CN108997772A - 一种线粒体定位近红外荧光染料THX-Np及其制备方法与应用 - Google Patents

一种线粒体定位近红外荧光染料THX-Np及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种线粒体定位近红外荧光染料THX‑Np及其制备方法与应用，染料的结构式为(I)。该染料在不同pH条件下的水相中具有稳定的pH荧光开启效应，利用其制备的2,4‑二硝基苯基醚类衍生物可用于硫化氢的检测。本发明具有以下优点：该荧光染料具有对pH稳定、斯托克斯位移大、较好的水溶性、良好的细胞膜通透性及优良的线粒体定位性能，并且其羟基和羧基容易被修饰生成生物相关的示踪物，利用其羟基被2,4‑二硝基苯基醚化后衍生物对硫化氢的选择性识别性能显著，是优良的选择性硫化氢检测荧光探针。

Description

一种线粒体定位近红外荧光染料THX-Np及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及染料分子荧光探针技术领域，尤其是一种线粒体定位近红外荧光染料THX-Np及其制备方法与应用。
背景技术
以有机荧光团为基础的分子荧光探针具有灵敏度高、操作简便、重现性好、膜透性好、原位检测等众多优点，所以有机小分子荧光探针在标记生物分子或微粒的生物工程与医疗检测领域具有重要应用。相较于可见光区域的荧光探针，近红外荧光探针具有较强的组织穿透性，背景干扰也大大降低，因而能增加荧光技术的灵敏度。荧光染料的特性将直接影响到检测结果的准确性、灵敏度，因而开发适用于荧光标识的新型近红外荧光染料将对化学和生物分析检测具有重要的意义。
目前公开的近红外荧光染料包括Si-派洛宁和Changsha染料等。这类染料的合成相对简单且具有较高的量子效率，在生物成像方面有很大的潜能。但这一类染料的斯托克斯位移较小(<50nm)，抗干扰能力小。本发明的线粒体定位近红外荧光染料THX-Np相较于CS-OH(一种Changsha染料，J.Am.Chem.Soc.2012,134(2),pp1200-1211)和TP-NIR-OH(Biosens.Bioelectron.2017,91,pp699-705.)，有以下显著特征：染料在水相中具有稳定的pH荧光开启效应，当将这种染料作为光学信号报告基团用于环境样品检测和生物标记时，可获得稳定的荧光光学检测信号。另外，这种染料的斯托克斯位移大(107nm)，具有良好的线粒体定位性能且结构易修饰，可用于小分子识别的荧光探针、细胞生物成像等领域。
发明内容
本发明的目的在于针对上述技术现状和存在的问题，提供一种线粒体定位近红外荧光染料THX-Np。该荧光染料在较宽的pH范围内具有稳定的紫外吸收和荧光发射光谱信号，有望作为荧光探针材料的光学信号报告基团广泛应用于生物学检测等领域。
本发明还提供了上述荧光染料的制备方法，合成方法简单。
本发明还提供了基于上述荧光染料的荧光探针的制备方法与应用，可用作硫化氢荧光探针的制备方法与应用。探针本身无荧光，与硫化氢作用后，显示出近红外荧光。
本发明还提供了上述荧光染料与探针在水体系、有机溶剂体系或生物体中的应用。
本发明的技术方案如下：
所述的线粒体定位近红外荧光染料THX-Np，其特征在于具有如式(I)所示化学结构的化合物：
所述的线粒体定位近红外荧光染料THX-Np，其制备方法是，采用2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸与环己酮为原料，经缩合反应得到化合物1，再与6-羟基-2-萘甲醛进行缩合反应得到如式(I)的化合物，其制备反应步骤如下：
所述的线粒体定位近红外荧光染料THX-Np的制备步骤如下：
(1)在环己酮的浓硫酸溶液中，加入2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸，于一定温度下搅拌反应，跟踪反应到终点，将反应液倒入冰水中，滴入70wt％高氯酸，收集析出的固体并干燥，得到化合物1；
(2)将化合物1与6-羟基-2-萘甲醛溶于冰乙酸，于一定温度下搅拌反应，跟踪反应到终点，分离提纯得到式(I)所示化合物。
所述步骤(1)中，2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸与环己酮的摩尔比为1:1-3；
所述步骤(1)中，2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸与环己酮总质量与浓硫酸的质量比为1:5-10；
所述步骤(1)中，反应温度为20-110℃；
所述步骤(2)中，化合物1与6-羟基-2-萘甲醛摩尔比为1:0.8-1.2；
所述步骤(2)中，每毫摩尔化合物1所用冰乙酸的体积为2-20ml；
所述步骤(2)中，反应温度为20-120℃；
所述步骤(2)中，分离提纯的方法为：反应完成后，旋转蒸馏除去溶剂，固体用二氯甲烷与甲醇的混合溶剂柱层析分离，得到式(I)所示化合物。
与已报道的近红外荧光染料相比，本发明的线粒体定位近红外荧光染料THX-Np在水相中具有稳定的pH荧光开启效应，在碱性、中性和酸性的水样介质中以开环的共轭形式存在，在pH 4.0-10.0的水溶液中557nm处有显著的吸收峰，664nm处有明显的发射峰。
基于上述线粒体定位近红外荧光染料THX-Np，制备其2,4二硝基苯醚衍生物作为小分子荧光探针，用作硫化氢荧光探针，可用于硫化氢的检测。
所述的荧光探针，是染料THX-Np的2,4-二硝基苯基醚化衍生物，其化学结构如式(II)所示：
所述的荧光探针，由荧光染料THX-Np与2,4-二硝基氟苯在缚酸剂存在下，经缩合反应得到，制备反应步骤如下：
所述的荧光探针的制备步骤如下：
将染料THX-Np溶于二氯甲烷，加入2,4-二硝基氟苯及缚酸剂，于一定温度下搅拌反应，跟踪反应到终点，分离提纯得到式(II)所示化合物。
所述的制备步骤中，染料THX-Np与2,4-二硝基氟苯的摩尔比为1:1-5；
所述的制备步骤中，所用的缚酸剂为碳酸钾、碳酸钠、醋酸钠、三乙胺，染料THX-Np与缚酸剂的摩尔比为1:1-5；
所述的制备步骤中，二氯甲烷的用量为10-50ml/毫摩尔染料THX-Np；
所述的制备步骤中，反应温度为0-90℃；
所述的制备步骤中，分离提纯的方法为：反应完成后，旋转蒸馏除去溶剂，残余固体用二氯甲烷与甲醇的混合溶剂柱层析分离，得到式(II)所示化合物。
上述线粒体定位近红外荧光染料THX-Np及基于该染料的探针应用于水体系、有机体系或生物体系中。以一个波段荧光从无到有且逐渐增强的方式检测硫化氢。探针本身在664nm处基本无荧光，与硫化氢作用后，溶液在664nm处出现荧光信号，且逐渐增强。探针与细胞孵育后，用635nm的波长激发，在650-750nm波长范围内实现线粒体定位的荧光成像应用。
本发明的优点和有益效果如下：
1、本发明的线粒体定位近红外荧光染料THX-Np具有对pH稳定、斯托克斯位移较大、光稳定性好、良好的细胞膜通透性及优良的线粒体定位性能。
2、本发明线粒体定位近红外荧光染料THX-Np的羟基和螺环内酯的羧基易被修饰成生物相关的示踪物。
3、本发明线粒体定位近红外荧光染料THX-Np的羟基被2,4-二硝基苯基醚化后得到的探针对硫化氢的选择性识别性能显著。
4、本发明线粒体定位近红外荧光染料THX-Np及其2,4-二硝基苯基醚化衍生物的制备方法简单。
附图说明
图1为本发明实施例4中pH＝7.4时，染料THX-Np的紫外与荧光图谱。
图2为本发明实施例5中pH＝7.4时，激发波长为557nm，发射波长为664nm处的荧光强度，不同浓度硫氢化钠条件下硫化氢荧光探针的荧光光谱，从下往上硫氢化钠浓度依次增加。
图3是本发明实施例6中染料THX-Np和罗丹明123与HeLa细胞共同孵育30min后，分别用488nm激发和560nm激发，获得500-600nm的绿场图和580-680nm的红场图，其中：a为罗丹明123对活细胞HeLa染色30min的绿场荧光显微照片；b是染料对活细胞HeLa染色30min的红场显微照片；c为活细胞HeLa染色30min的白场显微照片；d为染料和罗丹明123共定位染色绿场、红场和白场叠加显微照片。
图4是本发明实施例7中小分子硫化氢探针与HeLa细胞共同孵育30min后，用635nm激发得到的荧光显微镜成像图，其中：a为探针对活细胞HeLa染色30min的白场显微照片；b是探针对活细胞HeLa染色30min的荧光显微照片。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进一步详细说明，但不限于此。实施例中所用原料，如无特殊说明均为常规市购产品。
实施例1
化合物1的制备
将2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸(5.0g，16mmol)0℃下加入到35mL含有3.3mL(31.8mmol)环己酮的98wt％浓硫酸中，90℃搅拌反应，TLC跟踪反应到终点，约1.5h，反应液冷却至室温后倒入150mL冰水中，滴入3.5mL70wt％高氯酸，过滤并用100mL冰水洗涤，固体经干燥后得到化合物1。
合成路线如下：
实施例2
荧光染料THX-Np的制备
将实施例1中制备的化合物1(3.76g，10mmol)与6-羟基-2-萘甲醛(1.72g，10mmol)溶于50ml冰乙酸，于95℃搅拌反应，TLC跟踪反应至终点，约1h，旋转蒸馏除去冰乙酸，固体用二氯甲烷/甲醇(v/v 20:1)柱层析分离纯化得到目标产物为蓝色固体(1.34g，产率：25％)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.84(s,1H),7.96(d,J＝7.6Hz,1H),7.86(s,1H),7.80(dd,J＝7.8,6.0Hz,2H),7.69(dd,J＝14.5,7.7Hz,2H),7.50(d,J＝9.0Hz,2H),7.34(d,J＝7.7Hz,1H),7.16-7.06(m,2H),6.58(s,1H),6.44(dd,J＝23.8,8.8Hz,2H),3.41-3.35(m,4H),2.87(d,J＝15.5Hz,1H),2.70(s,1H),1.91(s,1H),1.59(d,J＝12.9Hz,2H),1.23(s,1H),1.10(t,J＝6.9Hz,6H).13C NMR(125MHz,DMSO)δ169.44,156.32,135.68,134.14,131.28,130.50,130.40,130.26,129.55,128.92,128.72,128.27,127.99,127.29,126.38,125.24,124.24,119.48,109.08,97.28,44.22,31.75,29.47,29.15,27.29,23.20,22.49,14.40,12.88.MS(ESI):m/z：[M]+实测值530.2329，理论值530.2326。
合成路线如下：
实施例3
硫化氢探针的制备
将实施例1制备的近红外荧光染料(1.06g，2.0mmol)、2,4-二硝基氟苯(1.12g，6.0mmol)、无水碳酸钾(0.83g，6mmol)溶于60mL二氯甲烷，于室温搅拌反应，TLC跟踪反应到终点，约2h，溶液颜色由黑蓝色变为棕褐色，旋转蒸发除去二氯甲烷，固体用二氯甲烷/甲醇(v/v 20:1)柱层析分离纯化得到目标产物为褐色固体(0.53g，产率：37％)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.95(d,J＝2.8Hz,1H),8.45(dd,J＝9.3,2.8Hz,1H),8.14(d,J＝9.0Hz,1H),8.08(s,1H),7.99-7.92(m,2H),7.85-7.76(m,2H),7.69(dd,J＝7.9,5.2Hz,2H),7.57(s,1H),7.47(dd,J＝8.9,2.4Hz,1H),7.35(d,J＝7.7Hz,1H),7.29(d,J＝9.3Hz,1H),6.57(d,J＝2.1Hz,1H),6.44(dt,J＝19.1,5.6Hz,2H),3.38(d,J＝6.7Hz,4H),2.88(d,J＝14.2Hz,1H),2.73(d,J＝15.6Hz,1H),1.91(d,J＝11.9Hz,1H),1.61(t,J＝14.3Hz,3H),1.11(t,J＝6.9Hz,6H).13C NMR(125MHz,DMSO)δ169.51,155.34,152.15,149.52,146.65,142.08,140.04,135.79,134.82,133.15,131.65,131.41,131.23,130.38,130.11,129.26,128.71,127.91,127.14,125.12,124.06,122.38,120.64,120.30,117.08,109.44,108.68,104.60,97.31,44.17,27.24,23.11,22.42,12.87.MS(ESI):m/z：[M]+实测值696.2333，理论值696.2340。
合成路线如下：
实施例4
染料THX-Np光谱测试
在PBS缓冲液中加入初始浓度为1mM的线粒体定位近红外荧光染料，使得溶液中染料的浓度为10μM。用紫外-可见分光光度计测得染料的最大吸收波长为557nm，荧光光谱仪测得染料的最大发射波长为664nm，结果如图1所示。
实施例5
探针与硫化氢的滴定实验
在PBS缓冲液中，加入初始浓度为1mM的探针，使得溶液中探针的浓度为10μM。然后，依次加入初始浓度分别为0.1mM、0.2mM、0.4mM、0.8mM、1mM、1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM、5.0mM、10.0mM的硫氢化钠溶液，使得溶液中硫氢化钠的浓度分别为1μM、2μM、4μM、8μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、50μM、100μM，以不加硫氢化钠作为对照。用荧光光谱仪测试不同硫氢化钠条件下的荧光光谱，激发波长为557nm，发射波长为664nm，检测波长为664nm，结果如图2所示。由图2可知，随着硫氢化钠浓度的增加，664nm波长下的荧光强度逐渐增强。说明探针能对硫氢化钠进行响应。
实施例6
染料THX-Np的线粒体定位实验
在HeLa细胞玻底培养皿中，加入10μL浓度为1mM的染料与10μL浓度为0.1mM的线粒体定位剂罗丹明123，在5％CO2的细胞培养箱中于37℃孵育30min，用PBS缓冲溶液漂洗三次，采用激光共聚荧光显微镜(Leica TCS-SP5II)观察细胞形态，选取代表性区域，用物镜(63×)观察，重复三次，分别用488nm激发和560nm激发，获得500-600nm的绿场图和580-680nm红场图，结果如图3所示，其中：a为罗丹明123对活细胞HeLa染色30min的绿场荧光显微照片；b是染料对活细胞HeLa染色30min的红场显微照片；c为活细胞HeLa染色30min的白场显微照片；d为染料和罗丹明123共定位染色绿场、红场和白场叠加显微照片。
实施例7
硫化氢探针细胞成像实验
在HeLa细胞96孔培养板中，加入1μL浓度为1mM的探针，在5％CO2的细胞培养箱中于37℃孵育30min，PBS缓冲溶液漂洗三次，采用高内涵分析成像系统(PerkinElmer，Harmony 4.6)选取代表性区域，635nm激发，用物镜(40×)观察，重复三次，结果如图4所示，其中：a为探针对活细胞HeLa染色30min的白场显微照片；b是探针对活细胞HeLa染色30min的荧光显微照片。

Claims (10)

1.一种线粒体定位近红外荧光染料THX-Np，其特征是具有如式(I)所示化学结构的化合物：
2.一种权利要求1所述的线粒体定位近红外荧光染料THX-Np的制备方法，其特征是采用2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸与环己酮为原料，经缩合反应得到化合物1，再与6-羟基-2-萘甲醛进行缩合反应得到如式(I)的化合物，反应步骤为：
3.一种权利要求1或2所述的近红外荧光染料THX-Np的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：
(1)在环己酮的浓硫酸溶液中，加入2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸，于一定温度下搅拌反应，跟踪反应到终点，将反应液倒入冰水中，滴入70wt％高氯酸，收集析出的固体并干燥，得到化合物1；
(2)将化合物1与6-羟基-2-萘甲醛溶于冰乙酸，于一定温度下搅拌反应，跟踪反应到终点，分离提纯得到式(I)所示化合物。
4.根据权利要求2或3所述的荧光染料THX-Np的制备方法，其特征在于：
所述步骤(1)中，2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸与环己酮的摩尔比为1:1-3；
所述步骤(1)中，2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸与环己酮总质量与浓硫酸的质量比为1:5-10；
所述步骤(1)中，反应温度为20-110℃；
所述步骤(2)中，化合物1与6-羟基-2-萘甲醛摩尔比为1:0.8-1.2；
所述步骤(2)中，每毫摩尔化合物1所用冰乙酸的体积为2-20ml；
所述步骤(2)中，反应温度为20-120℃；
所述步骤(2)中，分离提纯的方法为：反应完成后，旋转蒸馏除去溶剂，固体用二氯甲烷与甲醇的混合溶剂柱层析分离，得到式(I)所示化合物。
5.一种权利要求1所述的线粒体定位近红外荧光染料THX-Np的应用，其特征在于，所述线粒体定位近红外荧光染料及基于该染料的探针应用于水体系、有机体系或生物体系中。
6.一种权利要求1所述的线粒体定位近红外荧光染料THX-Np用于制备荧光探针，其特征在于其具有如式(II)的化学结构：
7.一种权利要求6所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，由荧光染料THX-Np与2,4-二硝基氟苯在缚酸剂存在下，经缩合反应得到，制备反应步骤如下：
8.一种权利要求6或7所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：
将染料THX-Np溶于二氯甲烷，加入2,4-二硝基氟苯及缚酸剂，于一定温度下搅拌反应，跟踪反应到终点，分离提纯得到式(II)所示化合物。
9.根据权利要求8所述的荧光探针的制备方法，其特征在于：
所述步骤中，染料THX-Np与2,4-二硝基氟苯的摩尔比为1:1-5；
所述步骤中，所用的缚酸剂为碳酸钾、碳酸钠、醋酸钠、三乙胺，染料THX-Np与缚酸剂的摩尔比为1:1-5；
所述步骤中，二氯甲烷的用量为10-50ml/毫摩尔染料THX-Np；
所述步骤中，反应温度为0-90℃；
所述步骤中，分离提纯的方法为：反应完成后，旋转蒸馏除去溶剂，残余固体用二氯甲烷与甲醇的混合溶剂柱层析分离，得到式(II)所示化合物。
10.根据权利要求5或6所述的线粒体定位近红外荧光染料THX-Np的应用，其特征在于，用作硫化氢荧光探针；以一个波段荧光从无到有且逐渐增强的方式检测硫化氢，探针本身在664nm处基本无荧光，与硫化氢作用后，溶液在664nm处出现荧光信号，且逐渐增强；探针与细胞孵育后，用635nm的激发波长，在650-750nm波长范围内实现线粒体定位的荧光成像应用。
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