CN114835773A

CN114835773A - 一种ace抑制肽及其用途

Info

Publication number: CN114835773A
Application number: CN202210512572.2A
Authority: CN
Inventors: 王斌; 迟长凤; 潘筱鸯; 赵玉勤
Original assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Current assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Priority date: 2020-11-06
Filing date: 2020-11-06
Publication date: 2022-08-02
Also published as: CN112521446B; CN112521446A

Abstract

本发明提供一种ACE抑制肽及其用途，属于生物活性肽技术领域，其氨基酸序列为Met‑Phe‑Arg或Met‑Phe‑Val或Phe‑Val或Lys‑Pro或Gln‑Pro或Gln‑Val‑Lys或Ile‑Lys或Tyr‑Lys‑Val或Ile‑Arg‑Lys或Met‑Leu‑Lys‑Val或Asn‑Phe‑Arg‑Pro‑Gln或Tyr‑Glu‑Gly‑Asp‑Pro或Trp‑Phe或Gly‑Pro‑Glu或Ser‑Trp‑Ile‑Ser‑Ser或Ser‑Val‑Glu‑Trp‑Lys或Phe‑Lys‑Trp‑His。本发明ACE抑制肽用于制备降血压产品和/或预防和/或治疗高血压产品。

Description

一种ACE抑制肽及其用途

技术领域

本发明属于生物活性肽技术领域，具体涉及一种ACE抑制肽及其用途。

背景技术

高血压是引发中风、心肌梗塞、心力衰竭、慢性肾病的主要危险因素，据统计，全世界每年由高血压导致死亡的人数约占总死亡人数的12.8％。目前，常见的化学合成的降压药物有卡托普利、赖诺普利、依那普利等，然而临床发现此类药物会引起血钾水平升高、味觉紊乱、咳嗽、过敏反应等不良反应。与化学合成ACE抑制剂相比，食源性的生物活性肽具有许多优点，例如相对温和、安全和易于吸收。同时这类肽往往还具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等功能，因此，食源性ACE抑制肽越来越受到人们的喜爱，其具有广阔的开发和应用前景。因此，寻找一类安全有效的降压药物代替化学合成药物成为了一种必然趋势。现今，越来越多的研究者将焦点集中在从食物蛋白中寻找ACE抑制肽。

紫贻贝别名淡菜、海红，有很高的营养价值和药用保健功效。在我国古代早有记载贻贝具有医疗保健功能，如《本草拾遗》中记载“贻贝，主虚赢劳损，因产廋瘠，血气结积，腹冷，肠鸣，下痢腰疼，带下。”贻贝中含有丰富蛋白质和牛磺酸，其蛋白质中必需氨基酸种类齐全。现代研究显示，贻贝含有多不饱和脂肪酸，可用于预防中老年人动脉粥样硬化。还含有人体必需微量元素硒，相关研究表明硒有防癌、抗癌和抗衰老等作用。贻贝提取物具有抗肿瘤、抗氧化、降血压、抗炎、抗菌、抗衰老等多种作用。研究紫贻贝ACE抑制肽的活性与作用机制，寻找新型ACE抑制肽，对肽类降压药物的开发及其发展具有重要意义，同时也为紫贻贝的高值化利用提供理论依据。

发明内容

本发明的目的在于一种ACE抑制活性高的ACE抑制肽。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

一种ACE抑制肽，其氨基酸序列为Met-Phe-Arg(MFR)或Met-Phe-Val(MFV)或Phe-Val(FV)或Lys-Pro(KP)或Gln-Pro(QP)或Gln-Val-Lys(QVK)或Ile-Lys(IK)或Tyr-Lys-Val(YKV)或Ile-Arg-Lys(IRK)或Met-Leu-Lys-Val(MLKV)或Asn-Phe-Arg-Pro-Gln(NFRPQ)或Tyr-Glu-Gly-Asp-Pro(YEGDP)或Trp-Phe(WF)或Gly-Pro-Glu(GPE)或Ser-Trp-Ile-Ser-Ser(SWISS)或Ser-Val-Glu-Trp-Lys(SVEWK)或Phe-Lys-Trp-His(FKWH)。

本发明ACE抑制肽具有较高的ACE抑制活性，主要通过氢键、静电力、疏水作用与ACE蛋白结合，无细胞毒性，能增加HUVEC细胞中内源性舒张因子NO含量且降低内源性收缩因子ET-1含量，抑制由H₂O₂诱导的细胞凋亡，提高氧化损伤HUVEC细胞中SOD、GSH-Px的活性以及NO含量，降低MDA含量和ROS水平，对氧化损伤的HUVEC细胞具有一定的保护作用。因此，本发明ACE抑制肽可以作为潜在的天然降压药品或功能性食品进行研究，同时也为紫贻贝的商业价值的提高提供理论支持。

优选地，ACE抑制肽的ACE半抑制浓度IC₅₀≤5.6mg/mL。

优选地，ACE抑制肽的氨基酸序列为IK或YEGDP或WF或SWISS。

优选地，ACE抑制肽的氨基酸序列为YEGDP或WF。

优选地，IK的ACE半抑制浓度IC₅₀＝0.77±0.02mg/mL。

优选地，YEGDP的ACE半抑制浓度IC₅₀＝0.19±0.010mg/mL。

优选地，WF的ACE半抑制浓度IC₅₀＝0.40±0.015mg/mL。

优选地，SWISS的ACE半抑制浓度IC₅₀＝0.32±0.017mg/mL。

优选地，ACE抑制肽源自紫贻贝。

本发明还公开了上述ACE抑制肽在制备降血压产品和/或预防和/或治疗高血压产品中的用途。

优选地，产品为药品或功能性食品。

优选地，ACE抑制肽在促进HUVEC细胞中NO释放中的用途。

优选地，ACE抑制肽在抑制ET-1生成中的用途。

优选地，ACE抑制肽在HUVEC细胞降压和调节中的用途。

优选地，ACE抑制肽在保护氧化损伤的HUVEC细胞中的用途。

本发明还公开了上述ACE抑制肽在制备抗氧化产品中的用途。

优选地，产品为药品或功能性食品。

本发明还公开了一种降血压的产品和/或预防和/或治疗高血压的产品，含有上述ACE抑制肽作为活性成份。

优选地，ACE抑制药物包含MFR和/或MFV和/或FV和/或KP和/或QP和/或QVK和/或IK和/或YKV和/或IRK和/或MLKV和/或NFRPQ和/或YEGDP和/或WF和/或GPE和/或SWISS和/或SVEWK和/或FKWH。

本发明还公开了一种ACE抑制肽的制备方法，包括如下步骤：

1)采用乙酸乙酯脱脂处理紫贻贝；

2)依次采用胃蛋白酶和胰蛋白酶分步酶解紫贻贝；

3)将步骤2)所得酶解液经超滤、离子交换层析、凝胶层析和反相高效液相色谱纯化得到ACE抑制肽。

本发明制备方法以紫贻贝为材料，以ACE抑制活性为指标，酶解消化产物经过超滤、QFF阴离子交换色谱、G-15凝胶色谱和反相高效液相色谱(RP-HLPC)等一系列分离纯化技术制备出具有ACE抑制活性的17条寡肽，其序列分别为MFR、MFV、FV、KP、QP、QVK、IK、YKV、IRK、MLKV、NFRPQ、YEGDP、WF、GPE、SWISS、SVEWK、FKWH。

优选地，步骤1)中，紫贻贝和乙酸乙酯的料液为1:4-6(w/v)，脱脂时间为24-72h。

优选地，步骤2)中，胃蛋白酶酶解的pH为1.0-3.0，胃蛋白酶:底物(w/w)＝1:40-60，酶解温度为30-40℃，时间为1-5h。

优选地，步骤2)中，胰蛋白酶酶解的pH为7.0-9.0，胰蛋白酶:底物(w/w)＝1:20-30，酶解温度为30-40℃，时间为2-6h。

优选地，步骤2)中，酶解结束后，在100℃下灭酶活5-20min。

优选地，步骤3)中，超滤具体为：用截留分子量为1kDa的超滤膜对紫贻贝酶解液进行超滤，得到MW<1kDa组分，冷冻干燥。

优选地，步骤3)中，离子交换层析具体为：将超滤得组分配成40-60mg/mL溶液，用0.22μM的微孔滤膜过滤后，加载到Q Sepharose FF柱上；然后分别用Tris-HCl、0.1M NaCl+Tris-HCl、0.5M NaCl+Tris-HCl、1M NaCl+Tris-HCl溶液逐级洗脱，流速为1-3mL/min，每2-5min收集一管，并于214nm吸光度下检测吸光度值，按峰合并溶液，脱盐，冻干，将各组分以0.5-2.0mg/mL的浓度进行ACE抑制活性测定，选择ACE抑制活性最高组分，进行下一步的纯化。

优选地，步骤3)中，凝胶层析具体为：将离子交换层析得ACE抑制活性最高组分以40-60mg/mL的浓度进行上样，用超纯水洗脱，流速为0.5-0.8mL/min，每2-5min收集一管，并在214nm吸光度下检测，将不同的峰分别收集后冻干，分别配制成0.5-2.0mg/mL进行ACE抑制活性测定，选择ACE抑制活性最高组分，进行下一步的纯化。

优选地，步骤3)中，反相高效液相色谱纯化具体为：将凝胶层析得ACE抑制活性最高组分溶于超纯水并过0.22μM微孔滤膜后，加载到Zorbax C18柱上进行分离；洗脱液包含两种，一种A液0.05％TFA(三氟乙酸)的超纯水，一种B液含有0.05％TFA的乙腈，使用梯度洗脱：0-5min，10％B；5-10min，10％-60％B；10-35min，60％-100％B；35-40min，0％-100％B。在214nm处测吸光度值，并分别收集各组份冻干，收集得到17个组分，经测序得到17条寡肽，其序列分别为MFR、MFV、FV、KP、QP、QVK、IK、YKV、IRK、MLKV、NFRPQ、YEGDP、WF、GPE、SWISS、SVEWK、FKWH。

本发明还公开了一种紫贻贝ACE抑制肽的制备方法，含有氨基酸序列为MFR、MFV、FV、KP、QP、QVK、IK、YKV、IRK、MLKV、NFRPQ、YEGDP、WF、GPE、SWISS、SVEWK、FKWH的ACE抑制肽，包括如下步骤：

1)采用乙酸乙酯脱脂处理紫贻贝；

2)依次采用胃蛋白酶和胰蛋白酶分步酶解紫贻贝；

3)将步骤2)所得酶解液过滤、浓缩、干燥，得到紫贻贝ACE抑制肽。

优选地，步骤2)中，酶解结束后，在100℃下灭酶活5-20min。

优选地，紫贻贝ACE抑制肽的ACE抑制率＞24％。

本发明具有如下有益效果：本发明ACE抑制肽具有较高的ACE抑制活性，主要通过氢键、静电力、疏水作用与ACE蛋白结合，无细胞毒性，能增加HUVEC细胞中内源性舒张因子NO含量且降低内源性收缩因子ET-1含量，抑制由H₂O₂诱导的细胞凋亡，提高氧化损伤HUVEC细胞中SOD、GSH-Px的活性以及NO含量，降低MDA含量和ROS水平，对氧化损伤的HUVEC细胞具有一定的保护作用。因此，本发明ACE抑制肽可以作为潜在的天然降压药品或功能性食品，同时也为紫贻贝的商业价值的提高提供理论支持。

附图说明

图1为本发明紫贻贝ACE抑制肽对ACE抑制活性的影响；

图2为本发明QFF阴离子交换分步洗脱曲线；

图3为本发明QFF阴离子交换各洗脱峰对ACE抑制活性的影响；

图4为本发明Sephadex G-15凝胶柱层析洗脱曲线；

图5为本发明Sephadex G-15凝胶柱层析各洗脱峰对ACE抑制活性的影响；

图6为本发明MH1-4-2的Zorbax C18反相高效液相的谱图；

图7为本发明IK与ACE的分子对接结果；

图8为本发明YEGDP与ACE的分子对接结果；

图9为本发明WF与ACE的分子对接结果；

图10为本发明SWISS与ACE的分子对接结果；

图11为本发明ACE抑制肽对HUVEC细胞存活率的影响；

图12为本发明ACE抑制肽对HUVEC细胞中NO水平的影响；

图13为本发明ACE抑制肽对HUVEC细胞中ET-1水平的影响；

图14为本发明不同浓度的双氧水作用4h对HUVEC细胞的损伤作用；

图15为本发明ACE抑制肽对氧化损伤HUVEC保护作用；

图16为本发明不同浓度YEGDP和WF对HUVEC氧化损伤的保护作用；

图17为本发明DCFH-DA染色法测定HUVEC内ROS水平；

图18为本发明AV-PI染色法测定细胞凋亡结果；

图19为本发明不同浓度的YEGDP和WF对HUVEC细胞中GSH-Px、SOD水平的影响；

图20为本发明不同浓度的YEGDP和WF对HUVEC细胞中MDA水平的影响；

图21为本发明不同浓度的YEGDP和WF对HUVEC细胞中NO水平的影响。

具体实施方式

本发明允许各种修改及变形，其特定实施例进行了举例，下面进行详细说明。但并非要把本发明限定于公开的特别形态之意，相反，本发明包括与由权利要求项所定义的本发明思想一致的所有修改、均等及替代。

这些实施例只用于更具体地说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围并非限定于这些实施例，这是所属技术领域的技术人员不言而喻的。

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：

实施例1：

1材料与仪器

1.1材料

紫贻贝，购于舟山嵊泗枸杞岛。

1.2主要试剂

表1主要试剂

1.3仪器

表2仪器

2方法

2.1一种紫贻贝ACE抑制肽的制备方法，包括：

1)先将紫贻贝进行脱壳、采肉、去足丝处理，绞碎后，用乙酸乙酯按料液比1:5(w/v)脱脂48h，脱脂后的紫贻贝经真空抽滤去除乙酸乙酯后，烘干，粉碎得脱脂紫贻贝；

2)将20mg/mL的脱脂紫贻贝溶液用1M HCl将pH调节至2.0，按酶:底物(w/w)为1:50添加胃蛋白酶，混匀后于37℃下搅拌2h；然后用饱和NaHCO₃溶液(0.9M)将pH调节至5.3，并用2M NaOH进一步调节pH至7.5，按酶:底物(w/w)为1:25加入胰蛋白酶，混匀后于37℃下搅拌酶解4h,反应结束后，置于100℃的沸水中加热灭酶10min，得酶解液过滤；

2.2ACE抑制活性的测定

试剂的配制：80mM HEPES缓冲液(pH 8.3，Cl^－浓度为300mM)：HEPES 1.910g，NaCl1.755g，双蒸水溶解后，NaOH调节pH至8.3再补充水至100mL，置4℃备用；FAPGG溶液(1mM)：取3.994mg FAPGG粉末加HEPES缓冲液，混合溶解，定容至10mL，置4℃避光保存；ACE抑制剂(待测肽)：称取适量的活性肽粉末，用HEPES缓冲液为溶剂配制成一系列浓度的活性肽溶液；ACE溶液(0.1U/mL)：将0.25U ACE溶于2.5mL的HEPES缓冲液中，即可得到0.1U/mLACE溶液，置-20℃保存备用。

ACE抑制活性的测定：在96孔板上按表3设计添加反应物，在340nm处分别测定空白孔和样品孔的初始吸光度(A₁，B₁)，在37℃的恒温培养条件下反应30min，再测定其吸光度(A₂，B₂)。ACE抑制活性计算公式如下：

其中：Bi(B₁-B₂)为样品孔吸光值在30min的变化：Ai(A₁-A₂)为空白孔吸光值在30min的变化。

表3 ACE抑制活性测定

2.3数据处理

实验结果用平均值±标准偏差表示(n＝3)，并使用Origin和SPSS 22.0软件进行作图和数据分析。

实施例2：

与实施例1的不同之处在于：一种紫贻贝ACE抑制肽的制备方法，步骤2)用脱脂紫贻贝溶液浓度为5mg/mL。

实施例3：

与实施例1的不同之处在于：一种紫贻贝ACE抑制肽的制备方法，步骤2)用脱脂紫贻贝溶液浓度为10mg/mL。

实施例4：

与实施例1的不同之处在于：一种紫贻贝ACE抑制肽的制备方法，步骤2)用脱脂紫贻贝溶液浓度为40mg/mL。

实施例1-4紫贻贝ACE抑制肽对ACE抑制活性的影响如图1所示，可以看出，实施例1-4紫贻贝ACE抑制肽的ACE抑制率＞24％。

实施例5：

1材料与仪器

同实施例1。

2方法

2.1一种ACE抑制肽的制备方法，包括：

1)同实施例1；

2)同实施例1；

其中，步骤3)具体为：

用截留分子量为1kDa的超滤膜对紫贻贝酶解液进行超滤，得到MW<1kDa的MH1组分，MH1的ACE抑制活性为(54.80±1.63％)，冷冻干燥；

将超滤得组分配成50mg/mL溶液，用0.22μM的微孔滤膜过滤后，加载到QSepharose FF柱上；然后分别用Tris-HCl、0.1M NaCl+Tris-HCl、0.5M NaCl+Tris-HCl、1MNaCl+Tris-HCl溶液逐级洗脱，流速为2mL/min，每3min收集一管，并于214nm吸光度下检测吸光度值，按峰合并溶液，得到5个峰(如图2)，脱盐，冻干，将将冻干后的MH1-1、MH1-2、MH1-3、MH1-4及MH1-5五个组分以1.0mg/mL的浓度进行ACE抑制活性测定，结果如图3所示，MH1-4的ACE抑制活性(67.18±2.87％)明显比其他四个组分高，因此选择MH1-4组分，进行下一步的纯化；

将MH1-4组分以50mg/mL的浓度进行上样到Sephadex G-15(3.6×150cm)柱上，用超纯水洗脱，流速为0.6mL/min，每3min收集一管，并在214nm吸光度下检测，将不同的峰分别收集，得到3个峰(如图4)，冻干，分别配制成1.0mg/mL进行ACE抑制活性测定，结果如图5所示：MH1-4-2的ACE抑制活性(75.79±1.56％)高于MH1-4-1(63.30±1.05％)，因此选择MH1-4-2组分冻干进行下一步的纯化；

将MH1-4-2组分溶于超纯水并过0.22μM微孔滤膜后，加载到Zorbax C18柱上进行分离；洗脱液包含两种，一种A液0.05％TFA(三氟乙酸)的超纯水，一种B液含有0.05％TFA的乙腈，使用梯度洗脱：0-5min，10％B；5-10min，10％-60％B；10-35min，60％-100％B；35-40min，0％-100％B。在214nm处测吸光度值，并分别收集各组份冻干，收集得到17个组分(如图6)，委托检测中心采用Edman降解法进行N端序列测序。氨基酸测序委托上海波泰生物科技有限公司，采用日本岛津PSSM-8型多肽自动合成仪合成，纯度为95％以上。经测序得到17条寡肽，其序列分别为MFR、MFV、FV、KP、QP、QVK、IK、YKV、IRK、MLKV、NFRPQ、YEGDP、WF、GPE、SWISS、SVEWK、FKWH。

测定17条寡肽在不同浓度下的ACE抑制率，利用SPSS Statistics 22软件进行统计，计算17条寡肽的IC₅₀值，结果如表4所示。

表4 17条寡肽氨基酸组成序列及活性

实施例5：

将寡肽IK、YEGDP、WF以及SWISS委托上海纽普生物科技有限公司进行模拟分子对接。

IK、YEGDP、WF和SWISS与ACE的分子对接结果如图7-10。由图7可知，IK与ACE氨基酸残基His387形成氢键；与Phe457、Tyr523、Tyr520形成疏水作用；与Asp415、Glu384、His353、Glu411通过静电力作用。由图8可知，YEGDP与ACE氨基酸残基Asp453、Glu376、Ala354、Tyr520形成氢键，其中与S1活性口袋(Ala354)以及与S2活性口袋(Tyr520)形成氢键；与Val380、His353、Tyr523形成疏水作用，其中His353、Tyr523与；与Asp415通过静电力作用。由图9可知，WF与ACE氨基酸残基Phe457、Phe527、His353、His383、Val380形成疏水作用；与Asp377、Glu376、Lys454通过静电力作用。由图10可知，SWISS与ACE氨基酸残基Asp377、Gys352、Ala354、Tyr523、His383、His353、His387，其中与S1活性口袋(Ala354、Tyr523)以及与S2活性口袋(His353)形成氢键；与Val380、Trp279形成疏水作用；与Glu384、Glu411通过静电力作用。这表明ACE抑制肽主要通过氢键、静电力、疏水作用与ACE蛋白结合发挥抑制作用，并且ACE抑制活性可能与活性口袋相互作用以及与ACE蛋白结合强度紧密相关。同时，SWISS、IK、YEGDP以及WF与ACE的亲和力分别为-8.6Kcal/mol、-6.1Kcal/mol、-8.8Kcal/mol以及-7.6Kcal/mol。

实施例6：

1材料和仪器

1.1材料

人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelialm Cell，HUVEC)购于中国科学院上海细胞库。

1.2试剂

表5试剂

1.3仪器

表6仪器

2方法

2.1HUVEC细胞的培养

HUVEC细胞使用DMEM+10％胎牛血清(FBS)+1％双抗(青霉素-链霉素)培养液进行培养。培养流程如下：复苏后的细胞置于含5％CO₂培养箱中，37℃培养，12h后换液，等到细胞生长至能覆盖瓶底80％-90％时，用胰酶进行消化并传代。取对数生长期的HUVEC细胞作为实验材料。

2.2HUVEC细胞毒性试验(MTT法)

将对数生长期的HUVEC，接种于若干96孔培养板。每孔180μL，细胞数0.9×10⁴个/孔，置于37℃、5％CO₂的恒温箱中孵育24h。样品组加入20μL寡肽其终浓度分别为100、200、300、400和500μM，空白组加入20μL PBS，孵育24h后，再加入20μL MTT孵育4h后弃去培养液，再加入150μL DMSO在37℃下孵育10min后，用酶标仪在570nm测量吸光度值，计算细胞存活率。

细胞存活率计算公式：细胞存活率(％)＝(实验组/对照组)×100

2.3实验分组及处理

将对数生长期的HUVEC，接种于若干6孔培养板。每孔1.8mL，细胞数3.5×10⁵个/孔，置于37℃、5％CO₂的恒温箱中孵育24h。随机分组如下：

(1)空白对照组：不加任何试剂处理细胞；

(2)卡托普利(Cap)组：加入Cap终浓度为1μM；

(3)去甲肾上腺素(NE)组：加入NE终浓度为0.5μM；

(4)ACE抑制肽低剂量组：加入肽终浓度为100μM；

(5)ACE抑制肽中剂量组：加入肽终浓度为200μM；

(6)ACE抑制肽高剂量组：加入肽终浓度为400μM；

(7)ACE抑制肽+NE组：加入肽和NE终浓度分别为400μM，0.5μM。

2.4HUVEC细胞内NO含量测定

采用硝酸还原酶试剂盒。其测定原理：NO化学性质活泼，在体内代谢转化为硝酸盐(NO₃ ^-)和亚硝酸盐(NO₂ ^-)，而亚硝酸盐(NO₂ ^-)又进一步转化为硝酸盐(NO₃ ^-)，本法利用硝酸还原酶特异性将硝酸盐(NO₃ ^-)还原为硝酸盐(NO₂ ^-)，通过在550nm测定其吸光值，计算NO含量。作用24h后，弃去培养液，用PBS洗三次，再使用细胞刮分别将每组细胞刮下收集到EP管中，在冰水浴中用细胞破碎仪将细胞破碎，加入300μL PBS，然后按NO试剂盒上的步骤进行操作。

2.5HUVEC细胞内ET-1含量测定

采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。其原理：往预先包被内皮素1(ET-1)抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化氢酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下最终转化成黄色。颜色的深浅与样品中的内皮素1(ET-1)呈正相关。用酶标仪在450nm波长处测其吸光值，计算样品浓度。ET-1含量测定的具体步骤按试剂盒说明书进行操作。

3实验结果

ACE抑制肽对HUVEC细胞存活率的影响如图11所示，与空白组相比，在100-400μM浓度范围内，IK、YEGDP、WF组的细胞存活率均在90％以上。

ACE抑制肽对HUVEC细胞中NO水平的影响如图12所示，与空白对照组相比，卡托普利(Cap)组NO含量显著上升至56.27±2.63μM(P<0.01)。此外，样品组中寡肽IK、YEGDP和WF分别以100、200、400μM的浓度作用于细胞，结果显示NO含量呈现剂量依赖性。IK、YEGDP和WF在浓度为400μM下细胞中NO的含量分别为44.23±0.29、47.61±0.64和45.39±0.99μM。同时，去甲肾上腺素(NE)抑制细胞中NO的释放(19.47±0.60μM)，且加入ACE抑制肽后，NO含量显著上升(P<0.01)，说明NE抑制细胞中NO释放的作用可以被ACE抑制肽所拮抗。

ACE抑制肽对HUVEC细胞中ET-1水平的影响如图13所示，与空白对照组相比，卡托普利(Cap)组ET-1含量显著下降至25.79±1.10μM(P<0.01)。此外，样品组中寡肽IK、YEGDP和WF分别以100、200、400μM的浓度作用于细胞，ET-1含量呈现剂量依赖性。IK、YEGDP和WF在浓度为400μM下细胞中ET-1的含量分别为50.51±1.44、42.85±0.73和44.89±0.49μM。同时，去甲肾上腺素(NE)抑制细胞中ET-1的释放(71.30±1.50μM)，且加入ACE抑制肽后，ET-1含量显著下降(P<0.01)，说明ACE抑制肽能抑制细胞中ET-1释放的作用。

通过IK、YEGDP以及WF这三条寡肽对NO和ET-1两种因子的复合作用结果表明，IK、YEGDP和WF对HUVEC无明显毒性，并能促进HUVEC细胞中内源性舒张因子一氧化氮(NO)的释放和抑制内源性收缩因子内皮素(ET-1)的生成，表明这三条寡肽对HUVEC细胞具有一定的降压和调节功能。因此，在体内环境下，IK、YEGDP和WF可以通过影响血管内皮细胞的功能来发挥其降压作用。

实施例7：

1材料和仪器

1.1试剂

表7试剂

1.2仪器

表8仪器

2方法

2.1HUVEC细胞的培养

同实施例6。

2.2用H₂O₂诱导HUVEC细胞

将对数生长期的HUVEC，接种于96孔培养板。每孔180μL，细胞数0.9×10⁴个/孔，置于37℃、5％CO₂的恒温箱中孵育24h。模型组加入由20μL浓度终浓度分别为500、600、700、800、900μM H₂O₂，空白组加入20μL PBS，孵育4h后，用MTT法检测细胞存活率。

2.3ACE抑制肽对HUVEC细胞氧化应激作用的筛选

将对数生长期的HUVEC，接种于若干96孔培养板。每孔160μL，细胞数0.9×10⁴个/孔，置于37℃、5％CO₂的恒温箱中孵育24h。样品组加入20μL终浓度为400μM寡肽，阳性药组加入20μL终浓度为1mM谷胱甘肽(GSH)，空白组和模型组加入20μL PBS，孵育3h后，样品组、模型组和阳性药组加入20μL终浓度为600μM H₂O₂，空白组加入20μL PBS，孵育4h后，用MTT法检测细胞存活率。选出在400μM活性肽对HUVEC细胞氧化应激有较好保护作用的寡肽，再分别以100、200和400μM浓度作用于细胞，观察ACE抑制肽是否对HUVEC细胞氧化应激具有保护作用。

2.4HUVEC细胞内ROS水平的测定

将对数生长期的HUVEC，接种于若干96孔培养板。每孔160μL，细胞数0.9×10⁴个/孔，置于37℃、5％CO₂的恒温箱中孵育24h。样品组加入20μL终浓度为100、200、400μM的活性肽，阳性药组加入20μL终浓度为1mM GSH，空白组和模型组加入20μL PBS，孵育3h后，样品组、模型组和阳性药组加入20μL终浓度为600μM H₂O₂，空白组加入20μL PBS，孵育4h后，弃去培养液用PBS洗涤2次后，加入100μL的10μm DCFH-DA荧光探针溶液，在37℃下孵育40min后，用PBS洗涤3次后，在激发波长500±15nm,发射波长530±20nm下用多功能酶标仪检测细胞内活性氧水平。

ROS水平计算公式：ROS水平(％)＝(实验组/对照组)×100

2.5HUVEC细胞凋亡率的测定

将对数生长期的HUVEC，接种于若干6孔培养板。每孔1.6mL，细胞数3.5×10⁵个/孔，置于37℃、5％CO₂的恒温箱中孵育24h。将6孔板分为空白对照组、模型组、阳性药组和样品组，空白对照组和模型组加入200μL PBS，阳性药组加入200μL的GSH，样品组加入200μL的寡肽(样品终浓度分别为100、200、400μM)，恒温细胞培养箱中培养3h。空白组加入200μLPBS，各模型组、阳性药组和样品组加入200μL终浓度为600μM H₂O₂，恒温细胞培养箱中培养4h。

(1)将6孔板里的细胞培养液吸出，用PBS清洗贴壁细胞两次，用不含EDTA的胰酶细胞消化液消化细胞1～3min。

(2)细胞消化吹落后，用预冷的PBS混匀后转移到离心管内。以1000rpm，4℃下离心5min后弃上清，收集下层沉淀细胞，重复两次，最后尽量吸尽PBS。

(3)用400μL 1×Annexin-V结合液悬浮细胞，使重悬的细胞浓度为3×10⁵个/mL。

(4)在细胞悬液中加入5μL Annexin V-FITC染色液，轻轻混匀，用铝箔进行避光，在2℃下孵育10min。

(5)再加入10μL碘化丙啶，轻轻混匀，用铝箔进行避光，在2℃下孵育10min。

(6)将待测细胞液过细胞筛后随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC的绿色荧光信号可通过FL1(FITC接收器)通道检测；PI为红色荧光，可通过FL2(Propidium iodide接收器)通道检测。

其中，左上角(Q1-UL)为机械死亡细胞区，右上角(Q1-UR)为晚期调亡细胞区，左下角(Q1-LL)为活细胞区，右下角(Q1-LR)为早期调亡细胞区，总调亡细胞＝晚期调亡细胞+早期调亡细胞区。

2.6 HUVEC细胞内GSH-Px、SOD的活性以及NO和MDA含量测定

将对数生长期的HUVEC，接种于若干6孔培养板。每孔1.6mL，细胞数3.5×10⁵个/孔，置于37℃、5％CO₂的恒温箱中孵育24h。样品组加入200μL终浓度为100、200、400μM的寡肽，阳性药组加入200μL终浓度为1mM的GSH，空白组和模型组加入200μL PBS，孵育3h后，样品组、模型组和阳性药组加入200μL终浓度为600μM H₂O₂，空白组加入200μL PBS，孵育4h后弃去培养液，用PBS洗三次，用细胞刮分别将每组细胞刮下收集到EP管中，在冰水浴中用细胞破碎仪将细胞破碎，然后按照BCA蛋白试剂盒、GSH-Px、SOD、NO和MDA试剂盒步骤测量各个组分细胞内的蛋白浓度和GSH-Px和SOD的活性以及NO和MDA含量。

3实验结果

不同浓度的双氧水作用4h对HUVEC细胞的损伤作用如图14所示，在一定浓度范围内，随H₂O₂的浓度升高，HUVEC细胞的存活率显著下降。根据相关文献报道，当HUVEC细胞存活率在50％左右为最佳模型，因此选择双氧水浓度为600μM(51.33±1.37％)作用4h作为建立HUVEC细胞双氧水氧化损伤模型的条件。

ACE抑制肽对氧化损伤HUVEC保护作用如图15所示，与空白组相比，模型组的细胞存活率具有显著性的差异(P<0.01)，为52.30±2.70％，说明所建氧化损伤模型成功。与模型组相比，寡肽样品组(IK、YEGDP、WF)细胞存活率各有不同，其中YEGDP和WF对H₂O₂损伤的HUVEC细胞具有显著的保护作用(P<0.01)，使细胞存活率由52.30±2.70％分别提高到61.56±1.80％和60.43±1.16％。不同浓度YEGDP和WF对HUVEC氧化损伤的保护作用如图16所示，寡肽YEGDP和WF分别以100、200和400μM的浓度作用于细胞，随着这两条寡肽浓度的增加，寡肽对HUVEC细胞氧化损伤保护作用逐渐增强，即YEGDP和WF对HUVEC细胞氧化损伤保护作用呈剂量依赖型。

DCFH-DA染色法测定HUVEC内ROS水平如图17所示，模型组细胞内ROS含量为对照组的205.30±7.04％，明显高于对照组(P<0.01)。当样品组寡肽YEGDP和WF分别以100、200和400μM作用于细胞后发现，能减少细胞内的ROS并呈剂量依赖型。YEGDP和WF以400μM浓度作用于细胞时，细胞中ROS含量分别显著性降低到对照组的158.67±6.45％和160.97±4.06％(P<0.01)。

AV-PI染色法测定细胞凋亡结果如图18所示，与空白组相比，模型组细胞凋亡率为49.6±2.1％，说明凋亡模型建立成功。与模型组相比，样品组在不同程度上抑制了H₂O₂所引起HUVEC细胞的凋亡，YEGDP和WF在100、200、400μM浓度下能显著降低细胞凋亡率(P<0.05或P<0.01)，且均呈现剂量依赖性。YEGDP和WF以400μM浓度作用于细胞时，凋亡率分别为30.5±1.2％和30.7±1.1％。结果表明：ACE抑制肽YEGDP和WF能降低H₂O₂所致HUVEC细胞的凋亡，且呈现剂量依赖性。

不同浓度的YEGDP和WF对HUVEC细胞中GSH-Px、SOD水平的影响如图19所示，空白组细胞中SOD和GSH-Px的活性分别为241.06±14.83U/mgprot和62.18±1.94U/mgprot，模型组细胞中SOD和GSH-Px的活性分别为119.31±9.48U/mgprot和27.01±1.37U/mgprot，样品组中寡肽YEGDP和WF分别以100、200、400μM的浓度作用于细胞，发现细胞中SOD和GSH-Px的活性随着寡肽浓度的增加而增加。与模型组相比，YEGDP和WF以400μM浓度作用于细胞时，细胞中SOD的活力分别显著性提高到174.32±6.54U/mgprot和171.97±10.94U/mgprot(P<0.01)。同时发现细胞中GSH-Px的含量分别显著性提高至41.16±2.31U/mgprot和38.92±1.31U/mgprot(P<0.01)。

不同浓度的YEGDP和WF对HUVEC细胞中MDA水平的影响如图20所示，空白组细胞中MDA的含量为13.03±0.58nmoL/mgprot，模型组细胞中MDA含量为28.38±0.78nmoL/mgprot，样品组中寡肽YEGDP和WF分别以100、200、400μM的浓度作用于细胞，发现细胞中MDA含量随着寡肽浓度的增加而减少。YEGDP和WF在400μM时细胞中MDA的含量分别显著性降低为20.73±1.20nmoL/mgprot和21.46±1.03nmoL/mgprot(P<0.01)。

不同浓度的YEGDP和WF对HUVEC细胞中NO水平的影响如图21所示，空白组细胞中NO的含量为35.69±1.50μmol/L，模型组细胞中NO含量为15.54±0.62μmol/L，样品组中寡肽YEGDP和WF分别以100、200、400μM的浓度作用于细胞，发现细胞中NO含量呈现剂量依赖性。YEGDP和WF在400μM时细胞中NO的含量分别显著性上升为21.26±0.78μmol/L和20.74±0.78μmol/L(P<0.01)。

以上结果表明，寡肽YEGDP和WF能抑制由H₂O₂诱导的细胞凋亡，提高氧化损伤HUVEC细胞中SOD、GSH-Px的活性以及NO含量，降低MDA含量和ROS水平，对氧化损伤的HUVEC细胞的具有一定的保护作用，可以潜在地作为药品或功能食品中的天然降压肽，可作为新型降压肽进行更加深入的研究。

上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims

1.一种ACE抑制肽，其氨基酸序列为Trp-Phe。

2.根据权利要求1所述的一种ACE抑制肽，其特征在于：所述ACE抑制肽的ACE半抑制浓度IC₅₀＝0.40±0.015mg/mL。

3.根据权利要求1所述的一种ACE抑制肽，其特征在于：所述ACE抑制肽源自紫贻贝。

4.权利要求1所述的ACE抑制肽在制备降血压产品和/或预防和/或治疗高血压产品中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述ACE抑制肽在HUVEC细胞降压和调节中的用途。

6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述ACE抑制肽在保护氧化损伤的HUVEC细胞中的用途。

7.权利要求1所述的ACE抑制肽在制备抗氧化产品中的用途。

8.一种降血压的产品和/或预防和/或治疗高血压的产品，含有权利要求1所述的ACE抑制肽作为活性成份。

9.一种紫贻贝ACE抑制肽的制备方法，含有权利要求1所述的ACE抑制肽，包括如下步骤：

1)采用乙酸乙酯脱脂处理紫贻贝；

2)依次采用胃蛋白酶和胰蛋白酶分步酶解紫贻贝；

10.根据权利要求9所述的一种紫贻贝ACE抑制肽的制备方法，其特征在于：所述紫贻贝ACE抑制肽的ACE抑制率＞24％。