CN109045107A

CN109045107A - 一种治疗类风湿关节炎的药物及制备方法

Info

Publication number: CN109045107A
Application number: CN201811043922.5A
Authority: CN
Inventors: 向阳; 武璐璐; 袁林; 吴昊; 万星; 夏燕; 李厚聪; 朱健; 李丽丽
Original assignee: Hubei University for Nationalities
Current assignee: Hubei University for Nationalities
Priority date: 2018-09-07
Filing date: 2018-09-07
Publication date: 2018-12-21
Anticipated expiration: 2038-09-07
Also published as: CN109045107B

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，公开了一种治疗类风湿关节炎的药物及制备方法，所述治疗类风湿关节炎的药物为枫杨总黄酮；取湖北枫杨干燥茎皮10kg，粉碎，10倍体积70％乙醇加热回流提取3次，每次2h，过滤，合并滤液；减压浓缩后加至D‑101大孔树脂柱上端静置吸附1h，6倍柱体积纯水洗脱，5倍柱体积70％乙醇洗脱，回收70％乙醇洗脱液，减压浓缩后真空冷冻干燥，得湖北枫杨总黄酮粗提物。枫杨提取物中含有丰富的黄酮类化合物。黄酮类化合物广泛存在于自然界诸多蔬菜、水果和药用植物中，是我国中药中重要的有效成分之一，具有生理活性广泛，毒副作用低的特点。

Description

一种治疗类风湿关节炎的药物及制备方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种治疗类风湿关节炎的药物及制备方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：类风湿关节炎(rheumatoidarthritis，RA)是临床常见的以滑膜组织的过度增生、血管翳形成和骨侵蚀为病理特点的自身免疫性慢性炎性疾病。据研究报道，RA全球患病率为0.5％～1％，其中发展中国家为0.35％，而我国RA的患病率为0.42％。RA导致患者关节活动明显受限甚至致躯体残疾、工作能力丧失、生活质量下降、期望寿命降低，并给患者本人、家庭和社会均造成巨大的经济负担。据调查，未经正规治疗的患者，两年致残率为50％，三年致残率为70％，中国RA患者每年人均药费高达8018±17238元，国外RA患者每年人均药费高达5720～5822美元。因此RA的防治已成为当今医学面临的最严峻的课题之一。虽然RA的病因病机尚不明确，但关节滑膜是其公认的治疗靶器官。滑膜细胞的过度增生活化是RA发病的重要基础，成纤维滑膜细胞(fibroblast-likesynoviocytes，FLS)凋亡不足是其关键因素。正常情况下，FLS增殖与凋亡处于动态平衡中，当RA机体内微环境改变时FLS出现凋亡缺陷，开始异常增殖，并大量释放多种细胞因子，造成滑膜组织异常增生和炎性细胞浸润，形成血管翳并侵蚀软骨及骨骼，最终导致关节破坏和畸形。因此，如何有效地促进滑膜细胞凋亡、减少滑膜组织增生，成为治疗RA的关键。Fas膜受体凋亡通路和线粒体凋亡通路是RA中FLS凋亡的主要信号转导途径。在各种细胞凋亡信号的刺激下，Fas一方面可募集死亡结构域FADD，形成凋亡复合物后和Caspase-8酶原或Caspase-10酶原结合，使其活化，激活下游的Caspase-3、Caspase-7，最终导致细胞的凋亡；或者激活JNK通路，使Daxx从核内移至胞浆，与FADD结合，介导凋亡。另一方面可作用于细胞膜鞘磷脂使其降解为神经酰胺，介导线粒体的改变，使Cyt-c释放，与Apaf-1等结合形成凋亡体，在dATP或者ATP存在的条件下，与Caspase-9前体结合，使Caspase-9酶原活化。活化的Caspase-9可以激活下游的“效应执行子”，如Caspase-3、6、7等，从而启动细胞凋亡。Bcl-2家族是作用于线粒体的另一类细胞凋亡的关键调节分子，线粒体是其调控内在凋亡途径的重要靶点。Bcl-2家族包括抗凋亡成员(Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Al/Bfl-1等)和促凋亡成员(Bax、Bad、Bak、Bid、Bim/Bod等)。Bcl-2家族中促凋亡和抑凋亡蛋白的比率可协调线粒体内、外膜的渗透性，当促凋亡和抑凋亡蛋白的比率升高时可使线粒体外膜通透性增加，引起Cyt-C等膜间隙蛋白释放，激活下游Caspases级联反应，诱导FLS凋亡。炎性反应介质的持续作用在RA的发生、发展中亦发挥着重要的作用，与TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17a的关系尤为密切。这些炎症因子一方面可增加趋化因子的合成、分泌，影响黏附分子的表达，促进前列腺素、金属蛋白酶的合成和释放，促进滑膜细胞和淋巴细胞的增殖，加重炎性反应，对血管、细胞和组织造成破坏，在软骨破坏和骨侵蚀中起着重要作用；另一方面可调节多种炎症因子的表达，协同促进炎症因子增加，促进RA的进展。在RA患者关节滑膜和关节炎动物模型中，NF-κB p65均处于高度活化状态，活化的NF-κB p65可诱导大量炎性细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6产生，而TNF-α、IL-1β、IL-6的上调又可正反馈调节NF-κB p65的活化，这种恶性循环形成持久、放大的炎性反应，加重RA的病情。HIF-1α可以诱导包括VEGF在内的许多促血管生成因子的表达。VEGF被认为是血管新生过程中的核心因子，可直接促进RA中的血管新生，打破血管新生平衡，新生血管不仅可以提供氧和营养物质，还运输包括炎症因子在内的许多分子物质，干扰关节滑膜细胞正常代谢，参与RA滑膜血管翳的形成和骨侵蚀。

目前西医对RA的治疗以非甾体抗炎药、糖皮质激素、改变病情抗风湿药和生物制剂为主，其治疗目的均在于控制病情，延缓或阻止骨骼破坏，改善关节功能和预后。因为非甾体抗炎药、糖皮质激素、改变病情抗风湿药的用药个体差异性大，药物副作用明显，因此病人的耐受性和依从性比较差。阿司匹林、布洛芬、双氯芬酸等非甾体抗炎药易造成消化道损伤、骨髓抑制、肝功能损伤等。强的松、泼尼松等糖皮质激素药停药困难，易引起向心性肥胖、满月脸、高血压、糖尿病及骨质疏松等不良反应。改变病情抗风湿药主要有甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶、来氟米特、羟氯喹、青霉胺、硫唑嘌呤、环孢素等，主要不良反应有胃肠道反应、肝肾损伤和骨髓抑制，此外来氟米特还有皮肤和血液毒性，羟氯喹有视网膜毒性，硫唑嘌呤长期服用可致癌等。现有生物制剂主要有:①肿瘤坏死因子抑制剂:依那西普，英夫利昔单抗、阿达木；②IL-6抑制剂:托珠单抗；③IL-1受体拮抗剂阿那白滞素；④B细胞清除剂:利妥昔单抗；⑤T细胞抑制剂:阿巴西普；以及新型生物制剂。生物制剂有特异性较高、治疗靶点明确的优势，可有效提高RA治疗的达标率，降低RA患者疾病活动度，但其在临床的推广使用亦面临诸多问题。生物制剂的价格昂贵，生物制剂的费用约占RA患者所有直接费用的80％。我国RA患者接受3～6个月TNF抑制剂治疗的费用分别是：类克69300元，益赛普9158.6元；国外接受TNF抑制剂治疗1年的费用为16000～20000美元。免疫原性是生物制剂特有的安全性问题，生物制剂几乎都存在诱导抗体反应的潜能。生物制剂的免疫原性可影响药物的疗效和安全性。在疗效方面由于外源序列或抗原表位的存在引起的免疫反应可导致药物疗效的降低或丧失，在安全性方面则变现为破坏患者自身抗原免疫耐受，从而造成多种不良反应。生物制剂的不良反应主要有注射部位反应(红肿、瘙痒、出血、疼痛等)，感染(上呼吸道感染、溃疡性结肠炎、结核感染等)，过敏反应(阵发性瘙痒、荨麻疹、休克等)和肿瘤，还会导致脏器功能损害、神经系统病变、急性血管内溶血、血清病及皮肤损害等。包括序列变异、生产和加工有关的纯度、辅料和产品稳定性、活性物质的性质、糖基化再加工、来自生产过程或下游处理过程的污染物和杂质、剂型、给药途径、剂量、疗程长短、分析技术、患者人群特征等在内的诸多因素都可影响生物制剂的免疫原性。生物制剂的生产、储存、运输有着极其严格的要求。任何运输和储存条件的细微变化均可影响生物制剂的安全性和有效性，如在储存、运输中湿度、温度、氧气、光照、微生物等条件不适当均可能引起生物制剂的失活，最终影响生物制剂的临床特性，导致严重的后果。这又增加了生物制剂的成本。此外部分生物制剂如依那希普、益赛普的半衰期较短，药效持续时间短，需要注射的周期短，增加了患者使用生物制剂的不便性和经济负担。因此目前我国RA患者应用生物制剂的比例不高，使用过生物制剂的患者患者仅占我国全部RA患者的10％，在基层、特别是经济落后的地区更是难以推广使用。中医药作为我国传统医学的瑰宝，在治疗本病上历史悠久，经验丰富，有着自己独特的优势，是目前治疗本病的常用手段之一。当今世界新药已从化合物合成转向天然药物开发，雷公藤多苷即是抗风湿中草药的代表性研究成果，其虽可抗炎、镇痛、抑制免疫、增强肾上腺皮质功能，改善微循环，但不良反应较多，主要有肾毒性：少尿、水肿、血尿、蛋白尿，严重者可致肾功能不全甚至急性肾功能衰竭等；生殖系统毒性：精子活力下降或少精、无精，女性月经紊乱、闭经、性欲减退等；消化系统毒性：可使胃肠黏膜溃疡、出血及轻度坏死等；造血系统损害：重度贫血、发热、皮肤疲斑等；神经系统毒性：使神经细胞变性而引起中枢神经系统损伤，导致头晕、乏力、失眠、嗜睡、听力减退、复视、周围神经炎等；皮肤黏膜毒性：皮肤溃疡、糜烂、荨麻疹、结节性红斑以及皮肤变应性血管炎等。因此探索开发疗效显著、价格低廉且不良反应少的中草药不失为我国现今抗风湿中草药研究的重点。我国幅员辽阔、资源丰富，不同地区、不同民族在与风湿病作斗争的过程中，在中草药应用上，积累了丰富的经验。仅恩施土家族抗风湿药物记载就有300余种，具有较好的研究、开发与应用前景，湖北枫杨(Pterocarya hupehensis Skan)即是恩施民间常用的一种土家族抗风湿中草药。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)目前西医对RA的治疗以非甾体抗炎药、糖皮质激素、改变病情抗风湿药和生物制剂的用药个体差异性大，药物副作用明显，因此病人的耐受性和依从性比较差。

(2)生物制剂价格昂贵、免疫原性强、半衰期短等原因，应用比例不高，难以在基层、特别是经济落后的地区推广使用。

解决上述技术问题的难度和意义：解决上述问题的困难重重，优化药物疗效、减少药物不良反应面临的技术难度较大，研究开发的局限性引起药物大规模使用后产生安全问题，生物制剂生产、储存、运输条件未达标造成药物变性失活，临床使用不规范引起制剂有效性和安全性问题，免疫原性引起机体免疫系统疾病等，皆亟待解决。而解决上述问题又需庞大资金支持，继而增加药物成本，加剧患者经济负担。所以可将探索开发疗效显著、价格低廉且不良反应少的中草药作为我国抗风湿中草药研究的重点。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种治疗类风湿关节炎的药物及制备方法。

本发明是这样实现的，一种治疗类风湿关节炎的药物，所述治疗类风湿关节炎的药物为枫杨总黄酮。

本发明的药物的本质是湖北枫杨的一种提取物，主要成分为总黄酮，10kg原药可提取约303.62总黄酮，芦丁法测得其中黄酮的含量约为72.84％。

本发明的另一目的在于提供一种所述治疗类风湿关节炎的药物的制备方法，所述治疗类风湿关节炎的药物的制备方法包括以下步骤：

步骤一，取湖北枫杨干燥茎皮10k g，粉碎，10倍体积70％乙醇加热回流提取3次，每次2h，过滤，合并滤液；

步骤二，减压浓缩后加至D-101大孔树脂柱上端静置吸附1h，6倍柱体积纯水洗脱，5倍柱体积70％乙醇洗脱，回收70％乙醇洗脱液，减压浓缩后真空冷冻干燥，得湖北枫杨总黄酮粗提物。

本发明的另一目的在于提供一种验证所述治疗类风湿关节炎的药物的CIA模型，所述CIA模型为从48只适龄雄性SD大鼠中随机取出8只作为阴性对照组NC，其余大鼠用于建立CIA模型；将完全弗氏佐剂与用冰醋酸溶解后4℃过夜的牛Ⅱ型胶原按1:1比例在冰浴条件充分乳化，配制成混合乳剂；分别在大鼠右后足趾、尾部、背部多点皮内注射混合乳剂0.3mL/只，阴性对照组在相同部位注射等体积的生理盐水；7d后重复上述步骤；

二次免疫3d-7d后免疫组大鼠足趾肿胀度和关节炎指数明显增加，膝关节滑膜增厚同时伴大量炎症细胞浸润，CIA模型构建成功；

将造模成功的40只大鼠随机分为模型组CIA，雷公藤多苷组TG，湖北枫杨总黄酮低、中、高剂量组；

在二次免疫第7d后给与雷公藤多苷组灌服6.25mg/kg.d雷公藤多苷，湖北枫杨总黄酮低、中、高剂量组分别灌服湖北枫杨总黄酮62.5mg/kg.d、125mg/kg.d、250mg/kg.d灌服，对照组、模型组灌服等体积的生理盐水，皆连续灌胃28d。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明具体为诱导类风湿关节炎模型滑膜细胞凋亡、抑制其炎症反应和血管新生的作用；提供的湖北枫杨总黄酮可通过激活Fas受体途径和线粒体途径促使滑膜细胞凋亡，并可抑制相关炎症因子和血管生成因子产生一定的抗炎和抗血管新生作用。同时其对类风湿关节炎模型肝、肾损伤有一定的改善作用。

附图说明

图1是本发明实施例提供的治疗类风湿关节炎的药物的制备方法流程图。

图2是本发明实施例提供的各组大鼠足跖肿胀率变化情况示意图；

图中：模型组与阴性对照组比较#P＜0.05；各用药组与模型组比较*P＜0.05；枫杨总黄酮低、中、高剂量组与雷公藤多苷组比较△P＜0.05。

图3是本发明实施例提供的各组大鼠关节炎指数变化情况示意图；

图4是本发明实施例提供的各组大鼠膝关节滑膜HE染色情况示意图；

图中：A为阴性对照组(×20)；B为模型组(×20)；C为雷公藤多苷组(×20)；D为枫杨总黄酮低剂量组(×20)；E为枫杨总黄酮中剂量组(×20)；F为枫杨总黄酮高剂量组(×20)。

图5是本发明实施例提供的各组大鼠膝关节滑膜Tunel染色情况示意图。

图中：A为阴性对照组(×20)；B为模型组(×20)；C为雷公藤多苷组(×20)；D为枫杨总黄酮低剂量组(×20)；E为枫杨总黄酮中剂量组(×20)；F为枫杨总黄酮高剂量组(×20)。模型组与阴性对照组比较#P＜0.05；各用药组与模型组比较*P＜0.05；枫杨总黄酮低、中、高剂量组与雷公藤多苷组比较△P＜0.05。

图6是本发明实施例提供的各组大鼠血清相关炎症因子的变化示意图；

图7是本发明实施例提供的各组大鼠血清相关血管因子的变化示意图；

图8是本发明实施例提供的各组大鼠滑膜相关蛋白的表达示意图；

图9是本发明实施例提供的各组大鼠肝、肾生化指标的变化示意图；

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

湖北枫杨为我国所特有，产于我国湖北西部至四川西部、陕西南部至贵州北部。恩施地处北纬30度武陵山地区，雨量充沛，植物茂密，素有“华中药库”之美誉，湖北枫杨广泛生长于土壤肥沃的水边、湖滩等地，药源充足，便于采集。枫杨作为传统中草药，又名柜柳、枫柳、桦柳、鬼柳，麻柳等。《中华本草》记载枫杨性辛、苦、温，归肝、大肠经，有小毒，可祛风除湿、消肿止痛、解热杀虫。《恩施中草药手册》记载枫杨可解毒消肿，将枫杨树皮或鲜叶捣碎外敷，对风湿肿痛、跌打损伤、癣疥疔疮有较好的治疗效果。在恩施民间很多土家医用枫杨治疗类风湿关节炎均取得了很好的临床治疗效果。枫杨提取物中含有丰富的黄酮类化合物。黄酮类化合物广泛存在于自然界诸多蔬菜、水果和药用植物中，是我国中药中重要的有效成分之一，具有生理活性广泛，毒副作用低的特点。结构模式的多样性使黄酮类化合物被认为是一个丰富的潜在抗癌化合物来源。

大量研究表明，黄酮类化合物对癌细胞具有阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡、破坏有丝分裂纺锤体的形成和抑制血管生成的能力，使其可能成为新的抗癌药物。近年来，黄酮类化合物及其合成类似物已在卵巢、乳腺、宫颈癌、胰腺、前列腺癌治疗等方面进行了许多有益的探索，研究表明从枫杨中分离出的黄酮类化合物也有不同程度的抗肿瘤作用，RA中FLS具有肿瘤细胞样的异常增殖和侵蚀特性。

但是有关黄酮类化合物对类风湿关节炎的疗效研究报道却相对较少。本发明发现枫杨总黄酮可有效诱导人类风湿关节炎成纤维滑膜细胞MH7A凋亡，抑制其增殖，降低MH7A细胞内Caspase-3、Caspase-9、Caspase-7、Caspase-6的mRNA和Caspase-8、Caspase-10、Bcl-2的蛋白表达，增加Fas、Cyt-C、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Bax的蛋白表达。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

本发明实施例提供的治疗类风湿关节炎的药物为枫杨总黄酮。

如图1所示，本发明实施例提供的治疗类风湿关节炎的药物的制备方法包括以下步骤：

S101：取湖北枫杨干燥茎皮10k g，粉碎，10倍体积70％乙醇加热回流提取3次，每次2h，过滤，合并滤液；

S102：减压浓缩后加至D-101大孔树脂柱上端静置吸附1h，6倍柱体积纯水洗脱，5倍柱体积70％乙醇洗脱，回收70％乙醇洗脱液，减压浓缩后真空冷冻干燥，得湖北枫杨总黄酮粗提物。

下面结合实验对本发明的应用效果做详细的描述。

1实验材料

1.1实验动物

SPF级雄性SD大鼠48只，体重(200±20)g，购自三峡大学实验动物中心，许可证号：SCXK(鄂)2011-0012，适应性喂养一周后开始实验。实验方案通过恩施州医学实验动物伦理委员会批准。

1.2主要药品及试剂

湖北湖北枫杨由湖北民族学院中草药标本中心集中采购，经专家袁林教授鉴定为胡桃科Juglandaceae湖北枫杨属Pterocarya Kunth湖北湖北枫杨P.hupehensis Skan的干燥茎皮；雷公藤多苷片(浙江得恩德制药有限公司，国药准字Z3302042)；胎牛血清、胰蛋白酶(美国Gibco公司)；DMEM高糖培养基(美国HyClone公司)；CCK-8试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)；Annexin V/FITC细胞凋亡试剂盒(美国BD公司)；实时荧光定量PCR相关试剂盒(日本TaKaRa公司)；扩增引物(上海生物工程股份有限公司)；牛Ⅱ型胶原(美国Chondrex公司)；弗氏完全佐剂(美国Sigma公司)；Tunel试剂盒(瑞士Roche公司)；TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17a、HIF-α、VEGF试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司)；Cyt-C、casase-3、Bcl-2、Bax、Phospho-NF-κB p65抗体(美国CST公司)；Fas、casase-8、casase-10、caspase-9、HIF-α、VEGF抗体(美国Abcam公司)；β-acting抗体、HRP羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司)；石蜡包埋及HE染色材料等由实验室自配。

2技术实施步骤

2.1枫杨总黄酮的制备

取湖北枫杨干燥茎皮10k g，粉碎，10倍体积70％乙醇加热回流提取3次，每次2h，过滤，合并滤液，减压浓缩后加至D-101大孔树脂柱上端静置吸附1h，6倍柱体积纯水洗脱，5倍柱体积70％乙醇洗脱，回收70％乙醇洗脱液，减压浓缩后真空冷冻干燥，得湖北枫杨总黄酮粗提物303.62g，用芦丁法测得其中黄酮的含量为72.84％。

2.2CIA模型的建立、分组及给药

从48只适龄雄性SD大鼠中随机取出8只作为阴性对照组(NC)，其余大鼠用于建立CIA模型。将完全弗氏佐剂与用冰醋酸溶解后4℃过夜的牛Ⅱ型胶原按1:1比例在冰浴条件充分乳化，配制成混合乳剂。分别在大鼠右后足趾、尾部、背部多点皮内注射混合乳剂0.3mL/只，阴性对照组在相同部位注射等体积的生理盐水。7d后重复上述步骤。二次免疫3d-7d后免疫组大鼠足趾肿胀度和关节炎指数明显增加，膝关节滑膜增厚同时伴大量炎症细胞浸润，即CIA模型构建成功。将造模成功的40只大鼠随机分为模型组(CIA)，雷公藤多苷组(TG)，湖北枫杨总黄酮低、中、高剂量组(PHSTF-L、PHSTF-M、PHSTF-H)。在二次免疫第7d后给与雷公藤多苷组灌服6.25mg/kg.d雷公藤多苷，湖北枫杨总黄酮低、中、高剂量组分别灌服湖北枫杨总黄酮62.5mg/kg.d、125mg/kg.d、250mg/kg.d灌服，对照组、模型组灌服等体积的生理盐水，皆连续灌胃28d。

2.3大鼠足跖肿胀度、关节炎指数的测定

第一次免疫前用足容积测量仪测量每只大鼠左后足的容积，从第二次免疫第7d天起，每隔7d测量1次各组大鼠左后足容积，观察计算大鼠的足跖肿胀度。计算公式为：足趾肿胀率＝[致炎后足容积－致炎前足容积/致炎前足容积]×100％。大鼠关节炎指数计算采取5级评分法：0分—关节无红肿；1分—趾关节红肿；2分—趾关节和足趾肿胀；3分—踝关节以下的足爪肿胀；4分——踝关节和所有足爪肿胀、关节严重变形。大鼠所有关节炎指数之和即为每只大鼠关节炎指数值，最高分值为16分。

2.4大鼠膝关节滑膜组织病理形态学观察

给药28d后，麻醉大鼠，腹主动脉取血，然后取大鼠左后足膝关节滑膜用4％的多聚甲醛溶液固定后脱钙，酒精逐级脱水，二甲苯透明，浸蜡包理，切片，进行HE染色，其中左后足膝关节滑膜同时按照Tunel凋亡检测试剂盒进行滑膜细胞凋亡检测。显微镜下观察、拍照计算滑膜细胞凋亡细胞数。取右膝关节滑膜置于－80℃冰箱备用。

2.5大鼠血清中相关肝肾生化指标、炎症因子、血管生成因子的测定

将取出的大鼠全血室温静置2h后3500r/min离心10min，取上层血清，分装。其中一部分血清即用全自动生化分析仪检测各组大鼠血清中ALT、AST、BUN、CREA、UA的含量；另一部分按照相应Elisa试剂盒检测各组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17a及HIF-α、VEGF的含量。

2.6大鼠膝关节滑膜中相关蛋白表达的检测

冰上提取各组大鼠右膝关节滑膜总蛋白，蛋白上样缓冲液变性后，进行SDS-PAGE电泳，转膜，5％脱脂牛奶封闭，洗膜，分别加相应一抗Fas、Cyt-C、casase-8、casase-10、casase-3、caspase-9、Bcl-2、Bax、Phospho-NF-κB p6，4℃孵育过夜，洗膜后，加入HRP标记的二抗，室温下在摇床上孵育2h。洗膜后，加入ECL发光剂，用凝胶成像系统拍照成像。用Quantity One软件分析条带灰度值，以内参β-actin作对照，计算各组目的蛋白的相对表达量。

3技术有益效果

3.1枫杨总黄酮对大鼠足跖肿胀度、关节炎指数的影响

如图2-图3所示，与阴性对照组比较，模型组大鼠足跖肿胀度、关节炎指数明显增加(P<0.05)，出现严重的红肿甚至变形，足掌的宽度、厚度均显著增加，提示造模成功；与模型组比较，治疗1周后雷公藤多苷组和湖北枫杨总黄酮低、中、高剂量组大鼠足跖肿胀度、关节炎指数下降并持续至用药4周后(P<0.05)；其中湖北枫杨总黄酮高剂量组下降较雷公藤多苷组明显(P<0.05)。

3.2枫杨总黄酮对大鼠膝关节滑膜病理形态的影响

大鼠膝关节滑膜HE染色和Tunel染色如图4-图5所示，阴性对照组膝关节滑膜无增生、突起，无炎细胞浸润；模型组滑膜细胞增生明显，滑膜衬细胞分层增多、增厚，血管增生增多，并伴有大量炎性细胞浸润；各治疗组滑膜细胞增生减轻，炎性细胞浸润明显减少，血管增生减少；其中湖北枫杨总黄酮高剂量组滑膜细胞轻度增生，血管增生和炎性细胞侵润显著减少。

经Tunel染色后凋亡细胞呈棕色(阳性细胞)，正常细胞呈蓝色。计数结果显示，模型组滑膜细胞有少量凋亡，凋亡指数与阴性对照组比较无显著差异；与模型组比较，各用药组阳性细胞数量皆增多，凋亡指数升高(P<0.05)；其中湖北枫杨总黄酮高剂量组滑膜细胞凋亡指数高于雷公藤多苷组(P<0.05)。

3.3枫杨总黄酮对大鼠膝关节滑膜相关蛋白的影响

如图6所示，模型组大鼠膝关节滑膜中p65磷酸化水平较阴性对照组明显增加(P<0.05)，用药后各治疗组滑膜内casase-8、casase-10、Bcl-2、p65磷酸化表达减少，Fas、Cyt-C、Cleaved casase-3、Cleaved caspase-9、Bax表达增加。其中湖北枫杨总黄酮高剂量组上述改变显著(P<0.05)，优于雷公藤多苷组。

3.4枫杨总黄酮对大鼠血清相关炎症因子的影响

如图7所示，与阴性对照组比较，模型组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17a含量明显增加(P<0.05)；给药后各治疗组血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17a含量较模型组下降(P<0.05)，其中湖北枫杨总黄酮高剂量组较雷公藤多苷组下降较为明显(P<0.05)。

3.5枫杨总黄酮对大鼠血清相关血管生成因子的影响

如图8所示，与阴性对照组比较，模型组大鼠血清中HIF-α、VEGF含量明显增加(P<0.05)；给药后各治疗组血清中HIF-α、VEGF含量较模型组下降(P<0.05)，其中湖北枫杨总黄酮高剂量组较雷公藤多苷组下降较为明显(P<0.05)。

3.6枫杨总黄酮对大鼠肝、肾生化指标的影响

如图9所示，与阴性对照组比较，模型组大鼠血清ALT、AST、UN、CREA、UA水平增加(P<0.05)；湖北枫杨总黄酮低、中、高剂量组较模型组下降(P<0.05)；雷公藤多苷组较模型组下降不明显。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种治疗类风湿关节炎的药物，其特征在于，所述治疗类风湿关节炎的药物为枫杨总黄酮。

2.一种如权利要求1所述治疗类风湿关节炎的药物的制备方法，其特征在于，所述治疗类风湿关节炎的药物的制备方法包括以下步骤：

3.一种验证权利要求1所述治疗类风湿关节炎药物疗效的CIA模型构建方法，其特征在于，所述CIA模型为从48只适龄雄性SD大鼠中随机取出8只作为阴性对照组NC，其余大鼠用于建立CIA模型；将完全弗氏佐剂与用冰醋酸溶解后4℃过夜的牛Ⅱ型胶原按1:1比例在冰浴条件充分乳化，配制成混合乳剂；分别在大鼠右后足趾、尾部、背部多点皮内注射混合乳剂0.3mL/只，阴性对照组在相同部位注射等体积的生理盐水；7d后重复上述步骤；

4.一种利用权利要求1所述的枫杨总黄酮制备的抗癌药物。