CN108892710B - 龙须菜降压肽提取物和龙须菜降压肽及其应用 - Google Patents
龙须菜降压肽提取物和龙须菜降压肽及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108892710B CN108892710B CN201810819628.2A CN201810819628A CN108892710B CN 108892710 B CN108892710 B CN 108892710B CN 201810819628 A CN201810819628 A CN 201810819628A CN 108892710 B CN108892710 B CN 108892710B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- asparagus
- antihypertensive
- antihypertensive peptide
- ace
- polypeptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 121
- 230000003276 anti-hypertensive effect Effects 0.000 title claims abstract description 59
- 241000234427 Asparagus Species 0.000 title claims abstract description 51
- 235000005340 Asparagus officinalis Nutrition 0.000 title claims abstract description 51
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 66
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 55
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 6
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 5
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N L-methionine (R)-S-oxide Chemical compound C[S@@](=O)CC[C@H]([NH3+])C([O-])=O QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N 0.000 claims description 2
- QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N L-methionine sulphoxide Natural products CS(=O)CCC(N)C(O)=O QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000005541 ACE inhibitor Substances 0.000 claims 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims 1
- 229940044094 angiotensin-converting-enzyme inhibitor Drugs 0.000 claims 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 239000000463 material Substances 0.000 claims 1
- UUUHXMGGBIUAPW-UHFFFAOYSA-N 1-[1-[2-[[5-amino-2-[[1-[5-(diaminomethylideneamino)-2-[[1-[3-(1h-indol-3-yl)-2-[(5-oxopyrrolidine-2-carbonyl)amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbon Chemical compound C1CCC(C(=O)N2C(CCC2)C(O)=O)N1C(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1CCCN1C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C1CCCN1C(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C1CCC(=O)N1 UUUHXMGGBIUAPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 57
- 102000004270 Peptidyl-Dipeptidase A Human genes 0.000 abstract description 57
- 108090000882 Peptidyl-Dipeptidase A Proteins 0.000 abstract description 57
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 23
- 241000700159 Rattus Species 0.000 abstract description 11
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 abstract description 11
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 abstract description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 6
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 abstract description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 5
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000002220 antihypertensive agent Substances 0.000 abstract description 3
- 229940127088 antihypertensive drug Drugs 0.000 abstract description 3
- 230000001631 hypertensive effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 abstract description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 abstract 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- QIAFMBKCNZACKA-UHFFFAOYSA-N N-benzoylglycine Chemical compound OC(=O)CNC(=O)C1=CC=CC=C1 QIAFMBKCNZACKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 10
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 5
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 5
- 229960000830 captopril Drugs 0.000 description 5
- FAKRSMQSSFJEIM-RQJHMYQMSA-N captopril Chemical compound SC[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O FAKRSMQSSFJEIM-RQJHMYQMSA-N 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 5
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 101000984728 Chiropsoides quadrigatus Angiotensin-converting enzyme inhibitory peptide Proteins 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 3
- 230000001077 hypotensive effect Effects 0.000 description 3
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 3
- 230000036454 renin-angiotensin system Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000011699 spontaneously hypertensive rat Methods 0.000 description 3
- AAXWBCKQYLBQKY-IRXDYDNUSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[(2-benzamidoacetyl)amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)C=1C=CC=CC=1)C1=CN=CN1 AAXWBCKQYLBQKY-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 2
- BIDNLKIUORFRQP-XYGFDPSESA-N (2s,4s)-4-cyclohexyl-1-[2-[[(1s)-2-methyl-1-propanoyloxypropoxy]-(4-phenylbutyl)phosphoryl]acetyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound C([P@@](=O)(O[C@H](OC(=O)CC)C(C)C)CC(=O)N1[C@@H](C[C@H](C1)C1CCCCC1)C(O)=O)CCCC1=CC=CC=C1 BIDNLKIUORFRQP-XYGFDPSESA-N 0.000 description 2
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 2
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 2
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 2
- 108010061435 Enalapril Proteins 0.000 description 2
- 241000206611 Gracilariopsis lemaneiformis Species 0.000 description 2
- 241000703939 Gracilariopsis longissima Species 0.000 description 2
- 108010007859 Lisinopril Proteins 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 229960000873 enalapril Drugs 0.000 description 2
- GBXSMTUPTTWBMN-XIRDDKMYSA-N enalapril Chemical compound C([C@@H](C(=O)OCC)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 GBXSMTUPTTWBMN-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 229960002490 fosinopril Drugs 0.000 description 2
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 2
- 108010016268 hippuryl-histidyl-leucine Proteins 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 229960002394 lisinopril Drugs 0.000 description 2
- RLAWWYSOJDYHDC-BZSNNMDCSA-N lisinopril Chemical compound C([C@H](N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 RLAWWYSOJDYHDC-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 208000009304 Acute Kidney Injury Diseases 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010064733 Angiotensins Proteins 0.000 description 1
- 102000015427 Angiotensins Human genes 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 241000195649 Chlorella <Chlorellales> Species 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 208000007530 Essential hypertension Diseases 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- 208000001953 Hypotension Diseases 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 241000206607 Porphyra umbilicalis Species 0.000 description 1
- 208000033626 Renal failure acute Diseases 0.000 description 1
- 241000196252 Ulva Species 0.000 description 1
- 244000273928 Zingiber officinale Species 0.000 description 1
- 235000006886 Zingiber officinale Nutrition 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 201000011040 acute kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 208000012998 acute renal failure Diseases 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002180 anti-stress Effects 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000004531 blood pressure lowering effect Effects 0.000 description 1
- 238000009530 blood pressure measurement Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 235000008397 ginger Nutrition 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 208000021822 hypotensive Diseases 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 201000001474 proteinuria Diseases 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000029865 regulation of blood pressure Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003462 sulfoxides Chemical group 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001841 zingiber officinale Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
- A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
本发明公开了龙须菜降压肽及其在制备降血压药物中的应用。龙须菜降压提取物经酶解获得，对该提取物进一步分离纯化得到一特定序列的多肽，该降压肽的氨基酸序列为Phe‑Gln‑Ile‑Asn‑[Met(O)]‑Cys‑Ile‑Leu‑Arg（FQIN[M(O)]CILR），质谱鉴定分子量为1153.43 Da。本发明筛选的龙须菜降压肽具有显著的血管紧张素转化酶抑制活性。在体外表现为温度、pH、模拟胃肠消化和血管紧张素转化酶（ACE）降解稳定性。酶动力学考察显示该多肽为一种ACE的非竞争性抑制剂。在体外和非自发性高血压大鼠（SHRs）体内都显示出良好的降压效果，可用于高血压治疗相关的药品。
Description
技术领域
本发明涉及生物活性肽技术领域，涉及龙须菜的降压肽提取物和具有特定序列的降压肽及其在降血压药品方面的应用。
背景技术
高血压以人体循环动脉血压升高为主要特征(高压≥140mmHg，低压≥90mmHg)，高血压与心血管疾病和糖尿病的死亡率增加有关。肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)和激肽-缓激肽系统(kallikreo-bradykinin system,KKS)可在血压调节中发挥重要作用。ACE是普遍存在于哺乳动物组织中的能够调控肾素-血管紧张素系统(RAS)和激肽-缓激肽系统(KKS)的一种Zn2+依赖性的羧肽酶。所以，ACE被认为是治疗高血压的重要靶点。
市场上普遍的ACE抑制药物多为“普利”类，像卡托普利(captopril)、赖诺普利(lisinopril)、依那普利(enalapril)、福辛普利(fosinopril)等，尽管这些药物能发挥好的降压效果，但是，他们也会产生一系列的副作用，像咳嗽、皮疹、恶心、急性肾功能衰竭、蛋白尿等。这些副作用会降低患者的依从性，增加额外医疗费用，因此越来越多的研究开始集中于对低毒性的天然ACE抑制肽的开发来作为抗高血压药物的辅助和替代品。食源性的多肽不仅能发挥同样的抗压作用还因为其天然来源具有安全性和低毒性，所以从天然食品中开发降压肽具有意义和前景。
龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)是一种广泛分布于海洋环境中的经济红藻，是生产琼脂的主要来源。龙须菜中富含多糖、蛋白质和其他活性组分，这说明龙须菜可以作为活性肽的重要来源。
目前已经有多种从海洋藻类中筛选出具有ACE抑制作用的多肽，像紫菜、小球藻、石莼等。但没有从龙须菜中分离得到ACE抑制肽的报道。
发明内容
鉴于此，本发明地目的是选择龙须菜作为原料，通过胰蛋白酶酶解，液质连用技术，龙须菜转录组数据库比对筛选和鉴定出氨基酸序列为Phe-Gln-Ile-Asn-[Met(O)]-Cys-Ile-Leu-Arg(FQIN[M(O)]CILR)的ACE抑制肽。
本发明的龙须菜来源的具有特定序列(Phe-Gln-Ile-Asn-[Met(O)]-Cys-Ile-Leu-Arg)的ACE抑制肽中的甲硫氨酸修饰为甲硫氨酸亚砜。
本发明的龙须菜降压肽修饰之前的氨基酸序列为：Phe-Gln-Ile-Asn-Met-Cys-Ile-Leu-Arg(FQINMCILR)。
本发明的龙须菜降压肽在体外显示较高的血管紧张素转化酶(ACE)抑制作用，在自发性高血压大鼠(SHRs)体内发挥良好的降压效果。
本发明的另个一个目的是提供一种龙须菜降压肽提取物，其按照以下方法制备：龙须菜晾干粉碎，粉末加水溶胀，加入胰蛋白酶酶解之后，过滤，上清液醇沉，离心除去沉淀，上清液超滤，收集分子量<3kDa的组分冻干后与-80℃保存，制得降压肽提取物。其中所述的龙须菜粉末与溶剂的料液比为1:20-1:40，浸泡时间为2h-4h；所述的胰蛋白酶(EC3.4.23.4,≥250.N.F.U/mg)添加量为2％-5％，酶解温度控制在35℃-45℃，酶解pH控制在7.2-8.7，酶解2h-4h后沸水10min灭酶；所述的上清液醇沉浓度为50％-90％。
本发明的具有特定序列的龙须菜降压肽按照如下方法筛选和鉴定：<3kDa的龙须菜降压肽提取物经过UPLC-ESI-Q-Exactive Focus-MS/MS和龙须菜转录组(Accession:SRX258772,下载自NCBI)比对得到特定序列。
本发明中的龙须菜降压肽提取物及龙须菜降压肽在血管紧张素抑制剂，降压药物中有广泛的应用。
附图说明
图1为龙须菜降压肽FQIN[M(O)]CILR的质谱鉴定图。
图2多肽(0.5mg/ml)在不同温度处理下的ACE抑制活性，图中值表示抑制率的平均值±标准偏差。
图3多肽(0.5mg/ml)在不同pH处理下的ACE抑制活性，图中值表示抑制率的平均值±标准偏差。
图4多肽(0.1mg/ml和0.5mg/ml)在模拟胃肠液中处理之后的ACE抑制活性。GC不添加胃蛋白酶的模拟胃液处理；G添加胃蛋白酶的模拟胃液处理；G+IC无胃蛋白酶和胰酶的模拟胃肠液；G+I添加胃蛋白酶和胰酶的模拟胃肠液；图中值表示抑制率的平均值±标准偏差。
图5多肽(0.1mg/ml)与ACE结合稳定性研究，图中值表示抑制率的平均值±标准偏差。
图6多肽抑制ACE的双倒数作图(Lineweaver-Burk plots)，X轴为底物浓度的倒数，Y轴为反应速率的倒数。
图7多肽对自发性高血压大鼠(SHRs)高压的降低作用；灌胃剂量10mg/kg；图中值表示不同侧量时间点SHRs大鼠的高压平均值±标准偏差。
图8多肽对自发性高血压大鼠(SHRs)低压的降低作用；灌胃剂量10mg/kg；图中值表示不同侧量时间点SHRs大鼠的低压平均值±标准偏差。
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明方案作进一步的具体说明：
龙须菜降压肽FQINMCILR(Phe-Gln-Ile-Asn-Met-Cys-Ile-Leu-Arg)为含有9个氨基酸的单链多肽，该多肽分离自龙须菜降压肽提取物，对多肽的甲硫氨酸修饰之后得到多肽FQINM[M(o)]CILR，修饰之后的多肽稳定性和活性都有所提高，在体外和SHRs体内都显示出良好的降压效果。
实施例1：
龙须菜降压肽提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)龙须菜粉末20g，加入500ml蒸馏水搅拌溶胀2h。
(2)加入500mg胰蛋白酶(EC 3.4.23.4,≥250.N.F.U/mg)酶解，酶解温度42℃，酶解pH控制在8.0，酶解时间为3h，酶解完成之后100℃灭酶10min，过滤除杂。
(3)上清液使用终体积浓度70％的乙醇醇沉，除去沉淀，上清液超滤收集<3kDa的组分，浓缩至20ml冻干，制得降压肽提取物。
(4)高效液相色谱法测定降压肽的IC50值。
本实施例所用的药品及仪器无特殊说明均可从商业获得。
高效液相色谱法(HPLC)测定ACEI活性的原理为：马尿酰-组氨酰-亮氨酸(Hip-His-Leu，HHL，美国Sigma公司)可被ACE(美国Sigma公司)酶解成为马尿酸和二肽产物，马尿酸在紫外波长228nm处有特征的吸收峰，当抑制剂与血管紧张素转化酶作用时，马尿酸的生成量减少，通过测定加入抑制剂前后生成马尿酸的量可以测定抑制剂对ACE的抑制率。计算公式如下：
上式中A空白为不添加抑制肽时马尿酸的峰面积，A抑制剂为添加抑制肽时马尿酸的峰面积；IC50表示能抑制ACE一半活性时抑制肽的浓度。
将降压肽提取物配制成为0.1、0.5、1、1.5、2.0、2.5、5mg/ml的水溶液，按照姜瞻梅等高效液相色谱法快速测定降血压肽的血管紧张素转化酶抑制活性的实验方法测定FQINMCILR的抑制率，每个浓度测定3次，取平均值，计算该降压肽的IC50值。(高效液相色谱法快速测定降血压肽的血管紧张素转换酶抑制活性[J].食品与发酵工业,2007(08):122-126.)，经计算降压肽的IC50值为1.41±0.31mg/ml(表1)。
表1.不同浓度龙须菜降压肽的ACE抑制率。
实施例2：
龙须菜降压肽提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)龙须菜晾干粉碎，取干粉20g加入400ml蒸馏水搅拌，并在室温下溶胀4h。
(2)加入400mg胰蛋白酶(EC 3.4.23.4,≥250.N.F.U/mg)搅拌酶解，酶解温度控制在42℃，酶解pH控制在7.8，酶解时间为2h，酶解完成后沸水灭酶10min，过滤除杂。
(3)上清液使用终体积浓度80％的乙醇醇沉，除去沉淀，上清液超滤收集<3kDa的组分，并浓缩至20ml，冻干后制得龙须菜降压肽提取物。
(4)使用高效液相色谱法(测定方法具体参考实施例1)对龙须菜降压肽提取物的ACE抑制活性进行评价。
表2.不同浓度龙须菜降压肽的ACE抑制率。
表2显示该降压肽抑制ACE的IC50值为0.93±0.24mg/ml。
实施例3:
上述龙须菜<3kDa的龙须菜降压肽提取物UPLC-ESI-Q-Exactive Focus-MS/MS的质谱信息使用Mascot2.2与龙须菜转录组(Accession:SRX258772,下载自NCBI)数据库比对，选择丰度前20的多肽选择性的进行合成，再进行筛选具有ACE抑制活性的多肽，经鉴定多肽FQINMCILR具有较好的ACE抑制活性。甲硫氨酸和半胱氨酸因含有S原子在体内易被氧化，将S原子修饰成为亚砜结构，增强其在体内的稳定性。FQINMCILR委托上海强耀生物科技有限公司进行合成，并选择性的对甲硫氨酸进行修饰，得到序列为FQIN[M(O)]CILR，纯度≥98％的多肽，质谱鉴定分子量为1153.43Da。
(一)高效液相色谱法(HPLC)法测定多肽体外ACE抑制活性
将多肽配制成为1、5、10、20、40、60、80μM的水溶液,按照上述实验方法测定FQINMCILR的抑制率，每个浓度测定3次，取平均值，计算多肽的IC50值。(高效液相色谱法快速测定降血压肽的血管紧张素转换酶抑制活性[J].食品与发酵工业,2007(08):122-126.)
表3.不同浓度龙须菜降压肽的ACE抑制率。
表3结果为修饰之前龙须菜降压肽FQINMCILR的IC50值为13.41±0.79μM；修饰之后龙须菜降压肽FQIN[M(O)]CILR的IC50值为9.64±0.36μM，下文将选用活性较好的FQIN[M(O)]CILR进行进一步研究。
(二)多肽的理化性质
图1合成多肽的质谱图中[M+H+]的峰值为1153.43，说明多肽FQIN[M(O)]CILR的分 子量为1153.43Da.
(三)热稳定性和pH稳定性评价
多肽水溶液(0.5mg/ml)在0、20、40、60、80、100℃下水浴处理2h，取20μL的多肽水溶液按上述方法测定其ACE抑制活性，每个温度处理下测定3次。
多肽溶于pH分别为2、4、6的盐酸溶液和pH分别为8、10、12的氢氧化钠溶液中至终浓度为0.5mg/ml，将上述多肽溶液室温下处理2h，用1M的HCL和1M的NaOH中和多肽溶液至pH为7.0，取多肽溶液20μL按上述方法测定其ACE抑制活性，每个pH值下测定3次。
附图2和附图3显示在0-100℃和pH2-12处理下，多肽仍然保持稳定的ACE抑制率，该龙须菜降压肽FQIN[M(O)]CILR具有温度和pH稳定性。
(四)模拟胃肠液降解稳定性评价
体外模拟胃肠液降解来评价该多肽在模拟胃肠液中的稳定性。多肽溶解到0.1MKCl-HCl(pH 2.0)缓冲液中至终浓度为0.1mg/mL和0.5mg/ml。上述多肽溶液添加胃蛋白酶(≥250U/mg)，酶加量为0.8mg/ml，该溶液在37℃中孵育4h，体系在沸水中灭酶10min，12000rpm离心5min，取20μL上清液测定ACE抑制率；调节剩余多肽溶液的pH至7.0，添加胰酶(8x USP)，添加量为10mg/mL，该溶液在37℃中继续孵育4h，沸水浴10min灭酶，12000rpm离心5min，取上清液20μL继续测定ACE抑制活性。
附图4显示龙须菜降压肽FQIN[M(O)]CILR在0.1mg/ml和0.5mg/ml的浓度下经模拟胃肠液的处理之后维持了稳定的ACE抑制率，这说明该多肽能够在抵抗模拟胃肠液的降解，在模拟胃肠液中保持其结构及ACE抑制活性稳定性，推断该多肽能在吸收进入血液之前能保持其结构稳定性并发挥稳定降压活性。
(五)多肽与ACE结合稳定性考察
ACE是具有广泛的特异底物的羧肽酶，它能够产生降解降压肽的功能。30μL的多肽水溶液(0.1mg/mL)与30μL 0.1U/mL ACE溶液(溶质为0.1mol/l的硼酸缓冲液，Ph8.3，含有0.3M的NaCl)混匀之后，在37℃的水浴中孵育24h，24小时之内每隔2h取样20μL溶液沸水灭酶之后测定ACE抑制率。每个时间点取样3次测定。
附图5显示在与ACE溶液孵育的24小时之内，多肽的ACE抑制率并未发生显著性的变化，维持在65％，说明龙须菜降压肽FQIN[M(O)]CILR并非ACE的底物，不被ACE降解。
(六)多肽的抑制模式
多肽溶于纯水中使终浓度为1mg/mL、0.5mg/mL和0mg/ml，马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)溶于0.1M硼酸缓冲液(pH8.3，含0.3M的氯化钠)至终浓度分别为4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL和0.5mg/mL。每个浓度的多肽分别与不同的五个浓度的HHL反应(ACE固定浓度0.1U/ml，0.1M的硼酸缓冲液，pH8.3，含0.3M的氯化钠)按照上述的方法测定多肽的ACE抑制率，X轴为底物HHL浓度的倒数，Y轴为反应速率的倒数用每分钟产生的马尿酸的浓度的倒数表示(即双倒数作图法)，该方法,用来确定抑制肽的的抑制模式。
附图6显示Km(与X轴的交点)为固定值，随着抑制剂浓度的增大，Vmax减小，这是非竞争性抑制剂的显著特征，说明龙须菜降压肽FQIN[M(O)]CILR为ACE的非竞争性抑制剂，即多肽与ACE的活性部位以外的部位结合，形成酶-底物-抑制剂三元复合物，从而影响ACE的催化活性。
表2显示ACE的抑制常数为0.71±0.04mM，表示抑制肽与ACE的解离速率较慢。
表2.多肽的动力学参数
(七)自发性高血压大鼠(SHRs)单次给药后降压效果评价
卡托普利北京索莱宝科技有限公司(纯度>99.0％)
原发性高血压大鼠(SHRs)北京维通利华实验动物有限公司
鼠尾无创血压测量系统CODA肯特科技有限公司
对多肽的体内降压作用评价通过单次给药后自发性高血压大鼠SHRs(雄性，10周龄，体重250-300g，无特异性病原体)购买自北京维通利华实验动物有限公司，SHRs在22±2℃下12h的日夜(光照/黑暗)循环，每天定时喂养纯水和标准普通鼠饲料的饮食。SHRs被分为分为三组(空白组，多肽组，阳性对照组)，每组有6只，在高压高于180mmHg时，开始灌胃。
生理盐水用作空白对照，卡托普利作为阳性对照，多肽和卡托普利的溶剂都为生理盐水，灌胃剂量为10mg/kg，鼠尾无创血压测定系统CODA测定灌胃后0、1、2、4、6、8h的高压和低压，每次测定重复10次，每组6只大鼠，每个时间点获得60组数据，每个测量时间点的血压值采用SPSS 17.0版本进行处理，为了比较组间的平均差异，采用了单因素方差分析，结果显示为血压的平均值±标准偏差,p<0.05为有统计学意义。
附图7和附图8说明FQIN[M(O)]CILR在灌胃之后2h至4h能够显著的降低SHRs的高压(p<0.05)，在2h高压最多能从204mmHg降低至170mmHg，最多能使高压降低34mmHg，然后血压开始缓慢的恢复，直到灌胃后8h，血压恢复至之前的水平(200mmHg)。FQIN[M(O)]CILR在2h使SHRs的低压显著的降低，低压由145mmHg降低至118mmHg(p<0.05)，然后血压开始缓慢恢复，8h恢复至原始的水平(145mmHg)。总的来说，FQIN[M(O)]CILR能在SHRs体内产生良好的降压效果。
以上结果表明：龙须菜降压肽FQIN[M(O)]CILR对ACE有较强的抑制活性；该多肽能在0℃-100℃和pH2-12的范围内都能保持活性，此外该多肽还能抵抗模拟胃肠液和ACE的降解；酶动力学显示该多肽为ACE的非竞争性抑制剂；在自发性高血压大鼠(SHRs)体内也能显示出显著的降压活性。龙须菜的降压肽和具有特定序列的降压肽FQIN[M(O)]CILR将广泛应用于高血压治疗相关的药物。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细的说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种龙须菜降压肽，其特征在于: 所述龙须菜降压肽选自下述序列：
第一序列：序列表SEQ ID NO：1 中氨基酸序列,多肽序列为Phe-Gln-Ile-Asn-Met-Cys-Ile-Leu-Arg （FQINMCILR）；
第二序列：Phe-Gln-Ile-Asn-Met-Cys-Ile-Leu-Arg（FQINMCILR）的甲硫氨酸修饰为甲硫氨酸亚砜的多肽序列。
2.一种权利要求1所述龙须菜降压肽的应用，其特征在于：所述的降压肽在制备血管紧张素转化酶抑制剂或治疗高血压的药物中的应用。
3.一种治疗高血压的药物，其特征在于：其以权利要求1所述龙须菜降压肽为活性成分。
4.按照权利要求3所述的治疗高血压的药物，其特征在于：所述治疗高血压的药物中添加了药物学上可接受的载体或辅料。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810819628.2A CN108892710B (zh) | 2018-07-24 | 2018-07-24 | 龙须菜降压肽提取物和龙须菜降压肽及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810819628.2A CN108892710B (zh) | 2018-07-24 | 2018-07-24 | 龙须菜降压肽提取物和龙须菜降压肽及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108892710A CN108892710A (zh) | 2018-11-27 |
| CN108892710B true CN108892710B (zh) | 2021-10-29 |
Family
ID=64352378
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810819628.2A Active CN108892710B (zh) | 2018-07-24 | 2018-07-24 | 龙须菜降压肽提取物和龙须菜降压肽及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108892710B (zh) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112940079B (zh) * | 2021-03-19 | 2022-09-09 | 广州明创生物科技有限公司 | 一种大米降压肽及其酶解制备方法 |
| CN115368469A (zh) * | 2021-05-20 | 2022-11-22 | 易森荟(武汉)生物医药有限公司 | 血管紧张素转换酶抑制剂 |
| CN114195857B (zh) * | 2021-10-14 | 2023-07-04 | 中国科学院海洋研究所 | 一种降压肽及其制备方法和应用 |
| CN114790227B (zh) * | 2022-05-23 | 2023-08-15 | 福建省水产研究所（福建水产病害防治中心） | 以龙须菜为原料的活性多肽、制备方法及应用 |
| CN114773431B (zh) * | 2022-05-23 | 2023-08-25 | 福建省水产研究所（福建水产病害防治中心） | 龙须菜ace抑制肽、制备方法及应用 |
| CN114773432B (zh) * | 2022-05-23 | 2023-08-01 | 福建省水产研究所（福建水产病害防治中心） | 具有降压活性的龙须菜多肽、制备方法及应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103923177A (zh) * | 2014-04-26 | 2014-07-16 | 宁波大学 | 一种海洋微藻来源的血管紧张素转化酶抑制肽 |
| CN106188227A (zh) * | 2016-07-07 | 2016-12-07 | 华东理工大学 | 降血压肽和降血压蛋白质及其应用 |
-
2018
- 2018-07-24 CN CN201810819628.2A patent/CN108892710B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103923177A (zh) * | 2014-04-26 | 2014-07-16 | 宁波大学 | 一种海洋微藻来源的血管紧张素转化酶抑制肽 |
| CN106188227A (zh) * | 2016-07-07 | 2016-12-07 | 华东理工大学 | 降血压肽和降血压蛋白质及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Purification and identification of a novel ACE inhibitory peptide from marine alga Gracilariopsis lemaneiformis protein hydrolysate;Dequn Cao等;《Eur Food Res Technol》;20170410;摘要、第1830页左栏第4段至第1831页右栏第3段 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108892710A (zh) | 2018-11-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108892710B (zh) | 龙须菜降压肽提取物和龙须菜降压肽及其应用 | |
| KR101115560B1 (ko) | 생체내 비분해성 펩티드, 안지오텐신 변환효소 저해제, 의약 및 기능성 식품 | |
| Lin et al. | Angiotensin-I-converting enzyme (ACE)-inhibitory and antihypertensive properties of squid skin gelatin hydrolysates | |
| JP4369986B2 (ja) | アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド | |
| CN108840909B (zh) | 一种紫菜降压肽和紫菜降压肽提取物及应用 | |
| CN106866814A (zh) | Dpp‑4抑制剂 | |
| JP2000157226A (ja) | 海苔の酵素分解物およびその用途 | |
| CN114106092B (zh) | 一种具有ace抑制作用的活性多肽及其应用 | |
| CN103965287A (zh) | 一种次血红素三肽及其制备方法和用途 | |
| EP2968442B1 (en) | New stable pentadecapeptide salts, a process for preparation thereof, a use thereof in the manufacture of pharmaceutical preparations and a use thereof in therapy | |
| WO2020035079A1 (zh) | 具有心脑血管保护功能的多肽及其制备方法与应用 | |
| WO2012081531A1 (ja) | 疾病抑制剤 | |
| JPH0521092B2 (zh) | ||
| CN112125952B (zh) | 一种猪源ace抑制活性多肽与药物组合物或食品及应用 | |
| CN114835773A (zh) | 一种ace抑制肽及其用途 | |
| CN113005165A (zh) | α-乳白蛋白水解液和降血压肽及其应用 | |
| JP3110075B2 (ja) | アンギオテンシン変換酵素阻害剤含有組成物の製造方法 | |
| CN1204651A (zh) | 螺旋藻多肽的制备方法及其含有这些多肽的药剂和应用 | |
| JP4783882B2 (ja) | 新規α−アミラーゼ阻害活性物質、その製造方法及びその用途 | |
| JP2873327B2 (ja) | アンジオテンシン変換酵素阻害剤 | |
| CN113087767B (zh) | 具有降血压功能的三肽rfy及其用途 | |
| CN113444145B (zh) | 一种聚球藻血管紧张素转化酶抑制肽及其制备方法与应用 | |
| JP2990354B1 (ja) | 新規なペンタペプチドおよびアンジオテンシン変換酵素阻害剤 | |
| JP2006199672A (ja) | 新規なトリペプチド及びアンジオテンシン変換酵素阻害剤 | |
| JP2001106699A (ja) | 新規なヘクサペプチドおよびアンジオテンシン変換酵素阻害剤 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |