CN1089992A - 新的载体 - Google Patents

Abstract

得自苏云金芽孢杆菌克氏亚种HD 73的复制原 点，它可用于制备用以稳定地转化苏云金芽孢杆菌菌 株而又不置换其固有质粒的载体。

Description

本发明涉及从苏云金芽孢杆菌（Bacillus  thuringiensis）质粒中分离出的复制原点、含有这些复制原点的质粒载体、它们在克隆中的应用及由此得到的转化菌株。

近年来，生物杀虫剂特别是基于苏云金芽孢杆菌（B.t.）的产品，由于是天然存在的并且具有很高的宿主特异性，所以越来越多地用作广谱化学杀虫剂的专门替代品。

同时，由于这些产品越来越广泛地被人们所接受，对其在抗靶害虫活性谱和保留非靶昆虫的能力方面提出了更高的要求。

达到这一效果有各种方法，例如分离含有突变毒素编码基因的菌株（其中突变可以是自发突变或诱发突变）（参见英国专利申请2216127A），或使天然存在的菌株或突变菌株接合，产生含有来自具不同或互补宿主特异性的两亲本菌株质粒的杂交菌株（参见美国专利4，797，279）。但这些方法均有一定的缺点和局限性，例如不能预见突变，不能使所有菌株都起供体作用，不能使所有质粒都能成功地从一个菌株向另一个菌株转移。

这就导致更多地使用重组DNA技术，将表达结晶蛋白质毒素或其他所需蛋白质的基因以灵活和受控的方式导入宿主细胞内。例如，越来越多地使用电穿孔或电转化等技术来转化B.t.菌株（参见Bore和Ellan，FEMS.Microbiology  Letters  58（1989）171-178;英国专利申请2219806  A和欧洲专利申请433945  A：Baum等，Appl.Environ.Microbiol.，56（11）3420-28，1990年11月）。

如上述文献中详细讨论过的，为对结晶蛋白质毒素的生产、调节、活性（杀虫程度/杀虫谱）等产生有利影响，或为导入其他所需蛋白质基因，对B.t.菌株进行成功操作的一个基本要素是，可得到能将所需遗传物质转移到宿主菌株内的适当克隆载体。

上述文献和Miteva等人的文章（1988，Arch.Microbiol.150：496-498）中记载了对目前用于转化B.t.的载体性质和使用目的的一般性评述。

然而，迄今为止为导入异源遗传物质而对B.t.菌株进行的成功转化，采用的是不仅含有B.t.DNA，而且还含有大量异源生物体如大肠杆菌（参见EP  433945  A）、蜡状芽孢杆菌（参见GB  2219806  A）等DNA的质粒载体。异源生物体DNA的存在会造成在宿主菌株内的稳定性问题，而且，如果能使转化生物体主要含有或仅含有其所属种属固有的DNA，显然更为理想。

Baum等人（Appl.Environ.Microbiol.56（Ⅱ）3420-28，1980年11月）描述了在大肠杆菌中克隆苏云金芽孢杆菌克氏亚种（Bacillus  thuringiensis  Kurstaki（B.t.k.）HD  263和HD  73固有质粒的七个复制原点的方法。已将其中三个来自B.t.k.HD  263的43、44和60  MDa质粒的复制原点用于构建一组穿梭载体。但这些克隆复制原点都表面出与作为其来源的固有B.t.质粒的不相容性（Baum和Gilbert（1991），J.Bacteriol.173（17）5280-5289）。

Baum等人（文献同上）还描述了克隆含B.t.k.HD  73-26-10（一种跨膜接合体菌株，携有HD  263的44  MDa固有质粒和未指明来源的4.9MDa质粒）复制原点的质粒DNA片段的方法。制得了在Southern印迹中与由菌株HD  73-26的4.9  MDa质粒构成的杂交探针产生强杂交的新质粒pEG  588-2、pEG  588-18和pEG  588-21。但这些质粒中的HD  73-26转化体中，减少了或完全不存在HD  73-26的固有4.9MDa质粒，提示这些新质粒与4.9  MDa质粒间有一定程度的不相容性。

我们现已发现，有可能构建在B.t.宿主细胞中稳定的、主要含B.t.DNA的DNA载体。而且，我们发现，通过适当地选择复制原点的来源质粒并操作其DNA，有可能提供能与作为复制原点来源的天然固有质粒相容的质粒。

因此，本发明的第一个方面提供用于转化苏云金芽孢杆菌细胞的DNA载体，该载体包含苏云金芽孢杆菌克氏亚种的复制原点，它基本上不含通常与之相关联的、对复制不必要的DNA。

该复制原点可来自任何B.t.k.HD  73质粒，但优选来自HD  73的5.2  MDa、5.6  MDa质粒，最优选的是来自HD  73的50  MDa质粒。下文顺序一览表中给出了50  MDa质粒最小复制原点的DNA顺序，即6号顺序。

除天然HD  73质粒复制原点如50  MDa质粒的复制原点外，还可使用相对于天然复制原点DNA顺序具有缺失、置换或少量加入（如插入）的同源DNA顺序，这些改变并不影响天然顺序发挥复制原点功能的能力。

另外，本发明的DNA载体优选含有占优势的B.t.DNA。

术语“占优势的B.t.DNA”是指除多克隆位点、所需的标志基因或欲掺入宿主细胞内的编码蛋白质的基因外，载体几乎不含其他细胞的DNA。

利用来自HD  73质粒之一的复制原点的一个特殊优点是，除去了负责复制以外功能的DNA，使所构建的质粒载体能稳定地导入到含有带相似复制原点的固有质粒的菌株中，而没有从转化菌株中置换掉这些固有质粒。以这种方式，有可能使用如下文描述的含有得自HD  73  50MDa质粒复制原点的载体，将编码异源结晶蛋白质毒素或其他所需蛋白质的基因导入HD  73中，而没有置换掉其中天然包含的、携带重要的cry  IA（C）结晶蛋白质毒素基因的完整50  MDa质粒。HD  73的50  MDa质粒是已知的（如参见Kronstad和Whiteley，J.Bacteriol.160：95-102）。然而，该质粒的复制原点并不是以前详细研究或讨论的主题内容。

可按常规方法，例如如上述文献或Lereclus等人（FEMS  Microbiology  Letters  60（1989）211-218）、McDowell等人（Plasmid，25：113-120，1991）或Hardy（Plasmids：A  Practical  Approach，Washington，D.C.IRL  Press，1987）所述的方法，进行载体构建和/或B.t.菌株的转化。

适用于本发明的载体除得自HD  73质粒的复制原点外还可包含：用于选择被质粒转化的宿主的顺序，如编码抗生素抗性等可选择标志的基因;克隆位点，优选多克隆位点;能使基因在选择的宿主内表达的DNA区域;以及一个或多个在表达时编码一种或多种所需B.t.结晶蛋白质毒素或其他有用蛋白质的DNA顺序（后两者通常整合在克隆位点中）。

因此，本发明的第二方面提供在一种苏云金芽孢杆菌菌株中产生所需外源蛋白质的方法，该方法包括：用本发明的DNA载体转化所述苏云金芽孢杆菌菌株的细胞，所述载体包含为所需外源蛋白质的表达编码的基因;以适当方式增殖所述转化细胞，以进行所需外源蛋白质编码基因的表达。

[有关结晶蛋白质毒素及其编码基因的一般性讨论可参见Hoefte和Whiteley，Microbiol.Reviews，53（2），PP.242-255（1989年6月）]。

本发明的另一些方面还包括用本发明的载体转化的苏云金芽孢杆菌菌株和包含这些转化苏云金芽孢杆菌菌株的杀虫剂组合物，其中的载体优选包含编码苏云金芽孢杆菌结晶蛋白质毒素的基因。

此外，本发明还包括从苏云金芽孢杆菌HD  73中分离的复制原点，特别是50  MDa质粒的复制原点，即下文顺序一览表中作为6号顺序给出的DNA顺序或其同源顺序。

可按下述一般性方法鉴定和分离所需的复制原点，并用以转化B.t.菌株。

从适当B.t.HD  73菌株中分离质粒DNA并纯化之。可用等密度离心法和差速离心法分离所需的质粒，如50  MDa质粒。然后可用适当的限制酶消化质粒，使分离出的片段与适当消化的大肠杆菌质粒载体连接，并用此连接混合物转化大肠杆菌菌株。

可用限制性消化图来鉴定含有所需片段的亚克隆，并可在这些质粒中插入适当的标志基因（红霉素抗性）用于B.t.转化。

以下结合附图和非限制性实验概述及实施例进一步描述本发明。

图1显示含红霉素抗性基因ermC的质粒pSB  901;

图2显示含HD  73的50  MDa质粒9.6  kb  Bgl  Ⅱ片段和ermC基因的质粒pSB  904.1;

图3显示质粒pSB  904.2，它是pSB  904.1的衍生物，其中除去了9.6  kb  Bgl  Ⅱ片段的非必需部分;

图4显示质粒pSB  904.3，它包含pSB  904.2中所含的2.4  kbB.t.复制子的核苷酸123-1843。

图5显示质粒pSB  909，它包含ermC标志基因和50  MDa质粒的截短片段。

图6显示质粒pSB  909.3，它包含9.6  kb  50  MDa  Bgl  Ⅱ片段的2.4  kb部分及ermC基因;

图7显示用于确定HD  73的50  MDa质粒的最小复制子的、定位在pSB  904.1和pSB  909.3中2.4  kb部分上的缺失片段;

图8显示含有HD  73的50  MDa质粒中的最小复制子及ermC基因的质粒pSB  909.4;

图9显示含有上述最小复制子和多克隆位点的质粒pSB  909.5;

图10显示含有上述最小复制子和苏云金芽孢杆菌黄粉

亚种cryⅢ A基因的质粒pSB 922。

实验概述

用含有来自B.t.k.HD  73的50  MDa质粒的片段和可选择标志基因的质粒转化B.t.菌株。选择出表达标志基因的含复制原点的转化体作进一步的研究。用适当的酶消化所选择的质粒以除去不需要的DNA顺序，并进行连接，得到仍可用于转化B.t.的，含有所需片段及标志基因的另一个质粒。使用适当的酶造成含有经鉴定携带复制原点的片段的各种质粒各部分的选择性缺失，并连接这些片段使之重新环化而得到载体。再次用这些新构建体转化B.t.，结果只有含所需复制原点的构建体将产生可鉴定的转化体。再次从质粒中除去所需部分并按常规方法进行顺序测定。为了确定最小复制子，使用适当的酶，必要时再次按常规方法引入适当的限制性位点，在所需部分的两端造成缺失。

应明确的是，可在不影响上述顺序作为复制原点发挥功能的能力的情况下，在该顺序中造成缺失、置换和加入（如插入），本发明也将包括含有这些缺失、置换和加入但仍保留了上述能力的顺序。

然后构建含有为使之成为用于将选择的基因导入B.t.菌株的载体所必需的最小复制子、标志基因及多克隆位点的质粒。再用如此构建的质粒载体作为向其中再克隆所需基因的载体，并用以转化B.t.菌株。使用对个别结晶蛋白质基因或其他所需基因特异的引物，用PCR技术筛选转化体并进行生物测定。用本发明载体进行转化可产生保留了所有含固有结晶蛋白质基因的质粒的稳定转化体。

虽然本发明这些载体的主要应用是将结晶蛋白质基因导入通常不能表达这些基因的B.t.菌株中以拓宽杀虫谱等，但其应用不只限于此，因为它们同样也可用来导入其他编码有用蛋白质的基因。

可通过对昆虫或其栖息地施用杀昆虫有效量的转化B.t.菌株来防治昆虫。例如可按美国专利4，797，279中所述方法（该文中有关内容列为本文参考文献）制备适当的制剂和B.t.菌株。

下列实施例举例描述本发明。

以下称作传统或常规的所有实验程序均按Sambrook等人所述进行（《分子克隆：实验室手册》，1989年第二版，纽约冷泉港实验室出版社）。

所有限制酶均由Pharmacia  LKB  Biotechnology，Alameda，CA和New  England  Biolabs，Inc.，Beverly，MA提供;按制造商推荐的方法进行消化。Taq  DNA聚合酶（amplitaq）得自Perkin-Elmer  Cetus，Norwalk  CT，按推荐方法进行PCR反应。

所用的所有其他酶均由Pharmacia  LKB提供。化学药品由SigmaChemical  Co.，St.Louis，MO提供。

实施例1：鉴定来自HD  73  50  MDa质粒的最小复制子

a）分离质粒DNA

在适当培养基中培养HD  73菌株（参见Lereclus等人，Mol.Gen.Genet.，191：307-313，可得自巴斯德研究所（法国巴黎）或NRRL（Peoria，IL  51604）NRRL  B-4488），并用CsCl密度梯度超离心法纯化质粒DNA。质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳显示存在50、7.8、5.6和5.2  MDa质粒（结果未示出）。

用蔗糖梯度超离心法从其他质粒中分离出50  MDa质粒。分离后立即用Bgl  Ⅱ消化，并经制备性琼脂糖凝胶电泳分离限制性片段，然后用电洗脱法从凝胶中分离出来。

b）制备红霉素抗性基因

用枯草芽孢杆菌质粒pIM  13（Mahler等人，198，J.Gen.Microbiol.120：259-263）作为红霉素抗性基因ermC（Monod等人，1986，J.Bacteriol.167：138-147）的来源。经Hind  Ⅲ/Cla  Ⅰ双重消化切下pIM  13的ermC基因片段，并用琼脂糖凝胶电泳法使之与质粒的其他部分分离开。分离后立即将此Hind  Ⅲ/Cla  Ⅰ  ermC片段再克隆到经Hind  Ⅲ/Acc Ⅰ消化的pUC  18（Pharmacia  LKB  Biotechnology，Alameda，CA）中，并在大肠杆菌DH5-α（Gibco  BRL，Grand  Island，NY）中进行选择。该构建体被定名为pSB  901（参见图1）。经Hind  Ⅲ/Eco  RI或Hind  Ⅲ/Bam  HI双重消化从pSB  901中释放出ermC基因，如此它便携带了来自pUC  18多克隆位点的位点。含有pSB  901的大肠杆菌DH5-α细胞可表达红霉素抗性，但必须铺在含有100μg/ml红霉素的LB平皿上，以防止在用50μg/ml红霉素时在LB平皿上出现的非转化体的本底生长。

c）制备50  MDa质粒亚克隆

为了分离含50  MDa质粒复制原点的Bgl  Ⅱ片段，用大肠杆菌DH5-α作为亚克隆50  MDa质粒Bgl  Ⅱ片段的宿主，从而可很容易地产生用于最终转化B.t.的大量质粒DNA。

如所期望的，按上述方法用Bgl  Ⅱ消化后产生了大约35、13.8、10.2、9.6、4.2和3.3kb的限制性片段。已知13.8  kb  Bgl  Ⅱ片段含有cry  IA（c）基因。从凝胶片中电洗脱后以良好的回收率得到所有13.8  kb和下述大小的片段。分别将回收到的所有Bgl  Ⅱ片段连接到用Bam  HI消化的pUC  18上，并以此连接混合物按常规方法转化大肠杆菌DH5-α。将质粒DNA的限制性消化图与根据Kronstad和Whiteley的工作（J.Bacteriol.160：95-102）中所预期的消化图进行比较。根据限制图鉴定含3.3、4.2、9.6和13.8  kb  Bgl  Ⅱ片段的亚克隆。使用cry  IA（c）特异性引物，以PCR分析法进一步证实13.8  kb亚克隆。

质粒  描述

pSB  902  pUC  18中的3.3  kb  Bgl  Ⅱ片段

pSB  903  pUC  18中的4.2  kb  Bgl  Ⅱ片段

pSB  904  pUC  18中的9.6  kb  Bgl  Ⅱ片段

pSB  905  pUC  18中的13.8  kb  Bgl  Ⅱ片段

将ermC基因插入这些不同的质粒中，以提供用于B.t.转化的选择标志：

将来自pSB  901的ermC基因亚克隆到pSB  902至pSB  905中。例如，充填来自pSB  901的Bam  HI/Hind  Ⅲ  ermC基因片段，然后在用T4  DNA聚合酶修成平头并用CIAP处理过的pUC  18  MCS  PstI位点处将其插入pSB  904中。用这些连接混合物以常规方法转化大肠杆菌DH5-α。限制性分析进一步证实ermC基因的存在。如此制得下列质粒：

质粒  描述

pSB  902.1  pUC  18中的3.3  kb  Bgl  Ⅱ片段+ermC

pSB  903.1  pUC  18中的4.2  kb  Bgl  Ⅱ片段+ermC

pSB  904.1  pUC  18中的9.6  kb  Bgl  Ⅱ片段+ermC

pSB  905.1  pUC  18中的13.8  kb  Bgl  Ⅱ片段+ermC

将10.2  kb  Bgl  Ⅱ片段直接亚克隆到用Bam  HI消化的pSB  901中。用此连接混合物以传统方法转化大肠杆菌DH5-α。经限制性消化分析转化体质粒DNA。限制性酶切图进一步证实质粒中存在10.2  kb  Bgl  Ⅱ片段。

质粒  描述

pSB  906  pSB  901中的10.2  kb  Bgl  Ⅱ片段

d）鉴定含有50  MDa质粒复制原点的Bgl  Ⅱ片段

以电穿孔法分别用pSB  902.1、903.1、904.1、905.1和906转化B.t.HD1  cry  B（以下简称cry  B，参见Stahly等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.1984，3：581-588）。

结果只有质粒pSB  904.1（参见图2）得到红霉素抗性转化体，表明该9.6  kb  Bgl  Ⅱ片段含有50  MDa质粒的复制原点，使之得以在cry  B中增殖。限制性分析证实正确大小的构建体含有50  MDa质粒的9.6  kb  Bgl  Ⅱ片段。

e）pSB  904.1的限制性酶切分析

用各种不同的酶进行限制性分析，得到下列结果：

pSB  904.1

Acc I 4^*Pst I 无

Bam HI 无 Sac I 2^*

Eco RI 2^*Sal I 1^*

Hinc II 4^*Sma I 1^*

Hind III 2^*Sph I 1^*

Kpn I 1^*Xba I 5^*

Nar I  1  Xho II  许多

Nco I 无 Xma I 1^*

^＊＝一个位点在来自pUC 18的多克隆位点内

f）从pSB  904.1中除去pUC  18顺序

为除去pUC  18顺序，用在pUC  18载体的任一末端切割的Sph  Ⅰ和Sma  Ⅰ消化pSB  904.1  DNA，只留下多克隆位点顺序。通过制备性琼脂糖凝胶电泳及电洗脱，从pUC  18载体中纯化出只含9.6  kb  Bgl  Ⅱ片段加上ermC基因的限制性片段。用T4  DNA聚合酶处理该片段的Sph  Ⅰ末端使之成为平末端。用T4  DNA连接酶将两个平末端连接在一起，并用连接混合物以电穿孔法转化cry  B。

用琼脂糖凝胶电泳法，根据所含质粒筛选转化体。将这个含有50  MDa质粒的9.6  kb  Bgl  Ⅱ片段连同ermC基因的构建体定名为pSB909（参见图3）。

质粒  描述

pSB  909  缺失pSB  904.1中的pUC  18顺序（保留9.6  kb  Bgl  Ⅱ片段加ermC基因）

g）确定复制原点在pSB  909上的位置

为了定位质粒pSB  909中含复制原点的区域，首先制备缺失质粒不同部分的若干构建体。

1、对pSB  904.1进行Hind  Ⅲ消化得到两个片段。

借助制备性琼脂糖凝胶电泳法，从含有pUC  18和3.4  kb  B.t.DNA的片段中分离出含约6  kb  B.t.部分加ermC基因的片段。经电洗脱从凝胶片中移出含ermC的片段，并使之自我连接而重新环化。

2、对pSB  909进行Hind  Ⅲ/Eco  RI双重消化得到2个片段。经制备性琼脂糖凝胶电泳从小的3.5  kb  B.t.DNA片段中分离出含ermC基因的大片段。电洗脱后使用Klenow充填该大片段以形成平末端。使这些平末端自我连接使载体重新闭合。

3、对pSB  909进行Eco  RI/Sal  Ⅰ双重消化得到2个片段。借助制备性琼脂糖凝胶电泳，从小的2.4  kb  B.t.DNA片段中分离出含ermC基因的大片段。电洗脱后，使用Klenow充填该大片段以造成平末端，然后使之自我连接而重新环化。依照这一方式分别缺失pSB  909的各部分。

为了确定哪一个构建体保留了复制原点，用不同连接混合物转化cry  B。当缺失Eco  RI/Sal  Ⅰ  2.4kb片段时未得到转化体，从而将复制原点定位在这一DNA片段中。而使用另外2个缺失构建体时则得到转化体，这一事实进一步证实了上述定位。

质粒  描述

pSB  909.1  从pSB  909中除去Eco  RI/Hind  Ⅲ3.5  kb片段

pSB  909.2  缺少pSB  909中的3.4  kb  Hind  Ⅲ部分

h）构建909.3

为了证实如缺失研究所提示的pSB  909的2.4  kb部分含有复制原点的说法，构建一个只含有pSB  909的2.4  kb部分连同ermC基因的新质粒。用Eco  RI和Hind  Ⅲ消化pSB  904.1的质粒DNA，产生约3.6、3.5、3.4和2.7  kb（pUC  18部分）的限制性片段。使用Klenow充填这一限制性片段混合物以造成平末端，然后使之相互连接在一起而重新环化。通过电穿孔用该连接混合物转化cry  B。用琼脂糖凝胶电泳法根据所含质粒筛选所得转化体。由2.4  kb  B.t.部分连同ermC基因一起构成的3.6  kb片段能够复制，进一步证实它含有50  MDa质粒的复制原点。该构建体被定名为pSB  909.3（参见图4）。

质粒  描述

pSB  909.3  含有9.6  kb  50  MDa  Bgl  Ⅱ片段的2.4  kb部分连同ermC基因

i）测定909.3的顺序

为测定含50  MDa质粒复制原点的2.4  kb部分的顺序，经用Eco  RI和Sal  Ⅰ消化从pSB  904.1中除去该部分。将此Eco  RI/Sal  Ⅰ片段亚克隆到大肠杆菌质粒载体pSport（Gibco  BRL，Grand  Island，NY）中。

按照制造商推荐的双脱氧法（T7  DNA聚合酶顺序测定药盒，Pharmacia  LKB  Biotechnology，Alameda，CA）进行顺序测定。顺序测定结果表明该复制片段的大小为2392  bp。

j）确定最小复制子

按照制造商推荐的方法，使用Exo  Ⅲ（“Erase-A-Base”药盒，Promega，Madison，WI）从亚克隆到pSport中的B.t.复制子片段的Eco  RI末端（指定为2392号核苷酸）缺失不同部分。经顺序分析确定各缺失部分的末端核苷酸。所得结果在下列表1中给出并图解示于图5中。用Hind  Ⅲ和Xba  Ⅰ消化各Exo  Ⅲ缺失亚克隆的质粒DNA。将携带ermC基因的Hind  Ⅲ/Xba  Ⅰ片段连接到各Exo  Ⅲ亚克隆上。用各个不同的连接混合物按传统方法转化大肠杆菌菌株DH5-α。用Hind  Ⅲ和Xba  Ⅰ进行限制性消化以分析各转化体中的质粒DNA，从而进一步证实特定Exo  Ⅲ缺失亚克隆内ermC基因的存在。以电穿孔方法用各Exo  Ⅲ亚克隆的质粒DNA转化cry  B，以确定哪个ExoⅢ亚克隆仍具有复制能力。

表1

缺失末端的端点  cry  B  复制

2281  能

1912  能

1626  不能

1500  不能

1383  不能

1190  不能

用琼脂糖凝胶电泳法分析能够在cry  B中复制的质粒。据此，可在不破坏复制能力的情况下从复制子片段的Eco  RI末端删去479个碱基。因此，复制所需最小DNA的一个末端位于碱基对1626和1912之间。

为了确定在不丢失复制功能的情况下可从复制子片段的Bgl  Ⅱ末端（指定为1号核苷酸）除去多少DNA，通过置换部分片段引入缺失。用Eco  RI消化质粒pSB  904.1得到两个片段，其中一个含有pUC  18+ermC+2.4  kb复制子片段。

将混合物连接使各片段环化，并按标准程序用连接反应混合物转化大肠杆菌DH5-α。进行琼脂糖凝胶电泳然后用Eco  RI消化，分析转化体的质粒内容物。将此含有ermC基因和pUC  18的2.4  kb复制原点片段的构建体定名为pSB  904.2（参见图24）。因为复制子片段的头200个碱基内没有方便的限制性位点，所以设计一个定名为BT  113的PCR引物（所附顺序一览表中的1号顺序），以通过对下标横线的单一碱基改变而在123位核苷酸处引入一个Avr  Ⅱ位点。设计第二个称为BT898.rev的引物（所附顺序一览表中的2号顺序），以扩增2.4  kb复制子片段中从113到898号核苷酸的部分。引物顺序如下所示：

引物  顺序  位置

BT113  5′  GAA TCA AGC CTA GGC ACT AGG TTG 3′  113-137

BT898.rev  5′CTC AAT TGC TAG ATG CCA TTT GTG 3′  898-875

在以pSB  904.2质粒DNA作模板的PCR中，使用上述引物对产生一个786  bp片段。用Avr  Ⅱ和Acc  Ⅰ消化此PCR片段，产生一个相当于123到823号核苷酸的片段，然后进行凝胶纯化。用Xba  Ⅰ和Acc  Ⅰ消化质粒pSB  904.2，进行凝胶纯化后连接到Avr  Ⅱ/Acc  Ⅰ  PCR片段上。Avr  Ⅱ和Xba  Ⅰ具有相容的粘性末端，可供PCR片段插入pSB  904.2  Xba  Ⅰ/Acc  Ⅰ载体中。该插入使复制子片段产生一个比原始片段少122个碱基的新的5′末端。另外，也可用Dra  Ⅰ和Acc  Ⅰ消化PCR片段，产生一个相当于291到823号核苷酸的片段。用苯酚/氯仿提取并用乙醇沉淀后，使该Dra  Ⅰ/Acc  Ⅰ  PCR片段直接与已用Xba  Ⅰ消化并用Klenow修成平末端的pSB  904.2相连接，然后用AccⅠ消化，用苯酚/氯仿提取并用乙醇沉淀。Dra  Ⅰ平末端将连接到Xba  Ⅰ平末端上，从而使Dra  Ⅰ/Acc  Ⅰ  PCR片段得以插到pSB  904.2载体中，结果导致从原始“Bgl  Ⅱ”末端缺失290  bp。

按传统方法分别用两个连接混合物转化大肠杆菌DH5-α。使用相当于缺失点附近顺序的引物，以PCR分析技术筛选转化体，并用限制性消化分析法加以证实。通过电穿孔用各缺失构建体的质粒DNA转化cry  B，以确定各缺失构建体是否仍能复制。

缺失的部分  cry  B复制

1-122  能

1-291  不能

用琼脂糖凝胶电泳法分析仍能在cry  B中复制的缺失构建体，并经PCR分析加以证实。该质粒定名为pSB  904.2δA  3。据此可知最小复制子的这一末端位于碱基对122-291之间。

为了试验是否能从复制子的Eco  RI末端再缺失一些核苷酸，用Hind  Ⅲ和Afl  Ⅲ消化pSB  904.2δA  3，除去pUC  18部分并保留B.t.复制子的碱基对123-1843及ermC基因。将该Hind  Ⅲ/AflⅢ片段亚克隆到DH5-α中的pUC  18内，加以证实后用以转化cry  B，以确定这一缺失是否能够复制。经琼脂糖凝胶电泳分析所得转化体的质粒内容物。将该质粒定名为pSB  904.3（参见图2B）。

缺失构建体  cry  B复制

123-1843  能

为了确认pUC  18顺序对缺失构建体的复制功能是不必要的，用Klenow充填上述来自pSB  904.2δA  3的Hind  Ⅲ/Afl  Ⅲ片段的末端并连接成环，得到缺少pUC  18部分的构建体。借助电穿孔技术用此连接混合物转化cry  B。用琼脂糖凝胶电泳法分析转化体的质粒内容物，并用PCR和限制性消化分析法加以证实。将这一由B.t.复制子核苷酸123-1843和ermC基因组成的质粒称为pSB  909.4（参见图6），该质粒划定了最小复制子。最小B.t.复制子的顺序在所附顺序一览表中作为6号顺序给出。

实施例2

用含有最小复制子的质粒载体转化B.t.

a）多克隆位点插入

为了使该最小复制子适于作为克隆载体使用，在其中引入多克隆位点。构建具有下示顺序的两个寡核苷酸的多克隆位点（MCS），这两个寡核苷酸杂交后可形成Afl  Ⅲ和Hind  Ⅲ粘性末端。

寡核苷酸  顺序

MCS1  5′CATGTGAATTCCGCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGT

CGACCTGCAGA3′

MCS2  5′AGCTTCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACC

GCGGAATTCA3′

寡核苷酸MCS1和MCS2分别作为3号和4号顺序在所附顺序一览表中给出。用T4多核苷酸激酶激活这些寡核苷酸，混合并加热煮沸，逐渐冷却到室温，使用T4  DNA连接酶使之以1000倍摩尔过量与来自pSB  904.2δA  3的Hind  Ⅲ/Afl  Ⅲ片段连接。以电穿孔法用此连接混合物转化cry  B。经限制性酶消化筛选转化体，以证实质粒内多克隆位点的存在。该构建体定名为pSB  909.5（图7）。

b）分离cry  Ⅲ  A基因

分离cry  Ⅲ  Aδ-内毒素基因，并从B.t.t.中克隆之。该基因位于一个90  MDa质粒上。在SDS中溶解细胞并用NaCl沉淀污染物，然后透析并在乙醇中沉淀DNA，从而自B.t.t.中分离出总DNA。总DNA制备物含有携带cry  Ⅲ  A基因的90  MDa质粒。合成用于以Southern印迹法检测cry  Ⅲ  A基因的42碱基探针（Tenebr  1，所附顺序一览表中的5号顺序）。该探针与ATG起始密码子附近的顺序同源。探针顺序衍生于已公开的cry  Ⅲ  A顺序（Sekar等人，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.84：7036-7040）。

Tenebrl  5′ACT ACT GAA AAT GAG GTG CCA ACT AAC CAT GTT

CAA  TAT3′

用Hind  Ⅲ消化总DNA，并用0.6%琼脂糖在1X  TBE缓冲液中以凝胶电泳法进行分离。将已消化过的DNA转移到尼龙滤膜上，与探针Tenebr  1进行Southern印迹杂交，放射自显影后呈现出0.3  kb的杂交Hind  Ⅲ片段。用Hind  Ⅲ完全消化总DNA。经凝胶电泳分离所得的片段。在DEAE膜上分离大小相当于2.5-3.5kb的DNA部分，洗脱后重新悬浮在100μl  TE中。然后将分离出的Hind  Ⅲ片段连接到经Hind  Ⅲ切割的pTZ  18  R（Pharmacia  LKB  Biotechnology）中，产生部分文库，再用细菌碱性磷酸酶处理。用1μl连接反应混合物转化文库级BRL感受态DH5-α细胞（25μl感受态细胞），并在含有75μl/ml氨苄青霉素、100μg/ml  X-gal和1  mM  IPTG的LB平皿上选择重组体。使菌落DNA与探针Tenebr  1杂交，以筛选所得菌落。培养阳性菌落，分离质粒并用限制性分析法检查。将产生正确限制片段并含有适当大小插入片段的质粒克隆定名为pSB  100。经用Tenebr  1探针进行Southern印迹分析，得到pSB  100含有cry  ⅢA基因的进一步证据。

c）将cry  Ⅲ  A基因亚克隆到pSB  909.5中

在含25  mM  Tris（pH8.0）、25%蔗糖、25  mM  EDTA的溶液中，将细胞于37℃保温30-60分钟，然后用乙酸钾沉淀染色体DNA，从而以碱溶解法从含pSB  909.5的cry  B菌株中大量分离质粒DNA。将上清液直接加到Qiagen  tip-100柱（Qiagen  Inc.，Chatsworth，CA）上以纯化质粒DNA。然后用Hind  Ⅲ完全消化质粒载体DNA，再用CIAP处理。用Strataclean树脂（Stratagene，La  Jolla，CA）提取以除去Hind  Ⅲ和CIAP。使用可从pTZ18R载体中释放完整基因的Hind  Ⅲ进行消化，从pSB  100中分离出cry  Ⅲ  A基因。进行制备性琼脂糖凝胶电泳，然后用Qiaex（Qiagen  Inc.，Chatsworth，CA）从琼脂糖中提取，以分离出含cry  Ⅲ  A基因的Hind  Ⅲ片段。使用T4  DNA连接酶，以载体对插入片段1∶5的比例，使分离的cry  Ⅲ  A  HindⅢ片段与经Hind  Ⅲ消化的pSB  909.5连接。以电穿孔法用连接混合物转化cry  B。在含50μg/ml的LB平皿上，于30℃选择转化体并根据质粒内容物筛选菌落。使用对cry  Ⅲ  A基因特异的引物，以PCR技术分析正确大小的质粒。将此由亚克隆到pSB  909.5中的Hind  Ⅲ位点中的cry  Ⅲ  A  Hind  Ⅲ基因片段组成的构建体定名为pSB  922（参见图9）。

d）转化B.t.t.

按上述方法从携带pSB  922的cry  B菌株中大量分离质粒DNA。用纯化的质粒DNA以电穿孔法转化含有cry  Ⅰ  A（a）、cry  Ⅰ  A（b）、cry  Ⅰ  A（c）和cry  Ⅱ  A基因的B.t.t.菌株。按上述方法选择转化体。根据质粒内容物分析所分离的菌落。使用对各结晶蛋白质基因特异的引物，以PCR技术筛选携带cry基因的转化体。将含cry  ⅢA的pSB  909.5导入该B.t.t.菌株中，结果并没有置换掉任何含固有结晶蛋白质基因的质粒。

用可在适当培养基中形成孢子的转化培养物进行生物测定。预计它们将具有抗鳞翅目和鞘翅目昆虫的活性。用于生物测定的昆虫包括泰夏那甲虫（Leptinotarsa  texana）、粉纹夜蛾（Trichoplusia  ni）、谷实夜蛾（Heliothis  zea）和甜菜夜蛾（Spodoptera  exigua）。

在没有抗生素选择的条件下营养生长10代后，携带结晶蛋白质基因的质粒载体稳定地保留在转化细胞内。因此，该B.t.质粒载体可用来亚克隆各种基因，并可将这些基因稳定地引入各种不同的B.t.菌株中。

下列属、亚属和种的权利要求的组合，以及本说明书中提到的各种优选条件的组合，是特别优选的。

顺序一览表

（1）一般资料

（ⅰ）申请人：山道士技术有限公司

（ⅱ）发明名称：新的载体

（ⅲ）顺序数目：6

（ⅳ）通信地址：Sandoz  Technology  Ltd.，Basel，Basel-Stadt，Switzerland，CH-4002

（ⅴ）计算机可读形式：

（A）介质类型：

（B）计算机：

（C）操作：

（D）软件：

（ⅵ）本申请资料：

（A）申请号：

（B）申请日：

（C）分类：

（ⅷ）代理人/代理机构情况：

（A）姓名：Crawley，Patrick  E.

（B）登记号：51040

（C）卷号：133-0693

（ⅸ）电信信息：

（A）电话：061324  4796

（B）传真：061  322  7532

（2）1号顺序资料：

（ⅰ）顺序特征：

（A）长度：24碱基对

（B）类型：核酸

（C）链股：单股

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：DNA（基因组）

（ⅲ）假设：无

（ⅳ）反意：无

（ⅹⅰ）顺序描述：1号顺序：

  GAATCAAGCC TAGGCACTAG GTTG   24

（2）2号顺序资料：

（ⅰ）顺序特征：

（A）长度：24碱基对

（B）类型：核酸

（C）链股：单股

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：DNA（基因组）

（ⅲ）假设：无

（ⅳ）反意：无

（ⅹⅰ）顺序描述：2号顺序：

CTCAATTGCT AGATGCCATT TGTG  24

（2）3号顺序资料：

（ⅰ）顺序特征：

（A）长度：48碱基对

（B）类型：核酸

（C）链股：单股

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：DNA（基因组）

（ⅲ）假设：无

（ⅳ）反意：无

（ⅹⅰ）顺序描述：3号顺序：

CATGTGAATT CCGCGGTACC CGGGGATCCT CTAGAGTCGA CCTGCAGA  48

（2）4号顺序资料：

（ⅰ）顺序特征：

（A）长度：48碱基对

（B）类型：核酸

（C）链股：单股

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：DNA（基因组）

（ⅲ）假设：无

（ⅳ）反意：无

（ⅹⅰ）顺序描述：4号顺序：

AGCTTCTGCA GGTCGACTCT AGAGGATCCC CGGGTACCGC GGAATTCA  48

（2）5号顺序资料：

（ⅰ）顺序特征：

（A）长度：39碱基对

（B）类型：核酸

（C）链股：单股

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：DNA（基因组）

（ⅲ）假设：无

（ⅳ）反意：无

（ⅹⅰ）顺序描述：5号顺序：

ACTACTGAAA ATGAGGTGCC AACTAACCAT GTTCAATAT  39

（2）6号顺序资料：

（ⅰ）顺序特征：

（A）长度：1721碱基对

（B）类型：核酸

（C）链股：双股

（D）拓扑结构：线性

（ⅱ）分子类型：DNA（基因组）

（ⅲ）假设：无

（ⅳ）反意：无

（ⅹⅰ）顺序描述：6号顺序：

Claims (12)

1、一种用于转化苏云金芽孢杆菌细胞的DNA载体，该载体包含苏云金芽孢杆菌克氏亚种HD 73的复制原点，它基本上不含通常与之相关联的、对复制不必要的DNA。

2、根据权利要求1的DNA载体，其中所包含的DNA主要是苏云金芽孢杆菌DNA。

3、根据权利要求1或2的DNA载体，其中复制原点具有6号顺序的核苷酸顺序及其包含缺失、加入或置换而又不影响其作为复制原点发挥功能的能力的同源顺序。

4、根据权利要求1、2或3的DNA载体，该载体还包含用于选择被该载体转化的宿主的顺序和克隆位点。

5、根据权利要求4的DNA载体，该载体还包含在克隆位点中整合的DNA区域，该区域可使一个或多个DNA顺序在苏云金芽孢杆菌中进行基因表达，这些顺序在表达时编码一种或多种所需的苏云金芽孢杆菌结晶蛋白质或其他所需的蛋白质。

6、一种在苏云金芽孢杆菌菌株中生产所需外源蛋白质的方法，该方法包括，用权利要求1或2的包含为表达所需外源蛋白质编码的基因的载体，转化所述苏云金芽孢杆菌菌株;以适当方式增殖所述转化细胞，以进行所需蛋白质编码基因的表达。

7、根据权利要求6的方法，其中DNA顺序编码苏云金芽孢杆菌结晶蛋白质。

8、苏云金芽孢杆菌菌株，该菌株已用权利要求1、2或5的DNA载体转化。

9、杀虫剂组合物，该组合物包含根据权利要求8的苏云金芽孢杆菌菌株。

10、杀虫剂组合物，该组合物包含根据权利要求9的苏云金芽孢杆菌菌株。

11、从苏云金芽孢杆菌克氏亚种HD  73中分离的复制原点。

12、根据权利要求11的复制原点，该复制原点具有6号顺序所示的核苷酸顺序及其包含缺失、加入或置换而又不影响其作为复制原点发挥功能的能力的同源顺序。

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