CN1088985A - 抗肿瘤、抗过敏和抗炎化合物 - Google Patents

Abstract

描述了作为抗肿瘤剂、抗过敏剂和抗炎剂有用的 化合物。

Description

本发明是关于新的抗肿瘤、抗过敏和抗炎化合物，它们的制备和含有此类化合物的药用组合物。更准确地说，本发明是关于一种发酵液体培养基及其通过培养真菌Nattrassia  mangiferae而获得的成分。

这里所使用的酰基是指1到6个碳原子的直链或支链酰基，即甲酰（基）或一种（链）烷酰基（alkanoyl）。酰基的例子有甲酰（基）、乙酰（基）、丙酰（基）、丁酰（基）等等。

这里使用的虚线（……）表示在该纸平面下面的化学键，而实线（-）表示在该纸平面上面的化学键。

这里用到的还有：

SINEPT表示经过极化转移增强的选择性不灵敏核;

APT表示附加质子检验;

DEPT表示极化转移的无畸变增强;

HETCOR表示杂环的相关性;和

NOE表示核的奥氏效应。

TMS表示四甲基硅（烷）。

本发明提供了新化合物A、B、C、D、E、F、G、H和化合物A的乙酸酯，它们具有作为抗肿瘤剂，抗过敏剂和抗炎剂的活性。

                  A                 B

A的乙酸酯

另一方面，本发明提供了一种含有有效量的结构式为A、B、C、D、E、F、G、H或A的乙酸酯化合物的药用组合物。

另一方面，本发明提供了治疗肿瘤、过敏症和炎症的方法。

另一方面，本发明提供了一种生物学上纯的真菌Nattassia  mangiferae培养物，这里所说的培养物是指能够生产上述定义的化合物A、B、C、D、G和H，并且产生的量是在含有可吸收氮源和碳源的水性培养基中在有氧的条件下通过发酵而生成的可以回收的量。

另一方面，本发明提供了一种制备新的真菌液体培养基复合物的方法，其中包括培养生产真菌Nattrasia  mangiferae，它是在有氧的条件下在一种营养培养基中进行的，直到将大量活性给予这种培养基。具体地说我们使用了真菌Nattrassia  mangiferae，ATCC74078

生产微生物的性能描述

真菌的底物采集于危地马拉的一个海拔大约300米的干旱地区。真菌本身是从地面上约一米的枯死树叶上分离出的。将真菌作为SCF0642存储在Schering  Central  Culture  Collection有代表性继代培养的标为Nattrassia  mangiferae的真菌已被存储，而且现在已成为American  Type  Culture  Collection，Rockville，Maryland永久存储的样品中的一部分，其登记号为ATCC74078。当对上述机构提出请求时即可得到继代培养的Natrassia  mangiferaeATCC74078。除了已存储的Nattrassia  mangiferace菌株之外，本发明还包括它的突变体和变异体，它们显示出和已存储的菌株有相同或基本上相同的分类和生理学特性，包括可产生化合物A、B、C、D、G和H的特性。

这种真菌是Nattrassia属的典型种的分离菌，特别是N.mangiferae  Sutton  ＆  Dyko，1989（Mycol.Res.93（4）：466-488，1989）。Nattrassia是属于腔孢纲、球壳孢目、球壳菌科，虽然N.mangiferae是这种真菌的通用名称，但是直到最近它还以（同物）异名Hendersonula  toruloidea  Nattrass，1933为人们所知（“Transactions  of  the  British  Mycological  Society”18：189-197）。

如以下所指出的，真菌最通常是在实验室培养中通过在其共变体（synanamorph）Scytalidium  dimidiatum（Penz.）comb.nov.[ident.Torula  dimidiata.]存在下被鉴定的。Sutton  ＆  Dyko（mycol.Res.93（4）：466-488）建立的这种属名和种名的结合来包括通常称为“Scytalidium  state  of  Hendersonula  toruloidea”的分离物，由此，这种真菌已开始被鉴别。

在实验室培养中这种真菌容易发育形成Scytalidium  dimidiatum变体（anamorph）和不育的分生孢子器。在玉米粉琼脂上的菌落慢慢生长，在21℃培养10天后直径高达8mm，变得与亮灰色气生菌丝和背面的Saccardo′s  Olive相粘结用来自R.Ridgway颜色名称，“Color  standards  and  Nomenclature”Washington，D.C.1912）。色素扩散到玉米粉琼脂中。在麦芽提取物琼脂和麦芽酵母琼脂上的生长与在玉米粉琼脂上的生长是相似的，差别仅在于在麦芽基质培养基中没有色素扩散。在37℃时没有生长。

菌丝体轻微地浸入琼脂中，是有隔膜的、分枝的、典型的是1.5-3μm宽，某些隔膜处收缩细胞为透明到橄榄色。Scytalidium  Dimidiatum表现为分节式分生孢子链，它是由能生育菌丝发育形成的，这种能生育菌丝和营养菌丝是没有区别的。分生孢子慢慢离生，一些隔膜有折射性。分节式分生孢子有0-1层隔膜、壁是平滑的，棕色的，在第一个平截柱面上环绕形成桶状或近球形，3-7.5μm宽×5-10μm长。

Scytalidium  dimidiatum不同于大多数其它嗜热的、嗜酸的，或在欧石南型植物上ectomycorrhizal的Scytalidium种。从孢子形态学上可把它和S.lignicola和S.japonicum区分开。

这种真菌是从危地马拉沿着Cuilapa和Chiquimullilla间的公路收集到的底物中分离出来的。这个区域是干旱的，海拔大约300米。这种真菌是从高于地表1米的枯死树叶中分离出的。

Nattrassia  mangiferae  ATCC74078的一种令人惊讶的有利的和可被区分的特性是它可以产生化合物A、B、C、D、G和H。

在B、C  Sutton和B.J.Dyko，Mycol.Res.93（4），466（1989）中公开了这种真菌，在这里作为文献引用。

真菌的发酵

将铂环量的保留在马铃薯葡萄糖琼脂（Difco）中的真菌培养物转移到萌发培养基中，该萌发培养基由grms/l的蛋白胨＃3，5.0;氯化钠5.0;磷酸钾（一价碱）5.0;酵母提取物3.0;结晶葡萄糖20.0;和去皮大豆（soygrils）5.0组成。该培养物以300转/分在24℃下培养6天。将5%培养的接种物转移到同样的萌发培养基中并以类似的条件进行培养。将如此发育形成的接种物转移到由neopeptone，10.0，和结晶葡萄糖40.0（按grms/l计）组成的发酵培养基中。在24℃经过6天的发酵产生出了一种具有蛋白激酶C（PKC）抑制活性的物质。将至少含有6种生物活性成分的SCF0642复合物用乙酸乙酯从发酵培养基中提取出来，接着被吸附在XAD-16（一种非离子树脂）上并且甲醇∶水进行梯度洗脱。通过使用甲醇∶水和乙腈∶水作为洗脱溶剂系统的反相色谱分离，将6种主要组分A、B、C、D、G和H从复合物中分离出来。

产物的分离和纯化

PKC抑制剂通过下面的分离方法1进行分离和纯化。用乙酸乙酯在所得PH下提取培养的液体培养基（40L）。在真空中蒸发EtOAC提取物。残余物被溶解到甲醇中并吸附在少量XAD-16树脂上，以便制备用活性成分浸渗的填料。该填料被装在一个XAD-16柱中并且用0-100%水甲醇液进行梯度洗脱。80-100%的MeOH流分作为粗制活性复合物被合并。该精制物在一个CHP-20P柱上进行色谱分离。然后用水甲醇梯度溶液（0-100%）进行洗脱，初期的PKC-活性洗脱液，根据TLC分析（Rf值：0.38;色谱板：SG60，F254，Merck;溶剂系统：98∶2，CH₂Cl₂/MeOH），60%MeOH流分主要含有化合物A。该流分进一步在CHP-20P上经20-40%水乙腈洗脱的色谱分离纯化而得到纯化合物A（120mg）。后者的PKC-活性洗脱液，70%的MeOH流分，通过TLC分析发现是一种混合物（在和以上相同的条件下三种主要成分的Rf值分别是0.21，0.29，0.31）。混合物用色谱分离法通过在CHP-20P上用15-45%水乙腈洗脱而实现分离。纯化合物B（95mg）和一种活性复合物（64mg）被分离了，剩余的复合物通过半制备（semi-preparative）反相HPLC而进行纯化，其条件为：MC-ODS20×500mm（分离）柱，不规则的15μ粒子;流动相：在20分钟内线性梯度液为60-90%的水甲醇;流速：12毫升/分;检测：UV320nm。两种纯化的成分，化合物C（24mg）和化合物D（17mg）通过该过程被分开并纯化。

在冷冻真空干燥之后所得到的化合物A、B、C和A的乙酸酯（其合成将在下面描述）是白色无定形粉末，化合物D是黄色无定形粉末。

化合物A、B、C、D和A的乙酸酯的理化参数列在表1，2，3中。

分离方法1  培养物SCF-0642的分离流程表

化合物G、H和A的分离

如上所述将60升培养的液体培养基进行发酵。根据粗制EtOAC提取液（物）的TLC分析采用下面所示的分离方法2。整个液体培养基的EtOAC提取物，用2-10%EtOAC的CH₂CL₂液的硅胶快速色谱分离进行纯化。两个活性流分被收集。开始的流分主要含有化合物H。纯化合物H的黄色晶体是通过MeOH-CH₂CL₂（1∶1）结晶而从该流分中获得的。后面的流分是化合物A和化合物G的混合物。混合物的进一步分离是通过半制备反相HPLC完成的（条件为：YMC-ODS20×500柱，在20分钟内60-90%的线性水甲醇梯度，流速为20毫升/分，检测波长UV320nm。两种化合物（A和G）是通过该过程进行分离的。两种化合物都用CH₂CL₂-MeOH（1∶1）进行沉淀而得到无定形的粉末。G和H的理-化参数在表4，5，6中。

分离方法2化合物G、H和A的分离

制备化合物A的几种酰基衍生物。

化合物A的乙酸酯按以下方法制得：化合物A用乙酸酐/吡啶处理而得到的化合物A的乙酸酯。更具体的说，采用了以下的反应过程。

在室温下将吡啶（1滴）加入到由化合物A（30毫克，0.08毫摩尔）和乙酸酐（2滴，过量）的CH₂Cl₂（10ml）溶液中。反应溶液被搅拌8小时，然后加水（20ml）进行骤冷。分离CH₂Cl₂层。水层用CH₂Cl₂（2×15ml）提取。合并的CH₂CL₂溶液用盐水洗涤，用无水Na₂SO₄干燥，并在真空中浓缩。粗制产物通过用2%乙酸乙酯的CH₂Cl₂溶液洗脱进行快速硅胶色谱分离而被纯化，从而得到26.8mg（产率80%）纯的A乙酸酯。

通过类似的方法，可以制备相应的C₁-C₆的酯。用该方法可以制备的化合物的结构式如下：

式中R′是酰基

为了测定其它衍生物的相对的立体化学结构，例如化合物E和F也被合成了。

理化性质

本发明的9种活性化合物的理化性质、光谱和结晶数据被概括在下表1，2，3，4，5，6，7，8，9中。生物活性被总结在表10和11中。这些化合物对（水合）茚三酮和Rydon试验呈负反应，对碘蒸汽呈正反应。这些PKC抑制剂可溶于氯仿、二氯甲烷和二甲基亚砜;部分溶于乙酸乙酯、甲醇和丙酮;不溶于水、石油醚和己烷。

结构测定

化合物的结构测定是通过包括UV，IR，MS（FAB，CI和EIHRMS），¹H和¹³C NMR谱光谱数据的分析以及化合物F的X-射线衍射研究而完成的。化合物A，A的乙酸酯，B，C，D，E，F，G和H所具有的物理和光谱数据显示在表1-9中。这些化合物的每个质子和碳原子的详细测定是通过APT，DEPT，HETCOR和SINEPT实验完成的。所有化合物的相对的立体化学结构是基于对化合物F的X-射线结晶学的研究以及从NOE实验获得的NMR谱数据而建立的。

表3

化合物A、B、C、D和A的乙酸酯的¹³C NMR化学位移的认定^a.b

碳  A  B  C  D  A的乙酸酯

1  197.1s  199.6s  186.0s  183.6s  192.2s

2  54.62d  54.49d  133.7s  133.6s  54.43d

3  57.88d  56.24d  133.9d  133.5d  57.34d

4  93.48s  95.09s  96.81s  96.89s  93.59s

5  185.6s  61.81d  60.20d  60.26d  185.5s

6  127.8s  20.55t  123.6d  21.35t  129.2d

7  140.1d  23.06t  128.3d  23.18t  136.9d

8  61.65d  62.72d  60.34d  61.20d  57.34d

9  65.38s  64.30s  60.59s  61.30s  61.50s

10  66.26s  70.85s  63.51s  64.40s  62.89s

1'  144.9s  144.7s  143.9s  144.3s  144.9s

2'  121.4d  121.4d  122.0d  121.5d  121.4d

3'  127.4d  127.1d  127.2d  127.1d  127.4d

4'  109.2d  109.3d  109.7d  109.4d  109.3d

5'  109.9d  110.1d  110.6d  110.3d  110.1d

6'  127.7d  127.3d  127.3d  127.1d  127.9d

7'  121.5d  121.3d  121.5d  121.2d  121.6d

8'  144.9s  144.9s  145.0s  145.2s  145.0s

9'  111.9s  112.0s  112.4s  112.3s  112.0s

10'  134.2s  133.6s  132.1s  131.9s  134.3s

C=O  --  --  --  --  169.3s

CH₃-- -- -- -- 20.61q

a.在CHCl₃75MHz时记录，相对于TMS的化学位移，其单位为ppm：

b.由DEPT数据确定的峰数，

表4

H和G的物理，化学性质

化合物  H  G

MP℃(分解)  164-166  235-238

分子式 C₂₁H₁₄O₈C₂₀H₁₄O₅

FAB-MS(m/z) 395(M+H)⁺335(M+H)⁺

[α]²²D(CHCl₃) -89.8°(C 0.2) -133.5°(C 0.2)

UV(MeOH)λmax  nm(ε)  225(79,450)  227(46,560)

298(6,740)  299(5,850)

313(5,120)  313(4,420)

327(4,380)  328(3,860)

IR(KBr)υmax cm^-13459,1692(br.) 3424,3357,

1611,1415,  1609,1413,

1383,1274,  1384,1272,

1096,1075,  1110,1029,

1045,819  965,820,

756  756

表5

H和G的¹H NMR化学位移认定^a

化合物  H  G

1 -- 5.46(dd,2.7,10.5)^c

2 3.48(d,4.2)^b3.77(dd,2.7,4.4)

3  3.57(d,4.2)  3.89(d,4.4)

5  --  7.38-7.45(m)

6  6.62(d,4.3)  7.38-7.45(m)

7  6.62(d,4.3)  7.08(dd,2.4,6.9)

2'  7.59(d,8.1)  7.56(d,8.1)

3'  7.48(t,7.8)  7.47(t,7.4)

4'  7.03(d,7.5)  6.94(d,7.2)

5'  7.15(d,7.5)  7.16(d,7.2)

6'  7.52(t,7.8)  7.53(t,7.4)

7'  7.60(d,8.1)  7.57(d,8.1)

OCH₃3.68(s) --

OH 5.10^d(s) 3.51^d(s)

Ar-OH -- 8.41^d(br.s)

a.在CDCl₄中，300MHz时记录，相对于TMS的化学位移，其单位为ppm

b.在圆括号中为峰数和偶合常数（Hz）

c.D₂O交换后的宽单峰

d.可与D₂O交换

表6

H和G的¹³C NMR化学位移认定^a

碳  H  G

1 92.58s^b65.52d

2  52.60d  52.55d

3  53.83d  54.12d

4  94.10s  96.86s

5  185.4s  156.8s

6  135.3d  119.0d

7  137.4d  130.6d

8  193.8s  119.3d

9  63.33s  134.3s

10  63.49s  118.7s

1'  145.2s  147.5s

2'  121.4d  121.1d

3'  127.5d  127.6d

4'  109.3d  109.2d

5'  110.0d  110.0d

6'  127.9d  127.9d

7'  121.5d  121.2d

8'  145.4s  147.6s

9'  112.1s  113.0s

10'  134.4s  132.2s

OCH₃49.73q --

a.在CDCl₃75MHz时记录，相对于TMS的化学位移，其单位为ppm

b.由DEPT数据确定的峰数。

基于这些数据，化合物A，B，C，D，G，H和A的乙酸酯的结构表示如下：

如下所示合成下列另外的化合物：

上面所示反应是如下进行的：

在0℃条件下，将30%的含水过氧化氢（3ml）加入到由化合物A（240ml，0.66mmol），碳酸氢钠（1.4g），水（10ml）、THF（10ml）和甲醇（10ml）组成的混合物中。反应混合物在4℃条件下被搅拌2小时并使其升到室温过夜。TLC分析表明三环氧化物产物E是主要的斑点。加入另外的水（10ml）形成透明的溶液。溶液用乙醚提取三次（3×30ml）。合并的醚溶液用盐水洗涤，用无水Na₂SO₄干燥。在真空中浓缩。残余物用含有10%醚的CH₂Cl₂，进行快速的硅胶色谱分离而纯化得到117mg（产率47%）的纯E，得到了下表7中的纯E的数据。

在室温下将三乙基胺（TEA，1滴）加入到含有E（20mg，0.05mmol）和乙（酸）酐（2滴）的CH₂Cl₂（10ml）的溶液中。反应混合物被搅拌4小时，然后加水（20ml）进行骤冷。分离CH₂Cl₂层。水层用CH₂Cl₂（2×15ml提取。合并的CH₂Cl₂溶液用盐水洗涤，用无水Na₂SO₄干燥并在真空下浓缩。粗制产物用含有2% EtOAC的CH₂Cl₂溶液进行快速硅胶柱色谱分离而纯化，得到17mg（产率80%）的纯F。化合物F从氯仿：己烷（1∶1）溶剂混合物中结晶出来形成单斜晶，得到下表8所示纯F的数据。

表7.

E的物理-化学性质

M.P.  155-157℃

[α]²³D +28.4°(C0.2,CHCl₃)

EI-MS m/z(相对强度) 380(41,M⁺),211(23),171(42),

160(77),144(43),115(98),114

(100),57(77)

UV(MeOH)λmax  nm(ε)  225(48,660),299(6,200)313

(4,620),328(3,920)

IR(KBr)υmax cm^-13434,1726,1611,1414,1381,

1274,1086,1066,818,756

¹HNMR(300MHz,CDCl₃)δ 3.49-3.58(m,2H),3.78(m,2H),

3.86(d,J=4.1Hz,1H),5.28(m,

1H),7.04(d,J=7.2Hz,1H),7.21

(d,J=7.2Hz,1H),7.51(t,J=8.0Hz,

1H),7.56(t,J=8.0Hz,1H),7.62(d,

J=8.0Hz,1H),7.64(d,J=8.0Hz,

1H)

¹³CNMR(75MHz,CDCl₃)δ 197.8,190.7,145.0,145.0,134.4,

127.9,127.6,121.6,121.6,111.9,

110.1,109.3,93.4,69.1,69.1,

60.2,58.6,57.5,54.3,54.3

表8

F的物理-化学性质

M.P.  245-247℃(dec.)

[α]²³D +33.1°(C 0.2,CHCl₃)

SIMS m/z(相对强度) 445(65,M⁺+Na),422(98,M⁺),

358(44),300(51),216(100),190

(70)

SI-HRMS m/e calcd.for C₂₂H₁₄O₉,422.0637

found for C₂₂H₁₄O₉,422.0653

UV(MeOH)λmax  nm(ε)  226(49,800),298(6,600),313

(4,870),327(4,050)

IR(KBr)υmax cm^-13450,1758,1730,1612,1413,

1381,1273,1227,1088,1043,

820

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ 2.26(s,3H),3.45(d,J=4.0Hz,

1H),3.49(d,J=3.8Hz,1H),3.68

(dd,J=2.1,3.8Hz,1H),3.81(d,

J=4.0Hz,1H),6.34(d,J=2.1Hz,

1H),7.05(d,J=7.5Hz,1H),7.20

(d,J=7.5Hz,1H),7.50(t,J=8.0Hz

1H),7.55(t,J=8.0Hz,1H),7.62(d,

br,J=7.5Hz,2H)

¹³CNMR(75MHz,CDCl₃)δ 192.6,190.5,169.3,145.1,145.0,

134.4,128.0,127.5,121.7,121.6,

111.9,110.2,109.2,93.4,67.2,

66.5,60.1,56.9,56.4,54.2,53.9,

20.4

F的X-射线结晶学给出了如下数据：

表9 化合物F的结晶学数据^a

分子式 C₁₄H₂₂O₉

分子量  422.35

结晶系  单斜晶

空间群 C₂(C3₂)-No.5

a(

) 27.552(2)

b(

) 8.623(1)

c(

) 8.447(1)

β(°)  97.91(1)

定向反射的号数,θ(°)范围(No.

of  orientation  refls;θ(°)range)  25;37-40

V(

) 1987.8(7)

Z  4

Dcalcd.(g cm^-3) 1.411

μ(Cu-kα,辐射λ=1.54218 ) 9.1

温度(℃)  23

晶体大小(mm)  0.08×0.18×0.60

扫描类型  ω-2θ

扫描宽度(°)  0.80+0.14tanθ

θmax.(°)  75

强度控制反射(intensity

control  refls);  512,422,422,512;

误差;重复时间(小时)  <1%;2

记录的非等效反射(+h,+k±1)(Total

no.of  non-equiv.refls.(+h,+k±1)  2183

recorded)的总号数

定位反射号数[I>3.0σ(I)](No.of

refls,retained[I>3.0σ(I)]  1945

精确的参数号数(No.of  parameters  refined)  324

衰减校正值 5.0(4)×10^-6

R(Rw)^b0.033(0.046)

拟合优度^b(适合度) 1.37

最大位移:在最终最小二乘循环中的esd  0.02

最终最大△P(e/A³);分种 0.17;-0.13

a.在所有测量中都使用了一种Enraf-Nonius  CAD-4衍射仪（Cu-Kα辐射（线），石墨单色器）。对通常的Lorentz和极化效应的强度数据进行了校正。

晶体结构用直接的方法（MULTAN11/82）解释了。所有非氢原子的近似配价（coordina，tes）都是从一个E-map图中推导出来的。氢原子置于一系列不同傅里叶合成中，其中计算了下面几种系列的全矩阵的位置的最小二乘方细化和碳及氧原子的热力参数（首先是同性的，然后是不同性的）。在下面几个系列的最小二乘方计算中，氢原子的位置和同性热力参数以及一种衰减（extinction）校正是做为变量的。在这些迭代过程中，乙酰基甲基基团中的氢原子没有细化到物理学上可接受的位置。因此这些原子在最后的最小二乘方循环中被结合在被计算过的位置上。最后的不同傅利叶合成不含有异常的特征。

结晶学的计算是使用Enraf-Nonius  Structure  Determination  package（SDP）在PDP11/44和MicroVAX计算机上进行的。在所有结构因素计算中，中性原子散射因素和它们的异常色散校正都取自International  Tables  for  X-Ray  Crystallography，Vol.IV，The  Kynoch  Press  Birmingham  England，1974.

b.R＝∑llFOl-lF_cll/∑l Fol;RW＝l∑W（lFol-lF_cl）²/∑WFol²]^1/2;∑W△[W＝1/σ²（lFol），△＝（lFol-lF_Cl）]

达到最小;拟合优度＝[∑W△²/（Nobservations-Nparameters）]^1/2.基于以上的数据，确定下述结构为F。

（相对立体化学结构）

相对立体化学结构被测定了。由相对立体化学结构可知，化合物F可以有如上所示的立体化学结构或者可以是它的外消旋物，即有如下结构：

化合物F的绝对立体化学结构没有被确定，基于这种结构，化合物A和A的乙酸酯的相对立体化学结构可以确定如下：

基于F和A的相对立体化学结构的相关性，以及对NMR谱数据的分析，化合物B、C、D、E、G、H可以确定为如下的相对立体化学结构：

而且，B，C，D，E，G，H的相对立体化学结构是基于F的相对立体化学结构的相关性和NMR谱数据的分析。绝对立体化学结构还没有建立起来。

生物学特征

测定本发明化合物的生物活性实验描述如下。蛋白激酶C（PKC）是一种Ca²⁺和磷脂依赖性的蛋白激酶，包含作为引起多种不同细胞对生长因子、激素、致癌基因和其它控制生长调谐剂应答。（参见The role of protein Kinase C in cell surface signal transduction and tumor promotion Nature（Lond.）308：693-698;并参见Nishizuka，Y.（1986）Studies ane perspectives of protein kinase C Science（Wash.D.C）233：305-312）。大量研究已经表明在信号转导和肿瘤助长中这种酶起重要作用，并且这种控制在磷脂酰肌醇等第二信使系统的一个分支上起作用。（参见Blumberg，P.M，（1989）Protein Kinase C as the treceptor for the phorbol ester tumor promoters.Cancer Res.48：1-8;并参见Berridge，M.J.（1987）Inositol lipids and cell proliferation.Biochim.Biophys.Acta 907：33-45.）。重要的是，近来已发现对一个全长形式的PKC（β₁）的过度表达在与转化一致的成纤维细胞的细胞系中引起惊人的形态变异和表型变异。（参见Housey，G.M，Johnson，M，D，Hsiao，W.L.W.O′Brian，C.A.，Murphy，J.P.，Kirschmeier，P.and Weinstein，I.B（1988）.Overproduction of protein kinase C causes disordered growth controlin rat fibroblasts.Cell 52：343-354）。

这些研究着重说明PKC在生长控制和肿瘤发生中的关键作用。

本发明提供PKC有效抑制剂的化合物。表10表明体外在微摩尔范围内具有有效的PKC抑制作用。为了进一步评价这些化合物的抗癌能力，评价了对T₂₄膀胱癌细胞细胞毒活性（结果也显示在表10中）。所有化合物在低微摩尔范围内对于T₂₄膀胱癌细胞都有一定能力的细胞毒性。对T₂₄细胞的细胞毒性与在共培养中生长的正常的非转化细胞系的细胞毒性（HEPM）进行了比较。从真菌液体培养基中分离的化合物A，C，D，G和H显示了惊人的结果，与正常细胞相比具有更大对抗转化细胞的能力（表10）。总而言之，这些数据表明这些化合物的潜在的抗肿瘤治疗活性。

转化细胞侵入正常组织和转移到远离位点的能力也是癌症的一个标志。我们还评价了本发明的这些化合物在体外抑制肿瘤细胞侵害特性的能力。表10显示了这些化合物通过重建的基底膜（Matrigel）来抑制HT1080纤维肉瘤细胞侵害能力的数据。这种活性支持了这些化合物潜在的抗侵害和抗转移治疗的活性。

表10

PKC  T24  T24  与  HEPM  HT1080

IC₅₀细胞毒性 在共培养中的细胞毒性 细胞侵害

立体化学

uM IC₅₀uM IC₅₀uM IC₅₀uM IC₅₀uM

A  8  2.1  1.5  >3.0  0.75

B  30

C  45  8.0  16.0  >16.0

A-乙酸酯  32  2.5  >5.0  >5.0  0.25

D  >50  8.0  16.0  >16.0

E  >50  1.5  >3.0  >3.0  0.65

F  >50  1.1  >0.25  >0.25  8.0

G  >50  1.9  1.0  4.0  2.80

H  27  9.5  5.0  >5.0  6.20

作为抗炎、抗过敏剂的PKC抑制剂

1.背景

PCK是一种显示广泛组织分布的重要调节酶并被认为在细胞功能的调节方面起着重要作用。例如，PKC的活化与刺激分泌物偶联、导致从肥大细胞和嗜碱细胞释放介质例如组胺有关。而且，PKC星状孢子（staurosporine）的抑制剂可以抑制这些过程（1）。

除了肥大细胞和嗜碱细胞之外，其它与炎症密切相关的细胞也由PKC（2）活化。哮喘病是一种隐伏着慢性肺炎的急性呼吸道疾病。嗜曙红细胞是哮喘病中导致肺炎的主要浸润细胞（3）。

本发明描述的化合物是PKC的抑制剂，可以有力地抑制嗜曙红细胞在过敏性气管中的累积。这些研究使用了过敏性的豚鼠模型。当此动物的呼吸道暴露于侵犯的抗原时，嗜曙红细胞在肺组织和支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar  Lavage  Fluid（BALF））中有急剧的积累。BALF很容易从这些动物中得到。

2.方法

致敏和抗原的激发

雄性Hartley豚鼠（300至350g）取自Charles  River  Breeding  Laboratories（kingston，NY）。诱导致敏包括第一天腹膜内注射5mg卵清蛋白和皮下注射5mg卵清蛋白，每个都是溶解在0.5ml的盐水中。第四天腹膜内注射另外5mg卵清蛋白。这些致敏动物被激发并被研究了三到四周，过后他们的体重达到500-600g。在激发时，使有知觉的动物暴露在通过Devilbiss超声喷雾器（Devilbiss，Somerset，PA）使0.25%卵清蛋白的盐水溶液形成的雾气中，持续6秒钟。这样的短暂暴露是为了防止因过敏而死亡。

化合物的服用，

将这些化合物溶解或悬浮在0.5ml的甲基纤维素中并经腹膜给予豚鼠。没有处置过的动物接受了适量的赋形剂。化合物分两次给药，卵清蛋白激发之前2小时和激发后5小时。

支气管肺泡的灌洗和细胞学

卵清蛋白激发后24小时，用皮下给予的盐酸氯胺酮（50mg/kg）和甲苯噻嗪（10mg/kg）组合物将豚鼠麻醉。通过气管插管一次使用5ml0.9%的盐水冲洗肺来实施BAL。灌洗液被离心（150×g，4℃10分钟）形成片状细胞沉淀物。细胞的片状沉淀物被重新悬浮在2.5ml的盐水中，用标准血细胞计数器记录总细胞。用Shandon细胞离心机（150×g，室温，10分钟）制得细胞旋转（cytospin）制剂。用Leukostat

（Fisher Scientific，San Francisco，CA）使细胞固定和染色。对至少200个细胞进行区别计数，用形态学标准把细胞分类成嗜中性细胞、嗜曙红细胞和单核细胞。

Ⅲ.结果和讨论

表11中的数据表明化合物A在腹膜内注射剂量为25mg/kg时明显地抑制了嗜曙红细胞的积累。然而，此剂量的化合物确实存在毒性。更低剂量的化合物A表现出边缘活性，因为组里动物的数量少而没有统计学上的意义。然而，此数据有力地表明PKC抑制剂可以抑制与肺过敏反应相关的发炎细胞的流入。因此，这一类化合物在肺部炎症疾病中（例如哮喘，支气管炎和成年人的呼吸困苦综合症）可具有潜在的实用性。

在以上过程中的（1），（2），（3）号指的是如下出版物：

参考文献：

1.W.A.Massey，V.L.Cohan;D.W.MacGlashan，J.W.Gittlen;A.Kagey-Sobotka，C.M.Lichtenstein  and  J.A.Warner.Protein  kinase  C  modulates  immunoglobulin  E-mediated  activation  of  humanmast  cells  from  lung  and  skin.1.Pharmacologic  inhibition.J.Pharmacol，Exp.Ther.675，824-830，1991.

2.Y.Nishizuka.Studies  and  perspectives  of  protein  kinase  C.Science  233，305-312，1986.

3.A.J.Wardlaw，S.Dunnette，G.J.Gleich，J.J.Collins  and  A.B.Kay.Eosinophils  and  mast  cells  in  bronchoalveolar  lavage  in  subjects  with  mild  asthma：Relationship  to  bronchial  hy  perreactivity.Amer.Rev.Respir.Dis  137，62-69，1988.

表11

PKC抑制剂（化合物A）对于嗜曙红细胞在过敏豚鼠气道中累积的抑制效果。

处置  剂量(mg/kg)  n  嗜曙红细胞在BALF中

I.  的百分数(平均值±SEM)

没有抗原  -  10  6±1*

抗原  -  10  31±4

抗原+化合物A  25  5  6±4*,a

II.

无抗原  -  6  2±1*

抗原  -  6  22±4

抗原+化合物A  3  6  12±3

抗原+化合物A  1  6  18±4

＊与抗原组比较P＜0.05

a.相关化合物，10只被处置的动物中死亡5只。

本发明化合物的抗炎性能

用TPA-诱导的水疱模型试验了A和A的乙酸酯，并且两种分子在试验剂量50和125μg/剂量时表明显著活性。这个模型评价在服用PKC激活剂TPA后，化合物对减少小鼠皮肤上水疱形成的能力。水泡的形成是由于应答发炎过程传递中增加的血管渗透性。试验和结果描述如下。

表12评价A和A的乙酸酯对表皮水疱的减少

化合物¹计算值²

TPA+甲醇  3.12±0.13

TPA+A

50μg/剂量  0.25±0.25*

125μg/剂量  0.80±0.37*

TPA+A的乙酸酯

50μg/剂量  0.4±0.25*

125μg/剂量  0.2±0.20*

这里所使用的，TPA表示12-0-十四（烷）酰佛波醇-13-乙酸酯（12-0-tetradecanoyl  phorbol-13-acetate）。

1  小鼠首先用溶解于甲醇（25μl）的化合物处理，30秒钟后再用TPA（12.5μl）进行处理。治疗后6小时评价水泡的形成。将每只小鼠评为1-4级，4＝水疱完全存在，3＝水疱形成有轻微的减少，2＝水疱的形成减少50%，1＝完全没有水疱。这里在没有被处治的小鼠中和只用甲醇处治的小鼠中没有水疱出现。

2.数据表示对每组4-5只小鼠的计算的平均值和标准偏差。星号（＊）表示由“t”测验（student′s  T-test）得出的在P＜0.05时的统计意义。

引言

在小鼠的皮肤上使用了TPA之后，血管的可渗透性有令人吃惊的增加，并且导致在皮肤上有类似水泡的升高区域，它在2-3小时内出现并大约持续36小时。（参见Fischer，S.M.，Patrick，K.E.and  Slaga，T.J.Effects  of  antihistamines  on  phorbol  ester  tumor  promotion  and  vascular  permeability  changes.Carcinogenesis  11：6，991-996，1990;

Gschwendt，M.Kittstein，W.，Furstenberger，G.and  Marks，F.The  mouse  ear  edema：a  quantitatively  valuable  assay  for  tum  or  promoting  compounds  and  for  inhibitors  of  tumor  promotion，Cancer  Lett25，177-185;Nakadate，T.，Tamamoto，S.，Aizu，E.and  Kato，R.Inhibition  of  12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate-induced  increase  in  vascular  permeability  in  mouse  skin  by  lipogenase  inhibitors.Japan  J.Pharmacolo，38：161-168，1985;and  Young，J.M.Wagner，B.M.andDoreen  A.S.Tacchyphylaxis  in  12-0-tetradec  anoylphorbol-13-acetate  and  arachidonic  acid-induced  ear  edema.J.Invest.Dermatol.，80，48-52，1983.）

如下面文献中所揭示的，血管可渗透性的增加和在我们的研究中水疱的出现，表明与TPA的所含剂量成正比。水疱的形成被认为是由发炎过程和应答PKC活化中的血管渗透性导致的。（参见Fischer，S.M.，Patrick，K.E.and  Slaga，T.J.Effects  of  antihistamines  on  phorbol  ester  tumor  promotion  and  vascular  permeabilitychanges.Carcinogenesis  11：6，991-996，1990;and  Gschwendt，M.Kittstein，W.，Furstenberger，G.and  Marks，F.The  mouse  ear  edcma：a  quantitively  valuable  assay  for  tumor  promoting  compounds  and  for  inhibitors  of  tumor  promotion，Cancer  Lett.25，177-185）.

材料和方法

动物：取自Charles  River  Laboratories的4-6周的雄性无毛小鼠（每组3-6只小鼠）。

处治：小鼠用间千金藤烷（metaphane）麻醉并放在一边。首先使用化合物（25μl甲醇）在背部皮肤进行局部处治，30秒钟后使用TPA（0.5nM-1nM，在12.5-15μl的体积中）进行处治。所有处治都是使用微量滴管完成的。在处治中25μl的化合物被分散在平均2-3cm²的面积上。12.5-15Ml的TPA被分散在大约2cm²的面积上，并且在该区域的中心在此之前已经被化合物处治过。

评价：处理6小时以后水疱形成的程度已经可以明显地被测定和记录。在TPA处治处和对照组小鼠中总是观察到水疱的形成表现为白色隆起区域的皮肤。将试剂对于减小水疱形成的效果分为不同等级，与用TPA处治小鼠相比较：1＝完全减少水疱形成，2＝50%减小水疱形成，3＝轻微减小水疱形成，4＝没有减小水疱形成。

统计：在P＜0.05时的统计意义是由“t”试验测定的。

如所看到的，本发明的化合物在以上的小鼠水疱试验中可减小水疱的大小，并且具有作为抗炎剂的活性。

实验1抑制肿瘤细胞侵入的体内试验。

动物：6-8周的C57bl/6雌性小鼠

细胞系：M27，2×10⁵细胞通过皮下注射进入胁部。

组:  A组  未处治的对照(组)  5只小鼠

B组  赋形剂对照(HP-BCD)  5只小鼠

C组  环磷酰胺250mg/kg×1  5只小鼠

D组  环磷酰胺125mg/kg×1  5只小鼠

E组  A乙酸酯  5只小鼠

3周2.5mpk和1周1.25mg/kg

F组  A  2.5mg/kg

处方和途径：将药物制成好的在HP-BCD的悬浮剂并腹膜内给予。在表13、14、15、16的数据中，环磷酰胺被用作阳性对照和只用赋形剂处理的动物被作为100%的对照组。

原始记录：细胞在第0天被注入。所有的处治从第一天开始。第一天是第一个星期一。C组、D组（环磷酰胺处治）仅在第一天服药一次。B、E、F组动物在每星期一、三、五处治、持续4周。原发肿瘤的测量被定在每个星期五。

结果：该实验在第35天做出结论。所有对照动物都有明显的肺转移瘤。与对照组相比较（表13）使用A的乙酸酯的动物在肺部没有转移瘤，而使用A的动物的肺部有少量群体（colonies）。这两组的原发肿瘤的大小也小于对照组，以上实验的结果显示在表14中。

表13  肺转移瘤的数目

实验1

组  转移瘤的数目  %对照

(平均值±标准偏差)

A  16.0±4.2  -

B  12.0±7.5  100.0

C  0±0  0

D  7.2±4.4  60.0

E  0±0  0

F  6.0±2.1  50.0

表14  原发肿瘤的大小

实验1.

组 肿瘤体积(mm³) %对照

A  2415±1284  -

B  2611±615  100.0

C  0±0  0

D  1956±1477  74.9

E  10±0  0.4

F  1685±1170  64.5

实验2.抑制肿瘤细胞侵入的体内试验

动物：6-8周的C567B16雌性小鼠

细胞系：鼠的肺癌M27，2×10⁵细胞被皮下注射到胁部。

组:  A组  未处理的对照组  5只小鼠

B组  赋形剂对照  5只小鼠

C组  环磷酰胺250mg/kg×1  5只小鼠

D组  A的乙酸酯1.25mg/kg  5只小鼠

E组  A  2.5mg/kg  5只小鼠

处方和途径：将药物制成好的HP-BCD悬浮剂，并腹膜内给予。

原始记录：细胞在第0天被注入。所有处理从第一天开始。第一天是第一个星期一。C组的动物（环磷酰胺处理）仅在第一天服用一次。B、D、E动物每星期一、三、五服药，持续4周。定在每个星期五测定原发肿瘤体积。

结果：实验在第36天结束，记录在第30天到36天死的动物的肺群体。在30天前死的动物的肺群体没有被包括在内，因为肺群体太小而不能被测定。与对照组相比，A和A的乙酸酯有效地减少了肺群体的数目（表15）。这两组的原发肿瘤的水小也小于对照组（表16）

表15  肺转移瘤的数量

实验2

组 肿瘤体积(mm³) %对照

A  29.3±2.1  -

B  33.6±9.7  100.0

C  5.0±2.4  14.9

D  14.5±7.8  43.2

E  9.3±3.2  27.7

表16  原发肿瘤的大小

实验2

组 肿瘤体积(mm³) %对照

A  1375±708  -

B  3343±2809  100.0

C  570±626  17.1

D  954±463  28.5

E  763±230  22.8

由上述肿瘤试验可见，本发明的化合物具有作为抗肿瘤剂的活性。

最后，6种PKC抑制剂，即化合物A、B、C、D、G、H已从真菌Natrissia.mangiferaeATCC74078中分离出来。所有化合物，包括A、B、C、D、E、F、G、H和A的乙酸酯含有独特结构特征高度张力的多环的酮缩醇环系统。这类不平常的化合物在肿瘤生物学以及抗过敏和抗炎治疗中表现出潜在的实用性。

因此，本发明提供了如下结构式的化合物：

其中R是H或酰基。

本领域技术人员应该能够使用含有本发明化合物的组合物来治疗肿瘤、过敏症和炎症。

本发明化合物可以为片剂、胶囊剂、悬浮剂或气雾剂形式使用。并可以通过口服、皮下注射、静脉注射或通过吸入引入机体。

虽然有效剂量可以变化，而且根据疾病可以使用不同组合物，但是抗过敏活性要求的最小剂量通常为1-1000mg，每天1-4次。

本发明的化合物可以通过各种常规的剂量形式引入机体，例如，局部的、口服的、非肠道的、直肠、透皮吸收，等形式。口服和直肠剂量形式包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂、扁形胶囊剂和栓剂。液体口服剂量形式包括溶液和悬浮液。非肠道制剂包括无菌溶液和悬浮液。局部剂量形式可以是气雾剂、霜剂、软膏、洗剂，透皮吸收系统（例如，常规的贴剂或基质型（matrix  type）等形式。

上述剂量形式所期望的制剂和药用组合物可以使用常规药用可接受的赋形剂和添加剂并采用常规的技术来制备。这些药用可接受的赋形剂和添加剂可以包括载体、粘合剂、香料、缓冲剂、增稠剂、着色剂、稳定剂、乳化剂、分散剂、悬浮剂、香料、防腐剂、润滑剂等等。

合适的药用可接受的固体载体有碳酸镁、硬酯酸镁、滑石、蔗糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧基甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂和类似物质。胶囊可以通过把活性化合物和药用可接受的载体一起装于胶囊中而制成。本发明的活性化合物可以和药用可接受的赋形剂混合，或者不加赋形剂而只加细分散的粉末形式，然后包在胶囊中。同样扁胶囊剂也可包括在内。

用于非肠道注射的液体形式的制剂包括溶液、悬浮液、乳剂例如水或水-丙二醇溶液。液体制剂也可制成聚乙二醇和/或丙二醇的溶液，其中可以含有水。适于口服使用的水溶液可以通过在水中加入活性成分并且根据需要加入合适的着色剂、调味剂、稳定剂、增甜剂、助溶剂、增稠剂来制备。适于口服使用水悬浮液可以通过在含粘稠物质的水中很好分散的形式的活性成分，粘稠物质有药用可接受的天然的或人工合成的胶、树脂、甲基纤维素、羧基甲基纤维素钠以及其它公知的悬浮剂。

局部应用的制剂可以包括以上的液体形式，以及霜剂、气雾剂、喷雾剂、粉尘剂（dusts）、粉末剂、洗剂和软膏，它可以通过把本发明的活性组分和常规药用可接受的、用在局部的、干的、液体的、霜剂的和气雾剂中的稀释剂和载体混合在一起制成。软膏剂和霜剂可以用例如水或油基质中加入适用的增稠剂和/或凝胶剂来配制。这些基质，例如可以包括水和/或油，如液体石蜡或植物油，如花生油或蓖麻油。增稠剂可以根据基质的性质来选用，包括软石蜡、硬脂酸铝，十八醇十六醇混合物（cetostearyl  alcohol），丙二醇、聚乙二醇、羊毛脂、氢化羊毛脂、蜂蜡等等。

配制洗剂可以使用水或油基质并且一般还包括一种或多种药用可接受的稳定剂、乳化剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂、着色剂、香料等等。

粉末制剂的配制可以使用任何合适的药用可接受的粉末基质，例如滑石、乳糖、淀粉等等。制备滴剂可以使用一种水基质或非水基质，也包括一种或多种药用可接受的分散剂、悬浮剂、助溶剂等等。

局部药用组合物也可以包括一种或几种防腐剂或抑菌剂例如，羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、氯甲酚、氯苄烷铵（benzalkonium  chlorides）等等。

局部药用组合物还可以含有一种本发明的活性化合物并配合其它活性组分例如，抗微生物剂，特别是抗菌素、麻醉剂，止痛剂和止痒剂。

还包括固体形式制剂，该制剂用于口服或非肠道使用时，都在使用前转换为液体制剂形式。这些液体形式包括溶液、悬浮液和乳剂。这些特定的固体形式制剂在作为单位剂量使用时最为方便并如此用于提供一个液体剂量单位。另一方面，可提供充足的固体药剂，这样转移为液体形式后，通过使用注射器，茶匙或其它体积容器测量液体形式的预定体积而获得多个液体分剂量，当多个液体剂量制备出来后，应把没有使用的所说液体剂量部分保存在防止可能分解的条件下。用来转换为液体形式的固体剂型，除了含有活性物质外，还含有药用可接受的调味剂、着色剂、稳定剂、缓冲剂、人工合成的和天然的增甜剂、分散剂、增稠剂、助溶剂等等。用于制备液体形式制剂的溶剂可以是水、等渗水、乙醇、甘油、丙二醇等及其混合物。当然，所用溶剂的选择要考虑给药的途径，例如含有大量乙醇的液体制剂就不适于非肠道使用。

本发明的化合物也可以是用于系统分布的透皮吸收系统。透皮吸收组合物可使用霜剂、洗剂和/或乳剂形式，并且包括为此目的技术上的常规使用的基质型或储备库型透皮吸收贴。

本发明的组合物包含有治疗有效剂量的本发明的化合物与药用可接受的载体物质的组合物。

本发明的化合物可以通过任何常规给药方式给药，在此方式中使用治疗有效剂量的本发明化合物。该剂量可以根据护理临床医师判断的需要，治疗疾病的严重程度和所使用的特定化合物而变化。根据特定情况而决定合适剂量是在本领域技术人员范围之内。治疗可以从使用低于化合物最佳剂量开始，此后一点点地增加剂量，直到在当时条件下达到最佳效果。为了方便起见，在一天内按照需要可将每日总剂量分成几个部分来使用。

Claims (7)

1、一种选自下列结构式的化合物：

式中R是H或酰基。

2、根据权利要求1的化合物，

该化合物具有表1，2和3所述的物理特性。

3、根据权利要求1的化合物，

该化合物具有表1，2和3所述的物理特性。

4、根据权利要求1，一种选自下列结构式的化合物：

该化合具有表1，2，3，4，5，6，7，8和9中所述的物理特性。

5、一种药用组合物，含有抗肿瘤、抗过敏或抗炎有效量的权利要求1的一种化合物和药用上可接受的载体物质。

6、一种治疗肿瘤、过敏或治疗炎症的方法，它包含给予抗肿瘤、抗过敏或抗炎有效量的权利要求1的一种化合物。

7、一种真菌Nattrassia  mangiferae的生物纯培养物，该培养物在有氧条件下、在含有可吸收的氮源和碳源的水性介质中发酵产生可回收量的权利要求1中所定义的化合物A、B、C、D、G和H。