CN109022441B - 水稻颖壳持续生长基因启动子nsgp的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，尤其是涉及水稻颖壳持续生长基因NSG启动子的用途。本发明提供了水稻颖壳持续生长基因NSG启动子在水稻育种中的用途。本发明提供的NSG基因启动子NSGP可以在水稻早期花序、副护颖与护颖处特异性表达，可以用来研究及改善植物颖壳的发育。本发明为提高禾本科粮食作物育种提供一种新选择。

Description

水稻颖壳持续生长基因启动子NSGP的用途

技术领域

本发明涉及水稻发育技术领域，尤其涉及水稻颖壳持续生长基因NSGP启动子的用途。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，也是单子叶植物发育生物学研究的理想模式作物，水稻产量由单位面积穗数，每穗实粒数，千粒重这3个因素构成。每穗粒数是水稻等禾本科粮食作物产量构成的重要因素之一，由每穗颖花数和结实率共同决定，然而结实率极易受环境因素影响，改良难度较大。因而，增加穗粒数是目前国内外从事水稻育种相关研究工作者的共识。成熟时每穗粒数的多少与水稻幼穗和颖花的发育息息相关。控制颖花发育的相关基因中，控制颖花器官形成的基因应用潜力较小，而控制颖壳大小的基因应用潜力较大。因此，进一步加强水稻幼穗和颖花发育的相关研究具有重要理论意义和实际意义。

水稻等大多数的稻族，小穗由一对副护颖，一对护颖和一个顶生颖花组成。颖花是可孕的，由外稃、内稃、6个雄蕊、1个雌蕊和2个浆片构成。雄蕊包含花药和花丝2部分；雌蕊包括柱头、花柱和子房3部分。关于护颖的来源流行两种观点：一种认为护颖和副护颖一样，都是退化的颖片；而另一种主张一对护颖“代表”一对“退化的侧生小花”，护颖实际上是侧生小花的外稃退化而来，因此认为水稻为“3花小穗”。最近的研究着眼于调控护颖特征和发育的相关基因，有些报道认为护颖其实是水稻两朵退化的侧位颖花。水稻长护颖基因G1/LONG STERILE LEMMA，编码DUF640结构蛋白，属于植物特异的新基因家族。g1突变体中，护颖伸长变大，转变为外稃状器官(Yoshida et al.,2009)，表明G1基因参与抑制外稃特征基因的表达从而调控护颖发育；水稻脂肪酶基因EG1，在eg1突变体中，护颖被转变为外稃状器官，暗示EG1特化护颖特性(Li et al.,2009a)；还有一些其他基因，如MADS34/PAP2，也调控护颖的发育，在pap2极端突变体中，最明显的表型就是伸长了的具有外稃特征的护颖(Gaoet al.,2010)；。除此之外，异位表达OsMADS1/LHS1也会引起护颖外稃化(Wang etal.2016)；ASP1基因突变也会导致外稃化的护颖出现(Yoshida et al.,2012)。这些研究结果表明护颖与外稃同源，暗示原始稻族的小穗可能是一种“3花”小穗，包含两个侧生小花和一个顶生小花，后来侧生小花退化只剩下外稃，外稃进一步退化成为护颖。

G1、OsMADS34/PAP2、EG1、ASP1和OsMADS1/LHS1等基因的研究为“3花小穗”假说提供了一定的支持，暗示护颖可能是侧生小花的退化外稃，这些突变体或转基因材料中，护颖“恢复”成外稃状器官或延长变大，护颖的表皮细胞结构与正常的外稃表皮细胞结构非常相似，一定程度上验证了护颖是在水稻的进化过程中,由2个不育颖花的外稃退化而来的这一假说，也为研究水稻的进化以及提高水稻产量上提供了理论依据。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种具有特异表达启动子功能的DNA片段及其应用，从而为水稻转基因研究提供有力的工具，促进水稻的进化以及提高水稻产量的研究。

本发明提供了水稻颖壳持续生长基因NSG基因启动子NSGP在调控水稻早期花序、副护颖或护颖发育中的用途。

本发明提供了水稻颖壳持续生长基因NSG基因启动子NSGP在调控水稻颖壳发育中的用途。

本发明提供了水稻颖壳持续生长基因NSG基因启动子NSGP在调控水稻物产量的用途。

具体的，所述的启动子NSGP具有如SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。

本发明还提供了含有颖壳持续生长基因NSG基因启动子NSGP的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控水稻早期花序、副护颖或护颖发育中的用途。

本发明提供了含有颖壳持续生长基因NSG基因启动子NSGP的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控水稻颖壳发育中的用途。

本发明提供了含有颖壳持续生长基因NSG基因启动子NSGP的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控水稻物产量的用途。

具体的，所述的启动子NSGP具有如SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。

本发明的有益效果：NSG基因启动子NSGP可以在水稻早期花序、副护颖与护颖处特异性表达，可以用来研究及改善植物颖壳的发育并为研究水稻的进化以及提高水稻产量上提供了理论依据。启动子的发现和其表达模式及功能的阐明，在植物发育调控和生物技术育种中均具有重要意义，为今后在植物颖壳中特异性表达外源基因提供了新型有效的启动子和顺式作用原件。

附图说明

图1、pNSG-GFP互补载体示意图

图2、pNSG-GFP互补载体构建

A，pCAMBIA1301-35S-GFP-NOS质粒提取，第1泳道为maker，第2泳道为质粒；

B，目的基因扩增；第1泳道为maker，第2泳道为目的基因；

C，菌液PCR检测；第1泳道为maker，第2～8泳道为菌液样品。

图3、互补植株小穗表型，标尺为1mm。

图4、NSG基因的表达分析

A-D，pNSG-GFP融合蛋白在花序中的表达；A，普通荧光显微镜观察；B-D，激光共聚焦荧光显微镜观察放大观察。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明实施例中使用的材料：野生型水稻材料缙恢10号(wt)和颖壳持续生长突变体nsg1-1均购买自西南大学水稻研究所；M-MLV逆转录酶、高保真DNA聚合酶PFU、Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶、pMD19-T载体、Trizol试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、λ-Hind III DNA Marker及DL5,000DNA Marker购自TaKaRa公司；DNA MarkerIII购自天根生化科技(北京)有限公司；氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)和卡拉霉素(Kanamycin，Kan)为Sigma公司产品；引物合成和DNA测序由上海英俊生物技术有限公司完成；其它化学试剂购自北京鼎国生物技术有限责任公司；pTCK303、pA7植物表达载体、大肠杆菌DH5α、农杆菌LBA4404在BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心购买。

实施例1 NSG启动子的克隆和GFP报告基因表达载体的构建

本实施例中，通过报告基因绿色荧光蛋白(GFP)来检测NSG启动子的表达模式。构建了一个带有NSG基因自身启动子、基因编码框序列和GFP绿色荧光蛋白基因的融合表达载体(PNSG::NSG-GFP)。

具体构建过程：首先以PA7质粒(BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心购买)中包含的GFP序列为模板，扩增GFP编码框序列(引物GFP-F和GFP-R，序列见表1)，并连接到植物表达载体PCAMBIA1300(BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心购买)上，构建成PCAMBIA1300-GFP中间载体，然后扩增野生型西农1A的LOC_Os04g36650基因启动子及编码框序列(包括NSG基因起始密码子上游约2156bp以及NSG编码框com F2和com R1序列见表1)，分别连接到PCAMBIA1300-GFP上，构建成PNSG::NSG-GFP表达载体。

本实施例中，为获得阳性克隆，先挑选了10～15个大小正常的单斑，进行菌液培养。以菌液为模板，用检测引物(引物detect-1F和detect-1R序列见表1)进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果(图2，C)，选出了相应的阳性克隆斑。阳性克隆斑培养的菌液送至上海英潍捷基贸易有限公司(Invitrogen)进行了进一步的测序验证。测序结果显示目的基因顺利与载体相连。使用TIANGEN公司的质粒提取试剂盒对菌液进行了质粒提取并放于-80℃冰箱进行保存，提取步骤参看试剂盒说明书。

本实施例中，使用TransGen公司的无缝连接重组酶(

-Uni SeamlessCloning and Assembly Kit)对目的片段与线性载体进行高效连接。

表1互补载体引物与检测序列

实施例2转基因植株的获取与观察

本实施例中，带有NSG基因自身启动子、基因编码框序列和GFP绿色荧光蛋白基因的融合表达载体被送至武汉伯远生物科技有限公司进行遗传转化实验，将其转化nsg1-1突变体植株，获得转基因植株组培苗，将其于实验室恒温光照培养箱中培养至壮苗后，移栽大田，成熟后，观察其表型。本实施例中，共获得20株转基因组培苗，在这些植株中，有4个植株还保留有略微伸长的护颖或副护颖，剩下的8个转基因植株中，副护颖、护颖以及颖花则全部恢复正常(图3)。结果证明这8个转基因植株可以用来进行报告基因的检测，并能真实反映NSG基因启动子的表达模式。

实施例3 NSG1-GFP融合蛋白表达观察

本实施例中，选择表型恢复正常的转基因植株，在孕穗期取其幼嫩花序，于OLYMPUS荧光宏观体式显微镜(MVX10)和OLYMPUS激光共聚焦扫描显微镜(FV100)不同倍数下观察NSG-GFP融合蛋白在花序的哪些部位或哪些器官表达。有12个植株的幼穗能看到明显绿色荧光信号的表达，证明这些植株确实是转入了pNSG-GFP融合载体的转基因植株。以表型恢复正常的转基因植株为材料，使用普通荧光显微镜和激光共聚焦荧光显微镜观察GFP信号，以探究NSG基因的表达模式。普通荧光显微镜观察发现，GFP信号在幼嫩花序中有强烈表达，且富集于小花原基与小穗轴的基部(图4，A)。激光共聚焦荧光显微镜观察放大观察后，发现GFP信号强烈分布在副护颖与护颖原基中，且在副护颖中的信号要明显强于护颖，而在外稃、内稃、浆片、雄蕊与雌蕊这些花器官原基中信号非常微弱(图4，B-D)。

结论：本专利选取的NSGP序列(起始密码子上游2156bp的序列)可以驱动下游报告基因GFP特异地在水稻小穗的副护颖与护颖原基中强烈表达。

Claims (6)

1.水稻颖壳持续生长基因NSG基因的启动子NSGP在调控水稻早期花序、副护颖或护颖发育中的用途，其特征在于：所述的启动子NSGP的核苷酸序列如SEQ ID No.1所述。

2.水稻颖壳持续生长基因NSG基因的启动子NSGP在调控水稻颖壳发育中的用途，其特征在于：所述的启动子NSGP的核苷酸序列如SEQ ID No.1所述。

3.水稻颖壳持续生长基因NSG基因的启动子NSGP在调控水稻物产量的用途，其特征在于：所述的启动子NSGP的核苷酸序列如SEQ ID No.1所述。

4.含有颖壳持续生长基因NSG基因的启动子NSGP的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控水稻早期花序、副护颖或护颖发育中的用途，其特征在于：所述的启动子NSGP的核苷酸序列如SEQ ID No.1所述。

5.含有颖壳持续生长基因NSG基因的启动子NSGP的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控水稻颖壳发育中的用途，其特征在于：所述的启动子NSGP的核苷酸序列如SEQID No.1所述。

6.含有颖壳持续生长基因NSG基因的启动子NSGP的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控水稻物产量的用途，其特征在于：所述的启动子NSGP的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所述。

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