CN108929255A - 一种提取分离万寿菊中叶黄素的方法 - Google Patents

一种提取分离万寿菊中叶黄素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种提取分离万寿菊中叶黄素的方法，首先用酶水解万寿菊花粉末，得到酶解液，之后将酶解液进行盐析萃取，最后静置或离心分相，得到上相有机溶剂相和下相无机盐水相，蒸发上相溶剂得到叶黄素。本发明涉及一种提取分离万寿菊中叶黄素的方法。与传统提取分离方法相比，本发明利用酶‑盐析萃取以及酶‑微波辅助盐析萃取的优势，实现对万寿菊鲜花中叶黄素的直接提取，省去了万寿菊鲜花先发酵、再造粒的预处理加工过程，同时盐析萃取具有分相的功能，实现了对叶黄素的提取与初分离，对目标产物进行了初步纯化，酶与微波的作用有效地提高了有效成分的萃取得率、简化了生产工艺、缩短了生产周期。

Description

一种提取分离万寿菊中叶黄素的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种提取分离万寿菊中叶黄素的方法。
背景技术
天然产物有效成分一般是指具有生物活性，可被用于医药、食品、化妆品等领域的物质，一般以植物为主，有效成分主要包括酚类、黄酮类、生物碱类、多糖、果胶、蛋白质、色素及挥发油类等。天然产物有效成分的提取方法主要是溶剂萃取法，一般萃取时间较长，提取温度较高，不适宜用于热敏性物质的提取。由于天然产物中有效成分复杂，且含量较低，需选择不同的溶剂，经多次长时间的萃取来提高提取得率。在此过程中存在操作步骤繁琐、耗时长、能耗高、收率低等问题。随着天然产物功能性成分市场需求旺盛，产业发展迅猛的趋势，实现天然产物活性物质低成本、高效率的提取技术具有重要的现实意义。
万寿菊花中含有叶黄素、多酚、多糖及果胶等有效成分，其中最受关注的生理活性物质是叶黄素，因此，万寿菊也是提取叶黄素的主要原料。现有的提取方法，需要对万寿菊鲜花先进行发酵，发酵时间一般为2周左右，之后干燥、制成颗粒，再用有机溶剂萃取叶黄素。万寿菊鲜花采摘后先进行发酵，发酵过程一般是加入发酵剂后在自然条件下进行，存在发酵时间较长、过程难控制、叶黄素损失严重、产生对环境有害的污染性废水等问题。发酵之后的鲜花需经过高温烘干、粉粹、制粒等，干燥过程中过高的温度会降低叶黄素的品质。也有学者(中国专利：CN 107475343A)采用酶解结合超临界CO2萃取万寿菊中叶黄素，但酶解步骤也是在鲜花发酵后制成的万寿菊颗粒中加入有机溶剂和纤维素酶；邵会等(中国专利：CN 107629481A)通过采用乳酸菌优化万寿菊鲜花发酵过程，回收压榨废水中万寿菊及叶黄素来提高万寿菊加工过程中的叶黄素含量。可见现有万寿菊叶黄素提取技术普遍采用万寿菊发酵后制成的颗粒作为原料再进行溶剂萃取，存在生产周期较长、操作繁琐、得率低、能耗高、发酵废水对环境污染严重等突出问题。
发明内容
为解决现有技术万寿菊叶黄素提取过程中鲜花发酵时间长、发酵产生有机废水污染环境、发酵及颗粒制作过程中叶黄素损失较多、叶黄素提取效率低、溶剂用量大、成本高等问题，本发明提出一种提取分离万寿菊中叶黄素的方法，采用酶对万寿菊鲜花直接酶解，再与微波辅助盐析萃取技术相耦合提取叶黄素的新方法。
本发明提供一种提取分离万寿菊中叶黄素的方法，首先用酶水解万寿菊花粉末，得到酶解液，之后将酶解液进行盐析萃取，最后静置、离心以分相，得到上相有机溶剂相和下相无机盐水相，多糖和果胶在下相，多酚和叶黄素在上相，蒸发上相溶剂得到叶黄素；
其中，所述酶为纤维素酶、果胶酶、胰蛋白酶、漆酶、淀粉酶中的一种或几种；
所述盐析萃取是在酶解液中加入无机盐和有机溶剂；
作为优选，所述无机盐为氯化钠、硫酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐中的一种或几种组合；
作为优选，所述有机溶剂为乙醇、异丙醇、丙酮、正己烷、石油醚、乙酸乙酯、叔丁醇等中的一种或几种组合。
成相和无机盐和有机溶剂的种类有关，当选择上述无机盐和有机溶剂时，能够将酶解液很好的分层成相。
作为优选，还包括将酶解液进行盐析萃取时，进行微波的步骤。
所述万寿菊花粉末是将万寿菊鲜花避光通风阴干后粉碎得到的，其中，粉碎目数为40-200目。
本发明的方法不仅适用于万寿菊花鲜花，还能够适用于天然植物的花、叶、根茎及果实组织等原材料，这是由于植物细胞壁的主要组成部分为纤维素和果胶，因此利用酶解法对原料进行前处理，再结合盐析萃取中盐及微波的作用原理，使得植物细胞内的有效活性成分更好的释放在溶液中，通过多相盐析萃取技术对有效成分进行提取与初分离。
作为优选，包括以下步骤：
(1)、在万寿菊花粉末中加入酶和pH为3.5-5.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，进行酶解，得到酶解液；
(2)将步骤(1)得到的酶解液进行盐析萃取，所述盐析萃取是在酶解液中加入无机盐和有机溶剂；然后在25-40℃恒温静置30-120min，在1000～8000rpm下离心分离5～10min以分离上下相，蒸发上相溶剂得到叶黄素。
作为优选，将步骤(1)得到的酶解液结合微波辅助进行盐析萃取。
作为优选，步骤(1)中，所述酶的加入量为万寿菊花粉末质量百分比为0.50％-3.00％；
作为优选，所述酶解的条件为：酶解温度为30-65℃，酶解时间为30-180min。
作为优选，步骤(2)中，所述将步骤(1)得到的酶解液结合微波辅助进行盐析萃取具体为下述几种中的一种：
A、在步骤(1)得到的酶解液中加入无机盐后，进行微波，然后加入有机溶剂进行盐析萃取；
B、在步骤(1)得到的酶解液中加入有机溶剂后，进行微波，然后加入无机盐进行盐析萃取；
C、在步骤(1)得到的酶解液中加入无机盐和有机溶剂后，进行微波。
作为优选，步骤(2)中，所述微波反应的条件为：在微波功率为90-540W的条件下进行微波反应30-150s。
作为优选，步骤(2)中，当有机溶剂为一种时，无机盐的用量质量百分比范围为17％-22％，有机溶剂的用量质量百分比范围为26％-36％；当有机溶剂为两种时，无机盐的用量质量百分比范围为12％-16％，有机溶剂的用量质量百分比范围为28％-44％。
作为优选，步骤(2)中，当有机溶剂为一种时，无机盐的用量质量百分比范围为14％-22％，有机溶剂的用量质量百分比范围为24％-32％；当有机溶剂为两种时，无机盐的用量质量百分比范围为10％-14％，有机溶剂的用量质量百分比范围为26％-42％。
料液比的范围为1:30-1:50g/mL，所述料液比为万寿菊花粉末质量与整个体系的总体积比。
无机盐用量和有机溶剂用量是相对于整个体系而言的，即万寿菊花、酶、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液、无机盐、蒸馏水和有机溶剂构成的整个体系。
作为优选，包括以下步骤：
(1)、在万寿菊花粉末中加入占万寿菊花粉末质量百分比1.5％的果胶酶和pH为5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，进行酶解，酶解的条件为：酶解温度为45℃，酶解时间为150min，得到酶解液；
(2)在步骤(1)得到的酶解液中加入无机盐和有机溶剂，所述有机溶剂为无水乙醇或无水乙醇和异己烷的混合物，混合均匀后，进行微波反应，所述微波反应的条件为：在微波功率为270W或360W的条件下进行微波反应120s，然后在25-40℃恒温静置30-120min，最后在1000～8000rpm下离心分离5～10min以分离上下相，蒸发上相溶剂得到叶黄素。
在上述条件下，提取得到的叶黄素含量最高。
本发明涉及一种提取分离万寿菊中叶黄素的方法。与传统提取分离方法相比，本发明利用酶-盐析萃取以及酶-微波辅助盐析萃取的优势，实现对万寿菊鲜花中叶黄素的直接提取，省去了万寿菊鲜花先发酵、再造粒的预处理加工过程，从而解决了现有技术万寿菊叶黄素提取过程中鲜花发酵时间长、发酵产生有机废水污染环境、发酵及颗粒制作过程中叶黄素损失较多、叶黄素提取效率低、溶剂用量大、成本高等问题。同时盐析萃取具有分相的功能，实现了对叶黄素的提取与初分离，对目标产物进行了初步纯化，酶与微波的作用有效地提高了有效成分的萃取得率、简化了生产工艺、缩短了生产周期。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明实施例3中提取方法的生产工艺流程图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
实施例1 纤维素酶辅助盐析萃取万寿菊中叶黄素
步骤1将万寿菊鲜花避光通风阴干，粉碎过120目筛，得到万寿菊花粉末；
步骤2称取万寿菊花粉末0.22g，加入1.50％的纤维素酶(万寿菊花粉末质量百分比)和pH 4.00的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液4.00g，混合均匀，在40℃水浴锅中酶解120min，得到酶解液；
步骤3将1.90g硫酸铵盐和1.10g的水加入步骤2得到的酶解液中，混匀10min，使盐充分溶解，再加入3.00g的无水乙醇，混合10min后，形成两相盐析体系，室温(20～35℃)条件下静置60min，叶黄素富集在上相有机溶剂相，8000rpm下离心2min，旋蒸上相溶剂得到叶黄素。经上述处理后，检测本实施例提取纯化后叶黄素含量为4.27mg/g。
实施例2 纤维素酶与果胶酶的复合酶辅助盐析萃取万寿菊中叶黄素
步骤1将万寿菊鲜花避光通风阴干，粉碎过120目筛，得到万寿菊花粉末；
步骤2称取万寿菊花粉末0.22g，加入占万寿菊花粉末质量百分比1.50％的复合酶(复合酶为纤维素酶和果胶酶，纤维素酶与果胶酶的重量比为1:3)和pH 4.00的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液4.00g，混合均匀，在40℃水浴锅中酶解120min，得到酶解液；
步骤3将1.90g硫酸铵盐和1.10g的水加入步骤2得到的酶解液中，混匀10min，使盐充分溶解，再加入3.00g的无水乙醇，混合10min后，形成两相盐析体系，室温(20～35℃)条件下静置60min，叶黄素富集在上相有机溶剂相，8000rpm下离心2min，旋蒸上相溶剂得到叶黄素。经上述处理后，检测本实施例提取纯化后叶黄素含量为4.57mg/g。
实施例3 果胶酶辅助盐析萃取万寿菊中叶黄素
步骤1将万寿菊鲜花避光通风阴干，粉碎过120目筛，得到万寿菊花粉末；
步骤2称取万寿菊花粉末0.22g，加入占万寿菊花粉末质量百分比1.50％的果胶酶和pH 4.00的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液4.00g，混合均匀，在40℃水浴锅中酶解120min，得到酶解液；
步骤3将1.90g硫酸铵盐和1.10g的水加入步骤2得到的酶解液中，混匀10min，使盐充分溶解，再加入3.00g的无水乙醇，混合10min后，形成两相盐析体系，室温(20～35℃)条件下静置60min，叶黄素富集在上相有机溶剂相，8000rpm下离心2min，旋蒸上相溶剂得到叶黄素。经上述处理后，检测本实施例提取纯化后叶黄素含量为4.85mg/g。
由实施例1-3可以看出，当分别采用纤维素酶、果胶酶以及纤维素酶和果胶酶的复合酶进行酶解时，采用果胶酶最终得到的叶黄素含量最高。
实施例4 果胶酶辅助多相盐析萃取万寿菊中叶黄素
步骤1将万寿菊鲜花避光通风阴干，粉碎过160目筛，得到万寿菊花粉末；
步骤2称取160目的万寿菊粉末0.44g，加入占万寿菊花粉末质量百分比2.50％的果胶酶，pH 4.50的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液6.00g，混合均匀，于35℃条件下酶解150min；
步骤3将2.80g的硫酸铵盐和3.60g的水加入酶解液中，混合10min，使盐充分溶解，再加入5.20g的无水乙醇和2.40g正己烷，混合10min后，形成三相盐析体系，室温(20～35℃)条件下静置45min后，上相为正己烷相，中间相为乙醇相，下相为盐水相，旋蒸上相溶剂得到叶黄素。经上述处理后，检测本实施例提取纯化后叶黄素含量为16.20mg/g。
由实施例1-4可以看出，当采用果胶酶辅助多相盐析的方法萃取万寿菊中叶黄素时，相对于酶辅助两相盐析的方法，叶黄素含量有了大幅度提高。
实施例5 果胶酶辅助多相盐析萃取万寿菊中叶黄素
本实施例中，无机盐为1.40g氯化钠和1.40g柠檬酸钠，有机溶剂为5.20g石油醚和2.40g丙酮，其余均按照实施例4的条件和步骤进行提取，室温(20～35℃)条件下静置45min后，上相为石油醚相，中间相为丙酮相，下相为盐水相，旋蒸上相溶剂得到叶黄素。经上述处理后，检测本实施例提取纯化后叶黄素含量为13.21mg/g。
实施例6 酶-微波辅助两相盐析萃取万寿菊中叶黄素
酶-微波辅助两相盐析萃取万寿菊中叶黄素各参数的选择优化过程如下：
1考察酶量对多酚得率和回收率的影响
将万寿菊鲜花避光通风阴干，粉碎过160目筛，得到万寿菊花粉末；称取160目的万寿菊花粉末0.22g，分别加入不同重量的纤维素酶(纤维素酶的加入量分别占万寿菊花粉末质量百分比的1.00％，1.50％，2.00％，2.50％，3.00％)和pH 4.50的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液4.00g于5组10ml具塞试管中，每组3个平行样，于旋涡混旋器上混合均匀，然后放入50℃水浴锅酶解90min，得到酶解液；
之后再分别向每组酶解液中加入2.00g的硫酸铵盐和1.20g的蒸馏水，混合10min使盐充分溶解。然后再向各组中加入2.80g的无水乙醇，混合10min后放入微电脑微波化学反应器中，在功率为360W的条件下微波反应60s，微波反应起始温度是28℃，记录的反应结束的温度为50℃。将微波后的反应液混合均匀后放入40℃的水浴锅中提取30min。最后取出反应液离心，离心是在8000rpm下离心分离5min，分别取出上下相，进行含量测定。
结果为：当纤维素酶的用量分别为1.00％，1.50％，2.00％，2.50％，3.00％时，多酚得率分别为78.99,82.39,82.39,82.42,82.42mg/g，叶黄素含量分别为6.95,7.26,7.27,7.27,7.27mg/g。可以看出，当纤维素酶的用量为1.50％时，多酚得率和叶黄素含量已接近最高，故为节省原料，选择纤维素酶的用量为1.5％。
2固定酶量为1.50％，考察酶种类对多酚得率和回收率的影响
将万寿菊鲜花避光通风阴干，粉碎过160目筛，得到万寿菊花粉末；称取160目的万寿菊花粉末0.22g，分别加入占万寿菊花粉末质量百分比1.50％的不同种类的酶(不同种类的酶为：纤维素酶，果胶酶，纤维素酶与果胶酶质量比例分别为1：1，1：2，2：1的复合酶)和pH4.50的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液4.00g于5组10ml具塞试管中，每组3个平行样，于旋涡混旋器上混合均匀，然后放入50℃水浴锅酶解90min，得到酶解液；
之后再分别向每组酶解液中加入2.00g的硫酸铵盐和1.20g的蒸馏水，混合10min使盐充分溶解。然后再向各组中加入2.80g的无水乙醇，混合10min后放入微电脑微波化学反应器中，在功率为360W的条件下微波反应60s，微波反应起始温度是28℃，记录的反应结束的温度为50℃。将微波后的反应液混合均匀后放入40℃的水浴锅中提取30min。最后取出反应液离心，离心是在6000rpm下离心分离6min，分别取出上下相，进行含量测定。
结果为：当采用不同的酶时，即采用纤维素酶，果胶酶，或纤维素酶与果胶酶复合酶(质量比例分别为1：1，1：2，2：1)时，多酚得率分别为79.83,83.21,82.84,82.55,82.88mg/g，叶黄素含量分别为6.76,7.19,6.98,6.83,6.62mg/g。可以看出，当采用果胶酶时，多酚得率和叶黄素含量最高。
3固定酶量和酶种类，考察酶解时间对多酚得率和回收率的影响
将万寿菊鲜花避光通风阴干，粉碎过160目筛，得到万寿菊花粉末；称取160目的万寿菊花粉末0.22g，加入占万寿菊花粉末质量百分比1.5％的果胶酶和pH 4.50的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液4.00g于5组10ml具塞试管中，每组3个平行样，于旋涡混旋器上混合均匀，然后分别放入50℃水浴锅酶解60min，90min，120min，150min，180min，得到酶解液；
之后再分别向每组酶解液中加入2.00g的硫酸铵盐和1.20g的蒸馏水，混合10min使盐充分溶解。然后再向各组中加入2.80g的无水乙醇，混合10min后放入微电脑微波化学反应器中，在功率为360W的条件下微波反应60s，微波反应起始温度是28℃，记录的反应结束的温度为50℃。将微波后的反应液混合均匀后放入40℃的水浴锅中提取30min。最后取出反应液离心，离心是在4000rpm下离心分离8min，分别取出上下相，进行含量测定。
结果为：当采用不同的酶解时间时，即酶解时间分别为60min，90min，120min，150min，180min时，多酚得率分别为79.50,80.04,80.08,83.58,79.83mg/g，叶黄素含量分别为7.01,7.18,7.24,7.27,7.17mg/g。可以看出，当酶解时间为150min时，多酚得率和叶黄素含量最高。
4固定酶量、酶种类和酶解时间，考察酶解温度对多酚得率和回收率的影响
将万寿菊鲜花避光通风阴干，粉碎过160目筛，得到万寿菊花粉末；称取160目的万寿菊花粉末0.22g，加入占万寿菊花粉末质量百分比1.5％的果胶酶和pH 4.50的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液4.00g于5组10ml具塞试管中，每组3个平行样，于旋涡混旋器上混合均匀，然后分别放入35℃，40℃，45℃，50℃，55℃水浴锅酶解150min，得到酶解液；
之后再分别向每组酶解液中加入2.00g的硫酸铵盐和1.20g的蒸馏水，混合10min使盐充分溶解。然后再向各组中加入2.80g的无水乙醇，混合10min后放入微电脑微波化学反应器中，在功率为360W的条件下微波反应60s，微波反应起始温度是28℃，记录的反应结束的温度为50℃。将微波后的反应液混合均匀后放入40℃的水浴锅中提取30min。最后取出反应液离心，离心是在3000rpm下离心分离9min，分别取出上下相，进行含量测定。
结果为：当采用不同的酶解温度时，即酶解温度分别为35℃，40℃，45℃，50℃，55℃时，多酚得率分别为79.79,80.66,83.70,80.66,79.22mg/g，叶黄素含量分别为6.92,7.00,7.27,7.07,6.95mg/g。可以看出，当酶解温度为45℃时，多酚得率和叶黄素含量最高。5固定酶量、酶种类、酶解时间和酶解温度，考察pH对多酚得率和回收率的影响
将万寿菊鲜花避光通风阴干，粉碎过160目筛，得到万寿菊花粉末；称取160目的万寿菊花粉末0.22g，加入占万寿菊花粉末质量百分比1.5％的果胶酶和pH分别为3.50，4.00，4.50，5.00，5.50的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液4.00g于5组10ml具塞试管中，每组3个平行样，于旋涡混旋器上混合均匀，然后分别放入45℃水浴锅酶解150min，得到酶解液；
之后再分别向每组酶解液中加入2.00g的硫酸铵盐和1.20g的蒸馏水，混合10min使盐充分溶解。然后再向各组中加入2.80g的无水乙醇，混合10min后放入微电脑微波化学反应器中，在功率为360W的条件下微波反应60s，微波反应起始温度是28℃，记录的反应结束的温度为50℃。将微波后的反应液混合均匀后放入40℃的水浴锅中提取30min。最后取出反应液离心，离心是在1000rpm下离心分离10min，分别取出上下相，进行含量测定。
结果为：当采用不同的pH时，即pH分别为3.50，4.00，4.50，5.00，5.50时，多酚得率分别为80.62,81.69,83.01,84.20,82.47mg/g，叶黄素含量分别为6.94,7.13,7.18,7.27,7.12mg/g。可以看出，当pH为5.00时，多酚得率和叶黄素含量最高。
6固定酶量、酶种类、酶解时间、酶解温度和柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液pH值，考察微波时间对多酚得率和回收率的影响
将万寿菊鲜花避光通风阴干，粉碎过160目筛，得到万寿菊花粉末；称取160目的万寿菊花粉末0.22g，加入占万寿菊花粉末质量百分比1.5％的果胶酶和pH 5.00的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液4.00g于5组10ml具塞试管中，每组3个平行样，于旋涡混旋器上混合均匀，然后分别放入45℃水浴锅酶解150min，得到酶解液；
之后再分别向每组酶解液中加入2.00g的硫酸铵盐和1.20g的蒸馏水，混合10min使盐充分溶解。然后再向各组中加入2.80g的无水乙醇，混合10min后放入微电脑微波化学反应器中，在功率为360W的条件下分别微波反应30s，60s，90s，120s，150s，微波反应起始温度是28℃，记录的反应结束的温度为50℃。将微波后的反应液混合均匀后放入40℃的水浴锅中提取30min。最后取出反应液离心，离心是在7000rpm下离心分离5min，分别取出上下相，进行含量测定。
结果为：当采用不同的微波时间时，即微波时间分别为30s，60s，90s，120s，150s时，多酚得率分别为78.43,80.70,81.65,84.36,82.06mg/g，叶黄素含量分别为7.14,7.21,7.26,7.34,7.22mg/g。可以看出，当微波时间为120s时，多酚得率和叶黄素含量最高。
7固定酶量、酶种类、酶解时间、酶解温度、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液pH值和微波时间，考察微波功率对多酚得率和回收率的影响
将万寿菊鲜花避光通风阴干，粉碎过160目筛，得到万寿菊花粉末；称取160目的万寿菊花粉末0.22g，加入占万寿菊花粉末质量百分比1.5％的果胶酶和pH 5.00的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液4.00g于5组10ml具塞试管中，每组3个平行样，于旋涡混旋器上混合均匀，然后分别放入45℃水浴锅酶解150min，得到酶解液；
之后再分别向每组酶解液中加入2.00g的硫酸铵盐和1.20g的蒸馏水，混合10min使盐充分溶解。然后再向各组中加入2.80g的无水乙醇，混合10min后放入微电脑微波化学反应器中，分别在功率为90W，180W，270W，360W，540W的条件下微波反应120s，微波反应起始温度是28℃，记录的反应结束的温度分别为33.5℃，34℃，47.5℃，50℃，52℃。将微波后的反应液混合均匀后放入40℃的水浴锅中提取30min。最后取出反应液离心，离心是在5000rpm下离心分离7min，分别取出上下相，进行含量测定。
结果为：当采用不同的微波功率时，即微波功率分别为90W，180W，270W，360W，540W时，多酚得率分别为80.25,82.10,84.61,81.48,80.49mg/g，叶黄素含量分别为7.15,7.20,7.31,7.23,7.10mg/g。可以看出，当微波功率为270W时，多酚得率和叶黄素含量最高。
即上述7中为酶-微波辅助两相盐析萃取万寿菊中叶黄素的最佳方案。
在本发明中，无机盐的用量为：酶辅助双相时的范围是在17％(w/w)-22％(w/w)，酶微波辅助双相时的范围是在14％(w/w)-22％(w/w)，酶辅助三相时的范围是在12％(w/w)-16％(w/w)，酶微波辅助三相时的范围是在10％(w/w)-14％(w/w)；有机溶剂的用量为：酶辅助双相时的范围是在26％(w/w)-36％(w/w)，酶微波辅助双相时的范围是在24％(w/w)-32％(w/w)，酶辅助三相时的范围是在28％(w/w)-44％(w/w)，酶微波辅助三相时的范围是在26％(w/w)-42％(w/w)。
双相是指盐析萃取时使用一种有机溶剂，三相是指盐析萃取时使用两种有机溶剂。
实施例7 酶-微波辅助双相盐析萃取万寿菊中叶黄素
在本实施例中，硫酸铵盐的质量为1.40g，其余参数和反应步骤均与实施例6的步骤7中相同。多酚得率为70.09mg/g，叶黄素含量分别为5.91mg/g。
实施例8 酶-微波辅助双相盐析萃取万寿菊中叶黄素
在本实施例中，硫酸铵盐的质量为2.20g，其余参数和反应步骤均与实施例6的步骤7中相同。多酚得率为75.14mg/g，叶黄素含量分别为5.44mg/g。
实施例9 酶-微波辅助双相盐析萃取万寿菊中叶黄素
在本实施例中，无水乙醇的质量为2.40g，其余参数和反应步骤均与实施例6的步骤7中相同。多酚得率为69.97mg/g，叶黄素含量分别为2.85mg/g。
实施例10 酶-微波辅助双相盐析萃取万寿菊中叶黄素
在本实施例中，无水乙醇的质量为3.20g，其余参数和反应步骤均与实施例6的步骤7中相同。多酚得率为75.11mg/g，叶黄素含量分别为4.09mg/g。
实施例11 酶-微波辅助双相盐析萃取万寿菊中叶黄素
在本实施例中，万寿菊花粉末的质量为0.33g，其余参数和反应步骤均与实施例6的步骤7中相同。多酚得率为71.75mg/g，叶黄素含量分别为4.79mg/g。
实施例12 酶-微波辅助双相盐析萃取万寿菊中叶黄素
在本实施例中，万寿菊花粉末的质量为0.20g，其余参数和反应步骤均与实施例6的步骤7中相同。多酚得率为80.12mg/g，叶黄素含量分别为7.12mg/g。
实施例13 酶-微波辅助多相盐析萃取万寿菊中叶黄素
将万寿菊鲜花避光通风阴干，粉碎过160目筛，得到万寿菊花粉末；称取160目的万寿菊花粉末0.44g，加入占万寿菊花粉末质量百分比2.5％的果胶酶和pH 4.50的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液6.00g于5组20ml具塞试管中，每组3个平行样，于旋涡混旋器上混合均匀，然后分别放入35℃水浴锅酶解150min，得到酶解液；
之后再分别向每组酶解液中加入2.80g的硫酸铵盐和3.60g的蒸馏水，混合10min使盐充分溶解。然后再向各组中加入5.20g的无水乙醇，混匀后分别加入2.40g正己烷，混合10min后，形成三相盐析体系，上相为正己烷相，中间相为乙醇相，下相为盐水相。放入微电脑微波化学反应器中，在功率为270W的条件下微波反应60s，微波反应起始温度是28℃，反应结束的温度为47.5℃。将微波后的反应液混合均匀后,室温提取30min。最后取出反应液离心，离心是在8000rpm下离心分离5min，分别取出上相和中相，上相为叶黄素，中相为多酚，进行含量测定。多酚得率为87.93mg/g，叶黄素含量为16.45mg/g。
实施例14 酶-微波辅助多相盐析萃取万寿菊中叶黄素
将万寿菊鲜花避光通风阴干，粉碎过160目筛，得到万寿菊花粉末；称取160目的寿菊花粉末0.44g，加入占万寿菊花粉末质量百分比2.5％的果胶酶和pH 4.50的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液6.00g于5组20ml具塞试管中，每组3个平行样，于旋涡混旋器上混合均匀，然后分别放入35℃水浴锅酶解150min，得到酶解液；
之后再分别向每组酶解液中加入1.40g氯化钠、1.40g柠檬酸钠和3.60g的蒸馏水，混合10min使盐充分溶解。然后再向各组中加入2.40g石油醚和5.20g丙酮，混合10min后，形成三相盐析体系，上相为石油醚相，中间相为丙酮相，下相为盐水相。放入微电脑微波化学反应器中，在功率为270W的条件下微波反应60s，微波反应起始温度是28℃，反应结束的温度为47.5℃。将微波后的反应液混合均匀后,室温提取30min。最后取出反应液离心，离心是在8000rpm下离心分离5min，分别取出上相和中相，上相为叶黄素，中相为多酚，进行含量测定。多酚得率为88.03mg/g，叶黄素含量为16.59mg/g。
实施例15 酶-微波辅助多相盐析萃取万寿菊中叶黄素
酶-微波辅助多相盐析萃取万寿菊中叶黄素各参数的选择优化过程如下：
1考察微波时间对多酚得率的影响
将万寿菊鲜花避光通风阴干，粉碎过160目筛，得到万寿菊花粉末；称取160目的万寿菊花粉末0.44g，加入占万寿菊花粉末质量百分比2.5％的果胶酶和pH 4.50的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液6.00g于5组20ml具塞试管中，每组3个平行样，于旋涡混旋器上混合均匀，然后分别放入35℃水浴锅酶解150min，得到酶解液；
之后再分别向每组酶解液中加入2.80g的硫酸铵盐和3.60g的蒸馏水，混合10min使盐充分溶解。然后再向各组中加入5.20g的无水乙醇，混匀后分别加入2.40g正己烷，混合10min后放入微电脑微波化学反应器中，在功率为270W的条件下分别微波反应20s，40s，60s，80s，100s，微波反应起始温度是28℃，记录反应结束的温度为47.5℃。将微波后的反应液混合均匀后,室温提取30min。最后取出反应液离心，分别取出上相和中相，进行含量测定。
结果为：当采用不同的微波时间时，即微波时间分别为20s，40s，60s，80s，100s时，多酚得率分别为73.26,81.51,87.93,85.27,81.36mg/g，叶黄素含量分别为14.75,15.01,16.45,15.90,14.73mg/g。当微波时间为60s时，多酚得率和叶黄素含量最高。
2固定微波时间，考察微波功率对多酚得率的影响
将万寿菊鲜花避光通风阴干，粉碎过160目筛，得到万寿菊花粉末；称取160目的万寿菊花粉末0.44g，加入占万寿菊花粉末质量百分比2.5％的果胶酶和pH 4.50的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液6.00g于5组20ml具塞试管中，每组3个平行样，于旋涡混旋器上混合均匀，然后分别放入35℃水浴锅酶解150min，得到酶解液；
之后再分别向每组酶解液中加入2.80g的硫酸铵盐和3.60g的蒸馏水，混合10min使盐充分溶解。然后再向各组中加入5.20g的无水乙醇，混匀后分别加入2.40g正己烷，混合10min后放入微电脑微波化学反应器中，分别在功率为90W，180W，270W，360W，540W的条件下微波反应60s，微波反应起始温度是28℃，记录反应结束的温度为47.5℃。将微波后的反应液混合均匀后,室温提取30min。最后取出反应液离心，分别取出上相和中相，进行含量测定。
结果为：当采用不同的微波功率时，即微波功率分别为90W，180W，270W，360W，540W时，多酚得率分别为85.86,86.37,87.93,87.03,86.31mg/g，叶黄素含量分别为14.99,15.37,16.45,16.35,15.13mg/g。当微波功率为270W时，多酚得率和叶黄素含量最高。
即上述2中为酶-微波辅助两相盐析萃取万寿菊中叶黄素的最佳方案。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种提取分离万寿菊中叶黄素的方法，其特征在于：首先用酶水解万寿菊花粉末，得到酶解液，之后将酶解液进行盐析萃取，最后静置、离心以分相，得到上相有机溶剂相和下相无机盐水相，蒸发上相溶剂得到叶黄素；
其中，所述酶为纤维素酶、果胶酶、胰蛋白酶、漆酶、淀粉酶中的一种或几种；
所述盐析萃取是在酶解液中加入无机盐和有机溶剂；
作为优选，所述无机盐为氯化钠、硫酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐中的一种或几种组合；
作为优选，所述有机溶剂为乙醇、异丙醇、丙酮、正己烷、石油醚、乙酸乙酯、叔丁醇等中的一种或几种组合。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：还包括将酶解液进行盐析萃取时，进行微波的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)、在万寿菊花粉末中加入酶和pH为3.5-5.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，进行酶解，得到酶解液；
(2)将步骤(1)得到的酶解液进行盐析萃取，所述盐析萃取是在酶解液中加入无机盐和有机溶剂；然后在25-40℃恒温静置30-120min，在1000～8000rpm下离心分离5～10min以分离上下相，蒸发上相溶剂得到叶黄素。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：将步骤(1)得到的酶解液结合微波辅助进行盐析萃取。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述酶的加入量为万寿菊花粉末质量百分比为0.50％-3.00％；
作为优选，所述酶解的条件为：酶解温度为30-65℃，酶解时间为30-180min。
6.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述将步骤(1)得到的酶解液结合微波辅助进行盐析萃取具体为下述几种中的一种：
A、在步骤(1)得到的酶解液中加入无机盐后，进行微波，然后加入有机溶剂进行盐析萃取；
B、在步骤(1)得到的酶解液中加入有机溶剂后，进行微波，然后加入无机盐进行盐析萃取；
C、在步骤(1)得到的酶解液中加入无机盐和有机溶剂后，进行微波。
7.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述微波反应的条件为：在微波功率为90-540W的条件下进行微波反应30-150s。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，当有机溶剂为一种时，无机盐的用量质量百分比范围为17％-22％，有机溶剂的用量质量百分比范围为26％-36％；当有机溶剂为两种时，无机盐的用量质量百分比范围为12％-16％，有机溶剂的用量质量百分比范围为28％-44％。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，当有机溶剂为一种时，无机盐的用量质量百分比范围为14％-22％，有机溶剂的用量质量百分比范围为24％-32％；当有机溶剂为两种时，无机盐的用量质量百分比范围为10％-14％，有机溶剂的用量质量百分比范围为26％-42％。
10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)、在万寿菊花粉末中加入占万寿菊花粉末质量百分比1.5％的果胶酶和pH为5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，进行酶解，酶解的条件为：酶解温度为45℃，酶解时间为150min，得到酶解液；
(2)在步骤(1)得到的酶解液中加入无机盐和有机溶剂，所述有机溶剂为无水乙醇或无水乙醇和异己烷的混合物，混合均匀后，进行微波反应，所述微波反应的条件为：在微波功率为270W或360W的条件下进行微波反应120s，然后在25-40℃恒温静置30-120min，最后在1000～8000rpm下离心分离5～10min以分离上下相，蒸发上相溶剂得到叶黄素。
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