐标y，质量浓度为横坐标x，绘制基质匹配标准曲线；在相同条件下将步骤（2）中的待测液分别进行LC-MS/MS测定，测得样品液中百菌清和4-羟基百菌清的色谱峰面积，代入标准工作曲线，得到样品液中百菌清和4-羟基百菌清含量，根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中百菌清和4-羟基百菌清含量。液相色谱-三重四极杆质谱联用仪的色谱条件如下：配有大气压化学离子源（APCI）；色谱柱：Phenomenex Kinetex C18 色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；柱温：40℃；流速：0.7 ml/min；进样体积：1uL；流动相： A：乙腈，B：5 mmol/L甲酸铵水溶液；梯度洗脱程序：0～0.5 min，10%A；0.5～6.3 min，10%A～95%A；6.3～8.2 min，95%A；8.2～8.7 min，95%A～10%A；8.7～10.0 min，10%A；
质谱条件如下：APCI源负离子模式；多反应监测模式（MRM）；电晕针电流：-3 µA；蒸发温度550℃；百菌清的母离子为244.9m/z，子离子为181.9m/z，174.9m/z，209.9m/z，146.9m/z，其中181.9m/z为定量离子；4-羟基百菌清的母离子为244.9 m/z，子离子为181.9m/z，174.9 m/z，209.9 m/z，146.9 m/z，其中181.9 m/z为定量离子。其他质谱参数见表1。
表1百菌清和4-羟基百菌清的质谱参数
Figure DEST_PATH_IMAGE002
*定量离子
实施例2
除步骤（1）中称取样品为黄瓜以外，其他步骤与实施例1相同。
实施例3
除步骤（1）中称取样品为苹果以外，其他步骤与实施例1相同。
实施例4
除步骤（1）中称取样品为葡萄以外，其他步骤与实施例1相同。
实施例5
除步骤（1）中酸度调节剂为0.1mL 的10%硫酸以外，其他步骤与实施例1相同。
实施例6
除步骤（1）中酸度调节剂为0.5mL 的10%硫酸以外，其他步骤与实施例1相同。
实施例7
除步骤（1）中酸度调节剂为0.1mL 的10%磷酸以外，其他步骤与实施例1相同。
实施例8
除步骤（1）中酸度调节剂为0.5mL 的10%磷酸以外，其他步骤与实施例1相同。
实施例9
除步骤（1）中酸度调节剂为1.0mL 的10%磷酸以外，其他步骤与实施例1相同。
实施例10
除步骤（1）中酸度调节剂为乙酸（0.1 mL）/乙酸钠（1.5 g）缓冲盐以外，其他步骤与实施例1相同。
实施例11
除步骤（1）中不添加酸度调节剂以外，其他步骤与实施例1相同。
实施例12
步骤（31）百菌清标准储备溶液：准确称取25 mg百菌清标准物质，用乙酸乙酯溶解并且定容至25 mL，配成质量浓度1000 mg/L的标准储备液，于-18℃避光存储；
步骤（32）4-羟基百菌清标准储备溶液：准确称取10 mg 4-羟基百菌清标准物质，用甲醇溶解并且定容至10 mL，配成质量浓度1000 mg/L的标准储备液，于-18℃避光存储；
步骤（33）混合标准溶液：移取适量单标储备溶液，用含1%硫酸的乙腈溶液或者含1%磷酸的乙腈溶液配制成质量浓度为5 mg/L的混合标准溶液，于4 ℃避光保存，有效期三周。
线性范围及定量限
以阴性结球甘蓝为基质样品，按照实施例1实验方法进行样品提取，得到基质溶液，用该基质溶液配制成5、10、20、50、100、200 µg/L的系列标准溶液，上机分析，外标法定量。以分析物的峰面积为纵坐标（y），质量浓度为横坐标（x），绘制基质匹配标准曲线，权重选择1/x。以大于等于10倍信噪比（S/N）估算仪器定量限，其线性方程、线性范围、相关系数和方法定量限见表2。
表2 百菌清及其代谢物的线性方程、线性范围、相关系数和定量限
Figure DEST_PATH_IMAGE004
准确度与精密度
根据实施例1-4，分别在结球甘蓝、黄瓜、葡萄、苹果四种基质中中添加0.01 mg/kg、0.05 mg/kg、0.2 mg/kg水平的标准溶液，每个添加浓度平行测定6次，进行加标回收率实验。结球甘蓝、黄瓜、葡萄、苹果四种基质中加标水平0.01 mg/kg的MRM色谱图分别见图4~图11。百菌清的平均回收率为83.28%~104.23%，相对标准偏差（RSD）为0.97%~11.58%，4-羟基百菌清的平均回收率为81.56%~104.15%，相对标准偏差（RSD）为0.73%~8.60%，方法的回收率和精密度均满足痕量分析的要求。
表3百菌清及其代谢物在4种基质中的加标回收率和相对标准偏差
（n=6，酸度调节剂为1mL 10%硫酸）
Figure DEST_PATH_IMAGE006
表4百菌清及其代谢物在4种基质中的加标回收率和相对标准偏差
（n=6，酸度调节剂为1mL 10%磷酸）
Figure DEST_PATH_IMAGE008
建立了百菌清和4-羟基百菌清混合标准溶液（5mg/L）的制备方法
百菌清稳定性较差，采用实施例12中乙腈配制时很容易降解。实验发现，用乙腈配制的5 mg/L百菌清，在0±4℃冰箱中存放36小时的降解率为23.4%，其中有14.8%的百菌清转化为4-羟基百菌清。图12为用乙腈配制的百菌清工作标准品溶液（5 mg/L）在0±4℃冰箱中存放36小时的色谱图。当采用乙酸乙酯配制百菌清工作标准品溶液时，百菌清表现出同样较快的降解速率，说明在百菌清标准品在5 mg/L浓度水平不稳定的现象具有普遍性，由于本发明采用乙腈作为提取溶液，故未对乙酸乙酯配制的百菌清工作标准溶液的降解率数据进行研究。
分别在第1、8、15、22天用含1%硫酸的乙腈溶液或者含1%磷酸的乙腈溶液配制浓度为5 mg/L的混合标准溶液，比较4个时间配制的混合标准溶液，第1天配制的标准品相对于第22天配制的标准品，百菌清和4-羟基百菌清的损失均小于10%，因此5 mg/L的混合标准溶液在0±4℃条件下可以保存三周。
现有方法技术均未发现和解决百菌清标准品的稳定性问题，本发明利用APCI-MS/MS检测方法可以同时检测百菌清和4-羟基百菌清两个化合物的优势，获得百菌清标准品采用乙腈溶液配制时存放36小时后的降解率数据，以及向4-羟基百菌清的转化率数据。为提高标准品的稳定性，本发明通过使用含1%硫酸的乙腈溶液或者含1%磷酸的乙腈溶液配制标准品，通过稳定性实验得到百菌清和4-羟基百菌清标准品的稳定性数据，使本检测方法更具实用价值。
建立了同时提取蔬菜水果中百菌清和4-羟基百菌清的分散固相萃取前处理方法
分散固相萃取方法是近年发展起来的农药多残留检测样品前处理技术，具有操作简便，分析速度快，溶剂使用量少等诸多优点，但现有技术在应用于百菌清时，回收率偏低，特别是结球甘蓝等芸薹属类蔬菜，甚至无添加回收，本发明对分散固相萃取方法进行了改进，以提高样品前处理过程百菌清的稳定性和回收率。本研究采用体积分数同为10%的稀硫酸或者体积分数同为10%的稀磷酸作为分散固相萃取方法的酸度调节剂。实验选择结球甘蓝作为样品基质，考察比较了在分散固相萃取方法中分别加入0.1 mL 10%硫酸、0.5 mL10%硫酸、1.0 mL 10%硫酸、0.1 mL 10%磷酸、0.5 mL 10%磷酸、1.0 mL 10%磷酸、乙酸（0.1mL）/乙酸钠（1.5 g）缓冲盐和不添加酸度调节剂时，即实施例5-实施例11，百菌清和4-羟基百菌清的回收率情况，考察的浓度水平为0.2 mg/kg，每种条件下重复三次实验（n=3）。
实验结果如图13所示。对于百菌清，不添加酸度调节剂时，平均回收率只有10%左右；添加乙酸/乙酸钠缓冲盐，平均回收率有所改善，但重复性较差，同时证明采用乙酸/乙酸钠缓冲盐的分散固相萃取方法不适合百菌清的分析；采用硫酸溶液作为酸度调节剂，添加量为0.1 mL时，百菌清回收的重复性依然较差，当添加量大于0.5 mL时，百菌清的平均回收率提升到95%以上，其中添加量为1.0 mL时百菌清的重复性优于添加量为0.5 mL时的重复性；采用磷酸溶液作为酸度调节剂，添加量为0.1 mL时，百菌清的平均回收率为78%，当添加量大于0.5 mL时，百菌清的平均回收率提升到95%以上。对于4-羟基百菌清，不论使用何种酸度调节剂甚至不添加酸度调节剂，回收率都在88%~100%之间，说明酸度调节剂对4-羟基百菌清的回收率影响不大。实验说明，硫酸和磷酸都可作为分散固相萃取方法检测百菌清和4-羟基百菌清时的酸度调节剂，本发明分别选择1.0 mL体积分数为10%的硫酸和磷酸作为方法学验证实验的酸度调节剂。
建立了分析百菌清和4-羟基百菌清的液相色谱法，优化了色谱柱、流动相及梯度等仪器参数。
本方法比较了BEH-C18（100 mm×2.1 mm，1.7 µm）、HSS T3-C18（100 mm×2.1 mm，1.8 µm）、Kinetex-C18（100 mm×2.1 mm，2.6 µm）色谱柱的分离情况。结果显示，3种色谱柱均能有效保留和分离百菌清和4-羟基百菌清。相对于BEH-C18和HSS T3-C18色谱柱，在相同的流速下，使用Kinetex-C18色谱柱时系统压力更低。因此，最终本研究采用Kinetex-C18（100 mm×2.1 mm，2.6 µm）色谱柱。
考察了甲醇-水、乙腈-水作为流动相时百菌清和4-羟基百菌清的色谱行为和响应灵敏度，两个流动相体系的水相中均添加了5.0 mmol/L浓度水平的甲酸铵。结果显示，无论采用甲醇-水体系还是乙腈-水体系，两个目标分析物在色谱柱上均能获得良好的保留和分离效果；两个目标分析物在乙腈-水体系中的响应高于在甲醇-水体系中的响应，其中4-羟基百菌清在乙腈-水体系中的响应为甲醇-水体系中响应的2倍以上。由于采用乙腈-水体系仪器系统压力更低，最终本研究选择乙腈-5.0 mmol/L甲酸铵水溶液作为流动相。
建立了百菌清和4-羟基百菌清的APCI-MS/MS质谱方法，优化了锥孔电压，碰撞电压等参数。
确定了大气压化学电离源下百菌清和和4-羟基百菌清的产物离子（母离子），均百菌清为m/z=244.9；扫描得到百菌清和4-羟基百菌清的二级质谱图，这种化合物二级质谱图均得到m/z 146.9，174.9、181.9和209.9四个较强的碎片离子。对去簇电压和碰撞能量进行优化，优化后的质谱参数见表1。在优化后的质谱条件下进行多反应监测模式检测，无论是百菌清还是4-羟基百菌清，均是离子m/z 181.9的响应最高，因此选择m/z 181.9作为定量离子，剩余三个响应较弱的离子m/z 174.9，m/z 209.9，m/z 146.9作为定性离子，百菌清和4-羟基百菌清共用定量和定性离子通道。
优化了APCI离子源蒸发温度参数
实验优化了蒸发温度。通过比较蒸发温度在200℃~550℃范围目标分析物的响应发现，当蒸发温度低于350℃时，4-羟基百菌清有拖尾现象，这种现象在乙腈-水体系中尤其明显；当温度升至400 ℃以上时拖尾现象逐渐消失，如图14和图15为APCI蒸发温度为300℃和550℃时百菌清和4-羟基百菌清的MRM色谱图，说明这种拖尾现象不是发生在色谱柱上的色谱行为，可能因为含有极性基团的4-羟基百菌清在较低的蒸发温度下气化效率较低，有少量尚未气化的4-羟基百菌清分子在离子源腔体内滞留所致。乙腈沸点（81-82 ℃）比甲醇沸点（65.4 ℃）高，使拖尾现象更加明显。因此，将蒸发温度设置为550℃。
研究了在APCI源下百菌清可能发生的化学反应
如图16所述，根据百菌清在APCI源下母离子的质量及母离子同位素相对丰度，可以粗略推测，百菌清在APCI脱去一个氯原子，加上了一个氧原子。尽管百菌清和4-羟基在ACPI源下具有相同的母离子和子离子，不过百菌清是否完全生成了4-羟基百菌清仍然存疑。由于百菌清和4-羟基百菌清的二级质谱信号稳定性较差，实验比较了MRM监测模式下百菌清和4-羟基百菌清两个化合物定性离子的离子比率。将浓度为200 µg/L百菌清和4-羟基百菌清混合标准品溶液重复运行20次，以定量离子m/z 181.9的响应为100%，三个定性离子m/z174.9，m/z209.9，m/z146.9的响应分别与其进行比较，得到百菌清三个定性离子的平均离子比率（标准偏差）分别为82.4%（3.4%）、60.2%（3.4%）和54.9%（2.9%），4-羟基百菌清三个定性离子的平均离子比率（标准偏差）分别为76.5%（2.6%）、57.5%（2.1%）和55.9%（2.4%）。对于离子m/z174.9和m/z209.9，百菌清的平均离子比率分别比4-羟基百菌清的平均离子比率高5.9%和2.7%，说明百菌清与4-羟基百菌清定性离子的离子比率不一致，结合苯环上亲核取代反应的原理，从而可以推测，百菌清分子在2号位和4号位同时发生了亲核取代反应（其中4号位上发生的取代反应生成了4-羟基百菌清）。
在本说明书的描述中，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“具体实施例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或实例。而且，描述的具体特征、结构、材料或特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种快速同时检测蔬菜水果中百菌清及其代谢物的LCMSMS方法，其特征在于,具体步骤如下：
步骤（1）试样的称取：称取样品，置于离心管中，加入酸度调节剂和10 mL乙腈；
步骤（2）试样的提取：将步骤（1）中装有样品的离心管置振荡器上剧烈振荡，依次加入1g氯化钠和4 g无水硫酸镁，立即摇散，再置振荡器上剧烈振荡后离心，得到基质溶液，通过尼龙滤膜过滤至进样小瓶中等待进样分析；
步骤（3）标准曲线的配制：准确称取百菌清标准物质，用乙酸乙酯溶解并且定容，配成百菌清标准储备液；准确称取4-羟基百菌清标准物质，用甲醇溶解并且定容，配成4-羟基百菌清标准储备液；移取百菌清标准储备液和4-羟基百菌清标准储备液，用乙腈、含1%硫酸的乙腈溶液或者含1%磷酸的乙腈溶液配制成混合标准溶液；用步骤（2）的基质溶液对稀释混合标准溶液定容，得到5 µg/L-200µg/L的一系列校准溶液，至进样小瓶中等待进样分析；
步骤（4）测定和结果计算：将步骤（3）系列校准溶液分别进行LC-MS/MS测定，以分析物的峰面积为纵坐标y，质量浓度为横坐标x，绘制基质匹配标准曲线；在相同条件下将步骤（2）中的待测液分别进行LC-MS/MS测定，测得样品液中百菌清和4-羟基百菌清的色谱峰面积，代入标准工作曲线，得到样品液中百菌清和4-羟基百菌清含量，根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中百菌清和4-羟基百菌清含量。
2.根据权利要求1所述的一种快速同时检测蔬菜水果中百菌清及其代谢物的LCMSMS方法，其特征在于，所述步骤（1）试样的称取中称取10 g试样，置50 mL聚苯乙烯具塞离心管中，加入酸度调节剂和10 mL乙腈。
3.根据权利要求2所述的一种快速同时检测蔬菜水果中百菌清及其代谢物的LCMSMS方法，其特征在于，所述步骤（1）试样的称取中的酸度调节剂为10%硫酸或10%磷酸中的一种，加入的体积为0mL-1.0mL。
4.根据权利要求3所述的一种快速同时检测蔬菜水果中百菌清及其代谢物的LCMSMS方法，其特征在于，所述步骤（1）试样的称取中的酸度调节剂为10%硫酸或10%磷酸，加入的体积为1.0mL。
5.根据权利要求1所述的一种快速同时检测蔬菜水果中百菌清及其代谢物的LCMSMS方法，其特征在于，所述步骤（1）试样的称取中样品为结球甘蓝、黄瓜、苹果、葡萄中的一种。
6.根据权利要求1所述的一种快速同时检测蔬菜水果中百菌清及其代谢物的LCMSMS方法，其特征在于，所述步骤（2）试样的提取将步骤（1）中装有样品的离心管置振荡器上1000次/分剧烈振荡1分钟，依次加入1 g氯化钠和4 g无水硫酸镁，立即摇散，再置振荡器上1000次/分剧烈振荡1分钟后3500 r/min转速下离心5 min，得到基质溶液，通过尼龙滤膜过滤至进样小瓶中等待进样分析。
7.根据权利要求1所述的一种快速同时检测蔬菜水果中百菌清及其代谢物的LCMSMS方法，其特征在于，所述步骤（3）标准曲线的配制的具体步骤如下：
步骤（31）百菌清标准储备溶液：准确称取25 mg百菌清标准物质，用乙酸乙酯溶解并且定容至25 mL，配成质量浓度1000 mg/L的标准储备液，于-18℃避光存储；
步骤（32）4-羟基百菌清标准储备溶液：准确称取10 mg 4-羟基百菌清标准物质，用甲醇溶解并且定容至10 mL，配成质量浓度1000 mg/L的标准储备液，于-18℃避光存储；
步骤（33）混合标准溶液：移取适量单标储备溶液，用乙腈或者含1%硫酸的乙腈溶液或者含1%磷酸的乙腈溶液配制成质量浓度为5 mg/L的混合标准溶液，于4 ℃避光保存，有效期三周；
步骤（34）系列校准溶液：用步骤（2）的基质溶液对稀释混合标准溶液定容，得到5 µg/L、10µg/L、20µg/L、50µg/L、100µg/L、200µg/L的一系列校准溶液，至进样小瓶中等待进样分析，该溶液现用现配。
8.根据权利要求7所述的一种快速同时检测蔬菜水果中百菌清及其代谢物的LCMSMS方法，其特征在于，所述步骤（33）移取适量单标储备溶液，用含1%硫酸的乙腈溶液或者含1%磷酸的乙腈溶液配制成质量浓度为5 mg/L的混合标准溶液，于4 ℃避光保存，有效期三周。
9.根据权利要求7所述的一种快速同时检测蔬菜水果中百菌清及其代谢物的LCMSMS方法，其特征在于，所述步骤（4）中液相色谱-三重四极杆质谱联用仪的色谱条件如下：配有大气压化学离子源（APCI）；色谱柱：Phenomenex Kinetex C18 色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.6μm）；柱温：40℃；流速：0.7 ml/min；进样体积：1uL；流动相： A：乙腈，B：5 mmol/L甲酸铵水溶液；梯度洗脱程序：0～0.5 min，10%A；0.5～6.3 min，10%A～95%A；6.3～8.2 min，95%A；8.2～8.7 min，95%A～10%A；8.7～10.0 min，10%A。
10.根据权利要求9所述的一种快速同时检测蔬菜水果中百菌清及其代谢物的LCMSMS方法，其特征在于，所述步骤（4）中液相色谱-三重四极杆质谱联用仪的质谱条件如下：APCI源负离子模式；多反应监测模式（MRM）；电晕针电流：-3 µA；蒸发温度550℃；百菌清的母离子为244.9m/z，子离子为181.9m/z，174.9m/z，209.9m/z，146.9m/z，其中181.9m/z为定量离子；4-羟基百菌清的母离子为244.9 m/z，子离子为181.9 m/z，174.9 m/z，209.9 m/z，146.9 m/z，其中181.9 m/z为定量离子。
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